CN117442567A - 一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法和检测方法，其属于生物药物制剂领域。包括以下步骤：调节核心链霉亲和素原液的pH值至预设值；将PH值调节至预设值的核心链霉亲和素原液与海藻糖母液混合；将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥。本申请的有益效果在于通过海藻糖母液，提高冻干制剂的性状，保证冻干制剂的稳定性，以满足相关储存和运输要求。

Description

一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法和检测方法
技术领域
本申请涉及生物药物制剂领域，具体而言，涉及一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法和检测方法。
背景技术
链霉亲和素是一种具有高度亲和力的蛋白质，通常用于生物分子的分离、检测和标记。它在生命科学研究和分子生物学领域有广泛的应用背景，包括酶联免疫吸附实验、免疫组织化学、时间分辨免疫荧光技术、定量PCR、单链DNA制备、生物分子纯化、单克隆抗体制备等。核心链霉亲和素是链霉亲和素的一种改良形式，与天然的链霉亲和素相比，去除了与活性无关的氨基酸序列，仅保留核心序列，其结合生物素标记的分子的亲和力更强，因此可以更牢固地捕获目标分子，同时非特异性结合也大大降低。
真空冷冻干燥技术常用于解决蛋白制剂的储藏和运输问题。真空冷冻干燥技术又称为冻干，此法将需要干燥的制品置于低温下使其所含的水分冻结，然后放在真空环境下干燥，让水分由固体状态直接升华为水蒸气并从制品中排出而使制品干燥。该方法可有效防止制品理化及生物特性的改变，保护了蛋白制剂的稳定性。然而，由于工程改造，核心链霉亲和素的蛋白质疏水性也更高，更倾向于在溶液中形成聚集、凝聚或聚合体，导致其在冻干后的复溶性(冻干粉在重新溶解时的难易程度)较差。
因此核心链霉亲和素在冻干过程后存在形态萎缩、塌陷或碎块等现象，复溶性较差，且自身理化性质不够稳定，在夏天运输过程后与生物素的结合能力有所下降。目前并未有关于有效储藏和运输该蛋白的稳定剂型。
发明内容
本申请的内容部分用于以简要的形式介绍构思，这些构思将在后面的具体实施方式部分被详细描述。本申请的内容部分并不旨在标识要求保护的技术方案的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求的保护的技术方案的范围。
为了解决以上背景技术部分提到的技术问题，本申请的一些实施例提供了一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，包括以下步骤：调节核心链霉亲和素原液的pH值至预设值；将PH值调节至预设值的核心链霉亲和素原液与海藻糖母液混合；将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥。
进一步地，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0.25-5％。
进一步地，所述将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥的步骤包括：
将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母依次进行预冻、升华干燥和解析干燥。
进一步地，
所述预冻的温度为-50～-20℃，升温时间为30～75min，保持时间为60～300min；
所述升华干燥的温度为-40～25℃，升温时间为20～60min，保持时间为300～1500min，真空度为0～0.5mbar；
所述解析干燥的温度为-20～25℃，升温时间为10～100min，保持时间为120～600min，真空度为0～0.01mbar。
进一步地，
所述预冻的温度为-50～-25℃，升温时间为40～70min，保持时间为160～270min；
所述升华干燥的温度为-15～8℃，升温时间为25～50min，保持时间为1000～1500min，真空度为0～0.5mbar；
所述解析干燥的温度为-10～20℃，升温时间为20～50min，保持时间为240～480min，真空度为0～0.01mbar。
本申请的另一目的在于提供一种核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，该方法用于对权利要求1-5中任意一项制备的核心链霉亲和素冻干粉进行检测，包括以下步骤：
对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测。
进一步地，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测的步骤包括：
将核心链霉亲和素冻干粉置于80℃放置9小时，随后置于40℃放置15小时，如此往复，共放置72小时。于第72小时进行检测。
进一步地，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测的步骤包括：
用纯水将供试品稀释成1mg/mL，用Green改良法检测核心链霉亲和素的活性。
本申请的有益效果在于：
通过海藻糖母液，提高冻干制剂的性状，保证冻干制剂的稳定性，以满足相关储存和运输要求；
利用真空冷冻干燥技术，经过对技术参数的实验摸索，成功将核心链霉亲和素制备成冻干粉剂型，提高了该蛋白的复溶性和稳定性。同时本发明提供的冻干工艺和制备方法简单可行，条件温和，重现性好，可控性强，适合大规模生产。此外，本发明利用核心链霉亲和素复溶后制备的溶液进行活性检测，结果表明该核心链霉亲和素溶液与生物素结合的能力十分稳定，在模拟夏天运输过程后，其活力与初始状态相比无明显差异。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，使得本申请的其它特征、目的和优点变得更明显。本申请的示意性实施例附图及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
