CN104244985A - 生物材料的稳定化组合物 - Google Patents
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Abstract
生物活性材料的干燥的稳定化组合物包括糖类和水解蛋白,并可形成为生物活性材料提供增强的稳定性的片剂或其它形式。包含生物活性材料的组合物可由下述方法进行制备,方法包括:(a)将生物活性材料与其它组分在水性溶剂中组合以形成粘性浆料;(b)将浆料在液氮中快速冷冻以形成固体冷冻颗粒、珠、滴或串;(c)在真空下将步骤(b)的产物除水来进行初级干燥并将该产物保持在高于其冻结温度的温度下;和(d)在最大真空和20℃或更高的温度下使步骤(c)的产物经充分时间的二级干燥,以将水活度降低至低于0.3Aw。
Description
相关申请的交叉参考
此申请是于2012年3月29日提交的美国申请No.13/378,106的部分延续案,其是于2011年1月28日提交的国际申请No.PCT/US11/22821的进入国家阶段的申请,其要求于2010年1月28日提交的美国临时申请No.61/299,315的优先权。此申请还是于2011年8月12日提交的美国申请No.13/208,459的部分延续案,其要求于2010年8月13日提交的美国临时申请No.61/373,711的优先权。此申请进一步要求于2012年3月23日提交的美国临时申请No.61/614,994、于2012年5月3日提交的美国临时申请No.61/642,094和于2012年5月13日提交的美国临时申请No.61/646,337的优先权。所有上述申请的内容均出于所有目的通过引用并入本文。
背景技术
在于高温和高湿度长期储存时,生物材料的结构和功能的保存对于食品、营养品和药品工业是至关重要的。通常,敏感的生物材料如蛋白质、酶、细胞、细菌和病毒必须长期保存以供日后使用。虽然已尝试了许多方法来稳定存储中的生物材料,但许多方法并不适合于敏感的生物活性材料,如活的或减毒的细菌和病毒。例如,传统的冷冻干燥兼有归因于冷冻和干燥的压力。此方法的冷冻步骤可带来不良影响,如蛋白质和酶的变性和细胞的破裂。
需要一种稳定化的组合物,其用于宽范围的生物材料,并在升高的温度和变动程度的湿度下(如在材料运输和保存过程中可能遇到的温度和湿度),在延长的时间段内提供生物材料的优异的稳定性和保存,而在再水化后仍然保留有显著量的活性。还需要可用于压片应用而不过量损失生物材料的活性的稳定化组合物,许多生物材料在压片过程中对遭遇到的高压和高温敏感。
发明内容
在一个方面中,本发明提供了一种生物活性材料的干燥的稳定化组合物,其包括碳水化合物组分和蛋白质组分,其中,以组合物的总重量计,碳水化合物组分包含约10%至80%寡糖、约5%至30%二糖和约1%至10%多糖,蛋白质组分包含约0.5%至40%水解的动物或植物蛋白。组合物可以与生物活性材料组合。
在另一个方面中,本发明提供了一种制备组合了生物活性材料的上述组合物的方法,其包括:(a)在水性溶剂中将生物活性材料与至少一种碳水化合物组分和蛋白质组分组合,以形成一种粘性浆料;(b)在液氮中快速冷冻浆料,以形成固体冷冻颗粒、珠、滴或串;(c)在真空下将步骤(b)的产物除水来进行初级干燥并将该产物保持在高于其冻结温度的温度下;和(d)在最大真空下且在20℃或更高的温度下使步骤(c)的产物经充分时间的二级干燥,以将水活度降低至低于0.3Aw。
在另一个方面中,本发明提供了通过挤压包埋到干燥的玻璃质(glassy)和无定形组合物中的敏感生物活性材料制备的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物包括一种或多种糖和一种或多种水解的蛋白质,其中,以组合物的总干重计,糖介于约10%至60%之间,水解的蛋白质介于约1%至40%之间。
在另一个方面中,本发明提供了一种制备上述片剂、丸剂或颗粒的方法,包括挤压包埋在干燥的玻璃质和无定形组合物中的敏感生物活性材料,其中干燥的玻璃质和无定形组合物由包括下述步骤的方法制备:(a)在水性溶剂中将生物活性材料与至少一种或多种糖类和一种或多种水解的蛋白组合,以形成一种粘性浆料;(b)在液氮中快速冷冻浆料,以形成固体冷冻颗粒、珠、滴或串;(c)在真空下将步骤(b)的产物除水来进行初级干燥并将该产物保持在高于其冻结温度的温度下;和(d)在最大真空下和20℃或更高的温度下使步骤(c)的产物经充分时间的二级干燥,以将水活度降低至低于0.3Aw。
附图说明
图1示出了可商业购买的益生菌和在本发明的干燥组合物中的益生菌的加速稳定性。
图2示出了在加速储存条件(37℃和33%RH)下组合物中各种摩尔比的玻璃质增强剂和碳水化合物混合物对益生菌稳定性(副干酪乳杆菌(L.paracasei))的影响。
图3示出了本发明的组合物对益生菌嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)的储存稳定性的影响。在24℃和33%RH的加速储存条件下测试干燥的益生菌的稳定性537天。
图4示出了各种玻璃质增强剂化合物对益生菌嗜酸乳杆菌的储存稳定性的影响。在24℃和43%RH的加速储存条件下测试干燥的益生菌的稳定性180天。
图5示出了各种蛋白质水解物/糖的比例对益生菌乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)的储存稳定性(35℃和43%RH)的影响。
图6示出了益生菌鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)的最大稳定性的pH优化(在40℃和33%RH的加速储存条件下8周)。
图7和图8:根据本发明方法的包含各种基质和玻璃质形成剂的冷冻固体珠形式的不同干燥组合物的目测和显微观察结果。
图9:干燥组合物中新鲜的、冷冻珠或干燥粉末培养物形式的鼠李糖乳杆菌培养物形式对其初始CFU计数的影响。
图10:包含鼠李糖乳杆菌的如在液氮或-80℃低温冰箱中的冷冻固体珠和在+4℃中的非冷冻粘性浆料形式的组合物的冻结温度对干燥组合物中细菌初始CFU计数的影响。结果仅显示在干燥前没有额外驱气步骤的浆料的冻结温度的影响。
图11:包含双歧杆菌的如在液氮中的冷冻固体珠和在+4℃中的非冷冻的粘性浆料形式的组合物的冻结温度对干燥组合物中细菌初始CFU计数的作用。结果仅显示在干燥前没有额外驱气步骤的浆料的冻结温度的影响。
图12:真空下冷冻的固体珠的驱气持续时间对干燥组合物中鼠李糖乳杆菌的初始CFU计数的影响。
图13:根据本发明的方法的组合物在冷冻干燥器中的干燥曲线。
图14:本发明的组合物和干燥方法中的鼠李糖乳杆菌的方法损失和干燥损失。
图15:干燥的益生菌鼠李糖乳杆菌组合物在40℃和33%相对湿度的储存条件下的稳定性趋势。
图16:常规冷冻干燥的嗜酸乳杆菌属(L.acidophilus sp.)或经本发明的组合物和方法配制之后的嗜酸乳杆菌属在40℃和43%RH时的货架储存稳定性。
图17:常规冷冻干燥的鼠李糖乳杆菌属(L.rhamnosus sp.)或经本发明的组合物和方法配制之后的鼠李糖乳杆菌属在40℃和43%RH以及30℃和60%RH时的货架储存稳定性。
图18证明了在压片机中的压缩对于在本发明的组合物中稳定化和保护的益生菌鼠李糖乳杆菌在40℃和43%RH的活力和储存稳定性的影响。
图19示出了与多种维生素和矿物质的混合物一起压片并储存于40℃和43%RH对于在本发明的组合物中稳定化和保护的益生菌鼠李糖乳杆菌的活力的影响。
图20说明了在压片机中的压缩对游离形式的或在本发明的组合物中保护的蛋白酶和脂肪酶的活性的影响。酶可单独压片或按等量混合后再压片。
具体实施方式
定义
应当理解,在本文中使用的术语的目的仅仅是为了描述具体实施方式,并不旨在限制。当在本说明书和随附的权利要求书中使用时,单数形式“一”、“一个”和“此”包括其复数形式,除非上下文明确指明不是如此。因此,例如,言及“蛋白质”则包括单个蛋白质或两种或两种以上蛋白质的组合;言及“酶”、“细菌”等则包括单个或几种类型的混合物,等等。
