KR101863920B1 - 생물학적 물질용 저장 안정화 건조 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 저장시 펩티드, 단백질, 호르몬, 핵산, 항체, 약물 백신, 효모, 박테리아 (프로바이오틱 또는 기타), 바이러스 및/또는 세포 현탁액과 같은 민감한 생물활성 물질을 보존하기 위한 조성물 및 건조 방법을 포함한다. 조성물은 탄수화물 성분 및 유리 강화제 성분을 포함하고, 여기서 탄수화물 성분은 이당류, 올리고당류 및 다당류의 혼합물을 포함하고 유리 강화제는 유기산의 이온 및 단백질 가수분해물을 포함한다. 조성물은 모든 고체 성분들을 용액에 분산시키고 급속-동결시켜 소형 비드, 스트링 또는 점적을 형성함에 의해 제조된다. 동결된 비드, 스트링 또는 점적의 바람직한 건조 방법은 2000 mTORR 미만의 진공압하에 동결된 입자의 짧은 퍼징 및 구조 안정화 단계에 의해 개시되며 2000 mTORR 초과의 진공압하에 요망되는 온도에서 일차 건조 단계가 이어진다. 물질의 이차 및 최종 건조 단계 동안, 충분한 진공압 및 상승된 온도가 적용되어 건조 물질의 최종 요망되는 수분 활성도가 달성된다.

Description

생물학적 물질용 저장 안정화 건조 조성물{DRY STORAGE STABILIZING COMPOSITION FOR BIOLOGICAL MATERIALS}
본 출원은 2010년 8월 13일에 미국 특허상표국에 출원된 미국 가특허출원 61/373,711호의 우선권을 주장하며, 이의 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 유리질 건조 구조에서 생물학적 물질을 안정화시키는 분야에 관한 것이다.
높은 온도 및 습도에서 장기간 저장 동안 생물학적 물질의 구조 및 기능의 보존은 식품, 기능식품, 및 제약 산업에 근본적인 중요성을 갖는다. 단백질, 효소, 세포, 박테리아 및 바이러스와 같은 민감한 생물학적 물질은 종종 추후 사용을 위해 장기간 저장 동안 보존되어야 한다. 건조가 최종 제품에 유해하거나 적합하지 않을 때 단순 냉동이 종종 수행된다. 건조 상태로의 보존을 위해 - 동결-건조가 전통적으로 가장 일반적인 방법이었다. 주위 공기-건조, 주위 온도에서 진공하 건조 (진공-건조), 또는 옅은 연무의 점적을 따뜻한 공기와 접촉시킴에 의한 건조 (분무-건조) 및 말림(desiccation)에 의한 건조와 같은 그 밖의 방법은 일반적으로 살아 있거나 약독화된 박테리아 및 바이러스와 같은 민감한 생물활성물질에 적합하지 않다. 이러한 방법에 사용된 높은 건조 온도는 생물활성물질 자체를 심각하게 손상시킨다.
동결 건조 과정은 느린 건조 과정 동안 얼음 결정의 형성으로 인해 종종 현저한 활성 손실 및 생물활성제에 손상을 초래할 수 있다. 동결-건조는 냉동과 건조 둘 모두로 인한 스트레스를 겸비한다. 이러한 과정의 냉동 단계는 단백질 및 효소의 변성, 및 세포의 파열과 같은 바람직하지 않은 효과를 지닐 수 있다. 냉동에 의해 야기되는 손상은 동결방지 화합물 또는 작용제를 용액에 첨가시킴에 의해 일정 한도로 회피될 수 있다. 그러한 보호제는 일반적으로 냉동 동안 세포막 및 단백질을 보호하고 저장 동안 안정성을 향상시키기 위해 제형에 첨가되는 고도로 용해성인 화학물질이다. 보통의 안정화제는 높은 농도의 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, 또는 소르비톨과 같은 당을 포함한다 (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). 수크로스 및 트레할로스와 같은 이당류는 양호한 보호 성질을 갖는 천연 동결방지제이다. 트레할로스는 가뭄 기간 동안 가사 상태로 유지되는 식물 및 살아 있는 유기체로부터 실제로 단리되기 때문에 특히 관심을 끄는 동결방지제이다. 트레할로스는 다양한 생물학적 물질에 대해 효과적인 보호제인 것으로 밝혀졌다 (참조: Crowe, J. H., 1983). 몇몇 특허는 동결, 건조 및 재수화 동안 효소, 혈청, 혈청 보충물, 항체, 항원, 형광 단백질 및 백신 성분과 같은 단백질 및 그 밖의 생물학적 거대분자를 보호하기 위한 트레할로스 또는 그 밖의 동결방지제와 조합된 트레할로스의 용도를 기재한다 (미국특허 제 5,556,771호).
그러나, 유일한 동결방지제로서 트레할로스 또는 그 밖의 이당류 또는 단당류를 이용하는 것과 관련하여 몇몇 단점이 존재한다. 트레할로스는 세포내 용적내 활성 성분을 보호하기 위해 세포내로 충분히 침투할 수 없어서, 동결-건조된 물질의 저장시 불안정해질 수 있다. 또한, 주어진 보존 매질의 60중량%를 초과하는 트레할로스의 농도가 때로 필요하다. 트레할로스의 사용과 관련된 실로 더욱 심각한 문제는 트레할로스만을 이용하여 보존된 생물학적 물질이 연장된 기간 동안, 특히 높은 온도 및/또는 습도 환경에서 저장된 것들의 경우 저장시 안정하지 않다는 것이다. 따라서, 건조된 물질의 충분한 저장 안정성을 달성하면서 건조 손실을 최소화하는 최적 제형 및 건조 방법을 개발하기 위한 중대한 과제가 남아 있다.
트레할로스 및 동결-건조 과정과 관련된 논쟁들 중 일부는 유리질 상태, 특히 슈가 글라스(sugar glass)에서 특정 제형 및 진공 건조를 조합시켜 이용함에 의해 해소되었다 (미국특허 제 6,190,701호). 그러한 제형에서, 생물활성제는 높은 온도 및 습도와 같은 적대적 환경에 대해 유리질 매트릭스내에서 보호된다. 그러나, 이러한 제형에서, 주위에 습기와 같은 물의 존재는 가소제로서 작용하여 유리질 매트릭스의 유리 전이 온도 (Tg)를 낮추는 효과를 갖는다. 보다 높은 수함량에서, Tg는 건조 제형이 실온에서 요망되지 않는 고무질 또는 플라스틱 상태가 될 정도로 현저하게 낮아진다.
제형의 유리 형태를 유지시키는 이점은 고체의 증가된 물리적 안정성 및 유해한 분자간 반응의 감소를 포함한다. 유리질 상태와 관련된 워터-푸드 폴리머 상호작용의 물리화학 및 이들의 전이 온도의 상세한 논의는 문헌[M. Le Meste, et al. 2002]에서 찾아볼 수 있다. 그러나, 물리적 불안정성 및 높은 화학 반응성과 같은 무정형 시스템의 한계는 그 광범한 상업화에서 장애물로서 작용한다.
따라서, 광범한 범위의 생물학적 물질에 유용한 안정화 조성물에 대한 요구가 존재한다. 동결-건조 과정 및 주위-온도 건조를 포함하는 건조 과정 둘 모두에 효과적으로 이용될 수 있는 안정화 조성물에 대한 요구가 또한 존재한다. 현재 사용되고 있는 것보다 덜 비싼 조성물 혼합물에 대한 요구 또한 존재한다. 마지막으로, 그리고 중요하게도, 재수화시 현저한 정도의 활성을 여전히 유지하면서, 물질의 선적 및 저장 동안 마주칠 수 있는 상승된 온도 및 다양한 정도의 습도에서 장기간에 걸쳐 생물학적 물질을 보존하기 위한 안정한 매질을 제공하는 조성물 혼합물에 대한 요구가 존재한다.
이러한 모든 요구는 본 발명의 조성물 혼합물, 건조 방법 및 그로 인한 보존된 생물학적 물질 조성물에 의해 충족된다.
본 발명은 저장시 펩티드, 단백질, 호르몬, 핵산, 항체, 약물 백신, 효모, 박테리아 (프로바이오틱 또는 기타), 바이러스 및/또는 세포 현탁액과 같은 민감한 생물활성 물질을 보존하기 위한 조성물 및 건조 방법을 포함한다.
본 발명의 조성물은 이당류, 올리고당류 및 다당류의 탄수화물 혼합물 및 유기산, 바람직하게는 시트르산 및/또는 아스코르브산의 이온을 포함한다. 상기 제형은 모든 고체 성분들을 용액에 분산시킴에 의해 제조된다. 용액은 소형 비드, 스트링 또는 점적을 형성하기 위한 액체 질소 또는 드라이 아이스와 같은 당 분야에 공지된 수단에 의해 급속-동결(snap-frozen)된다. 동결된 비드를 이후 이용을 위해 딥-프리저 (-30℃ 내지 -80℃)에 동결된 상태로 저장하거나 통상적인 냉동 건조기에서의 건조를 위해 동결된 상태로 트레이에 놓을 수 있다. 바람직한 건조 방법은 임의로 2000 mTORR 미만의 진공압하에 동결된 입자의 짧은 퍼징 및 구조 안정화 단계에 의해 개시되며 2000 mTORR 초과의 진공압하에 요망되는 온도에서 일차 건조 단계가 이어진다. 물질의 이차 및 최종 건조 단계 동안 충분한 진공압 및 상승된 온도를 적용시켜 건조 물질의 요망되는 최종 수분 활성도를 달성한다.
