CN104147605A - 用于生物材料的干的贮存稳定用组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明包括用于在贮存中保存敏感性生物活性材料的组合物、该组合物的制备方法、包含该组合物的经口递送制剂、和使用该组合物的干燥方法。本发明提供一种用于生物材料的干的稳定用组合物，基于所述组合物的总重量，其包含占0.5％至90％的碳水化合物组分；和占0.5％至40％的水解的动物或植物蛋白质的蛋白质组分，其中所述生物材料包括：活的、死的或减弱的病毒、细菌、酵母、细胞培养物、蛋白质、肽、疫苗、药物或其混合物；其中所述组合物还包含占该组合物总重量的0.5％至20％的羧酸组分，其中所述羧酸组分包括玻璃增强用羧酸盐。本发明的组合物允许干燥并稳定敏感性生物活性材料。

Description

用于生物材料的干的贮存稳定用组合物及其制备方法

本申请是申请日为2011年8月12日、申请号为201180039219.7、发明名称为“用于生物材料的干的贮存稳定用组合物”(PCT/US2011/047547，进入国家阶段日期2013年2月7日)之申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年8月13日在美国专利商标局提交的美国临时申请No.：61/373,711的优先权，其内容通过引用并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明属于使玻璃状干结构的生物材料稳定的领域。

背景技术

对于食品、营养品和药品行业而言在高温度和高湿度下长期贮存的生物材料的结构和功能的维持非常重要。敏感的生物材料(如，蛋白质、酶、细胞、细菌和病毒)时常必须被保存一段时间以备将来使用。当干燥对于最终产品而言有害或者不合适时，常常进行简单的冷冻。就以干态保存而言，冷冻干燥在传统上是最常见的方法。其它方法(如环境空气干燥、在环境温度下真空干燥(真空干燥)、或通过使细雾的小滴与暖空气接触来干燥(喷雾干燥)以及通过脱水来干燥)一般不适于敏感性生物活性物质，如活的或减弱(attenuated)的细菌和病毒。用于这些方法中的高干燥温度导致对生物活性物质自身的显著损伤。

通常，冷冻干燥工艺可以因缓慢干燥过程中冰晶的形成而导致活性显著丢失以及对生物活性剂造成损伤。冷冻干燥组合了因冷冻和干燥二者所产生的应力。该工艺的冷冻步骤可以具有非期望的作用，如蛋白质和酶的变性和细胞的破裂。由冷冻造成的损伤在一定程度上可以通过向溶液中添加防冻化合物或试剂来规避。这样的保护剂一般是在冷冻过程中添加到制剂中以保护细胞膜和蛋白质以及在贮存过程中用以增强稳定性的高度可溶的化学品。常见的稳定剂包括高浓度的糖，如蔗糖、海藻糖、甘油或山梨糖醇(Morgan等，2006；Capela等，2006)。二糖(如蔗糖和海藻糖)是具有良好保护特性的天然冷冻保护剂。海藻糖是特别有吸引力的冷冻保护剂，因为在事实上已将其从在干旱期间仍处于假死状态的植物和活有机体中分离出来。已示出海藻糖对多种生物材料而言是有效的保护剂(参见，Crowe，J.H.，1983)。若干专利公开了海藻糖或海藻糖与其它冷冻保护剂的组合在冷冻、干燥和复水过程中保护蛋白质和其它生物大分子(如酶、血清、血清补体、抗体、抗原、荧光蛋白和疫苗组分)中的用途(美国专利No.5,556,771)。

但是，有一些缺点与使用海藻糖或其它二糖或单糖作为唯一冷冻保护剂相关。海藻糖可能无法充分穿透进入细胞中以保护胞内体积中的活性成分，这可以引起经冷冻干燥之物质的贮存不稳定。此外，有时必要的是海藻糖的浓度大于按给定保存介质的重量计的60％。与海藻糖的使用相关的甚至更严重的问题是单独使用海藻糖保存的生物材料在长时间内不稳定，特别是在高温度和/或高湿度环境下贮存的那些。因此，显著的挑战仍然是开发使经干燥材料的干燥损失最小化同时实现充分的贮存稳定性的最佳制剂和干燥工艺。

与海藻糖和冷冻干燥工艺相关的一些问题已通过采用某些制剂与玻璃态(特别是糖玻璃)真空干燥的组合而被解决(美国专利No.6,190,701)。在那些制剂中，生物活性剂被保护在对抗不利环境(如高温度和高湿度)的玻璃状基质中。但是，在这些制剂中，作为环境中的水分的水的存在起到了增塑剂的作用，并且具有降低玻璃状基质的玻璃化转变温度(Tg)的作用。在较高的水含量下，Tg显著地降低到干制剂在室温下为非期望的橡胶态或塑性状态的程度。

保持制剂的玻璃形式的优点包括固体的物理稳定性增加和有害的分子内反应减少。水-食物聚合物相互作用的物理化学的详细讨论(如与玻璃态及其转化温度相关)可见于M.Le Meste等(2002)中。但是，无定形系统(如物理不稳定性和较高的化学反应性)的限制成为其广泛商品化的限制。

因此，存在对可用于广泛范围的生物材料之稳定用组合物的需要。还存在对可以有效地用于涉及环境温度干燥的冷冻干燥工艺和干燥工艺二者的稳定用组合物的需要。还需要与目前所使用的那些相比成本较低的组合物混合物。最后，重要地，需要为在材料的运输和贮存过程中可以遇到的升高的温度和不同程度的湿度下，长时间保存生物材料提供稳定的介质，同时在复水后仍然保持显著量的活性的组合物混合物。

所有这些需要由本发明的组合物混合物、干燥方法和所得的保存生物材料组合物满足。

发明内容

本发明包括用于在贮存中保存敏感性生物活性材料的组合物和干燥方法，所述敏感性生物活性材料如肽、蛋白质、激素、核酸、抗体、药物疫苗、酵母、细菌(益生菌或其它)、病毒和/或细胞悬液。

本发明的组合物包含二糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物和有机酸(优选为柠檬酸和/或抗坏血酸)的离子。制剂是通过将所有固体组分分散于溶液中来制备的。通过本领域中公知的方法(如液氮或干冰)迅速冻结溶液以形成小珠、线或滴。可以将冻结的珠贮存于冷藏器(-30℃至-80℃)中用于之后以冻结状态使用或者置于处于冻结状态的盘上以在常规的冷冻干燥机中干燥。优选的干燥步骤任选地通过以下而起始的：短暂清洁，在小于＜2000毫托(mTORR)的真空压力下冻结颗粒的结构稳定化步骤，接着在大于＞2000毫托的真空压力和期望温度下的初级干燥步骤。在材料的次级干燥步骤和最终干燥步骤，施加了全真空压力和升高的温度以获得干材料的最终期望的水活性。

在一个特定实施方案中，生物材料包括活细菌(例如，益生菌)。合适的微生物的实例包括但不限于：酵母如酵母属(Saccharomyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis)；霉菌如曲霉菌属(Aspergillus)、根霉菌属(Aspergillus)、毛霉菌属(Mucor)、青霉菌属(Penicillium)和球拟酵母属(Torulopsis)；以及细菌如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、球菌属(Melissococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、Kocuriaw、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链锁球菌属(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、Weiss ella、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)和乳酸菌属(Lactobacillus)。合适的益生微生物的特定实例由下述物种来表示，并且包括这些物种中的所有培养生物型：黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(A.oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、缓慢芽胞杆菌(B.lentus)、地衣芽胞杆菌(B.licheniformis)、糖化菌(B.mesentericus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)、多毛拟杆菌(Bac.Capillosus)、瘤胃生拟杆菌(Bac.Ruminocola)、Bac.Suis、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、乳酸双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、伪长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、Candida pintolepesii、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、乳酪肠球菌(Enterococcus cremoris)、二乙酰乳酸肠球菌(E.diacety lactis)、屎肠球菌(E faecium)、中间肠杆菌(E.intermedius)、乳酸肠球菌(E.lactis)、E.muntdi、嗜热肠球菌(E.thermophilus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、完全乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis)、L.case4L.curvatus、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii ss.Bulgaricus)、香肠乳杆菌(Lfarciminis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、干酪乳杆菌(L.plantarum)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、致腐乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、啤酒球菌(P.cereviseae)(得酸球菌，damnosus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Prop，shermanii)啤酒酵母(Saccharomyces cereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、金黄色葡萄球菌(Staph)、木糖葡萄球菌(xylosus)、婴儿链球菌(Streptococcus infantarius)、链锁状球菌(Strep)、唾液链球菌嗜热亚种(salivarius ss.Thermophilus)、嗜热链球菌(Strep.Thermophilus)和乳酸链球菌(Strep，lactis)。

