CN105950599A - 猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂，涉及的是生物制品的冻干保存领域。包括如下成分：蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾及浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度分别为18%、6%、0.3%。本发明所选用的冻干保护剂组合物能够减少elysin在冷冻干燥过程中活性降低，可使elysin在冷冻干燥4℃保存7天后维持84.7%的活性；本发明的冻干保护剂组合物使elysin在4℃条件下保存7天，浊度递减实验中elysin的活性维持在84.7%。有效解决elysin不能4℃下不能长期保存，酶活性很快下降的问题。

Description

猪链球菌噬菌体裂解酶的冻干保护剂
技术领域
本发明涉及的是生物制品的冻干保存领域，具体的说是猪链球菌噬菌体裂解酶elysin冻干保护剂及其制备方法。
背景技术
猪链球菌噬菌体裂解酶是一种可以裂解猪链球菌细胞壁的水解酶。Elysin(猪链球菌噬菌体裂解酶，专利申请号：201610021643.3)是通过易错PCR对裂解酶LySMP进行定向突变而获得的对猪链球菌菌株SS2-4裂解活性增强的酶-。但该酶在冷藏或冷冻保存时极容易活力下降，在4℃可保存1周，在-20℃条件下保存期不超过1个月，期间裂解细菌活性也显著下降，这就要求elysin在保存和使用过程中尽可能在低温条件下进行，否则易因保存温度不当或保存时间不长而影响该酶的使用效果。
冷冻干燥是目前保持微生物、动物组织、细胞及蛋白质等活性物质生物活性的一个有效的、普遍的方法。制品经完全冻结,并在一定的真空条件下使冰晶升华,从而达到低温脱水的目的。但干燥过程中容易导致蛋白质失水,使原来与水形成的分子间氢键断开,多肽链展开,造成蛋白质变性而失去生物活性。为防止在冻干过程中蛋白质或细胞的损伤,在冻干过程中常添加糖、蛋白质、氨基酸等物质来起保护作用。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境,减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害,尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性，从而保证蛋白质或细胞在保藏期间的稳定性。常用的冻干保护剂包括多羟基化合物、糖类、氨基酸、聚合物、蛋白质等。多羟基化合物主要包括、甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇等；糖类常用的有蔗糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖等；氨基酸类主要有脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸等；聚合物类有聚乙二醇、明胶等；蛋白质类主要有牛血清白蛋白，此外还有吐温80、普朗尼克、维生素C、山梨酸钾等也可用作冻干保护剂或防腐剂(孙东坡，胡一桥.蛋白质冷冻干燥制品中的保护剂及其保护机制.药学进展，2003，27(4)：201-205)。本发明选用了蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、海藻糖、山梨酸钾、牛血清白蛋白、甘氨酸、明胶、维生素C作为冻干保护剂的候选试剂，通过浊度递减实验和正交设计实验选取了18％蔗糖、6％葡萄糖、0.3％山梨酸钾作为elysin的冻干保护剂，可使elysin在4℃条件下保存7天后，elysin的活性维持在84.7％。有效解决elysin不能4℃下不能长期保存，酶活性很快下降的问题。
对猪链球菌噬菌体裂解酶elysin的冻干保护剂的筛选和应用在国内外均未报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于冷冻干燥的保护剂组合物。
一种用于冷冻干燥的保护剂组合物，包括如下成分：蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾及浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度分别为18％、6％、0.3％。
所述的浓度为50mM，pH为8.0的磷酸钠缓冲液的配方为：NaH2PO4˙12H2O6.78g，Na2HPO4˙2H2O 0.17g，用双蒸馏水定容至1L。