在描述和主张本发明时,将根据下述定义来使用下列术语。
“生物活性成分”、“生物活性材料”和“生物材料”都是指允许生物活性的微生物或成分。适用于本发明的生物活性材料包括但不限于肽、蛋白质、酶、激素、核酸、抗体、药物、疫苗、酵母、真菌、细菌(益生菌或其它)、土壤微生物、病毒和/或细胞悬浮液。
“生物组合物”是指处于允许生物活性成分或试剂的生物活性明确有效的形式下的制备物。
“玻璃增强剂”、“玻璃增强化合物”和“玻璃形成剂”在本文中可互换使用,指能在低于临界温度(玻璃转化温度(Tg))时具有形成无定形或玻璃质结构的能力的化合物。在玻璃质结构的形成中,生物物质可以包埋于玻璃结构中。适用于本发明的玻璃增强剂包括但不限于有机酸的盐,如乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡糖酸、谷氨酸等的盐。盐可以包括阳离子磷酸盐等,所述阳离子如钠、钾、钙、镁。其它有用的玻璃增强剂包括蛋白质、蛋白质水解物、多肽和氨基酸。玻璃形成剂的组合也可考虑在单一组合物中。用于获得用于本发明目的的玻璃质结构的方法通常是溶剂升华和/或蒸发技术。理想情况下,属于GRAS化合物的化合物优选于那些不属于GRAS的化合物。
“糖类”是指主要由碳、氢和氧组成的糖类。可用的糖类包括还原性和非还原性糖类和糖醇类和二糖类。连接在一起的两个单糖形成二糖。用于形成二糖的两个单糖可以是相同的或不同的。可在本发明的组合物中使用的二糖的实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖。也可使用硫酸化的二糖。
“碳水化合物”或“多羟基化合物”是指主要由碳、氢和氧组成的糖类。糖类通常由以线性或非线性方式连接的重复结构单元的糖骨架组成,其中一些包含带正电荷或负电荷的化学基团。重复单元的范围可以是二至数百万。有用的糖类包括还原性和非还原性糖类和糖醇类、二糖类、寡糖类、水溶性多糖类及其衍生物。连接在一起的两个单糖形成二糖。用于形成二糖的两个单糖可以是相同的或不同的。可在本发明的碳水化合物混合物中使用的二糖的实例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、异麦芽糖。也可使用硫酸化的二糖。连接在一起的少量单糖(通常为3至20个)形成寡糖。用于形成寡糖的单糖可以是相同或不同组分的糖。适合使用的寡糖的实例包括菊粉、麦芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露寡糖(MOS)及其组合。连接在一起的大量单糖(通常多于20)形成多糖。用于形成多糖的单糖可以是相同或不同组分的糖。适合使用的多糖的实例包括但不限于甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素;可溶性淀粉或淀粉片段、黄原胶、瓜尔胶、果胶、角叉菜胶、半乳甘露聚糖、结冷胶(包括这些化合物的任何衍生物)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧甲基纤维素、海藻酸钠、海藻酸盐、羟基丙基甲基纤维素(HPMC)、阿拉伯树胶、刺槐豆胶、脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和修饰的淀粉和环糊精。
“水解蛋白”是指蛋白质经部分或完全的酸解或酶解而产生的具有约1kDa至约50kDa的分子量的水解蛋白。在一些实施方式中,在本文中所指的“深度水解蛋白”是至少20%的蛋白底物被转换成具有200至2000道尔顿的分子量的肽。水解蛋白具有与完整蛋白大致相同的氨基酸组成,并且可获得自任何数量的商业来源。低变应原的水解蛋白可有利地用于某些用于超敏感消费者如婴儿和老人的食品。
“稳定的”制剂或组合物是其中的生物活性材料在储存后基本上保留其物理稳定性、化学稳定性和/或生物活性的制剂或组合物。对于选定的时间长度而言,可以在选定的温度和湿度条件下测量稳定性。可以使用趋势分析来估算预期的储存期限,然后才将材料实际储存该时间长度。例如,对于活细菌而言,稳定性被定义为在预定的温度、湿度和时间长度条件下失去1log的CFU/g干制剂所花费的时间。
对于细菌来说,“活力”是指在适合于细菌生长的营养介质上形成菌落的能力(CFU或菌落形成单位)。对于病毒来说,活力是指感染适合的宿主细胞并在适合的宿主细胞中繁殖,导致在宿主细胞的菌苔(lawn)上形成噬斑的能力。
“环境”室温或条件是在给定环境中任何给定时间的温度或条件。通常,环境室温是22-25℃,环境大气压力和环境湿度是容易测量的,并且随着一年中的时节、天气和气候条件、海拔等而变。
在干燥制剂组合物的情形中,“水活度”或“Aw”是指水的可利用率,并且表示系统中水的能量状态。它被定义为样品上水的蒸汽压除以纯水在相同温度下的蒸汽压。纯蒸馏水的水活度正好为1,即Aw=1.0。
在储存稳定性的情形中,“相对湿度”或“RH”是指在给定温度下空气中水蒸气的量。相对湿度通常低于使空气饱和所需的湿度,并用饱和湿度的百分数表示。
“干燥”及其变化形式是指脱水或无水,即实质上缺乏液体的物理状态。干燥包括如喷雾干燥、流化床干燥、冻干和真空干燥。
“冻干”或冷冻干燥是指通过快速冷冻并在冷冻状态下脱水(有时被称为升华)来制备干燥形式的组合物。冻干发生于导致糖结晶的温度下。此过程可以在足以维持冷冻产物的真空下(在一些实施方式中,低于约2000mTORR)发生。
对于本文中描述的方法来说,“初级除水”或“初级干燥”步骤或“液体干燥”是指从融化冷冻颗粒的时间到开始二级干燥的时间点之间所发生的脱水干燥。通常情况下,大部分的初级干燥是通过大量蒸发来进行的,同时将产物温度维持在显著低于热源的温度下。该过程可以在足以维持融化的产物的真空下(在一些实施方式中,高于约2000mTORR)发生。
对于本文中描述的方法来说,“二级干燥”是指在接近热源温度的制剂温度下发生的干燥步骤。此过程可以在足以降低制剂的水活度的真空下(在一些实施方式中,低于约1000mTORR)发生。在典型的制剂干燥过程中,二级干燥步骤将制剂的水活度降低至0.3或更低的Aw。
本发明包括在储存中保存敏感的生物活性材料如肽、蛋白质、激素、核酸、抗体、药物疫苗、酵母、细菌(益生菌或其它)、病毒和/或细胞悬浮液的组合物和干燥方法。
本发明的组合物和干燥方法解决了提供包含敏感的生物活性材料如肽、蛋白质、激素、核酸、抗体、药物、疫苗、酵母、细菌、病毒和/或细胞悬浮液的且在干燥状态下的寿命显著延长的成本效益高且在工业上可放大的干燥制剂的问题。本发明提供了包括由高可溶性化合物的无定形玻璃质结构所包围的生物材料的保存组合物和干燥方法。干燥方法包括:在液体浆料中混合生物材料和组合物,在液氮中快速冷冻所述组合物浆料以形成滴、串或珠,随后通过在减压法同时给组合物提供热量下蒸发水份来干燥糖玻璃构成中的生物活性材料。
本发明基于下述令人惊奇的发现,即生物材料可以被保护在玻璃质结构中并同时保持实质上的活性。当生物材料与根据本发明的组合混合物组合并干燥时,在延长的暴露于苛刻的温度和湿度条件下的时间内也可达到优越的稳定性。本发明包括包含生物材料、可溶性碳水化合物和玻璃增强羧酸盐的混合物的组合物。本发明的组合物在其物理结构和功能方面与经常用冷冻干燥过程简单干燥的非粘性或浓缩的含糖组合物具有本质上的区别。例如,美国专利No.6,919,172公开了一种用于肺部给药的雾化粉末组合物,其包含各种碳水化合物和柠檬酸钠的混合物。然而,在此专利中所描述的组合物缺乏额外的蛋白质类化合物,此化合物在干燥具有高浓度糖的溶液的过程中对于增加稳定性和形成所需的物理结构是至关重要的。在此专利中所描述的组合物还缺少粘性或凝胶结构,其允许有效干燥解冻或未冻的溶液形成增强玻璃结构。相反,本发明的组合物和干燥过程克服了所有这些问题,同时实现了生物材料的优越稳定性。现有技术还缺少额外的羧酸组分,此羧酸组分与水解蛋白一起协同作用以保护和稳定生物材料。