在一个实施方案中，制剂包含二糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物，其中包埋有生物活性材料。合适的多糖的实例包括但不限于邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧基-甲基-纤维素、胶质、藻酸钠、藻酸的盐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉胶、吉兰糖胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和改性淀粉。合适的寡糖的实例包括但不限于环糊精、菊粉、FOS、麦芽糊精、葡聚糖等；及其组合。合适的二糖的实例包括但不限于乳糖、海藻糖、蔗糖等。在一个特定实施方案中，优选的多糖是藻酸钠或吉兰糖胶。优选地，碳水化合物混合物包含按总干物质的重量百分数计0.1％至10％的多糖、1％至10％的寡糖和10％至99％的二糖。在另一实施方案中，碳水化合物混合物包含重量比为10∶0.1-4∶0.1-2的二糖、寡糖和多糖，更优选地，其中，二糖/寡糖/多糖的重量比为约10∶0.2∶0.1至约10∶2∶1。

在本发明的又一实施方案中，碳水化合物混合物中的多糖与二价金属离子交联以形成坚固的水凝胶。

在另一实施方案中，组合物包含显著量的玻璃增强用化合物(glassenhancing compound)，所述玻璃增强用化合物包括有机酸的盐，所述有机酸如乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸、谷氨酸等)的盐。盐可以包括阳离子如钠、钾、钙、镁等。实例包括柠檬酸钠、乳酸钠、马来酸钠、葡萄糖酸镁、抗坏血酸钠等。优选具有高玻璃化转变温度(Tg)和高可溶性的盐。最优选的有机酸是柠檬酸及其盐(如柠檬酸钠或钾、柠檬酸三钠的脱水物)和抗坏血酸及其盐(例如，抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸镁)。干组合物中柠檬酸或抗坏血酸离子的优选重量使得离子与碳水化合物之摩尔数的摩尔比为约0.01至约0.3，更优选为约0.1至约0.2。

其它可用的玻璃增强剂(glass enhancer)包括蛋白质、蛋白质水解产物、多肽和氨基酸。这些包括明胶、白蛋白、乳清蛋白质、大豆蛋白质、酪蛋白、酪蛋白酸盐、免疫球蛋白、大豆蛋白质、豌豆蛋白质、棉籽蛋白质或其它食物和奶品或植物蛋白质和/或它们的水解产物。聚氨基酸的实例包括聚丙氨酸、聚精氨酸、聚甘氨酸、聚谷氨酸等。可用的氨基酸包括赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸，及疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)和甲胺如甜菜碱。干组合物中蛋白质、蛋白质水解产物和氨基酸的优选的总量为约1％至约30％的总质量的碳水化合物混合物，最优选为约5％至约20％的碳水化合物的质量。理想地，与非GRAS的那些相比，优选一般地被认为安全(GRAS)的化合物。

应当注意，组合物中玻璃增强剂的合适的量可以取决于干组合物的期望性质。应当根据期望的贮存条件来确定玻璃增强剂的合适的量。例如，包含碳水化合物混合物和蛋白质或蛋白质水解产物的组合物可用于增强生物材料的化学稳定性，同时在温和的温度和相对湿度(如25℃和25％RH)下贮存。柠檬酸盐离子可以优选地构成玻璃增强剂以获得在较高温度和湿度暴露下的稳定的额外益处。可替选地，可以是这样的情况：更优选柠檬酸盐/抗坏血酸盐离子与另一玻璃增强剂(如蛋白质或蛋白质水解产物)的组合来构成组合物。

生物材料和组合物的优选的混合工艺通过向包含生物材料的浓缩的培养溶液或介质溶液中添加总干组合物混合物来进行。培养基中生物材料的重量分数通常为约5％至30％w/v，更优选为约10％至20％w/v。培养基中组合物混合物的添加的重量分数通常为约10％至约60％，更优选为约20％至40％。混合的浆料中的最终固体含量为约20％至约60％，更特别地为约30％至约50％。优选地，将溶液在室温下混合或者轻微温热至有助于使材料在粘性溶液中溶解(例如20℃至40℃)。在本发明的变体中，将制剂中碳水化合物混合物的总量调节至获得粘度和密度使得进行有效干燥同时避免可能在干燥步骤过程中发生的橡胶形成或过度起泡的期望制剂。优选的浆料粘度为约1,000cP至约500,000cP，最优选的范围为约10,000cP至约300,000cP。可以通过本领域中公知的任意方法来获得具有期望粘度和密度的最终浆料，例如，稍微调节碳水化合物混合物中多糖的量，或者通过脱气或注气如空气、氮气、二氧化碳、氩气等。

本发明的生物材料通常迅速冻结至-30℃至-180℃，更优选地，通过雾化、滴下或注入液氮浴中来在液氮中迅速冻结。从液氮浴收集颗粒、珠、线或滴，并在冷冻干燥器或真空干燥器中干燥，或者可替选地，将它们贮存在冷藏器(-30℃至-80℃)中以在之后以冻结形式使用或者直至干燥。

一般，可用的干燥工艺技术包括喷雾干燥；冻干然后碾磨使粉末微粉化；雾化到冷表面上，然后升华并收集微粉化粉末；在高于浆料的冷冻温度的温度下(-20℃至50℃)，在真空烘箱或离心蒸发器中蒸发干燥非冻结溶液，然后碾磨为期望的粒径。所得的粉末颗粒是玻璃状或结晶的，其中大部分玻璃状材料包被在表面上。用玻璃状材料包被生物材料的优点是增加产品的物理稳定性和减少颗粒中不利的分子间反应。在一个优选实施方案中，将冻结颗粒加载于盘上，并立即转移到真空干燥室，在真空干燥室中，干燥过程以三个主要步骤进行，包括：(1)在小于＜2000毫托的真空压力下冻结颗粒的任选的、短暂清洁和结构稳定的步骤，(2)在大于＞2000毫托的真空压力和高于浆料的凝固点之温度下的初级干燥步骤；和(3)在全真空压力和升高的温度下的次级及最后干燥步骤，时间为足以将干燥制剂的水活性降低至0.3Aw或更小。

该干的和稳定的生物组合物可以直接以片使用，或者研磨为粉末并且筛至平均粒径为约10μm至约1000μm。制剂可以作为浓缩粉末、作为重构液体(例如，饮料)或者其可以以片或粉末形式整合入现有食物或饲料产品中而直接施用于动物，包括人。

在下文中，将在优选实施方案的详细描述中对本发明的这些和其它优点和特征进行描述。

附图说明

图1示出市售益生菌和本发明的干组合物中的益生菌的加速稳定性。

图2示出在加速贮存条件(37℃和33％RH)下，组合物中玻璃增强剂与碳水化合物混合物的多种摩尔比对益生菌稳定性(副干酪乳杆菌，L.paracasei)的作用。

图3示出本发明的组合物对益生菌嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)的贮存稳定性的作用。在24℃和33％RH的加速贮存条件下，针对干益生菌的稳定性测试537天。

图4示出多种玻璃改进剂化合物对益生菌嗜酸乳杆菌的贮存稳定性的作用。在24℃和43％RH的加速贮存条件下，针对干益生菌的稳定性测试180天。

图5示出多种蛋白质水解产物/糖的比例对益生菌乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的贮存稳定性(35℃和43％RH)的作用。

图6示出益生菌鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)的最大稳定性的pH优化(在40℃和33％RH的加速贮存条件下8周)。

具体实施方式

定义

应当理解，本文中所使用的术语是仅出于描述特定实施方案的目的，而并非意在限制。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非内容清楚地指出，否则单数形式包括复数指称。因此，例如，提及“蛋白质”包括单一蛋白质或者两种或者更多种蛋白质的组合；提及“酶”、“细菌”等包括单一细菌或者若干类型的混合物等。