특정 일 구체예에서, 생물학적 물질은 살아 있는 박테리아 (예컨대, 프로바이오틱 박테리아)를 포함한다. 적합한 미생물의 예는 비제한적으로 사카로마이세스(Saccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 캔디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)와 같은 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실리움(Penicillium) 및 토룰롭시스(Torulopsis)와 같은 곰팡이, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 코쿠리오(Kocuriaw), 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 펩토스트레포코쿠스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 바이스엘라(Weissella), 에어로코쿠스(Aerococcus), 에노코쿠스(Oenococcus) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속과 같은 박테리아를 포함한다. 적합한 프로바이오틱 미생물의 특수한 예는 하기 종에 의해 표시될 것이고 그러한 종내에서 모든 배양 생물형을 포함한다: 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), A. 오리자에(A. oryzae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), B. 렌투스(B. lentus), B. 리체니포르미스(B. licheniformis), B. 메센테리쿠스(B. mesentericus), B. 푸밀루스(B. pumilus), B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 나토(B. natto), 박테로이데스 아밀로필루스(Bacteroides amylophilus), Bac. 카필로수스(Bac . capillosus), Bac. 루미노콜라(Bac . ruminocola), Bac. 수이스(Bac . suis), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), B. 아니말리스(B. animalis), B. 브레베(B. breve), B. 비피둠(B. bifidum), B. 인펀티스(B. infantis), B. 락티스(B. lactis), B. 롱굼(B. longum), B. 슈도롱굼(B. pseudolongum), B. 써모필룸(B. thermophilum), 캔디다 핀토레페시이(Candida pintolepesii), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 엔테로코쿠스 크레모리스(Enterococcus cremoris), E. 디아세티락티스(E. diacetylactis), E. 파에시움(E. faecium), E. 인터메디우스(E. intermedius), E. 락티스(E. lactis), E. 문트디(E. muntdi), E. 써모필루스(E. thermophilus), 에스체리티아 콜라이(Escherichia coli), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), L. 알리멘타리우스(L. alimentarius), L. 아밀로보루스(L. amylovorus), L. 크리스파투스(L. crispatus), L. 브레비스(L. brevis), L. 카세(L. case) 4 L. 쿠르바투스(L. curvatus), L. 셀로비오수스(L. cellobiosus), L. 델브루엑키이(L. delbrueckii) ss. 불가리쿠스(ss . bulgaricus), L. 파르시미니스(L. farciminis), L. 페르멘툼(L. fermentum), L. 가세리(L. gasseri), L. 헬베티쿠스(L. helveticus), L. 락티스(L. lactis), L. 플란타룸(L. plantarum), L. 존스니이(L. johnsonii), L. 류테리(L. reuteri), L. 람노수스(L. rhamnosus), L. 사케이(L. sakei), L. 살리바리우스(L. salivarius), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), P. 세레비세아에(P. cereviseae) (damnosus), 페디오코쿠스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), P. 펜토사세우스(P. pentosaceus), 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이(Propionibacterium freudenreichii), Prop, 세르마니이(Prop . shermanii), 사카로마이세스 세리비세아에(Saccharomyces cereviseae), 스태필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 스타프(Staph), 자일로수스(xylosus), 스트렙토코쿠스 인펀타리우스(Streptococcus infantarius), Strep, 살리바리우스(Strep . salivarius) ss. 써모필루스(thermophilus), Strep. 써모필루스(Strep . Thermophilus) 및 Strep, 락티스(Strep . lactis).
일 구체예에서, 상기 제형은 생물활성 물질이 임베딩된 이당류, 올리고당류 및 다당류의 탄수화물 혼합물을 포함한다. 적합한 다당류의 예는 비제한적으로 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 펙틴, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 메틸 셀룰로스, 카라기난, 젤란검, 구아검, 검 아카시아, 잔탄검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분 및 변성 전분(modified strach)을 포함한다. 적합한 올리고당류의 예는 비제한적으로 시클로덱스트린, 이눌린, FOS, 말토덱스트린, 덱스트란 등; 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 이당류의 예는 비제한적으로 락토스, 트레할로스, 수크로스 등을 포함한다. 특정 일 구체예에서, 바람직한 다당류는 소듐 알기네이트 또는 젤란검이다. 바람직하게는, 탄수화물 혼합물은 총 건조 질량의 중량%로 0.1-10%의 다당류, 1-10%의 올리고당류 및 10-90%의 이당류를 포함한다. 추가 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 이당류, 올리고당류 및 다당류를 10:0.1-4:0.1-2의 중량 비로 포함하고, 보다 바람직하게는 이당류/올리고당류/다당류의 중량 비가 약 10:0.2:0.1 내지 약 10:2:1이다.
본 발명의 여전히 또 다른 구체예에서, 탄수화물 혼합물 중 다당류는 이가 금속 이온과 가교되어 단단한 하이드로겔을 형성한다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산 등과 같은 유기산의 염을 포함하는 상당량의 유리 강화 화합물을 포함한다. 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등과 같은 양이온을 포함할 수 있다. 예는 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 소듐 말레에이트, 마그네슘 글루코네이트, 소듐 아스코르베이트 등을 포함한다. 높은 유리 전이 온도 (Tg) 및 높은 용해성을 갖는 염이 바람직하다. 가장 바람직한 유기산은 시트르산 및 이의 염 (예컨대, 소듐 또는 포타슘 시트레이트, 트리소듐 시트레이트 탈수화물) 및 아스코르브산 및 이의 염 (예컨대, 소듐 아스코르베이트, 포타슘 아스코르베이트, 마그네슘 아스코르베이트)이다. 건조 조성물 중 시트레이트 또는 아스코르베이트 이온의 바람직한 총 양은 탄수화물 화합물의 몰에 대한 이온의 몰 비가 약 0.01 내지 약 0.3, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.2가 되게 하는 양이다.
그 밖의 유용한 유리 강화제는 단백질, 단백질 가수분해물, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 이들은 젤라틴, 알부민, 유청(whey) 단백질, 대두 단백질, 카세인, 카세이네이트, 면역글로불린, 대두 단백질, 완두 단백질, 목화씨 단백질 또는 그 밖의 식품 및 낙농 또는 식물성 단백질 및/또는 이들의 가수분해물을 포함한다. 폴리아미노산의 예는 폴리알라닌, 폴리아르기닌, 폴리글리신, 폴리글루탐산 등을 포함한다. 유용한 아미노산은 리신, 글리신, 알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘뿐 아니라 소수성 아미노산 (트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등) 및 베타인과 같은 메틸아민을 포함한다. 건조 조성물에서 단백질, 단백질 가수분해물 및 아미노산의 바람직한 총 양은 탄수화물 혼합물의 총 질량의 약 1% 내지 약 30%이고, 가장 바람직하게는 탄수화물 질량의 약 5% 내지 약 20%이다. 이상적으로는, 일반적으로 안전한 것으로 인정되는 (GRAS) 화합물이 GRAS가 아닌 것들에 비해 바람직하다.
조성물 중 유리 강화제의 적절한 양은 건조 조성물의 요망되는 특징에 의존할 수 있음이 주목되어야 한다. 유리 강화제의 적절한 양은 요망되는 저장 조건에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 탄수화물 혼합물 및 단백질 또는 단백질 가수분해물을 함유하는 조성물을 이용하여 25℃ 및 25% RH와 같은 온건한 온도 및 상대 습도하에 저장하면서 생물학적 물질의 화학적 안정성을 향상시킬 수 있다. 시트레이트 이온은 보다 높은 온도 및 습도 노출시 부가된 안정화 이익을 달성하도록 유리 강화제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 이것은 단백질 또는 단백질 가수분해물과 같은 또 다른 유리 강화제를 갖는 시트레이트 및/또는 아스코르베이트 이온의 조합물이 조성물을 구성하는 것이 더욱 바람직한 경우일 수 있다.
생물학적 물질 및 조성물의 바람직한 혼합 공정은 총 건조 조성물 혼합물을 생물학적 물질을 함유하는 농축 배양물 또는 배지 용액에서 첨가시킴에 의해 수행된다. 배양 배지에서 생물학적 물질의 무게 질량은 전형적으로 약 5% 내지 30% w/v, 보다 바람직하게는 약 10% 내지 20% w/v이다. 배양 배지 중 조성물 혼합물의 부가된 무게 질량은 전형적으로 약 10% 내지 약 60%, 보다 바람직하게는 약 20% 내지 40%이다. 혼합된 슬러리에서 최종 고체 함량은 약 20% 내지 약 60%이고, 보다 특히 약 30% 내지 약 50%이다. 바람직하게는, 용액은 실온에서 혼합되거나 다소 가온되어 점성 용액에서 물질의 용해를 돕는다 (예컨대, 20℃ 내지 40℃). 본 발명의 변형에서, 제형 중 탄수화물 혼합물의 총 양은 건조 단계 동안 일어날 수 있는 고무질 형성 또는 과도한 발포를 피하면서 효율적 건조가 가능하도록 하는 요망되는 제형 점도 및 밀도를 달성하도록 조정된다. 바람직한 슬러리 점도는 약 1,000 cP 내지 약 500,000 cP이고, 가장 바람직한 범위는 약 10,000 cP 내지 약 300,000 cP이다. 최종 슬러리의 요망되는 점도 및 밀도는, 예를 들어 탄수화물 혼합물 중 다당류의 양을 약간 조정하는 당 분야에 공지된 어떠한 수단 또는 공기, 질소, 이산화탄소, 아르곤 등과 같은 가스를 탈기시키거나 주입시킴에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 생물학적 물질 슬러리는 전형적으로 -30℃ 내지 -180℃로 급속-동결되고, 보다 바람직하게는 제형이 액체 질소에서 아토마이징, 적하 또는 액체 질소조로의 주입에 의해 급속-동결된다. 액체 질소조로부터 입자, 비드, 스트링 또는 점적을 수집하고 냉동 건조기 또는 진공 건조기에서 건조시키거나, 대안적으로 이들을 동결된 형태로 추후 이용을 위해 또는 건조시까지 딥 프리저(-30℃ 내지 -80℃)에 저장한다.