在现有技术中,通常通过在真空下发泡或沸腾溶液来促进有效干燥,来获得增强的玻璃质结构。发泡步骤通常引起溶液的大量沸腾和喷发,这是干燥未冻溶液不可避免的结果,因此,只能获得在小瓶或容器中非常低的溶液负载容量(参见例如美国专利No.6,534,087,其中最终发泡产物的厚度小于2mm)。本发明的组合物和干燥方法避免了制剂的沸腾和发泡,从而使单位干燥面积的材料负载大大提高,因此,能够容易地放大规模至生产大量材料,而无需使用特别设计的容器和托盘或设备。
宽范围的生物材料都可以使用本发明的组合物以形成根据本发明的水性保存介质。然后,此保存介质可进行本发明的干燥过程,以制备生物材料的稳定干燥粉末。这些生物材料包括但不限于:酶如胰腺酶、脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶(phitase)、乳酸脱氢酶;蛋白质如胰岛素;疫苗;病毒如腺病毒;包括原核细胞(包括细菌和真菌)和真核细胞的细胞,其它生物材料,包括药物、核酸、肽、激素、维生素、类胡萝卜素、矿物质、抗生素、杀菌剂、杀真菌剂、除草剂、杀虫剂、杀精子剂、抗体和脂质囊泡。
已经显示,益生菌特别受益于本发明的组合物和干燥方法。根据本发明的组合物和方法制备稳定的干燥益生菌粉末,其包括将益生菌的新鲜的、冷冻的或干燥的培养物与碳水化合物和玻璃增强化合物的混合物混合,在液氮中快速冷冻粘性制剂以形成冷冻的固体滴、串或珠,并且通过最初施加充足的真空使制剂温度高于冻结温度来进行干燥,并且供给20℃和更高的热源以促进初级除水。保持高于冻结点的制剂温度可以通过调节真空和传导热至制剂来实现。为了完成干燥过程并进一步降低制剂的水活度至0.3或更低的Aw之下,在最大真空中并在高达70℃的升高的温度时施加二级干燥步骤。这样的组合物可以在40℃和33%RH的储存条件中保持稳定30天或更长,如图15所示。
已经显示,在压制片中的活微生物如益生菌特别受益于本发明的组合物和干燥方法。根据本发明的组合物和方法制备稳定的干燥的生物粉末,其包括将单细胞有机体的新鲜的、冷冻的或干燥的培养物与糖、水解的蛋白和抗氧化剂的混合物混合,并且其可能包括额外量的多糖和寡糖和玻璃增强化合物,在液氮中快速冷冻粘性制剂以形成冷冻的固体滴、串或珠,并且通过最初施加充足的真空使制剂温度高于其冻结温度来蒸发水份,并且供给20℃和更高的热源以促进初级除水。保持高于冻结点的制剂温度可以通过调节真空和传导热或辐射热至制剂来实现。为了完成干燥过程并进一步降低制剂的水活度至0.3或更低的Aw之下,在最大真空中并在高达70℃的升高的温度时施加二级干燥步骤。
本发明的组合物
在一些实施方式中,制剂包含二糖、寡糖和多糖类的碳水化合物混合物,生物活性材料被包埋其中。合适的多糖的实例包括但不限于邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧甲基纤维素、果胶、海藻酸钠、海藻酸盐、羟基丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉菜胶、结冷胶(gellan gum)、瓜尔胶、阿拉伯树胶、黄原胶、刺槐豆胶、脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉和修饰的淀粉。合适的寡糖的实例包括但不限于环糊精、果聚糖、菊粉、FOS、麦芽糖糊精、葡聚糖等及其组合。合适的二糖的实例包括但不限于乳糖、海藻糖、蔗糖等。在一个具体实施方式中,合适的示例性多糖是海藻酸钠或结冷胶。在另一个实施方式中,制剂包含按总干物质重量百分比计0.1-20%的海藻酸钠。
在一些实施方式中,碳水化合物混合物包含按总干物质重量百分比计0.1-10%的多糖、1-10%的寡糖和10-90%的二糖。在另一个实施方式中,碳水化合物混合物包含重量比10:0.1-4:0.1-2的二糖、寡糖和多糖,或其中二糖/寡糖/多糖的重量比为从约10:0.2:0.1至约10:2:1。
在一些实施方式中,碳水化合物混合物中的二糖部分包括各种糖和糖醇。合适的二糖是那些在冻结温度(例如低于-20℃)和在除水过程中不结晶和/或不损害或不去稳定化制剂中的生物活性材料的糖。例如,生物活性材料可以在玻璃形成糖如蔗糖、乳糖或海藻糖存在的情况下进行干燥,以促进在整个干燥过程中保留分子结构并在干燥状态下传递结构刚度至无定形基质。合适的二糖会有效地替代在干燥过程中水合所损失的水,以防止细胞膜损伤和酶变性(参见综述Crowe等人,1998)。组合物中二糖的其它功能可以包括保护生物活性材料免于暴露于有害光、氧、氧化剂和水分。合适的二糖必须容易溶解在溶液中。海藻糖是一种特别有吸引力的保护剂,因为其是发现于在干旱期间保持休眠状态的植物和生物有机体(如细菌、真菌和无脊椎动物如昆虫和线虫)中的非还原性二糖。在某些情况下,为了延长时间段并减少成本,包括两种或更多种不同的二糖如海藻糖和蔗糖的混合物以抑制晶体形成并增强干燥的生物活性材料制剂在储存条件下的稳定性是有益的。
在一些实施方式中,碳水化合物混合物中的寡糖部分包括菊粉、麦芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露寡糖(MOS)及其组合。寡糖缓解与单独使用海藻糖作为保护剂以用于各种保存的生物材料相关的多个问题。虽然在脱水和复水过程中非常有效地保护了生物材料,单独将海藻糖作为稳定剂不能在延长的时间段中,尤其是在高温和/或潮湿环境中提供理想的储存稳定性。本发明通过将寡糖如菊粉添加到碳水化合物混合物中,使得这一问题得到解决。
碳水化合物混合物中的糖类的合适的示例性质量比为10:0.1-10:0.1-2的二糖/寡糖/多糖,在一些实施方式中,其中二糖/寡糖/多糖的重量比为从约10:0.2:0.1至约5:10:1。在一些实施方式中,碳水化合物混合物包含按总干物质重量百分比计10-90%的二糖、1-10%的寡糖和0.1-10%的多糖。在其它实施方式中,碳水化合物混合物包含按总干物质重量百分比计10-50%的二糖、10-80%的寡糖和0.1-10%的多糖。
在具体实施方式中,制剂包含寡糖的混合物。寡糖混合物能缓解与单独使用单一寡糖作为组合物中玻璃增强材料相关的多个问题。虽然非常有效地提高了玻璃转化温度,寡糖倾向于迅速地结晶并沉淀,并从而破碎了玻璃质无定形结构,特别是在高温和/或潮湿的环境下。本发明通过添加寡糖的混合物而不是单一型的寡糖(在一些实施方式中,是果聚糖和低DE糊精的混合物),使得这一问题得以解决。在一些实施方式中,碳水化合物混合物包含按总干物质重量百分比计5%-40%的果聚糖和5-40%的低DE糊精。
一种合适的组合物包含约0.5%至约90%的碳水化合物组分和蛋白质组分,碳水化合物组分包括至少二糖、寡糖和多糖,蛋白质组分包含约0.5%至约40%的水解的蛋白。在一些实施方式中,组合物包含约30%至约70%的碳水化合物组分和约10%至约40%的玻璃增强剂组分,如蛋白质水解的蛋白和羧酸,其中碳水化合物组分包含约10%至90%或约40%至80%的二糖;约1%至约10%或约5%至10%的寡糖;和约0.1至约10%或约5%至约10%的多糖。组合物进一步包括被认为是另一种玻璃增强剂组分的有机酸盐并包括按组合物总重量计介于约0.5%和20%之间的羧酸。
在另一个实施方式中,组合物包括按海藻酸钠/寡糖重量比计1:1-10(或1:1-5)的海藻酸钠和寡糖的混合物。
在本发明的另一个实施方式中,组合物与二价金属离子交联,以形成牢固的水凝胶。在一些实施方式中,通过在含有二价金属离子溶液的浴槽中雾化或挤出浆料,或通过直接将二价金属离子加入到浆料中并允许制剂硬化并形成水凝胶的方式形成交联的水凝胶制剂。然后将水凝胶制剂根据本发明的干燥方法进行快速冷冻并干燥。