在描述和要求保护本发明时，将根据下文中给出的定义来使用以下术语。

“生物材料”、“生物组合物”或“生物活性制剂”是指形式为使生物活性成分或生物活性剂的生物活性明确有效的制剂。

“玻璃增强剂”是在临界温度-玻璃化转变温度(Tg)下能够形成无定形结构或玻璃化结构的化合物。如果玻璃增强剂在其Tg下干燥，则将形成玻璃。但是，如果玻璃增强剂在高于其Tg下干燥，则不形成玻璃。在玻璃状结构形成期间，生物物质可以变得包埋于玻璃结构中。适用于本发明的玻璃增强剂包括但不限于有机酸(如乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸、谷氨酸等)的盐。盐可以包括阳离子如钠、钾、钙、镁、磷酸盐等。其它可用的玻璃增强剂包括蛋白质、蛋白质水解产物、多肽和氨基酸。玻璃形成剂的组合也包含于单一组合物中。出于本发明的目的用于获得玻璃化结构的方法一般是溶剂升华和/或蒸发技术。理想地，与非GRAS相比，化合物优选为GRAS化合物。

“碳水化合物”或“多羟基化合物”是指主要由碳、氢和氧构成的多糖。多糖通常由以线性或非线性形式连接的重复结构单元的糖骨架构成，一些重复结构单元包含带正电或带负电的化学基团。重复单元可以为两个至数百万个不等。可用的多糖包括还原性糖和非还原性糖，和糖醇、二糖、寡糖、水溶性多糖及其衍生物。两个单糖连在一起形成二糖。用于形成二糖的两个单糖可以相同或不同。可用于本发明的碳水化合物混合物中的二糖的实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖。也可以使用硫酸化二糖。小数目的单糖连接在一起(通常形成三至十)形成寡糖。用于形成寡糖的单糖可以是相同组成的糖或不同组成的糖。适于使用的寡糖的实例包括菊粉、麦芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其组合。大数目的单糖连接在一起(一般大于十)形成多糖。用于形成多糖的单糖可以是相同组成的糖或不同组成的糖。适于使用的多糖的实例包括但不限于甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；可溶性淀粉或淀粉级分、黄原胶、瓜尔胶、果胶、角叉胶、半乳甘露聚糖、吉兰糖胶，包括这些的任意衍生物，邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧基-甲基-纤维素、藻酸钠、褐藻酸的盐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、阿拉伯胶、槐豆胶、壳聚糖及壳聚糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和改性淀粉以及环糊精。

“稳定的”制剂或组合物是这样的制剂或组合物：其中生物活性材料在贮存时基本保持其物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性。稳定性可以在选定的温度和湿度条件下测量一段选定的时间。在材料在事实上已贮存一段给定时间之前，可以使用趋势分析来评估预期的贮存期限。例如，对于活细菌，稳定性被定义为在预定的温度、湿度和时间段的条件下，失去1log的CEF/g干制剂所需的时间。

对于细菌，“活力”是指在适于细菌生长的营养介质上形成菌落(CFU或菌落形成单位)的能力。对于病毒，“活力”是指在合适的宿主细胞中感染和繁殖，导致在宿主细胞的菌苔上形成噬斑的能力。

“环境”室温或条件是在给定环境中的任意给定时间的那些。通常，环境室温为22℃至25℃，环境大气压和环境湿度易于测量并且根据一年中的时间、天气和气候条件、高度等而变化。

在上下文中，干制剂组合物的“水活性”或“Aw”是指水的可用性，并且表示系统中水的能量状况。其定义为样品上方水的蒸汽压除以在系统温度下纯水的蒸汽压。纯蒸馏水的水活性恰好为1或者Aw＝1.0。

在上下文中，贮存稳定性的“相对湿度”或“RH”是指在给定温度下空气中水蒸汽的量。相对湿度通常小于使空气饱和所需的湿度，并且以饱和湿度的百分数表示。

“干”及其变体是指脱水或无水(即，基本缺乏液体)的物理状态。例如，干燥包括喷雾干燥、流化床干燥、冻干和真空干燥。

“冻干”或冷冻干燥是指通过快速冷冻和在冻结状态下脱水(有时称为升华)来制备干形式的组合物。冻干发生在导致聚合物结晶的温度下。该过程可在足以保持冻结产品优选地低于约＜2000毫托的压力下于真空下发生。

对于本文所述的工艺，“初级干燥”或“液体干燥”是指在将冻结颗粒融化到次级干燥开始的点的时间发生的脱水干燥。通常，大部分初级干燥通过广泛蒸发而发生，而产品温度保持显著低于热源的温度。该工艺可在足以保持融化产品的压力下(优选地大于约＞2000毫托)于真空下发生。

对于本文所述的工艺，“次级干燥”是指在高于制剂的冷冻温度和接近热源之温度的温度下发生的干燥步骤。该过程可在足以降低制剂的水活性的压力下(优选地小于约＜1000毫托)于真空下发生。在通常的制剂干燥工艺中，次级干燥步骤将制剂的水活性降低至Aw为0.3或更小。

本发明的组合物和干燥方法解决了提供经济有效并且可以以工业规模冻结或干燥的制剂的问题，所述制剂包含敏感的生物活性材料，如肽、蛋白质、激素、核酸、抗体、药物、疫苗、酵母、细菌、病毒和/或细胞悬液，其具有显著延长的干态贮存期限。本发明提供了组合物保存和干燥的方法，其包括由无定形玻璃状结构的高度可溶的化合物来包围生物材料。冷冻和干燥工艺包括：将生物材料与组合物在浆料中混合，在液氮中迅速冷冻(snap-freeze)所述组合物浆料以形成滴、线或珠，在高真空下清洁冻结颗粒，然后通过在减压方案下蒸发水分同时向组合物供热来干燥糖玻璃形成物中的生物活性材料。

本发明基于这样的惊人发现：可以将生物材料保护于玻璃状结构中同时保持基本活性。当根据本发明将生物材料与组合物混合物组合物并真空干燥时，在长时间暴露于苛刻的温度和湿度条件下的过程中获得了优越的稳定性。本发明包括含有生物材料、可溶性碳水化合物与玻璃增强用羧酸盐的混合物的组合物。本发明的组合物与简单地通过普通干燥方法干燥的非粘性或浓缩的含糖组合物在其物理结构和功能上有本质的不同。例如，美国专利No.6,919,172公开了用于肺部给药的雾化组合物，其包含多种碳水化合物与柠檬酸钠的混合物。但是，该专利中描述的组合物缺乏对于增加的稳定性以及对于干燥具有高浓度糖的溶液的过程中期望物理结构的形成而言所必需的添加的蛋白质样化合物。该专利中所述的组合物还缺乏使得有效干燥解冻的溶液或者未冻结的溶液以增强玻璃形成的粘性或水凝胶结构。

在本领域中，通常通过在真空下使溶液起泡或者煮沸溶液以促进有效干燥来获得增强的玻璃状结构。起泡步骤一般导致深度煮沸和溶液的喷发，这是干燥未冻结溶液的不可避免的结果，因此，在小瓶或容器中只能得到溶液的非常低的负荷容量(参见，例如美国专利6,534,087，其中最终起泡的产物的厚度为小于2mm)。本发明的组合物和干燥方法避免了制剂的煮沸和起泡，从而使得单位干燥面积有高得多的负荷，因此，可以易于按比例扩大至生产大量材料而无需使用特殊设计的容器和托盘或装置。

广泛范围的生物材料可以与本发明的组合物一起使用以形成本发明的水性保存介质。然后，可以使该保存介质经历本发明的干燥过程以制成生物材料的稳定干粉。这些生物材料包括但不限于：酶，如胰腺酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、phitase、乳酸脱氢酶；蛋白质，如菊粉；疫苗；病毒，如腺病毒；细胞，包括原核细胞(包括细菌)和真核细胞，其它生物材料，包括药物、核酸和脂质囊泡。