일반적으로, 유용한 건조 공정 기법은 분무 건조; 동결건조 후 제분시켜 분말을 미분화; 냉 표면 상에 아토마이징 후 미분된 분말의 승화 및 수집; 슬러리의 동결 온도 이상의 온도(-20 내지 50℃)로 진공 오븐 또는 원심분리 증발기에서 비동결 용액의 증발 건조 후 요망되는 입자 크기로 제분시키는 것을 포함한다. 생성된 분말 입자는 표면 상에 대부분 유리질 물질 코팅을 갖는 내부적으로 유리질 또는 결정질이다. 생물학적 물질을 유리질 물질로 코팅하는 이점은 생성물의 물리적 안정성을 증가시키고 입자내에서 유해한 분자간 반응을 감소시키는 것이다. 바람직한 구체예에서, 동결된 입자는 트레이에 로딩된 즉시 진공 건조 챔버로 옮겨지는데, 여기서 건조 공정은 하기를 포함하는 3개의 주요 단계로 진행된다: (1) 2000 mTORR 미만의 진공압하에 동결된 입자의 임의의 짧은 퍼징 및 구조 안정화 단계, (2) 2000 mTORR 초과의 진공압하에 슬러리의 동결점 이상의 온도에서 일차 건조 단계, 및 (3) 건조된 제형의 수분 활성도를 0.3 Aw 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안 충분한 진공압하에 상승된 온도에서 유리질 무정형 물질의 이차 및 최종 건조 단계.
건조된 안정한 생물학적 조성물을 박편으로서 직접 이용할 수 있거나, 분말로 분쇄하고 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 평균 입자 크기로 시빙(sieving)할 수 있다. 제형은 농축 분말, 재구성된 액체 (예컨대, 음료)로서 인간을 포함하는 동물에게 직접 투여될 수 있거나, 박편, 캡슐 또는 분말 형태로 현존하는 식품 또는 사료 제품에 혼입될 수 있다.
본 발명의 상기 및 그 밖의 이점 및 특징은 이어지는 바람직한 구체예의 상세한 설명에서 보다 충분히 설명될 것이다.
도 1은 시판되는 프로바이오틱 박테리아 및 본 발명의 건조 조성물 중 프로바이오틱 박테리아의 가속 안정성을 도시한다.
도 2는 가속화된 저장 조건하에 (37℃ 및 33%RH) 프로바이오틱 안정성 (L. 파라카세이)에 대한 조성물 중 유리 강화제 및 탄수화물 혼합물간의 다양한 몰 비의 효과를 도시한다.
도 3은 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 저장 안정성에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 도시한다. 건조 프로바이오틱 박테리아의 안정성을 24℃ 및 33%RH에서 537일 동안의 가속화된 저장 조건에서 시험하였다.
도 4는 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 저장 안정성에 대한 다양한 유리 강화제 화합물의 효과를 도시한다. 건조 프로바이오틱 박테리아의 안정성을 24℃ 및 43%RH에서 180일 동안의 가속화된 저장 조건에서 시험하였다.
도 5는 프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스의 저장 안정성 (35℃ 및 43%RH)에 대한 다양한 단백질 가수분해물/당 비의 효과를 도시한다.
도 6은 프로바이오틱 L. 람노수스 (40℃ 및 33%RH에서 8주간의 가속화 저장 조건)의 최대 안정성에 대한 pH 최적화를 도시한다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기재할 목적이며, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"은 유일한 단백질 또는 두 개 이상의 단백질의 조합물을 포함하고; "효소", "박테리아" 등에 대한 언급은 유일한 유형 또는 여러 유형의 혼합물 등을 포함한다.
본 발명을 기재하고 청구함에 있어서, 다음 용어는 하기에 개시된 정의에 따라 이용될 것이다.
"생물학적 물질", "생물학적 조성물" 또는 "생물활성 제형"은 생물활성 성분 또는 작용제의 생물학적 활성을 명료하게 효과적이게 하는 그러한 형태의 제조물을 지칭한다.
"유리 강화제"는 임계 온도, 즉 유리 전이 온도 (Tg) 아래에서 무정형 또는 유리질 구조를 형성하는 능력을 갖는 화학적 화합물이다. 유리 강화제가 그 Tg보다 낮은 온도에서 건조되는 경우, 유리가 형성될 것이다. 그러나, 유리 강화제가 그 Tg보다 높은 온도에서 건조되는 경우, 유리는 형성되지 않는다. 유리질 구조의 형성 동안, 생물학적 물질은 유리 구조내에 임베딩될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 유리 강화제는 비제한적으로 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트 등과 같은 양이온을 포함할 수 있다. 그 밖의 유용한 유리 강화제는 단백질, 단백질 가수분해물, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 유리 형성제의 조합물이 또한 단일 조성물 내에서 고려된다. 본 발명을 위한 유리질 구조를 수득하는데 사용되는 공정은 일반적으로 용매 승화 및/또는 증발 기법이다. 이상적으로는, GRAS 화합물인 화합물이 GRAS가 아닌 것들에 비해 바람직하다.
"탄수화물" 또는 "폴리히드록시 화합물"은 탄소, 수소 및 산소를 주로 포함하는 당류를 지칭한다. 당류는 전형적으로 선형 또는 비선형 양상의 결합된 반복 구조 단위의 당 백본을 포함하고, 이들 중 일부는 양 또는 음으로 하전된 화학기를 함유한다. 반복 단위는 2백만 내지 수 백만개의 범위일 수 있다. 유용한 당류는 환원당 및 비환원당 그리고 당 알코올, 이당류, 올리고당류, 수용성 다당류 및 이들의 유도체를 포함한다. 함께 결합된 두 개의 단당류가 이당류를 형성한다. 이당류를 형성하는데 사용된 두 개의 단당류는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 탄수화물 혼합물에 사용될 수 있는 이당류의 예는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스, 이소말토스를 포함한다. 황산화된 이당류를 또한 사용할 수 있다. 함께 결합된 소수의 단당류 (전형적으로 3개 내지 10개)는 올리고당류를 형성한다. 올리고당류를 형성하는데 사용된 단당류는 동일하거나 상이한 성분 당일 수 있다. 사용하기 적합한 올리고당류의 예는 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프럭토-올리고당류 (FOS), 갈락토-올리고당류 (GOS), 만난-올리고당류 (MOS) 및 이들의 조합물을 포함한다. 함께 결합된 다수의 단당류 (전형적으로 10개 초과)는 다당류를 형성한다. 다당류를 형성하는데 사용된 단당류는 동일하거나 상이한 성분 당일 수 있다. 사용하기 적합한 다당류의 예는 비제한적으로 메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 및 하이프로멜로스; 용해성 전분 또는 전분 분획, 잔탄검, 구아검, 펙틴, 카라기난, 갈락토만난, 젤란검 및 이들의 어떠한 유도체, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 검 아카시아, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분 및 변성 전분 및 시클로덱스트린을 포함한다.
"안정한" 제형 또는 조성물은 그 안에 있는 생물학적으로 활성인 물질이 저장시에 그 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지시키는 것이다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도 및 습도 조건에서 측정될 수 있다. 경향 분석을 이용하여 물질이 실제로 그 기간 동안 저장되기 전에 예상 저장 수명을 예측할 수 있다. 살아 있는 박테리아의 경우, 예를 들어, 안정성은 온도, 습도 및 기간의 소정의 조건하에 건조 제형 1 g 당 1 log의 CFU를 잃는데 걸리는 시간으로서 정의된다.
박테리아와 관련된 "생존력"은 박테리아의 성장에 적합한 영양 배지 상에 집락 (CFU 또는 집락 형성 단위)을 형성하는 능력을 지칭한다. 바이러스와 관련된 생존력은 적합한 숙주 세포에 감염 및 재생되어 숙주 세포의 론(lawn) 상에 플라크를 형성시키는 능력을 지칭한다.
"주위" 실온 또는 조건은 주어진 환경에서의 어떠한 주어진 시간에서의 것들이다. 전형적으로, 주위 실온은 22-25℃이고, 주위 대기압 및 주위 습도는 용이하게 측정되며 연중 시기, 날씨 및 기후 조건, 고도 등에 따라 달라질 것이다.
건조된 제형 조성물에 관해 "수분 활성도" 또는 "Aw"는 물의 이용도를 지칭하고 시스템에서 물의 에너지 상태를 나타낸다. 이것은 샘플 위의 수증기압을 동일한 온도에서 순수한 물의 증기압으로 나눈 것으로서 정의된다. 순수한 증류수는 정확히 1 또는 Aw=1.0의 수분 활성도를 갖는다.
저장 안정성에 관해 "상대 습도" 또는 "RH"는 주어진 온도에서 공기 중 수증기량을 지칭한다. 상대 습도는 일반적으로 공기를 포화시키는데 요구되는 것보다 낮으며 포화 습도의 백분율로 표시된다.
"건조" 및 이의 변형은 탈수화되거나 무수인 물리적 상태, 즉 실질적으로 액체가 없는 물리적 상태를 지칭한다. 건조는, 예를 들어, 분무 건조, 유동화층 건조, 동결건조, 및 진공 건조를 포함한다.
"동결건조" 또는 냉동 건조는 신속한 동결 및 동결된 상태에서 탈수화 (때로 승화로서 지칭됨)에 의해 건조 형태의 조성물을 제조하는 것을 지칭한다. 동결건조는 폴리머의 결정화를 유도하는 온도에서 일어난다. 이러한 공정은 동결된 생성물이 유지되기에 충분한 압력, 바람직하게는 약 2000 mTORR 미만의 압력에서 진공하에 일어날 수 있다.
본원에 기재된 공정들과 관련하여 "일차 건조" 또는 "액체 건조"는 동결된 입자가 해동되는 시점으로부터 이차 건조가 시작되는 시점까지 걸리는 탈수화 건조를 지칭한다. 전형적으로, 일차 건조의 벌크는 광범한 증발에 의해 일어나는 한편, 생성물 온도는 열원의 온도보다 현저히 낮게 유지된다. 이러한 공정은 해동된 생성물이 유지되기에 충분한 압력, 바람직하게는 약 2000 mTORR 초과의 압력에서 진공하에 일어날 수 있다.