在其它实施方式中,组合物包含显著量的玻璃增强化合物,此玻璃增强化合物包括有机酸的盐,如乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡糖酸、谷氨酸等的盐。盐可以包括阳离子,如钠、钾、钙、镁等。实例包括柠檬酸钠、乳酸钠、马来酸钠、葡糖酸镁、抗坏血酸钠等。优选具有高玻璃转化温度(Tg)和高溶解度的盐。示例性的有机酸包括柠檬酸及其盐(如柠檬酸钠或柠檬酸钾、脱水柠檬酸钠)和抗坏血酸及其盐(如抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸镁)。例如,在一些实施方式中,本发明的组合物包括二糖、寡糖和多糖的碳水化合物混合物和有机酸如柠檬酸和/或抗坏血酸的离子。
组合物中使用的玻璃增强剂的量将依整个组合物和其预期的干燥存储条件而变化。通常,组合物中玻璃增强化合物的量按总干物质重量计高于2%,且溶液或分散液的pH保持弱碱性(pH为7-7.5)。不被理论所束缚,据认为,如本文所述的相对高含量的玻璃增强化合物的功能不仅有助于所得到的干燥组合物的所期望的无定形和刚性玻璃质结构,还保护生物活性材料免于暴露在有害的光、氧气、氧化剂和水分中。合适的示例性组合物包括按总干物质重量计1-20%或约2-10%(总干物质重量百分比)的玻璃增强化合物。
其它合适的包含于组合物中以进一步增加其稳定性的玻璃增强剂包括蛋白质、蛋白质水解物、多肽和氨基酸。这些包括明胶、白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、酪蛋白盐、免疫球蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、棉籽蛋白或其它食品和乳制品或植物蛋白和/或其水解产物,或任何其它的水解的蛋白。聚氨基酸的实例包括聚丙氨酸、聚精氨酸、聚甘氨酸、聚谷氨酸等。有用的氨基酸包括赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸或组氨酸,以及疏水性氨基酸(色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等)和甲胺如甜菜碱。
在一些实施方式中,使用酪蛋白或豌豆蛋白或水解的酪蛋白或水解的豌豆蛋白。在一些实施方式中,组合物混合物中的水解的蛋白部分包括部分水解的或深度水解的蛋白、多肽和氨基酸。如本文所用,深度水解的蛋白是通过使用用于蛋白修饰(裂解)的蛋白酶深度酶解而获得的那些蛋白。在一些实施方式中,水解的动物或植物蛋白如酪蛋白、乳清、大豆蛋白或豌豆蛋白或深度水解的酪蛋白或豌豆蛋白。一些实施方式采用具有超过80%的分子量为约1kDa至约50kDa的短链肽的深度水解的蛋白,并且至少20%的蛋白底物被转变成分子量为200至2000道尔顿的肽。不被理论所束缚,据认为,由如本文所述的糖和深度水解的蛋白得到的混合物允许更快地干燥,并有助于所得到的干燥组合物的所期望的无定形和刚性玻璃质结构。酶解蛋白可以通过本领域技术人员已知的方法来制备或者可以自商业来源获得。合适的示例性组合物包括按总干物质重量百分比计5-40%的深度水解的蛋白。
干燥组合物中的蛋白、水解的蛋白或深度水解的蛋白和氨基酸的合适的示例性总量为干燥混合物总质量的约1%至约40%,或约5%至约40%,或约10%至约30%。
应注意的是,组合物中玻璃增强剂的合适量可能依赖于干燥组合物的所需特性。例如,可以使用包含碳水化合物混合物和蛋白质或蛋白质水解物的组合物来增强储存于温和温度和相对湿度下(如25℃和25%RH)的生物材料的化学稳定性。适当量的玻璃增强剂,尤其是二糖和寡糖之间的相对比例的确定,应根据所要求的储存条件来进行。例如,可以使用包含高比例的二糖/寡糖的组合物来增强储存于温和温度和相对湿度如25℃和25%RH下的生物材料的化学稳定性。可以使用包含低比例的二糖/寡糖的组合物来增强储存于高温和相对湿度下(如30℃和40%RH或更高)的生物材料的化学稳定性。
在一些实施方式中,可优选抗坏血酸离子用作玻璃增强剂以获得在暴露于较高温度和湿度时额外的稳定化益处。或者,在一些实施方式中,更优选柠檬酸盐和/或抗坏血酸盐离子与另一种玻璃增强剂如蛋白或蛋白水解物的组合。
在一些实施方式中,制剂包含糖和水解的蛋白的混合物,其中生物活性材料被包埋。合适的糖的实例包括但不限于二糖如乳糖、海藻糖、蔗糖及其混合物。合适的水解的蛋白的实例包括但不限于深度水解的明胶、白蛋白、乳清蛋白、大豆蛋白、酪蛋白、酪蛋白盐、免疫球蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白、棉籽蛋白或任何其它乳制品、动物或植物来源的深度水解的蛋白及其混合物。干燥组合物中糖的合适的示例性总量为干燥混合物的总质量的约10%至约80%,或干燥质量的约10%至约60%。
在一个示例性的实施方式中,玻璃形成剂包括二糖和水解的蛋白的混合物。在具体的实施方式中,合适的示例性玻璃形成剂是海藻糖和水解的蛋白的混合物。在一些实施方式中,制剂包含按总干物质重量百分比计10-90%的海藻糖和0.1-30%的水解的蛋白或20-80%的海藻糖和0.1-20%的水解的蛋白或40-80%的海藻糖和0.1-20%的水解的蛋白。
理想情况下,属于通常认为安全的化合物(GRAS)的化合物优选于那些不属于GRAS的化合物。其它包括赋形剂盐,如硫酸镁、多元醇如三羟或更多的糖醇(如甘油(glycerin)、赤藓醇、甘油(glycerol)、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇)、丙二醇、聚乙二醇、普朗尼克(pluronics)、表面活性剂和其组合物。
在一些实施方式中,生物材料包括活细菌(如益生菌)。合适的微生物的实例包括但不限于酵母,如糖酵母属(Saccharomyces)、德巴利氏酵母属(Debaromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤氏酵母属(Pichia)和球拟酵母属(Torulopsis),霉菌,如曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、青霉属(Penicillium)和球拟酵母属(Torulopsis),以及细菌,如双歧杆菌属(Bifidobacterium)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、蜜蜂球菌属(Melissococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、库克菌属(Kocuriaw)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、消化链球菌属(Peptostrepococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、片球菌属(Pediococcus)、微球菌属(Micrococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、魏斯氏菌属(Weissella)、气球菌属(Aerococcus)、酒球菌属(Oenococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)。