另外，贯穿附图中，相同或相似的附图标记表示相同或相似的元素。应当理解附图是示意性的，元件和元素不一定按照比例绘制。
在附图中：
图1是核心链霉亲和素冻干粉的溶液澄清度检测的结果示意图；
图2是核心链霉亲和素冻干粉冻干后单体的蛋白纯度检测的结果示意图；
图3是核心链霉亲和素冻干粉冻干后四聚体的蛋白纯度检测的结果示意图；
图4是核心链霉亲和素冻干粉模拟夏天运输过程后单体的蛋白纯度检测的结果示意图；
图5是核心链霉亲和素冻干粉模拟夏天运输过程后四聚体的蛋白纯度检测的结果示意图；
图6是核心链霉亲和素冻干粉的蛋白活性检测的结果示意图；
图7是海藻糖浓度为1.5％的核心链霉亲和素冻干粉的溶液澄清度检测的结果示意图；
图8是海藻糖浓度为1.5％的核心链霉亲和素冻干粉冻干后蛋白纯度检测的结果示意图；
图9是海藻糖浓度为1.5％的核心链霉亲和素冻干粉模拟夏天运输过程后的蛋白纯度检测的结果示意图；
图10是海藻糖浓度为1.5％的核心链霉亲和素冻干粉蛋白活性检测的结果示意图；
图11是海藻糖浓度为1.5％且磷酸钾盐和磷酸钠盐分别作为PH调节剂制备的核心链霉亲和素冻干粉的蛋白活性检测结果示意图。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的实施例。虽然附图中显示了本公开的某些实施例，然而应当理解的是，本公开可以通过各种形式来实现，而且不应该被解释为限于这里阐述的实施例。相反，提供这些实施例是为了更加透彻和完整地理解本公开。应当理解的是，本公开的附图及实施例仅用于示例性作用，并非用于限制本公开的保护范围。
另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与有关发明相关的部分。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
需要注意，本公开中提及的“第一”、“第二”等概念仅用于对不同的装置、模块或单元进行区分，并非用于限定这些装置、模块或单元所执行的功能的顺序或者相互依存关系。
需要注意，本公开中提及的“一个”、“多个”的修饰是示意性而非限制性的，本领域技术人员应当理解，除非在上下文另有明确指出，否则应该理解为“一个或多个”。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本公开。
总实施例
参照图1-11，
一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，包括以下步骤：调节核心链霉亲和素原液的pH值至预设值；将PH值调节至预设值的核心链霉亲和素原液与海藻糖母液混合；将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥。
具体的，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0.25-5％。
具体的，所述将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥的步骤包括：将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母依次进行预冻、升华干燥和解析干燥。
一些实施例中，所述预冻的温度为-50～-20℃，升温时间为30～75min，保持时间为60～300min；所述升华干燥的温度为-40～25℃，升温时间为20～60min，保持时间为300～1500min，真空度为0～0.5mbar；所述解析干燥的温度为-20～25℃，升温时间为10～100min，保持时间为120～600min，真空度为0～0.01mbar。
另一些实施例中，所述预冻的温度为-50～-25℃，升温时间为40～70min，保持时间为160～270min；所述升华干燥的温度为-15～8℃，升温时间为25～50min，保持时间为1000～1500min，真空度为0～0.5mbar；所述解析干燥的温度为-10～20℃，升温时间为20～50min，保持时间为240～480min，真空度为0～0.01mbar。
一种核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，该方法用于对上述方法制备的核心链霉亲和素冻干粉进行检测，包括以下步骤：
对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测。
具体的，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测的步骤包括：
将核心链霉亲和素冻干粉置于80℃放置9小时，随后置于40℃放置15小时，如此往复，共放置72小时。于第72小时进行检测。
具体的，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测的步骤包括：用纯水将供试品稀释成1mg/mL，用Green改良法检测核心链霉亲和素的活性。
具体的，对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测的步骤包括：取核心链霉亲和素冻干粉，并置明亮处观察外观形状；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测的步骤包括：取核心链霉亲和素冻干粉，并加纯水制成每1mL中约含蛋白10mg的溶液，振摇，测定复溶时间；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测的步骤包括：溶液澄清度：取核心链霉亲和素冻干粉，并加纯水制成每1mL中约含蛋白10mg的溶液，检测溶液澄清度；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测的步骤包括：用纯水将核心链霉亲和素冻干粉稀释成1mg/mL后，分别用还原型与非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定核心链霉素的单体与四聚体，分离胶的胶浓度为15％，加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法)。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。