본원에 기재된 공정들과 관련하여 "이차 건조"는 제형의 동결 온도보다 높고 열원의 온도에 근접한 온도에서 일어나는 건조 단계를 지칭한다. 이러한 공정은 제형의 수분 활성도를 감소시키기에 충분한 압력, 바람직하게는 약 1000 mTORR 미만의 압력에서 진공하에 일어날 수 있다. 전형적인 제형 건조 공정에서, 이차 건조 단계는 제형의 수분 활성도를 0.3 또는 그 미만의 Aw로 감소시킨다.
본 발명의 조성물 및 건조 방법은 펩티드, 단백질, 호르몬, 핵산, 항체, 약물, 백신, 효모, 박테리아, 바이러스 및/또는 세포 현탁액과 같은 민감한 생물활성 물질을 함유하는, 건조 상태로 현저하게 연장된 수명을 갖는 비용 효과적이고 산업적으로 확대될 수 있는 동결된 제형 또는 건조 제형을 제공하고자 하는 문제를 해소한다. 본 발명은 고도로 용해성인 화합물의 무정형 유리질 구조로 둘러싸인 생물학적 물질을 포함하는 보존 조성물 및 건조 방법을 제공한다. 동결 및 건조 과정은 액체 슬러리에 생물학적 물질 및 조성물을 혼합시키고, 상기 조성물 슬러리를 액체 질소에서 급속-동결시켜 점적, 스트링 또는 비드를 형성하고, 동결된 입자를 고진공하에 퍼징시킨 후 조성물에 열을 가하면서 감압의 지배하에 수분을 증발시킴에 의해 생물활성 물질을 당 유리 구성으로 건조시키는 것을 포함한다.
본 발명은 실질적인 활성을 유지하면서 생물학적 물질이 유리질 구조에서 보호될 수 있다는 현저한 발견에 기반한다. 생물학적 물질이 조성물 혼합물과 조합되고 본 발명에 따라 진공 건조될 때, 가혹한 온도 및 습도 조건으로의 장기 노출 동안 양호한 안정성이 달성되었다. 본 발명은 생물학적 물질, 용해성 탄수화물들의 혼합물 및 유리 강화 카르복실산 염을 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 그 물리적 구조 및 기능에 있어서 전형적인 건조 공정하에 간단히 건조된 비점성 또는 농축된 당 조성물과 본질적으로 상이하다. 예를 들어, 미국특허 6,919,172호는 다양한 탄수화물 및 소듐 시트레이트의 혼합물을 함유하는, 폐 투여용 에어로졸화 분말 조성물을 기재하고 있다. 그러나, 상기 특허에 기재된 조성물에는 고농도의 당을 지니는 용액의 건조 동안 요망되는 물리적 구조의 형성과 부가 안정성에 필수적인 추가의 단백질성 화합물이 없다. 상기 특허에 기재된 조성물은 또한 개선된 유리 형성을 위해 해동되거나 동결되지 않은 용액의 효율적인 건조를 가능하게 하는 점도 또는 하이드로겔 구조가 부족하다. 대조적으로, 본 발명의 조성물 및 건조 방법은 생물학적 물질의 양호한 안정성을 달성하는 한편 이러한 모든 문제를 해소한다.
개선된 유리질 구조는 일반적으로 효과적인 건조를 촉진하기 위해 진공하에 용액을 발포시키거나 비등시킴에 의해 종래 분야에서 달성되었다. 발포 단계는 일반적으로 동결되지 않은 용액의 불가피한 건조 결과로서 용액의 광범한 비등 및 폭발을 초래하고, 이에 따라 바이알 또는 용기에서 용액의 매우 낮은 로딩 용량만이 달성될 수 있다 (참조: 예를 들어 미국특허 6,534,087호, 여기서 최종 발포 생성물의 두께는 2 mm 미만이다). 본 발명의 조성물 및 건조 방법은 제형의 비등 및 발포를 피하므로 건조 면적 당 물질을 훨씬 많이 로딩할 수 있고, 결과적으로 구체적으로 설계된 용기 및 트레이 또는 장비를 이용하지 않고도, 다량의 물질 생산으로 용이하게 확대될 수 있다.
본 발명의 수성 보존 배지를 형성하기 위해 광범한 범위의 생물학적 물질을 본 발명의 조성물에 이용할 수 있다. 이러한 보존 배지는 그 후 생물학적 물질의 안정한 건조 분말을 제조하기 위해 본 발명의 건조 방법으로 처리될 수 있다. 이러한 생물학적 물질은 비제한적으로 효소, 예컨대 췌장 효소, 리파제, 아밀라제, 프로테아제, 피타제, 락테이트 데하이드로게나제; 단백질, 예컨대 인슐린; 백신; 바이러스, 예컨대 아데노바이러스; 원핵생물 세포 (박테리아 포함) 및 진핵생물 세포를 포함하는 세포, 약물, 핵산, 및 지질 소포체를 포함하는 그 밖의 생물학적 물질을 포함한다.
프로바이오틱 박테리아가 본 발명의 조성물 및 건조 방법에서 특히 유리한 것으로 나타났다. 안정한 건조 프로바이오틱 분말은, 프로바이오틱 박테리아의 신선하거나, 동결되거나 건조된 배양물을 탄수화물 및 유리 강화 화합물과 혼합시키고, 점성 제형을 액체 질소에서 급속-동결시켜 동결된 고체 점적, 스트링 또는 비드를 형성하고, 동결된 입자의 구조를 퍼징하고 안정화시키기에 충분한 진공압을 먼저 가하여 진공 건조시키고, 제형 온도를 동결 온도 이상으로 증가시키고 20℃ 이상의 열원을 공급하여 일차 물 제거를 촉진시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 제조된다. 제형의 온도를 동결 온도 이상으로 유지시키는 것은 진공압을 조정하고 제형으로의 열의 전도에 의해 달성될 수 있다. 건조 과정을 완료하고 제형의 수분 활성도를 0.3 이하의 Aw 밑으로 추가로 감소시키기 위해, 최대 진공압에서 70℃ 이하의 상승된 온도로 이차 건조 단계를 적용시킨다. 그러한 조성물은 40℃ 및 33%RH에서 60일 이상과 같은 가혹한 저장 조건에서도 안정을 유지할 수 있다.
조성물의 제조
본 발명에 따른 생물학적 물질의 동결되거나 건조된 안정한 분말을 제조하기 위한 조성물은 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 포함한다. 그러한 물질은 바람직한 생물활성 물질과 혼합시 액체 질소에서 비드, 스트링 또는 점적을 형성하고 본 발명의 방법에 따라 무정형 유리질 구조에서 효율적으로 건조될 수 있어서 상기 생물활성 물질의 저장 및 투여를 위한 다량의 안정한 건조 조성물을 제공한다 (참조: 도 1 - 건조 후 상이한 제형의 물리적 관찰 및 수분 활성도 (Aw)에 대한 것임). 탄수화물 혼합물은 제형에 구조적 안정성 및/또는 생물활성 물질에 물리적 및 화학적 보호 이익을 제공하고 재구성 또는 재수화시 역효과를 예방하거나 감소시킨다.
탄수화물 혼합물 중 다당류 분획은 제형에 점도 증점성 및 진공압하에 제형 밀도 특성에 관해 양호한 제어성 및 본 발명의 건조된 제형 조성물에 증가된 구조적 강도를 제공할 수 있다. 특히 살아 있는 유기체를 위한 바람직한 다당류는 수용성 검인데, 그 이유는 온건한 온도에서 점성 겔을 형성하는 이들의 독특한 특징 때문이다. 특정 농도의 검은 또한, 적절한 점도 및 밀도를 제형에 제공하여 특정 점도에서의 일차 액체 건조 단계 동안 제형을 효과적으로 건조시킴에 의해, 진공하 제형 구조를 효과적으로 안정화시키는 것으로 나타났다. 특정 검은 또한 이가 또는 다가 양이온 (예컨대, 알기네이트, 펙틴, 키토산)과 가교되거나 온도 또는 pH 변화 (예컨대, 젤라틴, CMC, CAP, 젤란검)에 의해 하이드로겔을 형성할 수 있다. 하이드로겔화된 용액은 동결되지 않은 용액의 진공 건조와 관련된 문제를 회피할 것이다.
탄수화물 혼합물 중 이당류 분획은 다양한 당 및 당 알코올을 포함한다. 바람직한 이당류는 동결 온도 (예컨대, -20℃ 미만)에서 물 제거 동안 제형 중 생물학적으로 활성인 물질을 결정화 및/또는 손상 또는 탈안정화시키지 않는 것이다. 예를 들어, 생물활성 물질은 건조 공정을 통틀어 분자 구조의 보유를 촉진하고 건조 상태의 무정형 매트릭스에 구조적 강성을 부여하기 위해 수크로스, 락토스 또는 트레할로스와 같은 유리 형성 당에 물리적으로 임베딩될 수 있다. 적합한 이당류는 건조 동안 수화 손실된 물을 효과적으로 대체하여 세포막의 손상 및 효소의 변성을 막을 것이다 (참조: Crowe et al., 1998 검토됨). 조성물 중 이당류의 그 밖의 기능은 파괴적인 광, 산소, 산화제 및 습기로의 노출로부터 생물활성 물질을 보호하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 이당류는 용액에 용이하게 용해되어야 한다. 트레할로스는 특히 매력적인 보호제인데, 그 이유는 이것이 가뭄 기간 동안 가사 상태로 유지되는 식물 및 살아 있는 유기체 (예컨대, 박테리아, 균류 및 곤충 및 선충류와 같은 무척추동물)에서 발견되는 비환원 이당류이기 때문이다. 트레할로스는 단백질 및 효소, 혈청, 항체, 항원 및 백신 조성물과 같은 그 밖의 생물학적 거대분자를 포함하는 다양한 생물학적 물질에 대한 효과적인 보호제인 것으로 밝혀졌다 (Sanchez et al, 1999, Intl. J. Pharm. 185, 255-266; Esquisabel et al, 1997, J. Microencapsulation, 14, 627-638). 일부 경우에, 결정 혈성을 막고, 연장된 기간 동안 저장 조건에서 건조된 생물활성 물질 제형의 안정성을 개선시키고, 비용을 낮추기 위해 트레할로스 및 수크로스의 혼합물과 같이 두 개 이상의 상이한 이당류를 포함하는 것이 이로울 수 있다.