合适的益生微生物的具体实例以下面的种为代表,并包括那些种中的所有培养生物型:黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(A.oryzae)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣形芽孢杆菌(B.licheniformis)、肠膜芽孢杆菌(B.mesentericus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、嗜淀粉拟杆菌(Bacteroides amylophilus)、多毛拟杆菌(Bac.capillosus)、瘤胃生拟杆菌(Bac.ruminocola)、猪拟杆菌(Bac.suis)、青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)、动物双歧杆菌(B.animalis)、短双歧杆菌(B.breve)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.longum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)、Candida pintolepesii、丁酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)、乳脂肠球菌(Enterococcus cremoris)、二丁酮肠球菌(E.diacetylactis)、屎肠球菌(E.faecium)、中间肠球菌(E.intermedius)、乳酸肠球菌(E.lactis)、E.muntdi、嗜热肠球菌(E.thermophilus)、大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、消化乳杆菌(L.alimentarius)、食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短小乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.case 4)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、纤维二糖乳杆菌(L.cellobiosus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiiss.bulgaricus)、香肠乳杆菌(L.farciminis)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、加氏乳杆菌(L.gasseri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、植物乳杆菌(L.plantarum)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、清酒乳杆菌(L.sakei)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、肠系膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、啤酒(有害)片球菌(P.cereviseae(damnosus))、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)、费罗伊登氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、薛曼纳氏丙酸杆菌(Prop.shermanii)、啤酒糖酵母(Saccharomyces cereviseae)、肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、木糖葡萄球菌(Staph.xylosus)、婴儿链球菌(Streptococcus in fantarius)、唾液链球菌嗜热亚种(Strep.salivariusss.thermophilus)、嗜热链球菌(Strep.Thermophilus)和乳链球菌(Strep.lactis)。
制备组合物的方法
一种合适的生物材料和组合物的混合方法是通过将总干燥组合物混合物添加到包含生物材料的浓缩培养物或介质溶液中。培养基中生物材料的重量质量通常介于约5%和30%w/v之间或介于约10%和20%w/v之间。培养基中所添加的组合物混合物的重量质量通常介于约10%和约60%之间或介于约20%和40%之间。混合浆料中的最终固体含量为约20%至约60%之间,更具体地约30%至约50%之间。在一些实施方式中,将溶液在室温下混合或稍微加热以帮助将材料溶解在粘性溶液中(例如20℃至40℃)。在本发明的变化形式中,调整制剂中碳水化合物混合物的总量,以获得期望的制剂粘度和密度以允许有效干燥,同时避免可能在干燥步骤中发生的橡胶状形成或过度发泡。合适的示例性浆料粘度是约1,000cP至约500,000cP,或约5,000cP至约300,000cP。最终浆料所需的粘度和密度可以通过任何本领域已知的手段来实现,例如略微调整碳水化合物混合物中多糖的量或通过脱气或注入气体如空气、氮气、二氧化碳、氩等。
本发明的生物材料浆料通常被快速冷冻到-30℃到-180℃之间,或通过雾化、滴落或注射到液氮浴在液氮中快速冷冻制剂。从液氮浴中收集颗粒、珠、串或滴并在冷冻干燥器或真空干燥器中进行干燥,或将它们以冷冻形式储存于低温冰箱中(-30℃和-80℃之间)以备日后使用或干燥,如喷雾干燥。
通常,干燥过程中有用的技术包括喷雾干燥或在真空箱或离心蒸发器中于高于浆料的冻结温度(-20至50℃)的温度下蒸发干燥未冻溶液,然后通过碾磨获得期望的粒径。得到的粉末颗粒是玻璃质的,大多数玻璃质材料涂覆生物材料。用玻璃质材料涂覆生物材料的优点是提高了产品的物理稳定性并减少了颗粒内的有害分子间反应。在合适的示例性实施方式中,冷冻颗粒被负载于托盘中并立即转移至真空干燥室,其中干燥过程经历三个主要的步骤,其包括:(1)在低于2000mTORR的真空压力下对冷冻颗粒进行任选的短时间驱气和结构稳定化步骤,(2)在高于2000mTORR的真空下和高于浆料的凝固点的温度下进行初级干燥步骤,和(3)在完全真空压力和升高的温度下对玻璃质无定形材料进行充分时间的二级和最终干燥步骤,以将干燥的制剂的水活度降低至0.3Aw或更低。
在本发明的一个具体实施方式中,将干燥的制剂用熔化的脂肪的混合物进行制粒,以获得短暂暴露于极端温度和湿度条件下的增强的保存。
干燥且稳定的生物组合物可直接用作薄片或磨成粉并过筛至约10μm至约1000μm的平均粒径。制剂可以以浓缩粉末、重新配制的液体(如饮料)直接给药至动物(包括人类),或者其可以以薄片或粉末的形式混合到现有的食品或饲料或农业制品中。
在一些实施方式中,根据本发明的用于制备生物材料的稳定冷冻的或干燥的粉末的组合物包括碳水化合物混合物和玻璃增强剂。当与生物活性材料混合时,这样的材料在液氮中形成了珠、串或滴,并能根据本发明的方法在无定形玻璃质结构中有效干燥,并提供大量的用于储存和给药所述生物活性材料的稳定的干燥组合物。(参见图7和图8,其是干燥后不同制剂的目测和显微观察结果以及水活度(Aw))。碳水化合物混合物在高温和潮湿(如30℃和40%RH以上)的条件下为制剂提供了结构稳定性和/或为生物活性材料提供了物理和化学的保护益处并阻止或减少了重新配制或再水化时的负面作用。
碳水化合物混合物中的多糖部分可以为制剂提供增稠的粘度以及在真空下制剂密度性质的更好控制,并为本发明的干燥制剂组合物增加结构强度。(参见图8-图片4、4b、4c,其是该具体制剂的玻璃质结构和干燥度)。合适的多糖(尤其对活有机体而言)是水溶性胶,这是由于水溶性胶在温和温度下形成粘性凝胶的独特性质。还发现一定浓度的胶可以通过为制剂提供适当的粘度和密度并允许在初级除水步骤中以特定粘度有效干燥制剂在真空条件下有效地稳定制剂结构。某些胶也可以通过与二价或多价阳离子交联(如海藻酸盐、果胶、脱乙酰壳多糖)或者通过温度或pH变化(如明胶、CMC、CAP、结冷胶)形成水凝胶。水凝胶化的溶液可防止与未冻溶液真空干燥有关的问题。还发现一定浓度的胶能有效地稳定制剂并促进无定形玻璃质结构的形成并增强真空下的干燥曲线(参见图7-图片3a、3b、3c、4和图8-4c和图13)。
值得注意地,通过观察图7的照片并结合下面表1中所列的结果,可以明显看出样品3b、3c、4、5和6都被充分干燥,在无定形玻璃质结构中提供了一定孔隙度。
表1
各种干燥组合物的目测检查