益生菌已示出特别地获益于本发明的组合物和干燥方法。根据本发明的组合物和方法以制备了稳定的干益生菌粉末，所述方法包括将益生菌的新鲜冻结的培养物或者干培养物与碳水化合物和玻璃增强用化合物的混合物混合，在液氮中快速冷冻该粘性制剂以形成冻结的固体滴、线或珠，并通过初始地施加充分的真空压力来真空干燥以清洁并稳定冻结颗粒的结构，将制剂温度增加至高于冷冻温度，并提供20℃及更高的热源以促进初级的水去除。可以通过调节真空压力以及通过将热传导至制剂来实现将制剂的温度保持为高于凝固点。为了完成干燥过程并且进一步将制剂的水活性降低至低于0.3或更低的Aw，在最大的真空压力以及升高至70℃的温度下施加次级干燥步骤。这样的组合物可以在如40℃和33％RH的苛刻的贮存条件下保持稳定60天或者更长。

组合物的制备

用于制备本发明的稳定的冻结生物材料或者干粉生物材料的组合物包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂。当这样的材料与优选的生物活性材料在液氮中混合时形成珠线或滴，并且根据本发明方法可以有效地在无定形的玻璃状结构中干燥，并且提供大量的稳定的干组合物用于贮存和施用所述生物活性材料(参见图1-干燥后不同制剂的物理观察结果和水活性(Aw))。碳水化合物混合物为制剂提供了结构稳定性和/或为生物活性材料提供了物理和化学保护的益处，并且预防或减少重构或复水的不利作用。

碳水化合物混合物中的多糖级分可以为制剂提供增稠的粘度和提供在减压下对制剂密度特性的更佳的控制以及为本发明的干制剂组合物提供增加的结构轻度。优选的多糖(特别是活有机体)是水溶性胶，因为它们在温和温度下形成粘性凝胶的特殊性质。还发现某浓度的胶可以通过为制剂提供合适的粘度和密度并且使得制剂在特定粘度的初级液体干燥步骤过程中有效干燥制剂来有效地在真空下稳定制剂结构。某些胶还可以通过与二价或多价阳离子(例如，藻酸盐、胶质、壳聚糖)交联或者通过温度或pH变化(例如，凝胶、CMC、CAP、吉兰糖胶)来形成水凝胶。水凝胶溶液将防止与未冻结溶液的真空干燥相关的问题。

碳水化合物混合物中的的二糖级分包括多种糖和糖醇。优选的二糖是在冻结温度(例如，低于-20℃)下以及在水去除过程中不使制剂中的生物活性材料结晶和/或破坏或失稳的那些。例如，生物活性材料可以物理地包埋于玻璃形成糖(如蔗糖、乳糖或海藻糖)中以促进在干燥过程中分子结构的保持并且为干态的无定形基质赋予结构硬度。合适的二糖可以有效地代替干燥过程中水合作用失去的水，以防止对细胞膜和酶的变性的破坏(参见综述Crowe等，1998)。组合物中二糖的其它功能可以包括保护生物活性材料免于暴露于具有破坏性的光、氧、氧化剂和水分。合适的二糖必须易于溶解于溶液中。海藻糖是特别有吸引力的保护剂，因为它是见于在干旱期保持休眠状态的植物和活有机体(例如，细菌、真菌和无脊椎动物如昆虫和线虫)中的非还原性二糖。已示出海藻糖对于多种生物材料(包括蛋白质和其它生物大分子，如酶、血清、抗体、抗原和疫苗组分)而言是有效的保护剂(Sanchez等，1999，Intl.J.Pharm.185，255-266；Esquisabel等，1997，J.Microencapsulation，14，627-638)。在一些情况下，有利的是包含两种或更多种不同二糖(如海藻糖与蔗糖的混合物)以抑制结晶的形成，从而提高在贮存条件下，干生物活性材料制剂在延长的时间中的稳定性以及降低成本。

碳水化合物混合物中的寡糖级分包括菊粉、麦芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其组合物。寡糖缓和了与单独使用海藻糖作为多种保存生物材料的保护剂相关的若干问题。海藻糖单独作为稳定剂对于在脱水和复水过程中保护生物材料非常有效，但其不提供期望的长时间的贮存稳定性，尤其是在高温下和/或湿环境中。在本发明中，通过向碳水化合物混合物中添加寡糖(优选为菊粉)解决了该问题。

碳水化合物混合物中糖的优选的质量比为10∶0.1-4∶0.1-2的二糖/寡糖/多糖，更优选地，其中二糖/寡糖/多糖的重量比为约10∶0.2∶0.1至约10∶2∶1。优选地，碳水化合物混合物包含按总干物质的重量计的百分数为10％至90％的二糖、1％至10％的寡糖和0.1％至10％的多糖。

本发明的玻璃结构增强剂包括有机酸的盐，所述有机酸如乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸、谷氨酸等。盐可以包括阳离子如钠、钾、钙、镁、缓冲盐、磷酸盐等。实例包括柠檬酸钠、乳酸钠、马来酸钠、葡萄糖酸镁、抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、磷酸缓冲的盐等。一般，多价阴离子比单价阴离子更易于以较高的Tg形成玻璃。优选的阴离子将具有高Tg以及足以已知结晶的可溶性，从而形成鲁棒性玻璃状结构。在一些情况下，有机盐的混合物是可用的(例如，柠檬酸钠和抗坏血酸钠)。发现柠檬酸钠与糖分子的羟基基团反应并且通过其羧基基团成键，这导致玻璃化蔗糖的玻璃化转变温度的急剧增加(Kets等，2004.Citrate increases glass transition temperature of vitrifiedsucrose preparations Cryobiology，48：46-54)。柠檬酸钠是确认为GRAS(21CFR184.1751-柠檬酸钠)的常见的食品添加剂。组合物中柠檬酸钠的其它功能与其缓冲能力与相关，并且防止冻结过程中液体介质的pH急剧变化，该变化可以导致被冷冻干燥的蛋白质变性。

包含于组合物中以进一步增加其稳定性的其它合适的玻璃增强剂包括蛋白质、蛋白质水解产物、多肽和氨基酸。优选使用酪蛋白或豌豆，更优选水解的酪蛋白蛋白或水解的豌豆蛋白。“水解蛋白”是指已经历部分或完全的酸水解或酶水解从而产生分子量为约1kDa至约50kDa的水解蛋白的蛋白质。优选地，蛋白质底物的至少20％被转化为分子量为200道尔顿至2000道尔顿的肽。水解蛋白与全蛋白具有相同的氨基酸组成，并且可以从任意数目的商业来源得到。由于具有低变应原性，所以水解蛋白可以有利地用于高度敏感的消费者(如幼儿和老人)的某些食物中。

用于该组合物中的玻璃增强剂的量将根据总体组成及其预期干燥贮存条件而不同。一般，玻璃增强剂与总碳水化合物的摩尔比将为约0.01至约0.3。优选的组成构成摩尔为约0.1至0.2。

优选的组合物包含约0.5％至约90％的碳水化合物组分(至少包括二糖、寡糖和多糖)和由约0.5％至约40％的水解蛋白构成的蛋白质组分。更优选地，组合物包含约30％至约70％的碳水化合物组分和约10％至约40％的玻璃增强剂组分如蛋白质水解的蛋白质和羧酸，其中，碳水化合物组分包含约10％至90％、更优选约40％至80％的二糖；约1％至约10％、更优选约5％至10％的寡糖；和约0.1％至约10％、更优选约5％至约10％的多糖。组合物还包含被认为是另一玻璃增强剂组分的有机酸盐，并且包含基于组合物的总重量的约大于0.5％至20％的羧酸。

本发明的含生物材料的溶液和稳定用组合物可以包含显著量的总固体(减去溶剂(如水)的成分)，重量百分数为约20％至约60％，优选为约30％至50％。总固体的主要部分可以由生物活性材料、碳水化合物混合物和玻璃增强剂组成。例如，生物活性材料可以以约5％至30％w/v、优选为约10％至20％w/v存在于制剂中。培养基中组合物混合物的重量分数通常为约10％至约60％，优选为约20％至40％。本发明制剂的粘度通常大于1000厘泊(cP)，更优选大约5000cP；最优选大于10000cP。

稳定干制剂的制备方法

多种干燥技术可以有效地用于干组合物。虽然与冷冻干燥或真空干燥相比复杂性较小并且成本较低，但是这些方法一般对生物材料的破坏性更大。与使用冷冻干燥或冻干时相比，使用在环境温度或较高温度下进行的方法保存方法相比，许多生物材料更倾向于总构象变化和非期望的反应。因此，即使使用目前已知的保护剂时，许多复水生物材料自身的活性都不能令人满意，并且显著地低于通过低温干燥而保存的。