탄수화물 혼합물 중 올리고당류 분획은 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프럭토-올리고당류 (FOS), 갈락토-올리고당류 (GOS), 만난-올리고당류 (MOS) 및 이들의 조합물을 포함한다. 올리고당류는 보존된 다양한 생물학적 물질에 대한 보호제로서 트레할로스만을 이용하는 것과 관련된 여러 문제를 완화시킨다. 탈수화 및 재수화 동안 생물학적 물질을 보호함에 있어서 매우 효과적일지라도, 안정화제로서 단독의 트레할로스는 연장된 기간 동안, 특히 높은 온도 및/또는 습도 환경에서 바람직한 저장 안정성을 제공하지 못한다. 올리고당류, 바람직하게는 이눌린을 탄수화물 혼합물에 첨가시킴에 의해 본 발명에서 이러한 문제를 해결하였다.
탄수화물 혼합물 중 당류들의 바람직한 질량 비는 10:0.1-4:0.1-2의 이당류/올리고당류/다당류이고, 더욱 바람직하게는, 이당류/올리고당류/다당류의 중량 비가 약 10:0.2:0.1 내지 약 10:2:1이다. 바람직하게는, 탄수화물 혼합물은 총 건조 질량의 중량%로 10-90%의 이당류, 1-10%의 올리고당류 및 0.1-10%의 다당류를 포함한다.
본 발명의 유리 구조 강화제는 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 완충 염, 포스페이트 완충제 등과 같은 양이온을 포함할 수 있다. 예는 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 소듐 말레에이트, 마그네슘 글루코네이트, 소듐 아스코르베이트, 포타슘 아스코르베이트, 포스페이트 완충염 등을 포함한다. 일반적으로, 다가 음이온은 일가 양이온보다 높은 Tg를 갖는 유리를 보다 용이하게 형성한다. 바람직한 음이온은 높은 Tg 및 충분한 용해성을 지녀서 결정화를 억제하므로 강한 유리질 구조를 형성할 것이다. 일부 경우에, 유기염의 혼합물이 유용할 수 있다 (예컨대, 소듐 시트레이트 및 소듐 아스코르베이트). 소듐 시트레이트는 당 분자의 히드록시기와 상호작용하고 그 카르복실기를 통해 결합을 형성하는 것으로 나타났고, 그 결과 유리화 수크로스의 유리 전이 온도가 극적으로 증가한다 (Kets et al., 2004. Citrate increases glass transition temperature of vitrified sucrose preparations Cryobiology, 48:46-54). 소듐 시트레이트는 GRAS로서 확인된 일반적인 식품 첨가제이다 (21 CFR 184.1751 - 소듐 시트레이트). 조성물 중 소듐 시트레이트의 추가 기능은 동결-건조된 단백질의 변성을 초래할 수 있는, 그 완충 용량 및 동결 동안 액체 배지의 pH에서의 격렬한 변화를 예방하는 것과 관련된다.
안정성을 추가로 증가시키기 위해 조성물에 포함되는 그 밖의 적합한 유리 강화제는 단백질, 단백질 가수분해물, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 카세인 또는 완두, 더욱 바람직하게는 가수분해된 카세인 또는 가수분해된 완두 단백질이 이용된다. "가수분해된 단백질"은 부분적으로 또는 전체적으로 산 또는 효소 가수분해되어 분자량이 약 1 kDa 내지 약 50 kDa인 가수분해된 단백질을 제공하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 단백질 기질의 적어도 20%가 분자 질량이 200 내지 2000 돌턴인 펩티드로 전환된다. 가수분해된 단백질은 완전한 단백질과 대략 동일한 아미노산 조성을 지니고 어떠한 수의 시판원으로부터 수득될 수 있다. 저자극성인 경우, 가수분해된 단백질은 유아 및 노인과 같은 과민한 소비자를 위한 특정 식품에 유리하게 사용될 수 있다.
조성물에 사용된 유리 강화제의 양은 전체적인 조성 및 그 의도하는 건조 저장 조건에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 총 탄수화물에 대한 유리 강화제의 몰 비는 약 0.01 내지 약 0.3일 것이다. 바람직한 조성물은 약 0.1-0.2의 몰 비를 포함한다.
바람직한 조성물은 적어도 이당류, 올리고당류 및 다당류를 포함하는 약 0.5% 내지 약 90%의 탄수화물 성분 및 약 0.5% 내지 약 40%의 가수분해된 단백질을 포함하는 단백질 성분을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 조성물은 약 30% 내지 약 70%의 탄수화물 성분 및 단백질 가수분해된 단백질 및 카르복실산과 같은 약 10% 내지 약 40%의 유리 강화제 성분을 포함하고, 여기서 탄수화물 성분은 약 10% 내지 90%, 보다 바람직하게는 약 40% 내지 80%의 이당류; 약 1% 내지 약 10%, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 10%의 올리고당류; 및 약 0.1 내지 약 10%, 보다 바람직하게는 약 5% 내지 약 10%의 다당류를 포함한다. 조성물은 또 다른 유리 강화제 성분으로 고려되는 유기산의 염을 추가로 포함하며, 조성물의 총 중량에 기반하여 약 0.5% 내지 20%의 카르복실산을 포함한다.
생물학적 물질 및 본 발명의 안정화 조성물을 함유하는 용액은 실질적인 양 (구성성분 빼기 용매, 예컨대 물)의 총 고체, 약 20 중량% 내지 약 60 중량%, 바람직하게는 약 30-50 중량%의 총 고체를 포함할 수 있다. 총 고체의 주요 부분은 생물활성 물질, 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제로 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물활성 물질은 약 5% 내지 30% w/v, 바람직하게는 약 10-20% w/v 범위의 농도로 제형에 존재할 수 있다. 배양 배지 중 조성물 혼합물의 무게 질량은 전형적으로 약 10% 내지 약 60%, 바람직하게는 약 20-40%이다. 본 발명의 제형의 점도는 전형적으로 1000 센티푸아즈 (cP) 초과이고; 보다 바람직하게는 5,000 cP 초과이며; 가장 바람직하게는 10,000 cP 초과이다.
안정한 건조 제형을 제조하는 방법
다양한 건조 기법을 효과적으로 이용하여 조성물을 건조시킬 수 있다. 이러한 방법은 동결-건조 또는 진공 건조보다 덜 복잡하고 덜 비싸면서 생물학적 물질에 일반적으로 더욱 파괴적이다. 많은 생물학적 물질은 주위 온도 또는 동결-건조 또는 냉각-건조를 이용할 때보다 높은 온도에서 일어나는 방법을 이용하여 보존될 때 큰 입체형태 변화 및 원치 않는 반응을 일으키기 쉽다. 결과적으로, 현재 공지되어 있는 보호제를 사용하는 경우에도, 다수의 재수화된 생물학적 물질의 활성은 타고난 자체로 충분치 못할 뿐 아니라, 저온 건조에 의해 보존되는 경우 더욱 현저하게 낮다.
생물활성 물질을 함유하는 안정한 건조 제형을 제조하는 바람직한 방법은 하기를 포함한다; (1) 생물활성 물질을 본 발명의 조성물과 수용액에서 혼합시킴에 의해 점성 슬러리 제형 제조, (2) 슬러리 제형을 급속-동결시켜 고체 동결 입자 형성, (3) 임의로, 동결된 입자를 단시간 동안 고진공압으로 처리하여 입자를 퍼징시키고 그 구조를 안정화시킴, (4) 제형 동결 온도 이상의 온도에서 습기를 증발시킴에 의해 수분 제거, (5) 충분한 진공 및 상승된 온도하에 제형 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 추가로 감소시킴.
예를 들어, 생물활성 물질의 건조 형태는 조성물 분말 혼합물을 함유하는 용액 또는 현탁액으로 제형화될 수 있다. 조성물 혼합물은 냉각 및 생물활성 물질과의 혼합에 앞서 저 전단 교반을 이용하여 따뜻한 수용액으로 용해될 수 있다. 배양된 바이러스 또는 박테리아와 같은 생물활성 물질은 농축되고 제형으로의 재현탁에 앞서 원심분리 또는 여과에 의해 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 제형 중의 물 전체는 농축된 생물학적 물질의 액체내에서 제공된다. 현탁액은 실온보다 약간 높은 온도에서 유지되며 건조 조성물 분말 혼합물이 생물학적 물질을 함유하는 가온된 (25℃ 내지 40℃) 현탁액에 천천히 첨가된다. 현탁액은 모든 성분이 완전히 분산되거나 용해되고 균일한 슬러리가 수득될 때까지 플래너터리 믹서에서 서서히 교반된다.