例如,生物活性材料的干燥形式可配制成包含组合物粉末混合物的溶液或悬浮液。在冷却并与生物活性材料混合之前,组合物混合物可以低剪切力搅拌溶于温热的水溶液中。在重新悬浮到制剂之前,生物活性材料如培养的病毒或细菌,可通过离心或过滤进行浓缩并从培养基中分离。或者,制剂中的全部或部分水以浓缩的生物材料的液体进行提供。悬浮液保持于略高于室温的温度,并将干燥组合物粉末混合物缓慢加入到包含生物材料的温热(25℃至40℃)悬浮液中。将悬浮液在行星式拌和器中温和搅拌,直到所有组分完全分散或溶解并获得均匀的浆料。
然后可以通过添加金属离子或改变浆料的温度或pH交联粘性浆料以形成水凝胶(取决于多糖性质),然后根据本发明的干燥方法进行干燥。或者,浆料可通过用喷嘴雾化、滴落或注射到干冰或液氮浴中进行快速冷冻,来形成小颗粒或固体滴、串或珠。冷冻的固体颗粒可以存储于-30℃至-80℃之间的低温冰箱中,以作为稳定的冷冻产品日后使用或直至干燥。合适的示例性干燥方法是真空干燥,其中产物温度保持在略高于其冻结温度的温度。将冷冻的滴或珠置于托盘上,负载容量为约0.1kg/sq ft至约1.5kg/sq ft,并根据本发明的方法进行干燥。在一些实施方式中,干燥过程始于一个短的驱气步骤,其允许产品适应冷冻颗粒的初始温度和结构,以缓和并稳定气体并且使多余的气体脱气。通常,驱气步骤持续1至60分钟之间,这取决于产品的粘度和托盘负载。珠或颗粒应在整个驱气步骤中保持固体冷冻形式。然后将产物温度升至高于其冻结温度的温度,再进行初级除水步骤,直到所有的游离水从产品中蒸发。一旦制剂温度达到所需温度时,调整热量以保持该温度,并通过蒸发进行初级液体干燥步骤。在此步骤中,制剂已经融化,并且在没有任何沸腾或发泡的情况下发生水的加速蒸发。在最大真空和升高的温度下用另外的二级干燥阶段完成干燥过程。
现有技术的典型方法涉及大量发泡和/或溅射以及剧烈沸腾,这可能损坏敏感性生物制品,并对以高负载容量进行工业规模放大造成困难(参见例如美国专利No.6,534,087,其中施加的真空压力引起剧烈沸腾和发泡)。但本发明的组合物和方法避免了制剂的沸腾或发泡,同时获得了明显更快的干燥速率,并能实现制剂的高负载容量。此外,完全且有效地将粘性液体浆料脱气是困难的,并可能需要延长的时间段。在本发明中,通过使用合适的组合物解决了所有这些障碍,该组合物允许有效的初级除水,同时形成玻璃质结构而没有沸腾和过度发泡。与浆料或粘性糖浆相反,固体冷冻颗粒在托盘上的负载使得托盘上单位干燥面积的负载容量比根据现有技术所提供的负载容量高得多。
在本发明的一个合适的实例中,生物材料是活的浓缩益生菌培养物。在一些实施方式中,粉末组合物混合物包含1-4%的海藻酸钠或结冷胶、50-75%的海藻糖、1-10%的菊粉或FOS、10-20%的蛋白质水解物(如酪蛋白、乳清、豌豆、大豆或棉籽水解物)和1-10%的柠檬酸钠或抗坏血酸钠。益生菌培养物可以是新鲜的、冷冻的或已经以干燥粉末形式干燥。
在本发明的另一个合适的实例中,生物材料是活的浓缩微生物培养物。通过混合1-4%的海藻酸钠或结冷胶、5-30%的海藻糖、5-40%的菊粉、5-40%的低DE麦芽糖糊精、10-30%的深度水解的蛋白(如酪蛋白、乳清、豌豆、大豆或棉籽蛋白)制备粉末组合物混合物。作为一种选择,组合物中也可以包含另外的0.1%-10%的玻璃增强剂,如柠檬酸钠、谷氨酸钠或抗坏血酸钠。微生物或孢子培养物可以是新鲜的、冷冻的或已经以干燥粉末形式干燥。
将组合物混合物加入到浓缩的益生菌培养基中,以使溶液混合物的固体含量为40-60%(w/w)并用磷酸盐或柠檬酸盐离子调节pH至6.5-7.5。将溶液在略高于室温的温度下(通常为25℃-37℃)混合,直到所有组分完全溶解。将粘性浆料滴落到液氮中以形成小滴或珠,然后将其从液氮中取出,装入袋中,并储存于-80℃的低温冰箱中直至干燥。
活益生菌的典型干燥方法包括:将固体冷冻珠在托盘上铺展成均匀的层,负载容量在100-1500g/sq ft之间,并将托盘立即置于冷冻干燥器中。然后,施加约1000mTORR或更低的真空,并且,依据冷冻干燥器的尺寸和热源的类型,调整架子温度以保持颗粒处于约-20至约-30℃之间的温度。允许对固体冷冻珠驱气约1至约60分钟并将真空调整到2000和10,000mTORR之间,并增加热传递以将制剂温度升高到-20℃至0℃之间,或-10℃至0℃之间,通常为-10℃。在初级除水步骤期间维持这些温度和真空压力条件,并且依据托盘载量,初级除水步骤可能持续数小时并高达24小时。在初级干燥过程中的某些时间点,溶剂的蒸发速率变缓,并由于干燥箱中热供应过多,制剂温度开始升高。该时间点表明本发明的初级干燥步骤结束。由于溶剂从制剂中被驱除,溶液中的玻璃形成化合物变得浓缩且更稠,直至不再像液体一样流动并形成无定形和/或稳定的玻璃质结构。
然后在最大真空和30℃和50℃之间的制剂温度下进行二级干燥步骤。二级干燥步骤的目的是除去残余的被夹带或结合的水分,并提供在环境温度下长期储存中稳定的组合物。二级干燥步骤可以持续数小时,其终点是制剂完全干燥并且其水活度低于0.3Aw时。
本发明的干燥方法产生包覆在无定形玻璃质结构中的生物活性材料,由于无定形玻璃质组合物中的化合物和其它分子的移动性被极大地降低,从而防止了蛋白质的解折叠或变性并显著减缓了分子相互作用或交叉反应性。只要无定形固体结构处于低于其玻璃转化温度的温度下且残余的水分保持相对低,益生菌就能保持相对稳定。参见图15。请注意,获得玻璃质结构不是长期稳定性的必要条件,因为一些生物材料在更加晶态下可能更好。
干燥的玻璃质结构可以被整块使用、切成所需形状和尺寸或压碎并碾磨成自由流动的粉末,自由流动的粉末提供了容易的下游处理,如湿法或干法团聚、成粒、压片、压实、制粒或任何其它种类的递送方法。用于压碎、碾磨、研磨或粉碎的方法在本技术领域中是公知的。例如,可以使用锤式碾磨机、风力碾磨机、冲击式碾磨机、喷射式碾磨机、钉式碾磨机、Wiley碾磨机或类似的碾磨装置。合适的示例性粒径为小于约1000μm,在一些实施方式中,为小于500μm。
在本发明的另一个实例中,包含生物活性材料的干燥的稳定粉末与熔化的脂肪凝聚。将干燥粉末置于40℃的行星式拌和器中,在混合的情况下将熔化的脂肪如可可脂、天然蜡或氢化油或其混合物缓慢地加入到温热的粉末中,将混合物冷却至低于脂肪的熔点的温度,并继续混合直到获得目测均匀尺寸的凝聚的粉末。组合物中熔化的脂肪混合物的重量质量介于约20%和约70%之间,在一些实施方式中是约30-50%。最终产物可以以成团的形式被消费或在压片机中压缩并以片剂的形式被消费。
在一个具体的实例中,干燥的粉末在压片机中被压缩,以形成所需形状和尺寸的片剂。将稳定且干燥的生物组合物任选地与填料混合,以将片剂的效力调整至所需的剂量。填料可以包括但不限于麦芽糖糊精、羧甲基纤维素钠、钙羧甲基纤维素、胶态二氧化硅及其组合。任选地,在压片混合物中还包括崩解促进剂。崩解促进剂的实例可以包括但不限于羧甲基纤维素钠、交聚维酮(crospovidone)(不溶性聚乙烯吡咯烷酮)、羧基乙酸淀粉钠、淀粉葡糖酸钠、预胶化淀粉等。如本文所使用,压片混合物可任选地包括流平剂(flowagent)。流平剂可以包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌(zinc state)、硬脂酸和气相二氧化硅(fumed silica),如亲水性或疏水性的气相二氧化硅。
从稳定的生物组合物和其它片剂组分制备片剂的合适方法包括标准压片法,标准压片法包括那些用于制备多层片剂的常规方法。优选的压片压力为高达50kN/cm2,对应于低于100N(Erweka设备)的拉伸强度,但在生物材料是活的微生物的情况下,暴露温度应限制为低于60℃。
片剂可以被设计为整个吞服、咀嚼或以泡腾饮料片剂形式消费。当片剂崩解消费时,无论在嘴里、在饮料中或在胃中,都使生物材料暴露于其它活性材料中(而生物材料在这之前通过片剂结构与其它活性材料隔离)。如果有害物质的局部浓度过高,这可能潜在地损伤生物材料。因此,在一些实施方式中,优选使生物活性材料的崩解延迟,以允许片剂中的其它活性成分的含量被稀释和分散。在本发明中,通过形成如本文所述的固化或交联的结构化的组合物使这一问题得到解决。在一些实施方式中,在水中混合时,生物材料在组合物基质上保持完整。在一些实施方式中,在沿动物的消化道到达所需的作用位点时,将生物材料从组合物基质上无损地释放。