用于制备包含生物活性材料的稳定干制剂的优选方法包括：(1)通过将生物活性材料与本发明的组合物在水性溶液中混合来制备粘性浆料制剂；(2)迅速冷冻浆料制剂以形成固体冻结颗粒；(3)任选地，使冻结颗粒在短时间内经历高真空压力以清洁颗粒并稳定其结构；(4)通过在高于制剂冻结温度的温度下蒸发水分来去除水；(5)在全真空和升高的温度下，将制剂水活性进一步降低至低于0.3Aw。

例如，可以将干形式的生物活性材料配制成包含组合物粉末混合物的溶液或悬液。在冷却以及与生物活性材料混合之前，可以将该组合物混合物溶解入温热的水性溶液中，同时低速搅拌(sheer agitation)。在重悬入制剂中之前，可以浓缩生物活性材料(如培养病毒或细菌)并通过离心或过滤将其与培养基分离。可替选地，制剂中水的总体提供于浓缩生物材料的液体中。将悬液保持在稍微高于室温的温度下，将干组合物粉末混合物缓慢地加入含生物材料的温热(25℃至40℃)悬液中。在行星式混合器中轻轻搅拌悬液直至所有组分都完全地分散或者溶解，获得均匀的浆料。

可以通过添加金属离子或者改变浆料的温度或pH来交联粘性溶液以形成水凝胶(取决于多糖特性)，然后根据本发明的干燥方法进行干燥。可替选地，可以通过经喷嘴雾化、滴下或注入干冰或液氮浴来迅速冻结浆料，以形成小颗粒或固体滴线或珠。可以将冻结的固体颗粒在-30℃至-80℃下储存于冷藏器中用于以后用作稳定的冻结产物或者直至干燥。优选的干燥方法是真空干燥，其中，产物温度保持在稍微高于其冷冻温度。将冻结的滴或珠置于盘负荷容量为约0.1千克/平方英尺至约1.5千克/平方英尺的盘上，根据本发明的方法进行干燥。优选地，干燥工艺是通过短的清洁步骤开始的，该步骤使得产物适应(acclimation)起始温度，并且使得冻结颗粒的结构松散且稳定，并且使过量的空气脱气。通常，清洁步骤需要1分钟至60分钟，这取决于产品粘度和盘的负荷。在整个清洁步骤中，珠或颗粒应当保持固体冻结形式。于是，产物温度达到高于其冻结温度，然后进行初级干燥，直至所有游离水从产物中蒸发。一旦制剂温度达到期望温度，则调节热以保持该温度，并且通过蒸发进行初级液体干燥步骤。在该步骤中，制剂被解冻，并且发生了加速的水蒸发，而没有任何煮沸或起泡。在最大真空和升高的温度下以附加的次级干燥期完成干燥过程。

本领域中的普通方法涉及可以对敏感的生物材料造成破坏并且导致难于在高负荷容量下工业规模生产的广泛起泡和/或溅射以及剧烈煮沸(参见例如，美国专利No.6,534,087，其中所施加的真空压力导致剧烈煮沸和起泡)。但是，现有组合物和方法避免了制剂的任何煮沸或起泡，同时获得显著更快的干燥速度，并且使得制剂具有高负荷容量。此外，粘性液体浆料的完全且有效的脱气是困难的并且可能需要延长的时间。通过使用使得形成玻璃状结构而无需任何煮沸和过量泡沫的有效初级液体干燥的合适的组合物，本发明解决了所有这些障碍。与浆料或粘性糖浆料相比，盘上固体冷冻颗粒的负荷比根据本领域所提供的盘上的单位干燥面积的负荷容量高得多。

在本发明的一个优选的实施例中，生物材料是活的浓缩的益生菌培养物。粉末组合物混合物优选地包含1％至4％的藻酸钠或吉兰糖胶、50％至75％的海藻糖、1％至10％的菊粉或FOS、10％至20％的蛋白质水解产物，如酪蛋白、乳清、豌豆、大豆或棉籽的水解产物和1％至10％的柠檬酸钠或抗坏血酸钠。益生培养物可以是新鲜的、冻结的或已干燥的干粉形式。将组合物混合物添加到浓缩的益生培养物介质中以使溶液混合物的固体含量为40％至60％(w/w)，用磷酸离子或柠檬酸例子将pH调节至6.5至7.5。将溶液在稍微高于室温的温度(通常为25℃至37℃)下混合直至所有组分都完全溶解。将粘性浆料滴入液氮中以形成小滴或珠，然后从液氮中将小滴或珠去除，装入袋中，并在-80℃下于冷藏器中贮存直至干燥。

活的益生菌的常用干燥方法包括：将固体冻结珠以均匀层散布在负荷容量为100至1500克/平方英尺的盘上，并且立即将盘置于冷冻干燥器中。然后施加约1000毫托或更低的真空压力，该压力取决于冷冻干燥器的尺寸和热源的类型，将搁板温度调节至将颗粒保持在约-20℃至约-30℃。清洁固体冻结珠约1分钟至约60分钟，并将真空调节至2000毫托至10,000毫托，以及将热传输增加至将制剂温度提高到-10℃至+0℃。在初级液体干燥步骤过程中保持这些温度和真空压力条件，所述步骤可持续几小时至24小时，这取决于盘负荷。在初级干燥过程中的某点，溶剂的蒸发速率变慢，制剂温度开始增加，这是因为在干燥室中过量供应的热。该点表示本发明的初级干燥步骤的结束。随着溶剂从制剂中出来，溶液中的玻璃形成用化合物变得浓缩并且更厚直至其停止作为液体流动，并且形成无定形的和/或稳定的玻璃状结构。

然后，接着在最大真空下进行次级干燥步骤，并且制剂温度为30℃至50℃。次级干燥步骤的目的是除去剩余的截留水分或者结合水份，并且提供在环境温度下在长时间内稳定贮存的组合物。次级干燥步骤可持续数小时，并且其结束点为制剂完全干燥并且其水活性低于0.3Aw时。

本发明的干燥方法引起生物活性材料被无定形的玻璃状结构包住，从而防止蛋白质的折叠或变性，并且显著地减缓分子相互作用或交叉反应，这是由于无定形的玻璃状组合物中的化合物和其它分子的大大降低的移动性。只要无定形固体结构保持在低于其玻璃化转变温度的温度下，并且残余水分保持较低(即，Aw低于0.5)，则益生菌可以保持相对稳定。应当注意，玻璃状结构并非长时稳定性的先决条件，因为一些生物材料可以在更为结晶的状态下更好。

干燥的玻璃状结构可以这样使用：以整体；切为期望的形状和大小，或者压成或者碾磨为自由流动的粉末，其提供容易的下游处理如湿凝集或干凝集、粒化、压片、压实、制丸或者任意其它种类的递送处理。压、碾磨、粉碎或研磨成粉的方法在本领域中是公知的。例如，可以使用锤式磨机、空气磨机、冲击式磨机、喷磨机、Wiley磨机或类似的碾磨装置。优选的颗粒大小为小于约1000μm，优选为小于500μm。

本文所述的组合物和方法在高于环境温度的温度和相对湿度下长时间稳定生物材料并保存其活性。例如，通过使它们经历升高的温度(例如，40℃)和高湿度(例如，33％RH)来测试组合物，并测量制剂的生物活性。作为活益生菌的实例，这些研究的结果表明，配制于这些组合物中的细菌稳定至少60天。稳定性定义为示出1l0g CFU/g效力的时间。这样的制剂即使在使用高浓度的生物活性材料时也是稳定的。因此，这些制剂的优点在于它们可以在室温或高于室温的温度下长时间运输和贮存。

实施例

提供了下述实施例以进行说明，但不限制所要求保护的发明。

实施例1

干且稳定的组合物的制备

基础碳水化合物混合物

将约70克的海藻糖(Cargill Minneapolis，MN)、约5克的速溶菊粉(Cargill Minneapolis，MN)和约3克的藻酸钠(ISP Corp.，Wayne，NJ)以干形式均匀混合。