그 후 점성 용액을 가교시켜 금속 이온을 첨가하거나 슬러리의 온도 또는 pH를 변화시킴에 의해 하이드로겔 (다당류 특성에 따라)을 형성한 다음 본 발명의 건조 방법에 따라 건조시킬 수 있다. 대안적으로, 슬러리를 노즐을 통해 아토마이징하거나, 적하하거나 드라이 아이스 또는 액체 질소조에서 주입시킴에 의해 급속-동결시켜 소입자 또는 고체 점적 스트링 또는 비드를 형성할 수 있다. 동결된 고체 입자는 안정한 동결된 생성물로서 추후 이용을 위해 또는 건조시까지 -30℃ 내지 -80℃의 딥 프리저에 저장될 수 있다. 바람직한 건조 방법은, 생성물 온도가 그 동결 온도보다 다소 높은 온도에서 유지되는 진공 건조이다. 동결된 점적 또는 비드를 트레이 상에 약 0.1 kg/sq ft 내지 약 1.5 kg/sq ft의 로딩 용량으로 배치시키고 본 발명의 방법에 따라 건조시킨다. 바람직하게는, 건조 과정이 짧은 퍼징 단계에 의해 개시되는데, 이러한 단계는 생성물을 동결된 입자의 초기 온도 및 구조에 순응시켜 경감 및 안정화시키고 과도한 공기를 탈기시킨다. 전형적으로, 퍼징 단계는 생성물 점도 및 트레이 로딩에 따라 약 1 내지 60분이 걸린다. 비드 또는 입자는 전체 퍼징 단계 동안 동결된 고체 형태로 유지되어야 한다. 그 후 생성물 온도는 그 동결 온도 이상이 되고, 모든 자유수가 생성물로부터 증발될 때까지 일차 건조 단계가 이어진다. 일단 제형 온도가 요망되는 온도에 도달하면, 그 온도가 유지되도록 온도가 조정되고 증발에 의한 일차 액체 건조 단계가 진행된다. 이러한 단계에서, 제형은 이미 해동되었고 어떠한 비등 또는 발포 없이 가속화된 물 증발이 일어난다. 건조 과정은 최대 진공 및 상승된 온도에서 추가의 이차 건조 단계로 완료된다.
종래 기술의 전형적인 방법은 민감한 생물학제에 손상을 줄 수 있는 광범한 발포 및/또는 스플래터링 및 극단적인 비등을 포함하며 고 로딩 용량의 산업적 규모로 확대하기에 어려움이 있다 (참조: 예를 들어 미국특허 6,534,087호, 가해진 진공압이 격렬한 비등 및 발포를 초래하는 경우). 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법은 현저히 빠른 건조 속도를 달성하고 제형의 고 로딩 용량을 가능하게 하면서 제형의 어떠한 비등 또는 발포도 회피한다. 추가로, 점성 액체 슬러리의 완전하고 효율적인 탈기가 곤란하고 연장된 기간이 필요할 수 있다. 이러한 단점들은 어떠한 비등 및 과도한 발포 없이 유리질 구조를 형성하는 효과적인 일차 액체 건조를 가능하게 하는 적합한 조성물을 이용함에 의해 본 발명에서 모두 해소되었다. 슬러리 또는 점성 시럽에 반하여 트레이 상의 동결된 고체 입자의 로딩은 종래 기술에서 제공된 트레이 상의 건조 면적 당 훨씬 높은 로딩 용량을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 일례에서, 생물학적 물질은 살아 있는 농축된 프로바이오틱 박테리아 배양물이다. 분말 조성물 혼합물은 바람직하게는 1-4%의 소듐 알기네이트 또는 젤란검, 50-75%의 트레할로스, 1-10%의 이눌린 또는 FOS, 10-20%의 단백질 가수분해물, 예컨대 카세인, 유청, 완두, 대두 또는 목화씨 가수분해물 및 1-10%의 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트를 함유한다. 프로바이오틱 배양물은 신선하거나, 동결되거나 건조 분말의 형태로 미리 건조될 수 있다. 조성물 혼합물을 농축된 프로바이오틱 배양 배지에 첨가하여 용액 혼합물의 고체 함량을 40-60% (w/w)로 만들고 pH를 포스페이트 또는 시트레이트 이온으로 6.5-7.5로 조정한다. 모든 성분들이 완전히 용해될 때까지 용액을 실온보다 다소 높은 온도에서 (전형적으로 25℃-37℃) 혼합시킨다. 점성 슬러리를 액체 질소에 적하시켜 소 점적 또는 비드를 형성하고, 그 후 액체 질소로부터 제거시키고, 백에 패킹시켜 건조시까지 -80℃의 딥 프리저에 저장한다.
살아 있는 프로바이오틱 박테리아의 전형적인 건조 방법은 트레이 상에 동결된 고체 비드를 균일한 층으로 100-1500 g/sq ft의 로딩 용량으로 스프레딩한 즉시 트레이를 냉동 건조기에 넣는 것을 포함한다. 그 후 진공압을 약 1000 mTORR 또는 그 미만으로 가하고, 냉동 건조기 크기 및 열원의 유형에 따라, 입자가 약 -20 내지 약 -30℃에서 유지되도록 선반 온도를 조정하였다. 동결된 고체 비드는 약 1 내지 약 60분간 퍼징될 수 있고 진공은 2000 내지 10,000 mTORR로 조정되며 열 전달은 제형 온도가 -10℃ 내지 +0℃로 상승하도록 증가된다. 이러한 온도 및 진공압 조건은 트레이 로딩에 따라 수 시간에서 24시간 이하로 지속될 수 있는 일차 액체 건조 단계 동안 유지된다. 일차 건조 공정 동안의 일부 시점에, 용매의 증발 속도가 느려지고 제형 온도가 건조 챔버에서의 열의 과잉 공급으로 인해 증가하기 시작한다. 이러한 시점이 본 발명의 일차 건조 단계의 끝을 나타내는 것이다. 용매가 제형으로부터 제거됨에 따라, 용액 중의 유리 형성 화합물이 액체로서의 흐름을 멈출 때까지 농축되고 진해져서 무정형 및/또는 안정한 유리질 구조를 형성한다.
그 후 최대 진공 및 30℃ 내지 50℃의 제형 온도에서 이차 건조 단계가 이어진다. 이차 건조 단계의 목적은 남아 있는 갇혔거나 결합된 수분을 제거하고 연장된 기간 동안 주위 온도에서 저장시 안정한 조성물을 제공하는 것이다. 이차 건조 단계는 수 시간 동안 지속될 수 있고 그 종말점은 제형이 완전히 건조되어 그 수분 활성도가 0.3 Aw 미만이 될 때이다.
본 발명의 건조 방법은 무정형 유리질 구조내에 감싸인 생물학적으로 활성인 물질을 생성함으로써 무정형 유리질 조성물 내에서 화합물 및 그 밖의 분자의 이동성을 크게 감소시킴으로 인해 단백질의 언폴딩 또는 변성을 예방하고 분자의 상호작용 또는 가교-반응성을 현저하게 늦춘다. 무정형 고체 구조가 그 유리 전이 온도 미만의 온도에서 유지되고 나머지 수분이 비교적 낮게 유지되는 한 (즉, 0.5의 Aw 미만), 프로바이오틱 박테리아는 비교적 안정하게 유지될 수 있다. 일부 생물학적 물질이 더욱 결정질 상태로 보다 잘 유지될 수 있으므로 장기간 안정성을 위해 유리질 구조를 달성하는 것이 필수적인 것은 아님을 주목하여야 한다.
건조된 유리질 구조를 총괄하여 이용하거나, 요망되는 형상 및 크기로 절단하거나, 습윤 또는 건조 응집화, 과립화, 정제화, 치밀화, 펠렛화 또는 어떠한 그 밖의 종류의 전달 공정과 같은 용이한 다운스트림 가공을 제공하는 자유 흐름 분말로 분쇄되고 제분될 수 있다. 분쇄, 제분, 연삭 또는 미분을 위한 공정은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 해머 밀, 에어 밀, 임팩트 밀, 제트 밀, 핀 밀, 윌리 밀, 또는 유사한 제분 장치를 이용할 수 있다. 바람직한 입자 크기는 약 1000 ㎛ 미만이고, 바람직하게는 500 ㎛ 미만이다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 생물학적 물질을 안정화시키고 그 활성을 연장된 저장 기간 동안 주위 온도 및 상대 습도 이상에서 보존시킨다. 예를 들어, 조성물을 상승된 온도 (예컨대, 40℃) 및 높은 습도 (예컨대, 33%RH)에서 처리하고 제형의 생물학적 활성을 측정함에 의해 안정성에 대해 조성물을 시험한다. 살아 있는 프로바이오틱 박테리아의 예로서, 이러한 연구 결과는 이러한 조성물로 제형화된 박테리아가 적어도 60일간 안정함을 입증한다. 안정성을 1 log CFU/g 효능 손실에 대한 시간으로서 정의한다. 상기 제형은 고농도의 생물학적으로 활성인 물질을 이용할 때에도 안정하다. 따라서, 이러한 제형은 이들이 실온 또는 실온 이상의 온도에서 장기간 선적 및 저장될 수 있다는 점에서 유리하다.
실시예
하기 실시예는 청구된 발명을 제한하는 것이 아니라 예시하기 위해 제공된 것이다.
실시예 1
건조 및 안정한 조성물의 제조
기본 탄수화물 혼합물
약 70 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 5 g의 인스턴트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN) 및 약 3 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합시켰다.
기본 유리 강화제 혼합물
약 17 g의 카세인 가수분해물 또는 완두 가수분해물 (초여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ) 및 5 g의 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합시켰다.
프로바이오틱 박테리아의 안정화
락토바실러스 람노수스의 신선한 농축물 (발효 수확물로부터 직접 10% 고체로 100 ml)을 블렌더에 첨가하고 35℃에서 유지시켰다. 약 78 g의 기본 탄수화물 혼합물 및 약 22 g의 기본 유리 강화제 혼합물을 서서히 프로바이오틱 배양물에 첨가시키고 35℃에서 10분간 혼합시켰다. 그 후 점성 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배스로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거한 즉시 건조를 위해 이동시켰다.
프로바이오틱 박테리아를 함유하는 동결된 비드의 건조
동결된 비드를 트레이 상에 200 g/sq ft의 로딩 용량으로 스프레딩한 직후 냉동 건조기의 선반에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 그 후 진공을 2000-2700 mTORR로 조정하였고 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압 설정을 5시간 동안 유지시켰다. 임의로, 동결된 비드의 온도를 약 -20℃로 순응시킨 후에 약 1000 mTORR의 진공압을 가함에 의해 일차 액체 건조를 개시하고 동결된 고체 비드가 약 10분간 퍼징되게 하였다. 이어서 일차 건조 단계 후에 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정하고 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압 설정을 5시간 동안 유지시켰다. 그 후 이차 건조 단계 후에 충분한 진공 (150-200 mTORR) 및 30℃ 내지 50℃의 선반 온도를 추가 3시간 동안 유지시켰다. 제형을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도를 Hygropalm Awl 기계 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.)에 의해 Aw = 0.23으로 측정하였다.