根据本发明的片剂可以以这样的方式进行包装,即在可接受的限度内保持其初始的干燥状态。这可能涉及到将片剂包装在隔水隔间中,如管中或泡罩包装中或包含用于吸收水使容器内的水活度降低的干燥剂如硅胶的容器中。为了防止氧化,此类包装也可以包含氧清除材料如AgelessTM、抗坏血酸棕榈酸酯或其它抗坏血酸盐、没食子酸丙酯(propyl galates)或其它没食子酸酯、α-生育酚、亚硫酸镁或亚硫酸钠、丁基羟基苯甲醚或丁基羟基甲苯等。
本文所述的组合物和方法使生物材料稳定并在高于环境温度和相对湿度时在延长的储存期内保存其活性。例如,通过将组合物置于升高的温度(如40℃)和高湿度(如33%RH或43%RH)下并测量制剂的生物活性,来测试组合物的稳定性。例如,对于活益生菌而言,这些研究的结果证实了被配制在这些组合物中的细菌至少稳定60天。稳定性被定义为效价损失一个log CFU/g的时间。即使在使用高浓度生物活性材料时,这样的制剂也是稳定的。因此,这些制剂的优点在于其可以在室温或高于室温的温度下长时间运输和储存。
实施例
实施例1
干燥且稳定的组合物的制备
基础碳水化合物混合物
将约70g的海藻糖(Cargill Minneapolis,MN)、约5g的速溶菊粉(CargillMinneapolis,MN)和约3g的海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)以干燥形式均匀混合。
基础玻璃增强剂混合物
将约17g酪蛋白水解物或豌豆水解物(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)和5g柠檬酸钠或抗坏血酸钠(Sigma,St.Louis,MO)以干燥形式均匀混合。
益生菌的稳定化
将鼠李糖乳杆菌的新鲜浓缩物(100ml,10%固体,直接来自发酵收获物)加入到搅拌器中,并保持在35℃。将约78g的基础碳水化合物混合物和约22g的基础玻璃增强剂混合物缓慢地加入到益生菌培养物中并于35℃混合10分钟。然后将粘性浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴到含有液氮的槽中。然后从液氮中取出珠并立即转移至干燥。
含益生菌的冷冻珠的干燥
将冷冻珠以200g/sq ft的负载容量铺展在托盘上,并立即置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。然后将真空调整至2000-2700mTORR之间,并将架子温度升高至+30℃。将这些温度和真空压力设置维持5小时。任选地,在开始初级液体干燥之前,通过施加约1000mTORR的真空压力并让固体冷冻珠驱气约10分钟,将冷冻珠的温度适应至约-20℃。然后,在初级干燥步骤之后,调整真空压力至2000-2700mTORR之间并将架子温度升高至+30℃。将这些温度和真空压力设置维持5小时。然后在完全真空(150-200mTORR)和保持在30℃和50℃之间的架子温度下进行另外3小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥,通过Hygropalm Aw 1仪器(RotonicInstrument Corp.,Huntington,NY.)测量其水活度为Aw=0.23。
实施例2
干燥益生菌的储存稳定性
图1示出了实施例1的干燥的稳定益生菌和可商业购买的干燥的益生菌(Culturelle,Amerifit,Inc.,Cromwell,CT)在两种不同的加速储存条件(40℃和33%RH以及30℃和43%RH)下的储存稳定性。可商业购买的益生菌在加速储存条件下在最初的几周内完全丧失了其活力,而本发明的益生菌的干燥组合物在30℃和43%RH下60天后仅损失了1.18log,在40℃和33%RH下仅损失1.09log。
实施例3
规模化生产包含益生菌鼠李糖乳杆菌的稳定的干燥组合物
将鼠李糖乳杆菌(来自商业来源的400g冷冻浓缩物)在带有夹套的双行星拌和器(DPM,1qt,Ross Engineering,Inc.Savannah,GA)中于37℃解冻并用蒸馏水将固体含量调整至10%的固体重量。将约212g的海藻糖(CargillMinneapolis,MN)、约20g的速溶菊粉(Cargill Minneapolis,MN)、约12g的海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)、约136g的酪蛋白水解物(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)和约20g的抗坏血酸钠(Sigma,St.Louis,MO)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢地加入到益生菌培养物中并在40RPM、37℃下混合10分钟。然后将浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴落到含有液氮的槽中。然后从液氮中取出珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存数周。
为了干燥,将冷冻珠以500至1500g/sq ft范围的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。通过将真空压力调整至2000-2700mTORR之间并使产品温度升高并稳定于-10和-5℃之间,开始初级液体干燥步骤。随时间推移(约10-16h),产品温度升高至约20至25℃,在此时间点,在最大真空(150-200mTORR)下并将产品温度保持在30至40℃之间,开始另外14小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度为0.23Aw。
实施例4
规模化生产包含益生菌乳双歧杆菌的稳定的干燥组合物
将乳双歧杆菌(来自商业来源的400g冷冻浓缩物)在带有夹套的双行星拌和器(DPM,1qt,Ross Engineering,Inc.Savannah,GA)中于37℃下解冻。将约212g的海藻糖(Cargill Minneapolis,MN)、约20g的速溶菊粉(CargillMinneapolis,MN)、约12g的海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)和约20g的抗坏血酸钠(Sigma,St.Louis,MO)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢地加入到益生菌培养物中。将约136g的豌豆水解物(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)溶解于80g的蒸馏水中,并将混合物短暂微波加热或在水浴中温热到60℃直至完全溶解,然后冷却至约35℃。将干燥的混合物粉末和包含豌豆蛋白质水解物的溶液加入到益生菌浓缩物中,并在40RPM、37℃下混合20分钟。然后将浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴落到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存数周。
为了干燥,将冷冻珠以800g/sq ft的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。通过将真空压力调整至2000-2700mTORR之间并使产品温度升高并稳定于-10和-5℃之间,开始初级液体干燥步骤。随时间推移(约10-16h),产品温度升高至约20至25℃,在此时间点,在最大真空(150-200mTORR)下并将产品温度保持在30至40℃之间,开始另外14小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度为0.23Aw。