基础玻璃增强剂混合物

将约17克的酪蛋白水解产物或豌豆水解产物(ultra filtrated hydrolysates，Marcor，Carlstadt，NJ)与5克的柠檬酸钠或抗坏血酸钠(Sigma，St.Louis，MO)以干形式均匀混合。

益生菌的稳定

将鼠李糖乳杆菌的新鲜浓缩物(100ml，10％的固体，直接来自发酵产物)添加到共混器中并保持在35℃。将约78克的基础碳水化合物混合物和约22克的基础玻璃增强剂混合物缓慢加入益生培养物中，并在35℃下实施混合10分钟。然后，将粘性浆料转移到具有多孔底的容器中，并且使其滴入包含液氮的浴中。然后从液氮中除去珠，并且立即调整至干燥。

包含益生菌的冻结珠的干燥

将冻结珠散布在负荷容量为200克/平方英尺的盘上，并且立即置于冷冻干燥器(Model25SRC，Virtis，Gardiner，NY)中的搁架上。然后，将真空调节至2000毫托至2700毫托，将搁架温度提高至+30℃。将这些温度和真空压力设置保持5小时。任选地，在通过施加约1000毫托的真空压力和清洁固体冻结珠约10分钟来起始初级液体干燥之前，将冻结珠的温度适应为约-20℃。然后，在初级干燥步骤之后，将真空压力调节至2000毫托至2700毫托，搁架温度升高至+30℃。将这些温度和真空压力设置为保持5小时。接着，在全真空(150毫托至200毫托)下进行次级干燥步骤，再将搁架温度在30℃至50℃下保持3小时。完全干燥制剂，并且通过Hygropalm Awl仪((Rotonic Instrument Corp.，Huntington，NY.)在Aw＝0.23下测量其水活性。

实施例2

干益生菌的贮存稳定性

图1示出来自实施例1的干稳定益生菌和市售干益生菌(Culturelle，Amerifit，Inc.，Cromwell，CT)在40℃和33％RH与30℃和43％RH的两种不同加速贮存条件下的贮存稳定性。在加速贮存条件下，市售益生菌在前几周完全示出其活力，而本发明益生菌的干组合物在30℃和43％RH下60天后仅示出了1.18logs以及在30℃和43％RH下仅1.09logs。

实施例3

包含益生菌鼠李糖乳杆菌的稳定干组合物的大规模生产。

在37℃下，将鼠李糖乳杆菌(来自市售来源的400克冻结浓缩物)在有罩的双行星混合器(DPM，lqt，Ross Engineering，Inc.Savannah，GA)中解冻，用蒸馏水将固体含量调节为按重量计10％的固体。将约212克的海藻糖(Cargill Minneapolis，MN)、约20克的速溶菊粉(CargillMinneapolis，MN)、约12克的藻酸钠(ISP Corp.，Wayne，NJ)、约136克的酪蛋白水解产物(ultra filtrated hydrolysates，Marcor，Carlstadt，NJ)和约20克的抗坏血酸钠(Sigma，St.Louis，MO)以干形式均匀混合。将粉末混合物缓慢地添加到益生培养物中，并在37℃下，以40RPM实施混合10分钟。然后将浆料转移到具有多孔底的容器中，并使其滴入含液氮的浴中。然后从液氮中除去珠，置于密封的铝箔袋中，并在-80℃下于冷藏起中贮存数周。

对于干燥，将冻结珠均匀地散布在负荷容量为500克/平方英尺至1500克/平方英尺的盘上，并且将盘置于冷冻干燥器(Model25SRC，Virtis，Gardiner，NY)的搁架上。通过将真空压力调节至2000毫托至2700毫托来起始初级液体干燥步骤，将产物温度提高并稳定为-10℃至-5℃。随时间推移(约10小时至16小时)，产物温度增加至约20℃至25℃，在该点，次级干燥步骤以最大真空(150毫托至200毫托)起始，并且将产物温度在30℃至40℃下再保持14小时。将制剂完全干燥，以0.23Aw测量水活性。

实施例4

包含益生菌乳双歧杆菌的稳定干组合物的大规模生产

在37℃下，将乳双歧杆菌(来自市售来源的400克冻结浓缩物)在有罩的双行星混合器(DPM，lqt，Ross Engineering，Inc.Savannah，GA)中解冻，将约212克的海藻糖(Cargill Minneapolis，MN)、约20克的速溶菊粉(Cargill Minneapolis，MN)、约12克的藻酸钠(ISP Corp.，Wayne，NJ)和约20克的抗坏血酸钠(Sigma，St.Louis，MO)以干形式均匀混合。将粉末混合物缓慢地添加到益生培养物中。将约136克的豌豆水解产物(ultra filtrated hydrolysates，Marcor，Carlstadt，NJ)溶解于80克蒸馏水中，将混合物短暂地经微波处理或者在水浴中温热至60℃，脂质完全分解，然后冷却至约35℃。将干混合粉末和包含豌豆蛋白水解产物的溶液添加到益生浓缩物中，并在37℃下以40RPM实施混合20分钟。然后，将浆料转移到具有多孔底的容器中，并使其滴入含液氮的浴中。然后从液氮中除去珠，置于密封的铝箔袋中，并在-80℃下于冷藏起中贮存数周。

对于干燥，将冻结珠均匀地散布在负荷容量为500克/平方英尺至1500克/平方英尺的盘上，并且将盘置于冷冻干燥器(Model25SRC，Virtis，Gardiner，NY)的搁架上。通过将真空压力调节至2000毫托至2700毫托来起始初级液体干燥步骤，将产物温度提高并稳定为-10℃至-5℃。随时间推移(约10小时至16小时)，产物温度增加至约20℃至25℃，在该点，次级干燥步骤以最大真空(150毫托至200毫托)起始，并且产物温度在30℃至40℃再保持14小时。将制剂完全干燥，以0.23Aw测量水活性。

实施例5

包含益生菌乳双歧杆菌的水凝胶制剂的制备

根据实施例1制备乳双歧杆菌的浓缩的益生浆料。向基础制剂中添加0.5克的二碱式磷酸钙，然后添加0.5克的葡萄糖酸内酯。在接下来的2个小时中，使浆料在室温下硬化以形成固体水凝胶。使用市售的切片机/撕碎机将坚固的凝胶切为薄且长的线。薄线直接以湿形式加载于盘上或者在液氮中迅速冻结，并加载于负荷容量为500克/平方英尺的盘上，并置于冷冻干燥器中用于如实施例3所述的干燥。制剂的水活性(Aw)为0.05(由HygroPalm Awl，Rotonic Huntington，NY测量)。使用标准的锤磨装置进一步将干制剂研磨为细粉末，并通过50微米至250微米筛过滤。

实施例6

玻璃增强剂与碳水化合物混合物的摩尔比的优化

根据权利要求1制备了包含多种摩尔比例的玻璃增强剂与碳水化合物混合物的若干组合物。从市售来源获得了益生菌副干酪乳杆菌的浓缩培养物，并如实施例1所述制备于干组合物中，除了将浆料以湿形式直接加载于盘上，而无需急冷步骤和清洁步骤。如实施例1和3所述将浆料在初级阶段和次级阶段中干燥，除了在初级干燥步骤和次级干燥步骤中将搁架温度升高至40℃以外。在37℃和33％RH下，使稳定粉末经历加速贮存条件84天。图2示出多种摩尔比对干细菌的稳定性的作用。结果表明，玻璃增强剂与碳水化合物混合物的最佳摩尔比为约0.12至0.15。

实施例7

本发明的组合物对益生菌嗜酸乳杆菌的贮存稳定性的作用

制备了如实施例1所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂混合物的组合物。从市售来源获得了益生菌嗜酸乳杆菌的浓缩培养物，并如实施例1和3所述制备于干组合物中，在37℃和33％RH下，使稳定粉末经历加速贮存条件537天。图3示出用本发明的组合物配置的益生菌的优越稳定性。结果表明，在特定条件下，搁架贮存经537天，益生菌的活力降低了仅0.18log。