실시예 2
건조 프로바이오틱 박테리아의 저장 안정성
도 1은 40℃ 및 33%RH 그리고 30℃ 및 43%RH의 두 상이한 가속화된 저장 조건하에 실시예 1로부터의 안정한 건조 프로바이오틱 박테리아 및 시판되는 건조 프로바이오틱 박테리아 (Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT)의 저장 안정성을 도시한다. 시판되는 프로바이오틱 박테리아는 가속화된 저장 조건하에 처음 수 주 내에 그 생존력을 완전히 상실하는 반면, 본 발명의 프로바이오틱 박테리아의 건조 조성물은 30℃ 및 43%RH에서는 60일 후에 1.18 로그만을 상실하고 40℃ 및 33%RH에서는 1.09 로그만을 상실한다.
실시예 3
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스를 함유하는 안정한 건조 조성물의 규모-확대 생산
락토바실러스 람노수스 (시판원으로부터 400 g의 동결된 농축물)를 피복 이중 플래너터리 믹서 (DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 37℃로 해동시키고 고체 함량을 증류수를 이용하여 10 중량%의 고체로 조정하였다. 약 212 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 20 g의 인스턴트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN), 약 12 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ), 약 136 g의 카세인 가수분해물 (초여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ) 및 약 20 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합시켰다. 분말 혼합물을 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가시키고 혼합을 40 RPM 및 37℃에서 10분간 수행하였다. 그 후 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배스로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거시키고, 밀봉된 알루미늄 포일 백에 놓고, 수 주 동안 -80℃에서 딥 프리저에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 500 내지 1500 g/sq ft 이하의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 냉동 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함에 의해 일차 액체 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 온도에서 최대 진공 (150-200 mTORR)으로 이차 건조 단계가 개시되며 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지시켰다. 제형을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도를 0.23 Aw에서 측정하였다.
실시예 4
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스를 함유하는 안정한 건조 조성물의 규모-확대 생산
비피도박테리움 락티스 (시판원으로부터 400 g의 동결된 농축물)를 피복 이중 플래너터리 믹서 (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 37℃로 해동시켰다. 약 212 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 20 g의 인스턴트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN), 약 12 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ) 및 약 20 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합시켰다. 분말 혼합물을 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가시켰다. 약 136 g의 완두 가수분해물 (초여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 80 g의 증류수에 용해시키고 완전히 용해될 때까지 혼합물에 잠시 마이크로파를 가하거나 수조에서 60℃로 가온시킨 다음 약 35℃로 냉각시켰다. 건조 믹스 분말 및 완두 단백질 가수분해물을 함유하는 용액을 프로바이오틱 농축물에 첨가하고 혼합을 40 RPM 및 37℃에서 20분간 수행하였다. 그 후 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배스로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거시키고, 밀봉된 알루미늄 포일 백에 놓고, 수 주 동안 -80℃에서 딥 프리저에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 800 g/sq ft 이하의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 냉동 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함에 의해 일차 액체 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 온도에서 최대 진공 (150-200 mTORR)으로 이차 건조 단계가 개시되며 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지시켰다. 제형을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도를 0.23 Aw로 측정하였다.
실시예 5
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스를 함유하는 하이드로겔 제형의 제조
비피도박테리움 락티스의 농축된 프로바이오틱 슬러리를 실시예 1에 따라 제조하였다. 기본 제형에 0.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리가 다음 2시간에 걸쳐 실온에서 경화되어 고체 하이드로겔을 형성하게 하였다. 시판되는 슬라이서/슈레더를 이용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 실로 베어 내었다. 얇은 실을 습윤 형태로 트레이 상에 직접 로딩시키거나 액체 질소에서 급속-동결시키고 트레이 상에 500g/sq ft의 로딩 용량으로 로딩시키고 건조를 위해 실시예 3에 기재된 대로 냉동 건조기에 넣었다. 제형의 수분 활성도 (Aw)는 0.05이었다 (HygroPalm Awl에 의해 측정됨, Rotonic Huntington, NY). 건조 제형을 표준 해머 밀 장비를 이용하여 미세 분말로 추가로 분쇄하고 50-250 마이크론 스크린을 통해 시빙하였다.
실시예 6
유리 강화제 및 탄수화물 혼합물 간의 몰 비의 최적화
유리 강화제 및 탄수화물 혼합물을 다양한 몰 비로 함유하는 여러 조성물을 실시예 1에 따라 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 파라카세이의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1에 기재된 대로 건조 조성물로 제조하였으며, 슬러리를 급속-동결 및 퍼징 단계 없이 습윤 형태로 트레이 위에 바로 로딩시키는 것이 달랐다. 슬러리를, 선반 온도를 일차 및 이차 건조 단계 동안 40℃로 상승시킨 것을 제외하고, 실시예 1 및 3에 기재된 대로 일차 및 이차 단계로 건조시켰다. 안정한 분말을 37℃ 및 33%RH에서 84일간의 가속화 저장 조건하에 두었다. 도 2는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 다양한 몰 비의 효과를 도시한다. 이러한 결과는 유리 강화제 및 탄수화물 혼합물 간의 최적 몰 비가 약 0.12-0.15임을 제안하였다.
실시예 7
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 저장 안정성에 대한 본 발명의 조성물의 효과
실시예 1에 기재된 대로 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제 혼합물을 함유하는 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기재된 대로 건조 조성물로 제조하고 안정한 분말을 24℃ 및 33%RH에서 537일간의 가속화 저장 조건으로 처리하였다. 도 3은 본 발명의 조성물로 제형화된 프로바이오틱의 양호한 안정성을 입증한다. 이러한 결과는, 프로바이오틱 생존력이 상세된 조건하에 537일의 선반 저장 동안 0.18 로그만이 감소하였음을 나타낸다.
실시예 8
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 저장 안정성에 대한 다양한 유리 강화제 화합물의 효과
실시예 1에 기재된 탄수화물 혼합물 및 카세인 가수분해물과 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트 또는 둘 모두의 조합물을 함유하는 유리 강화제 혼합물을 함유하는 여러 개의 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필루스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1에 기재된 대로 건조 조성물로 제조하였으며, 슬러리를 급속-동결 및 퍼징 단계 없이 습윤 형태로 트레이 위에 바로 로딩시키는 것이 달랐다. 슬러리를 실시예 1 및 3에 기재된 대로 일차 및 이차 단계로 건조시키고 안정한 분말을 24℃ 및 43%RH에서 180일간의 가속화 저장 조건에 두었다. 도 4는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 다양한 유리 강화 화합물의 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 단백질 가수분해물의 상부에 추가의 유리 강화제를 포함시킴으로써 현저히 양호한 안정성이 달성되었음을 제안하였다. 특히, 동등한 양의 소듐 아세테이트 및 소듐 아스코르베이트를 포함시키는 것이 가장 안정한 조성물을 제공하였다. 실시예 5 및 6 둘 모두로부터의 결과는 또한 다양한 유리 강화제가 박테리아 균주에 따라 더욱 효과적이거나 심지어 탈안정화제로서 작용할 수 있음을 제안하였다.
실시예 9
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스의 저장 안정성에 대한 다양한 단백질 가수분해물/당 비의 효과
실시예 1에 기재된 대로 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 포함하는 여러 개의 조성물 및 동등한 양이지만 다양한 비의 완두 가수분해물/트레할로스를 소듐 아스코르베이트와 함께 또는 소듐 아스코르베이트 없이 함유하는 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기재된 대로 건조 조성물로 제조하였고 안정한 분말을 35℃ 및 43%RH에서 7주간의 가속화 저장 조건하에 두었다. 도 5는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 소듐 아스코르베이트가 있거나 없는 1:4.1:2.5 및 1:1.5 비의 완두 가수분해물/트레할로스의 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 현저히 양호한 안정성이 증가된 비의 완두 가수분해물/트레할로스에서 달성되었음을 제안하였다. 특히, 1:1.5 비의 완두 가수분해물/트레할로스가 더욱 안정한 조성물을 제공하였다. 소듐 아스코르베이트를 보다 높은 완두 가수분해물/트레할로스 비에서 포함시키는 것이 소듐 아스코르베이트를 배제시킨 제형에 비해 양호한 안정성을 초래하였다.
실시예 10
프로바이오틱 L. 람노수스의 최대 안정성에 대한 pH 최적화
실시예 1에 기재된 대로 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 함유하는 다양한 pH의 여러 개의 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 람노수스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기재된 대로 건조 조성물로 제조하였다. 안정한 분말을 40℃ 및 33%RH에서 8주간의 가속화 저장 조건에 두었다. 도 6은 건조된 박테리아의 안정성에 대한 슬러리의 pH 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 최적 안정성이 중성 pH (~7)에서 달성되었음을 제안하였다.