所述的蔗糖的化学性质稳定，对阻止蛋白质二级结构改变、冻干处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。所述的葡萄糖在冻干过程中可部分保持无定型，对某些蛋白质具有一定的保护作用。所述的山梨酸钾是一种常用的防腐剂，其毒性低，能够有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性。在本发明中，三者联用可以显著保持elysin在冻干以后的活性。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述组合物的方法。
本发明提供一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，按照下述步骤进行：将蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾按照质量比18：6：0.3混匀，用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)溶解，即得到冻干保护剂的组合物。
将上述冻干保护剂组合物与所述的猪链球菌噬菌体裂解酶elysin按体积比1：1混合后用于冷冻干燥。
所述的冷冻真空干燥，其条件是：预冻阶段最低温度-50℃，达到最低温度后维持3h。主干燥阶段，将隔板温度升至-20℃--15℃，真空度0.1mba，干燥4-6h，终末干燥阶段，将隔板温度升至15-25℃,真空度0.005mba，保持5-8h。
所述的猪链球菌噬菌体裂解酶elysin是通过对大肠杆菌BL21原核表达的elysin进行纯化后获得(见专利：201610021643.3)，该酶的浓度为0.12-0.35mg/mL。
所述的方法中，冻干保护剂组合物与猪链球菌噬菌体裂解酶elysin混匀后的产物经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
本发明的有益效果
本发明的优点在于：
所选用的冻干保护剂组合物能够减少elysin在冷冻干燥过程中活性降低，可使elysin在冷冻干燥4℃保存7天后维持84.7％的活性；
本发明的冻干保护剂组合物使elysin在4℃条件下保存7天，浊度递减实验中elysin的活性维持在84.7％。有效解决elysin不能4℃下不能长期保存，酶活性很快下降的问题；
本发明的冻干保护剂在有效保护elysin的情况下，配制方法简单、成本较低，可以推广使用。
附图说明
图1为因素与指标关系趋势图，其中ABCD分别为蔗糖、葡萄糖、明胶、山梨酸钾。
具体实施方式
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1冻干保护剂的选择与配制
用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)配制质量浓度为20％蔗糖、20％麦芽糖、6％葡萄糖、20％海藻糖、0.5％山梨酸钾、1％牛血清白蛋白、1％甘氨酸、0.5％明胶缓冲液，摩儿浓度2mmol/L的维生素C缓冲液，以上9种缓冲液用于筛选elysin的冻干保护剂。
将以上9种缓冲液分别与elysin(100μg/ml)等体积混合，作为9组实验组。将未加上述9种缓冲液的elysin(50μg/ml)作为对照组1。在经过冷冻干燥以后，通过对SS2-4的浊度递减试验检测以上9种冻干保护剂对elysin的保护效果，以未经冷冻干燥的elysin(50μg/ml)作为对照组2进行筛选浊度递减度实验。
实施例2浊度递减试验
将猪链球菌SS2-4离心后用PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)调节OD600至1.0-1.2，将其加入96孔板中，每孔100μL；再将实施例1中的9组实验组与对照组1和2取100μL加入有上述猪链球菌SS2-4的96孔板中，每种纯化的裂解酶各做3个重复。37℃反应1h，测定OD600值，筛选可使细菌浊度OD600下降高的实验组试剂作为候选的冻干保护剂。实验结果见表1-1。本发明选取了20％蔗糖、6％葡萄糖、0.5％山梨酸钾和0.5％明胶作为候选的冻干保护剂用于下一步的正交实验设计。
表1-1冻干保护剂对elysin的浊度递减试验结果
冻干保护剂和对照组 初始OD600 1h后OD600 浊度下降百分数％
20％蔗糖 1.105 0.313 71.7
20％麦芽糖 1.098 0.427 61.1
6％葡萄糖 1.116 0.376 66.3
20％海藻糖 1.187 0.409 65.5
0.5％山梨酸钾 1.065 0.487 54.2
1％牛血清白蛋白 1.087 0.509 53.1
1％甘氨酸 1.065 0.539 49.4
0.5％明胶 1.142 0.499 56.3