实施例8

多种玻璃增强剂化合物对益生菌嗜酸乳杆菌的贮存稳定性的作用

制备了包含如实施例1所述的碳水化合物混合物的和含有酪蛋白水解产物和柠檬酸钠或抗坏血酸钠或二者之组合的玻璃增强剂的若干组合物。益生菌嗜酸乳杆菌的浓缩培养物得自商业来源，并制备于如实施例1所述的干组合物中，除了立即将浆料以湿形式加载于盘上以外，而无需急冷和清洁步骤。如实施例1和3所述在初级阶段和次级阶段干燥浆料，使稳定的粉末经历24℃和43RH％的加速贮存条件180天。图4示出多种玻璃增强用化合物对干燥细菌的作用。结果表明，在蛋白质水解产物的顶上包含额外的玻璃增强剂得到了更佳的稳定性。特别地，包含等量的乙酸钠和抗坏血酸钠提供了最稳定的组合物。来自实施例5和6二者的结果还表明，根据细菌菌株，多种玻璃增强剂可以更有效，或者甚至可以作为失稳剂。

实施例9

多种蛋白质水解产物/糖的比例对益生菌乳双歧杆菌的贮存稳定性的作用

制备了如实施例1所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂的若干组合物和等量但比例不同的豌豆水解产物/海藻糖的组合物(有或没有抗坏血酸钠)。益生菌乳双歧杆菌的浓缩培养物得自商业来源并且制备于如实施例1和3所示的干组合物中，使稳定粉末经历35℃和43RH％的加速贮存条件7周。图5示出比例为1∶4、1∶2.5和1∶1.5的豌豆水解产物/海藻糖(有或没有抗坏血酸钠)对干细菌的稳定性的影响。结果表明在增加比例的豌豆水解产物/海藻糖获得了显著更佳的稳定性。特别地，比例为1∶1.5的豌豆水解产物/海藻糖提供了更稳定的组合物。与不含抗坏血酸钠的制剂相比，包含更高的豌豆水解产物/海藻糖比例的抗坏血酸钠导致优越的稳定性。

实施例10

益生菌鼠李糖乳杆菌的最大稳定性的pH优化

制备了如实施例所述的包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂之pH不同的若干组合物。益生菌鼠李糖乳杆菌的浓缩培养物得自商业来源并且制备于实施例1和3所述的干组合物中。使稳定粉末经历40℃和33RH％的加速贮存条件8周。图6示出浆料对于干细菌稳定性的pH作用。结果表明，在中性pH(～7)得到了最佳稳定性。

实施例11

包含酶的稳定的干粉

通过将400克的碳水化合物和200克如实施例1和4所述的玻璃增强剂混合物和400克的phitase在1000ml的水中混合物来制备包含40重量份的phitase(BASF，GmBH)的水凝胶配方。将粉碎的水凝胶制剂在液氮中迅速冻结，并在50℃的初级干燥温度和次级干燥温度下于真空烘箱中干燥。对于确定干燥配方的负荷和贮存稳定性：在微量离心管中对干样品进行精确称重(＜100mg)。添加200μl的二甲亚砜。通过涡流将制剂溶解于DMSO缓冲剂中。向该样品中添加0.8ml的包含0.05N NaOH、0.5％SDS和0.075M柠檬酸(三钠盐)的溶液。将管在45℃下超声处理10分钟。将等份的清洁DMSO/NaOH/SDS/柠檬酸溶液加入微板的孔中，并施用Bradford测定法分析蛋白质含量。在95℃下暴露20分钟后，稳定的酶干组合物的稳定性显著高于不含本发明组合物的酶。

实施例12

包含感染性鲑鱼贫血病毒的稳定的干粉末

除将20mi4％的壳聚糖溶液在0.5％乙酸中添加到包含ISAV疫苗浓缩物、碳水化合物混合物和玻璃增强剂的浆料中以外，根据实施例4制备ISAV疫苗(Novozyme，Denmark)的浓缩浆料。添加0.5g的二碱式磷酸钙，然后添加0.5g的葡萄糖酸内酯。使浆料在接下来的2小时中在室温下变硬以形成固体水凝胶。使用市售切片机/粉碎机将坚固的胶切为细线和长线。将细线直接以湿形式负荷在盘上，或者在液氮中迅速冻结，并负荷在负荷容量为1500克/平方英尺的盘上，置于冷冻干燥器中并如实施例3所述进行干燥。制剂的水活性(Aw)为0.25。使用标准的锤磨装置将干制剂进一步研磨为细粉末，并经50微米至150微米的筛进行过滤。稳定的干ISAV组合物关于通过上层包被有干组合物的商业饲料来进行经口免疫，并施予大西洋鲑鱼。

实施例13

入侵物种诱饵的制备

根据本发明的用于特定地靶向入侵物种的丸状诱饵制备为包含杀虫剂。制备200克的如实施例9所述的制剂，添加到200克的水中。向该溶液中添加90克的鱼藤酮和0.5克的二碱式磷酸钙，然后添加0.5克的葡萄糖酸内酯。立即将浆料在标准工业喷雾干燥器中干燥，干燥制剂用于靶向特定的入侵物种，而对环境或附近的生态系统没有毒素的有害作用。

实施例14

受保护的植物益生菌制剂的制备

根据实施例4将生物控制剂(如根际细菌(Rhizobacteria))制备于干组合物中。在无菌条件下针对莴苣生长来评价干根际细菌组合物的有效性。将100mg的根际细菌干组合物/植物的剂量接种到具有沙的容器中，并种植预发芽(24小时)的莴苣种子。将营养剂5ml的无菌霍格兰溶液施加至容器中的植物。容器在保持在28℃的生长室中随机排布，光周期为12小时。在接种后每隔7天期间，小心地从容器中移出植物和粘沙。在无菌磷酸盐缓冲剂(pH7.0)中洗涤根，记录根长度的测量值。

参考文献

下述文献的内容就全部目的而言通过引用并入本文。

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以下内容对应于母案申请的原始权利要求书：

1.一种用于生物材料的干的稳定用组合物，基于所述组合物的总重量，其包含占约0.5％至90％的碳水化合物组分；和占约0.5％至40％的水解的动物或植物蛋白质的蛋白质组分。

2.根据项1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分是选自寡糖、多糖和二糖中的至少一种糖，其中基于所述碳水化合物组分的总重量，所述寡糖为约5％至10％，二糖为40％至80％，所述多糖为5％至10％。

3.根据项1所述的干的稳定用组合物，其中所述生物材料包括：活的、死的或减弱的细胞、微生物、病毒、细菌、益生菌、植物和土壤细菌、或酵母、细胞培养物、蛋白质、重组蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、药物及其混合物。

4.根据项1所述的干的稳定用组合物，其中所述水解的蛋白质组分包括：水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白质、水解的豌豆蛋白质、水解的大豆蛋白质及其混合物。

5.根据项1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包括多糖、寡糖、二糖及其混合物。

6.根据项2所述的干的稳定用组合物，其中所述多糖组分包括：邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧基-甲基-纤维素、胶质、藻酸钠、藻酸的盐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉胶、吉兰糖胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和改性淀粉及其混合物。

7.根据项2所述的干的稳定用组合物，其中所述寡糖组分是环糊精、菊粉、麦芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其混合物。

8.根据项5所述的干的稳定用组合物，其中所述二糖组分是海藻糖、蔗糖、乳糖及其混合物。

9.一种用于生物材料的干的稳定用组合物，基于所述组合物的总重量，其包含占约0.5％至90％的碳水化合物组分；占约0.5％至40％的水解的动物或植物蛋白质的蛋白质组分；和占约0.5％至20％的羧酸的羧酸组分。

10.根据项9所述的干的稳定用组合物，其中所述羧酸组分包括：乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡萄糖酸、谷氨酸及其盐或其混合物。

11.根据项9所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包含占约5％至10％的寡糖、占40％至80％的二糖、和占5％至10％的多糖。

12.根据项9所述的干的稳定用组合物，其中所述生物材料包括：活的、死的或减弱的细胞、微生物、病毒、细菌、益生菌、植物和土壤细菌，或酵母、细胞培养物、蛋白质、重组蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、药物及其混合物。

13.根据项9所述的干的稳定用组合物，其中所述水解的蛋白质组分包括：水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白质、水解的豌豆蛋白质、水解的大豆蛋白质及其混合物。