实施例1
一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，包括以下步骤：调节核心链霉亲和素原液的pH值至预设值；将PH值调节至预设值的核心链霉亲和素原液与海藻糖母液混合；核心链霉亲和素为10mg；将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥。PH值调节至预设值为pH＝8.0。所述pH调节剂为磷酸钾盐和磷酸钠盐中的一种。
具体的，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0％。
具体的，所述将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥的步骤包括：将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母依次进行预冻、升华干燥和解析干燥。
所述预冻的温度为-45℃，升温时间为50min，保持时间为240min；所述升华干燥的温度为-8℃，升温时间为45min，保持时间为1200min，真空度为0.5mbar；所述解析干燥的温度为15℃，升温时间为30min，保持时间为300min，真空度为0.01mbar。
一种核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，该方法用于对上述方法制备的核心链霉亲和素冻干粉进行检测，包括以下步骤：
对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测。
具体的，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测的步骤包括：
将核心链霉亲和素冻干粉置于80℃放置9小时，随后置于40℃放置15小时，如此往复，共放置72小时。于第72小时进行检测。
具体的，所述对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测的步骤包括：用纯水将供试品稀释成1mg/mL，用Green改良法检测核心链霉亲和素的活性。
具体的，对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测的步骤包括：取核心链霉亲和素冻干粉，并置明亮处观察外观形状；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测的步骤包括：取核心链霉亲和素冻干粉，并加纯水制成每1mL中约含蛋白10mg的溶液，振摇，测定复溶时间；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测的步骤包括：溶液澄清度：取核心链霉亲和素冻干粉，并加纯水制成每1mL中约含蛋白10mg的溶液，检测溶液澄清度；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测的步骤包括：用纯水将核心链霉亲和素冻干粉稀释成1mg/mL后，分别用还原型与非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定核心链霉素的单体与四聚体，分离胶的胶浓度为15％，加样量应不低于10μg(考马斯亮蓝R250染色法)。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0％。
实施例2
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0.25％。
实施例3
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0.5％。
实施例4
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为1％。
实施例5
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为1.5％。
实施例6
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为3％。
实施例7
在实施例1的基础上，与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为5％。
综上所述：
核心链霉亲和素冻干粉的外观形状检测结果如下表所示：
核心链霉亲和素冻干粉的复溶时间的检测结果如下表所示：
其中，核心链霉亲和素冻干粉的溶液澄清度检测结果如图1所示：
核心链霉亲和素冻干粉的蛋白纯度的检测结果如图2-5所示：
核心链霉亲和素冻干粉的蛋白活性的检测结果如图6所示：
上述结果表明：
核心链霉亲和素冻干粉外观均为白色海绵状固体，实施例1和实施例2在冻干和模拟夏天运输后均存在碎块，实施例6和实施例7在模拟夏天运输后出现明显萎缩；
实施例1在模拟夏天运输后复溶时间明显增加，且出现明显的白色浑浊，表明复溶效果差。实施例6和实施例7复溶后泡沫较多，需静置较长时间才能澄清透明，因此复溶时间较长。实施例2、实施例3、实施例4和实施例5的复溶时间较短，复溶后溶液澄清透明；
实施例1-7冻干后的蛋白纯度较高，无明显杂带，且均能形成较好的四聚体；在模拟夏天运输后，实施例1-4均出现杂蛋白，且形成四聚体的能力较差。但实施例5-7的蛋白纯度始终较好，能形成较好的四聚体；