2mmol/L维生素C 1.078 0.607 43.7
对照组1 1.028 0.846 17.8
对照组2 1.136 0.278 75.5
实施例3不同冻干保护剂的正交试验设计
按照L9(34)正交表安排试验：选取蔗糖、葡萄糖、明胶、山梨酸钾为四因素(因素A、B、C、D),各因素取三水平(水平1、2、3)，见表1-2。用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)与蔗糖、葡萄糖、明胶、山梨酸钾按正交表(表1-3)的设计，配成冻干保护剂组合物，共配制9组。将以上9组冻干保护剂组合物分别与100μg/mL elysin按1：1体积比混合。具体实验步骤，见实施例2，将未加冻干保护剂的50μg/ml elysin作为对照组1。将实验组和对照组1做冷冻干燥处理，再将未进行冷冻干燥50μg/ml elysin作为对照组2。随后，将实验组以及对照组1和对照组2按实施例2进行浊度递减实验，记录实验结果，见表1-4。绘制因素与指标关系趋势图，见图1。通过趋势图获得最优组合为A1B3C1D1，即18％蔗糖、6％葡萄糖、0.3％山梨酸钾可获得最佳保护效果。
表1-2冻干保护剂的正交试验设计
表1-3L9(34)正交设计表
表1-4L9(34)正交表与浊度递减实验结果
K1为水平1的结果之和，K2为水平2的结果之和，K3为水平3的结果之和；
T总和，R为极差。
实施例4冻干保护剂对elysin的4℃保存实验
将加入冻干保护剂组合物的elysin作为实验组、未加冻干保护剂的50μg/mlelysin作为对照组1在冷冻干燥后，放4℃保存7天后取出，用双蒸水融化。将未冻干新鲜的elysin用50mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)调节浓度至50μg/ml，作为对照组2，将实验组以及对照组1和对照组2按实施例2进行浊度递减实验，记录实验结果，见表1-5。
表1-5 4℃保存7天后浊度递减试验结果
初始OD600 1h后OD600 浊度下降百分数％
实验组(冻干) 1.038 0.405 61.0
对照组1(冻干) 1.046 0.679 35.1
对照组2(未冻干) 1.024 0.287 72.0
上表说明，相比未加冻干保护剂的对照组1，实验组在冷冻干燥4℃保存7天后，可使细菌浊度OD600的值下降61.0％，可将elysin的裂解效率保存新鲜状态的84.7％，而未加冻干保护剂的对照组1，可使细菌浊度OD600的值下降35.1％，仅可将elysin的裂解效率保存新鲜状态的48.8％。因此，加入冻干保护剂组合物的elysin在4℃的保存效果好于未加冻干保护剂的elysin，冻干保护剂组合物可应用于elysin的冻干保存，有利于在4℃保存和使用过程中，酶的活力不会显著丧失。

Claims (5)

1.一种用于冷冻干燥的保护剂组合物，其特征在于：包括如下成分：蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾及浓度为50mM， pH为8.0的磷酸钠缓冲液，所述的蔗糖、葡萄糖和山梨酸钾的质量浓度分别为18%、6%、0.3%。
2.根据权利要求1所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物，其特征在于：所述的浓度为50mM， pH为8.0的磷酸钠缓冲液的配方为：NaH2PO4˙12H2O 6.78g，Na2HPO4˙2H2O 0.17g，用双蒸馏水定容至1L。
3.根据权利要求1所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于：
按照下述步骤进行：将蔗糖、葡萄糖、山梨酸钾按照质量比18：6：0.3混匀，用50mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）溶解，即得到冻干保护剂的组合物。
4.根据权利要求3所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于：
将上述冻干保护剂组合物与所述的猪链球菌噬菌体裂解酶elysin按体积比1：1混合后用于冷冻干燥。
5.根据权利要求3所述的一种用于冷冻干燥的保护剂组合物的制备方法，其特征在于：所述的冷冻真空干燥，其条件是：预冻阶段最低温度-50℃，达到最低温度后维持3h；主干燥阶段，将隔板温度升至-20℃- -15℃，真空度0.1mba，干燥4-6h，终末干燥阶段，将隔板温度升至15- 25℃,真空度0.005mba，保持5-8h。
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