14.根据项9所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包括多糖、寡糖、二糖及其混合物。

15.根据项11所述的干的稳定用组合物，其中所述多糖组分包括：邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧基-甲基-纤维素、胶质、藻酸钠、藻酸的盐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉胶、吉兰糖胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和改性淀粉及其混合物。

16.根据项11所述的干的稳定用组合物，其中所述寡糖组分是环糊精、菊粉、麦芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)及其混合物。

17.根据项14所述的干的稳定用组合物，其中所述二糖组分是海藻糖、蔗糖、乳糖及其混合物。

18.根据项1或9所述的用于生物材料的干的稳定用组合物，其中所述组合物被干燥为无定形玻璃态。

19.根据项2或11所述的干的稳定用组合物，其中二糖/寡糖/多糖的重量比为约10∶0.2∶0.1至约10∶2∶1。

20.一种干燥方法，其中所述干燥是选自以下的一种或更多种工艺：冷冻干燥、空气干燥、真空干燥、流化床干燥和喷雾干燥。

21.一种用于生物材料的干的稳定用组合物的制备方法，其包括：(a)将生物材料与项1或9中所述的化合物的混合物在水性溶剂中组合以形成粘性浆料；(b)将所述浆料在液氮中迅速冷冻以形成固体冻结颗粒、珠、滴或线；(c)在高于其冷冻温度的配制温度下，通过在真空下蒸发来进行制剂的初级液体干燥步骤；(d)在最大真空和20℃或更高的温度下进行所述制剂的次级干燥，进行次级干燥的时间足以降低所述制剂的水活性。

22.根据项21所述的制备方法，其还包括在起始所述初级干燥步骤之前，所述固体冻结颗粒的适应步骤。

23.根据项21所述的制备方法，其中所述干的稳定用组合物被干燥为无定形玻璃态。

24.根据项21所述的制备方法，其中在迅速冷冻之前，通过pH或温度变化或者通过聚合物链的交联将所述浆料固化为坚固的水凝胶。

25.根据项24所述的制备方法，其中将所述浆料模制为期望形状。

26.根据项22所述的制备方法，其中在真空和低于所述制剂凝固点的温度下实施所述适应步骤。

27.根据项22所述的制备方法，其中所述适应步骤实施0分钟至60分钟。

28.根据项21所述的制备方法，其中在高于＞2000毫托的真空压力下实施所述初级液体干燥步骤。

29.根据项21所述的制备方法，其中将所述干的稳定用组合物切、压、碾磨或者分别粉碎为自由流动的粉末。

30.根据项29所述的制备方法，其中所述粉末的粒径小于约1000μm。

31.根据项21所述的制备方法，其中所述干的稳定用组合物的水活性(Aw)为Aw＜0.3或更低。

32.一种经口递送制剂，其包含根据项1或9所述的干的稳定用组合物，其中，所述制剂为以下形式：重构的液体、研磨的粉末、片剂、丸剂、胶囊、食品或饲料产品。

33.一种经口递送制剂，其包含根据项1或9所述的组合物，其中所述生物材料在所述制剂的贮存期限过程中是稳定的。

34.一种经口递送制剂，其包含根据项1或9所述的干的稳定用组合物，其中所述制剂作为食品、动物饲料、营养品、药品或疫苗产品而被消耗。

35.根据项1或9所述的用于生物材料的干的稳定用组合物，其中所述组合物作为以下形式的食品、食品添加剂、动物饲料、动物饲料添加剂、营养品、药品或疫苗产品而被消耗：杆、液体配方、胶状悬液、粉末、片剂、胶囊。

Claims (24)

1.一种用于生物材料的干的稳定用组合物，基于所述组合物的总重量，其包含占0.5％至90％的碳水化合物组分；和占0.5％至40％的水解的动物或植物蛋白质的蛋白质组分，

其中所述生物材料包括：活的、死的或减弱的病毒、细菌、酵母、细胞培养物、蛋白质、肽、疫苗、药物或其混合物；

其中所述组合物还包含占该组合物总重量的0.5％至20％的羧酸组分，其中所述羧酸组分包括玻璃增强用羧酸盐。

2.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分是选自寡糖、多糖和二糖中的至少一种糖，其中基于所述碳水化合物组分的总重量，所述寡糖为5％至10％，二糖为40％至80％，所述多糖为5％至10％。

3.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述水解的蛋白质组分包括：水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白质、水解的豌豆蛋白质、水解的大豆蛋白质或其混合物。

4.根据权利要求2所述的干的稳定用组合物，其中所述多糖组分包括：邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧基-甲基-纤维素、胶质、藻酸钠、藻酸的盐、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉胶、吉兰糖胶、瓜尔胶、阿拉伯胶、黄原胶、槐豆胶、壳聚糖和壳聚糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉、改性淀粉或其混合物。

5.根据权利要求2所述的干的稳定用组合物，其中所述寡糖组分是环糊精、菊粉、麦芽糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚甘露糖(MOS)或其混合物。

6.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包括选自海藻糖、蔗糖、乳糖或其混合物的二糖组分。

7.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包含占5％至10％的寡糖、占40％至80％的二糖、和占5％至10％的多糖。

8.根据权利要求1所述的用于生物材料的干的稳定用组合物，其中所述组合物被干燥为无定形玻璃态。

9.根据权利要求2或7所述的干的稳定用组合物，其中二糖/寡糖/多糖的重量比为10∶0.2∶0.1至10∶2∶1。

10.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述生物材料包括：益生菌、植物细菌、土壤细菌、重组蛋白或其混合物。

11.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其由包括以下步骤的方法制得：(a)将生物材料与权利要求1中所述的化合物的混合物在水性溶剂中组合以形成粘性浆料；(b)将所述浆料在液氮中迅速冷冻以形成固体冻结颗粒、珠、滴或线；(c)在高于其冷冻温度的配制温度下，通过在真空下蒸发来进行制剂的初级干燥步骤；(d)在最大真空和20℃或更高的温度下进行所述制剂的次级干燥，进行次级干燥的时间足以降低所述制剂的水活性。

12.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述生物材料包括：酶、激素或抗生素。

13.根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述碳水化合物组分包括藻酸盐。

14.一种制造用于生物材料的干的稳定用组合物的制备方法，其包括：(a)将生物材料与权利要求1中所述的化合物的混合物在水性溶剂中组合以形成粘性浆料；(b)将所述浆料在液氮中迅速冷冻以形成固体冻结颗粒、珠、滴或线；(c)在高于其冷冻温度的配制温度下，通过在真空下蒸发来进行制剂的初级干燥步骤；(d)在最大真空和20℃或更高的温度下进行所述制剂的次级干燥，进行次级干燥的时间足以降低所述制剂的水活性，

其中所述生物材料包括：活的、死的或减弱的病毒、细菌、酵母、细胞培养物、蛋白质、肽、疫苗、药物或其混合物。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其还包括在起始所述初级干燥步骤之前，所述固体冻结颗粒的适应步骤，

其中所述适应步骤包括将所述固体冻结颗粒保持在真空和低于所述制剂凝固点的温度下。

16.根据权利要求14所述的制备方法，其中所述干的稳定用组合物被干燥为无定形玻璃态。

17.根据权利要求14所述的制备方法，其中在迅速冷冻之前，通过pH或温度变化或者通过聚合物链的交联将所述浆料固化为坚固的水凝胶。

18.根据权利要求14所述的制备方法，其中在高于＞2000毫托的真空压力下实施所述初级干燥步骤。

19.根据权利要求14所述的制备方法，其中所述干的稳定用组合物的水活性(Aw)为Aw＜0.3或更低。

20.根据权利要求14所述的制备方法，其中所述生物材料包括：益生菌、植物细菌、土壤细菌、重组蛋白或其混合物。

21.根据权利要求14所述的制备方法，其中所述生物材料包括：酶、激素或抗生素。

22.一种经口递送制剂，其包含根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中，所述制剂为以下形式：重构的液体、研磨的粉末、片剂、丸剂、或胶囊。

23.根据权利要求22所述的经口递送制剂，其中，所述制剂为食品或饲料产品形式。

24.一种经口递送制剂，其包含根据权利要求1所述的干的稳定用组合物，其中所述制剂作为食品、动物饲料、营养品、药品或疫苗产品而被消耗。