실시예 11
효소를 함유하는 안정한 건조 분말
실시예 1 및 4에 기재된 대로 400 g의 탄수화물 혼합물 및 200 g의 유리 강화제 및 400 g의 피타제 (BASF, GmBH)를 1000 ml의 물에서 혼합시켜 40 중량%의 피타제를 함유하는 하이드로겔 제형을 제조하였다. 슈레딩된 하이드로겔 제형을 액체 질소에서 급속-동결시키고 50℃의 일차 및 이차 건조 온도에서 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조된 제형의 로딩 및 저장 안정성의 측정을 위해, 건조 샘플을 미세원심분리 튜브에서 정확하게 칭량하였다 (<100 mg). 200 ㎕의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 첨가하였다. 제형을 볼텍싱에 의해 DMSO 완충제에 용해시켰다. 이러한 샘플에 0.05 N NaOH, 0.5% SDS 및 0.075 M 시트르산 (트리소듐 염)을 함유하는 0.8 ml의 용액을 첨가하였다. 튜브를 10분간 45℃에서 초음파처리한 후에, 5,000 rpm에서 10분간 짧게 원심분리하였다. 투명한 DMSO/NaOH/SDS/시트레이트 용액의 분취량을 마이크로플레이트의 웰로 취하고 Bradford 검정 방법을 이용하여 단백질 함량에 대해 분석하였다. 95℃에 20분간 노출시킨 후에 안정한 효소 건조 조성물의 안정성은 본 발명의 조성물이 없는 건조 효소보다 월등히 더 높았다.
실시예 12
전염성 연어 빈혈 바이러스 (ISAV) 백신을 함유하는 안정한 건조 분말
ISAV 백신 (Novozyme, Denmark)의 농축된 슬러리를 실시예 4에 따라 제조하였으며, 20 ml의 0.5% 아세트산 중의 4% 키토산 용액을 ISAV 백신 농축물, 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 함유하는 슬러리에 첨가하는 것이 달랐다. 0.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리가 다음 2시간에 걸쳐 실온에서 경화되어 고체 하이드로겔을 형성하게 하였다. 시판되는 슬라이서/슈레더를 이용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 실로 베어 내었다. 얇은 실을 습윤 형태로 트레이 상에 직접 로딩시키거나 액체 질소에서 급속-동결시키고 트레이 상에 1500g/sq ft의 로딩 용량으로 로딩시키고 건조를 위해 실시예 3에 기재된 대로 냉동 건조기에 넣었다. 제형의 수분 활성도 (Aw)는 0.25이었다. 건조 제형을 표준 해머 밀 장비를 이용하여 미세 분말로 추가로 분쇄하고 50-150 마이크론 스크린을 통해 시빙하였다. 시판되는 사료를 건조 조성물로 상부 코팅시키고 대서양 연어에게 공급함에 의해 안정한 건조 ISAV 조성물을 경구 백신용으로 이용하였다.
실시예 13
침습성 종 미끼의 제조
살충제를 함유하는 본 발명에 따른 특히 표적화된 침습성 종을 위한 펠렛화 미끼를 제조하였다. 200 g의 제형을 실시예 9에 기재된 대로 제조하고 200 gm의 물에 첨가하였다. 이러한 용액에 90 gm의 로테논 및 0.5 gm 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 gm의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 즉시 표준 산업적 프레이(pray) 건조기에서 분무 건조시키고, 건조 제형을 환경에 유해한 독소 효과 없이 또는 생태계에 근접하게 특수한 침습성 종을 표적화하는데 이용하였다.
실시예 14
보호된 식물 프로바이오틱 제형의 제조
리조박테리아와 같은 생물학적 조절제를 실시예 4에 따라 건조 조성물로 제조하였다. 건조 리조박테리아 조성물의 유효성을 무균 조건하에 상추 성장에 대해 평가하였다. 식물 당 100 mg의 리조박테리아 건조 조성물의 용량을 모래가 있는 항아리에 접종시키고 미리 발아된 (24 h) 상추 모종을 심었다. 5 ml의 살균된 Hoagland 용액의 영양 용량을 항아리의 식물에 적용시켰다. 항아리를 28℃에서 12 h 광주기를 이용하여 유지된 성장 챔버에 임의로 정렬시켰다. 접종 후 매 7일 간격으로 식물과 붙어 있는 모래를 항아리에서 조심스럽게 분리시켰다. 살균 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로 뿌리를 세척하고, 뿌리 길이의 측정치를 기록하였다.
참조문헌
Figure 112013021843972-pct00001
Figure 112013021843972-pct00002

Claims (36)

  1. 조성물의 총 중량에 기반하여 0.5% 내지 90%를 포함하는 탄수화물 성분; 0.5% 내지 40%의 가수분해된 동물 또는 식물 단백질을 포함하는 단백질 성분; 및 0.5% 내지 20%의 카르복실산 염을 포함하는 카르복실산 성분을 포함하는 생물학적 물질용 건조 안정화 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 탄수화물 성분이 올리고당류, 다당류 및 이당류로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 당류이고, 여기서 탄수화물 성분의 총 중량에 기반하여 올리고당류가 5% 내지 10%이고, 이당류가 40% 내지 80%이며, 다당류가 5% 내지 10%인 건조 안정화 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 생물학적 물질이 살아 있거나, 죽었거나, 약독화된 세포, 미생물, 바이러스, 박테리아, 프로바이오틱 박테리아, 식물 및 토양 박테리아 또는 효모, 세포 배양물, 단백질, 재조합 단백질, 효소, 펩티드, 호르몬, 백신, 항생제, 약물 및 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 가수분해된 단백질 성분이 가수분해된 카세인, 가수분해된 유청(whey) 단백질, 가수분해된 완두 단백질, 가수분해된 대두 단백질 및 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 탄수화물 성분이 다당류, 올리고당류, 이당류 및 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  6. 제 2항에 있어서, 다당류 성분이 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 펙틴, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 메틸 셀룰로스, 카라기난, 젤란검, 구아검, 검 아카시아, 잔탄검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분 및 변성 전분 및 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  7. 제 2항에 있어서, 올리고당류 성분이 시클로덱스트린, 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프럭토-올리고당류 (FOS), 갈락토-올리고당류 (GOS), 만난-올리고당류 (MOS) 및 이들의 혼합물인 건조 안정화 조성물.
  8. 제 5항에 있어서, 이당류 성분이 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 이들의 혼합물인 건조 안정화 조성물.
  9. 삭제
  10. 제 1항에 있어서, 카르복실산 염이 락트산의 염, 아스코르브산의 염, 말레산의 염, 옥살산의 염, 말론산의 염, 말산의 염, 숙신산의 염, 시트르산의 염, 글루콘산의 염, 글루탐산의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 카르복실산 염이 카르복실산의 소듐 염, 포타슘 염, 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 포스페이트 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, 카르복실산 염이 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 소듐 말레에이트, 마그네슘 글루코네이트, 마그네슘 아스코르베이트, 소듐 아스코르베이트, 포타슘 아스코르베이트, 포타슘 시트레이트 또는 이들의 혼합물을 포함하는 건조 안정화 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 1항에 있어서, 조성물이 무정형 유리질 상태로 건조되는 건조 안정화 조성물.
  19. 제 2항에 있어서, 이당류/올리고당류/다당류의 중량 비가 10:0.2:0.1 내지 10:2:1인 건조 안정화 조성물.
  20. 제 1항에 있어서, 건조가 동결-건조, 공기-건조, 진공-건조, 유동층 건조 및 분무-건조로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정인 건조 안정화 조성물.
  21. (a) 생물학적 물질을 제 1항에 명시된 화합물의 혼합물과 수성 용매에서 혼합하여 점성 슬러리를 형성하는 단계; (b) 상기 슬러리를 액체 질소에서 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적(droplet) 또는 스트링(string)의 제형을 형성하는 단계; (c) 상기 제형을 상기 제형의 동결 온도 이상의 온도에서 진공하에 증발에 의해 일차 액체 건조시키는 단계; 및 (d) 상기 제형을 최대 진공 및 20℃ 이상의 온도에서 제형의 수분 활성도를 감소시키기에 충분한 시간 동안 이차 건조시키는 단계를 포함하는, 생물학적 물질용 건조 안정화 조성물을 제조하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 일차 건조 단계를 개시하기 전에 동결된 고체 입자의 순응화 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 건조 안정화 조성물이 무정형 유리질 상태로 건조되는 제조 방법.
  24. 제 21항에 있어서, 슬러리가 급속 동결에 앞서, pH 또는 온도 변화 또는 폴리머 사슬의 가교에 의해 단단한 하이드로겔로 고체화되는 제조 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 슬러리를 요망되는 형상으로 몰딩하는 제조 방법.
  26. 제 22항에 있어서, 순응화 단계가 진공하에 제형 동결점 미만의 온도에서 수행되는 제조 방법.
  27. 제 22항에 있어서, 순응화 단계가 0 내지 60분간 수행되는 제조 방법.
  28. 제 21항에 있어서, 일차 액체 건조 단계가 2000 mTORR를 초과하는 진공압하에 수행되는 제조 방법.
  29. 제 21항에 있어서, 건조 안정화 조성물이 자유 흐름 분말로 절단되거나, 분쇄되거나, 제분되거나(milled), 개별적으로 미분되는(pulverized) 제조 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 분말이 1000 ㎛ 미만의 입자 크기를 갖는 제조 방법.
  31. 제 21항에 있어서, 건조 안정화 조성물의 수분 활성도 (Aw)가 0.3 또는 그 미만인 제조 방법.
  32. 제 1항의 건조 안정화 조성물을 포함하는 경구 전달 제형으로서, 상기 제형이 재구성된 액체, 분쇄된 분말, 정제, 펠렛, 캡슐, 식품 또는 사료 제품의 형태인 경구 전달 제형.
  33. 제 1항의 건조 안정화 조성물을 포함하는 경구 전달 제형으로서, 생물학적 물질이 제형의 저장 수명 동안 안정한 경구 전달 제형.
  34. 제 1항의 건조 안정화 조성물을 포함하는 경구 전달 제형으로서, 제형이 식품, 동물 사료, 기능식품, 제약 또는 백신 제품으로서 소비되는 경구 전달 제형.
  35. 제 1항에 있어서, 조성물이 바(bar), 액체 포뮬라, 콜로이드 현탁액, 분말, 정제, 캡슐의 형태로 식품, 식품 첨가제, 동물 사료, 동물 사료 첨가제, 기능식품, 제약 또는 백신 제품으로서 소비되는 생물학적 물질용 건조 안정화 조성물.
  36. 제 21항의 방법에 의해 제조된 건조 안정화 조성물.
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