实施例1-7在冻干后的活力无明显差异，但在模拟夏天运输过程后，实施例1活力出现明显下降；实施例2-7的活力无明显变化。
综合上述结果显示，在添加了1.5％的海藻糖后，核心链霉亲和素冻干粉的外观、复溶时间、溶液澄清度、蛋白纯度和活力均较好，且在模拟夏天运输过程后也保持较好。
实施例8
在实施例5的基础上选择更大规格的核心链霉亲和素验证上述效果。核心链霉亲和素为100mg。
核心链霉亲和素冻干粉的外观形状和复溶时间的检测结果如下表所示：
检测项目 冻干后 模拟夏天运输过程后
外观性状 白色海绵状固体 白色海绵状固体
复溶时间 10s 9s
其中，核心链霉亲和素冻干粉的溶液澄清度检测结果如图7所示：
核心链霉亲和素冻干粉的蛋白纯度的检测结果如图8-9所示：
核心链霉亲和素冻干粉的蛋白活性的检测结果如图10所示：
上述结果表面，不同规格的核心链霉亲和素并不会影响核心链霉亲和素冻干粉制备的质量。
实施例9
在实施例5的基础上，分别使用磷酸钾盐作为PH调节剂和使用磷酸钠盐作为PH调节剂进行实验。
核心链霉亲和素冻干粉的蛋白活性的检测结果如图11所示：
与初始状态相比，模拟夏天运输过程后，无论是磷酸钾盐还是磷酸钠盐，冻干粉的蛋白活性均未出现明显下降，表明在这两种缓冲体系下，海藻糖均能有效发挥保护核心链霉亲和素活力的作用。但是，磷酸钠盐组的蛋白活性明显低于磷酸钾盐组，表明磷酸钾盐缓冲体系更适合于核心链霉亲和素的冻干过程。
上述实施例中，磷酸钾盐优选为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾。
以上描述仅为本公开的一些较佳实施例以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本公开的实施例中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离上述发明构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本公开的实施例中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

Claims (8)

1.一种核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
调节核心链霉亲和素原液的pH值至预设值；
将PH值调节至预设值的核心链霉亲和素原液与海藻糖母液混合；
将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，其特征在于：
与所述核心链霉亲和素原液混合的所述海藻糖母的浓度为0.25-5％。
3.根据权利要求1所述的核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，其特征在于：
所述将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母进行冷冻干燥的步骤包括：
将混合在一起的核心链霉亲和素原液与海藻糖母依次进行预冻、升华干燥和解析干燥。
4.根据权利要求1所述的核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，其特征在于：
所述预冻的温度为-50～-20℃，升温时间为30～75min，保持时间为60～300min；
所述升华干燥的温度为-40～25℃，升温时间为20～60min，保持时间为300～1500min，真空度为0～0.5mbar；
所述解析干燥的温度为-20～25℃，升温时间为10～100min，保持时间为120～600min，真空度为0～0.01mbar。
5.根据权利要求1所述的核心链霉亲和素冻干粉的制备方法，其特征在于：
所述预冻的温度为-50～-25℃，升温时间为40～70min，保持时间为160～270min；
所述升华干燥的温度为-15～8℃，升温时间为25～50min，保持时间为1000～1500min，真空度为0～0.5mbar；
所述解析干燥的温度为-10～20℃，升温时间为20～50min，保持时间为240～480min，真空度为0～0.01mbar。
6.一种核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，该方法用于对权利要求1-5中任意一项制备的核心链霉亲和素冻干粉进行检测，其特征在于，包括以下步骤：
对核心链霉亲和素冻干粉进行外观形状检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行复溶时间检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行溶液澄清度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白纯度检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测；
对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测。
7.根据权利要求6所述的核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，其特征在于：
所述对核心链霉亲和素冻干粉进行模拟夏天运输检测的步骤包括：
将核心链霉亲和素冻干粉置于80℃放置9小时，随后置于40℃放置15小时，如此往复，共放置72小时。于第72小时进行检测。
8.根据权利要求6所述的核心链霉亲和素冻干粉的检测方法，其特征在于：
所述对核心链霉亲和素冻干粉进行蛋白活性检测的步骤包括：
用纯水将供试品稀释成1mg/mL，用Green改良法检测核心链霉亲和素的活性。
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