实施例5
包含益生菌乳双歧杆菌的水凝胶制剂的制备
根据实施例1制备乳双歧杆菌的浓缩益生菌浆料。向基础制剂加入0.5g的二碱式磷酸钙,然后加入0.5g的葡糖酸内酯。然后在接下来的2小时内使浆料在室温下硬化,以形成固体水凝胶。使用可商业购买的切片机/破碎机,将坚固的凝胶切成细且长的丝。将细丝以湿的形式直接负载于托盘上或在液氮中快速冷冻,并以500g/sq ft的负载容量负载于托盘上,并置于冷冻干燥器中进行干燥,如实施例3所述。制剂的水活度(Aw)为0.05(通过HygroPalmAw1,Rotonic Huntington,NY进行测量)。将干燥的制剂进一步用标准锤式碾磨设备碾磨成细粉,并通过50-250微米的筛网进行筛分。
实施例6
玻璃增强剂和碳水化合物混合物之间的摩尔比的优化
根据实施例1制备数个包含不同摩尔比的玻璃增强剂和碳水化合物混合物的组合物。益生菌副干酪乳杆菌的浓缩培养物获自商业来源,并如实施例1所述制备于干燥组合物中,除了该浆料立即以湿的形式负载于托盘上而不进行快速冷冻和驱气步骤。将浆料如实施例1和3所述在初级和二级阶段进行干燥,除了在初级和二级干燥阶段内将架子温度升高至40℃。将稳定的粉末在37℃和33%RH的加速储存条件下储存84天。图2示出了不同摩尔比对干燥的细菌的稳定性的影响。结果表明,玻璃增强剂和碳水化合物混合物之间的最适摩尔比为约0.12-0.15。
实施例7
本发明的组合物对益生菌嗜酸乳杆菌的储存稳定性的影响
如实施例1所述,制备包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂混合物的组合物。益生菌嗜酸乳杆菌的浓缩培养物获自商业来源,并如实施例1和3所述,制备于干燥组合物中,并将稳定的粉末在24℃和33%RH的加速储存条件下储存537天。图3证明了与本发明的组合物一起配制的益生菌的优异稳定性。结果表明,在指定条件下的超过537天的货架储存期时,益生菌的活力仅减少了0.18log。
实施例8
不同玻璃增强剂化合物对益生菌嗜酸乳杆菌的储存稳定性的影响
如实施例1所述,制备数种包含碳水化合物混合物的组合物以及包含酪蛋白水解物和柠檬酸钠或抗坏血酸钠或两者组合的玻璃增强剂混合物。益生菌嗜酸乳杆菌的浓缩培养物获自商业来源,并如实施例1所述,制备于干燥组合物中,除了该浆料立即以湿的形式负载于托盘上而不进行快速冷冻和驱气步骤。将浆料如实施例1和3所述在初级和二级阶段进行干燥,并将稳定的粉末在24℃和43%RH的加速储存条件下储存180天。图4示出了不同的玻璃增强化合物对干燥的细菌的稳定性的作用。结果表明,通过在蛋白水解物的顶部加入另外的玻璃增强剂获得了显著更好的稳定性。特别地,等量乙酸钠和抗坏血酸钠的加入提供了最稳定的组合物。实施例5和6的结果还表明,依据菌株的不同,不同的玻璃增强剂可以更有效或者甚至可以用于去稳定化。
实施例9
不同蛋白质水解物/糖的比例对益生菌乳双歧杆菌的储存稳定性的影响
如实施例1所述,制备数种包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂的组合物,以及包含具有或不具有抗坏血酸钠的等量但不同比例的豌豆水解物/海藻糖的组合物。益生菌乳双歧杆菌的浓缩培养物获自商业来源,并如实施例1和3所述制备于干燥组合物中,并将稳定的粉末在35℃和43%RH的加速储存条件下储存7周。图5示出了具有或不具有抗坏血酸钠的1:4、1:2.5和1:1.5比例的豌豆水解物/海藻糖对干燥的细菌的稳定性的影响。结果表明,升高豌豆水解物/海藻糖的比例时获得显著更好的稳定性。特别地,1:1.5比例的豌豆水解物/海藻糖提供了更稳定的组合物。在更高比例的豌豆水解物/海藻糖中加入抗坏血酸钠,导致与不含抗坏血酸钠的制剂相比更优秀的稳定性。
实施例10
益生菌鼠李糖乳杆菌的最大稳定性的pH优化
如实施例1所述,制备数个不同pH的包含碳水化合物混合物和玻璃增强剂的组合物。益生菌鼠李糖乳杆菌的浓缩培养物获自商业来源,并如实施例1和3所述制备于干燥组合物中。将稳定的粉末在40℃和33%RH的加速储存条件下储存8周。图6示出了浆料的pH对干燥的细菌的稳定性的影响。结果表明,在中性pH(~7)达到最佳的稳定性。
实施例11
包含酶的稳定的干燥粉末
通过在1000ml水中混合如实施例1和4所述的400g的碳水化合物混合物和200g的玻璃增强剂混合物和400g的肌醇六磷酸酶(phitase)(BASF,GmBH)来制备包含40重量百分比的肌醇六磷酸酶的水凝胶配方。将粉碎的水凝胶制剂在液氮中快速冷冻,并在50℃的初级和二级干燥温度下在真空烘箱中进行干燥。为了测定干燥配方的负载和储存稳定性:在微量离心管中将干燥的样品精确称量(<100mg)。加入200μl份的二甲基亚砜(DMSO)。通过涡旋将制剂溶解在DMSO缓冲液中。向此样品加入0.8ml的包含0.05N的NaOH、0.5%的SDS和0.075M的柠檬酸(三钠盐)的溶液。将试管在45℃下超声处理10min,然后5,000rpm短暂离心10min。将清澈的DMSO/NaOH/SDS/柠檬酸溶液的等份放入微孔板的孔中并使用Bradford测定法分析蛋白质含量。在95℃暴露20min之后,稳定的酶的干燥组合物的稳定性明显高于不具有本发明的组合物的干燥的酶。
实施例12
包含传染性鲑鱼贫血病毒(ISAV)疫苗的稳定的干燥粉末
根据实施例4制备ISAV疫苗(Novozyme,丹麦)的浓缩浆料,除了将20ml在0.5%乙酸中的4%壳聚糖溶液加入到包含ISAV疫苗浓缩物、碳水化合物混合物和玻璃增强剂的浆料中。加入0.5g的二碱式磷酸钙,然后加入0.5g的葡糖酸内酯。然后在接下来的2小时内使浆料在室温下硬化,以形成固体水凝胶。使用可商业购买的切片机/破碎机将坚固的凝胶切成细且长的丝。将细丝以湿的形式直接负载于托盘上或如实施例3所述在液氮中快速冷冻,并以1500g/sq ft的负载容量负载于托盘上,并置于冷冻干燥器中进行干燥。制剂的水活度(Aw)为0.25。将干燥的制剂进一步用标准锤式碾磨设备研磨成细粉,并通过50-150微米的筛网进行筛分。通过外部涂覆具有干燥组合物的商业饲料,将稳定的干燥的ISAV组合物用于口服接种并喂食给大西洋鲑鱼。
实施例13
攻击性物种诱饵的制备
制备根据本发明的用于特异性针对攻击性物种的包含杀虫剂的颗粒诱饵。制备200g的如实施例9所述的制剂并加入200gm的水。向此溶液中加入90gm的鱼藤酮和0.5gm的磷酸氢钙,然后加入0.5gm的葡糖酸内酯。将浆料立即在标准工业喷雾干燥器(standard industrial pray drier)中进行喷雾干燥,并将干燥的制剂用于靶向特异性的攻击性物种,而对环境或临近生态系统没有毒素的有害作用。
实施例14
受保护的植物益生菌制剂的制备
根据实施例4,将生物控制剂如根瘤细菌(Rhizobacteria)制备于干燥组合物中。在限菌条件(gnotobiotic condition)下评估干燥的根瘤细菌组合物对莴苣生长的有效性。将每株植物100mg根瘤细菌干燥组合物的剂量接种到含有沙土的罐中,并种植预先发芽(24h)的莴苣苗。向罐中的植物施加5ml的无菌霍格兰(Hoagland)溶液的营养剂量。将罐随机排列在维持在28℃和12小时光照期的生长室中。在接种后每隔7天,将植物和附着的沙土小心地从罐中取出。将根在无菌磷酸盐缓冲液(pH7.0)中清洗,并记录根长度的测量值。
实施例15
干燥且稳定的益生菌物质的制备
基础制剂
将75g的海藻糖(Cargill Minneapolis,MN)和22g的深度水解的酪蛋白(Marcor,Carlstadt,NJ)以干燥形式与3g的海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)均匀混合。将新鲜的嗜酸乳杆菌浓缩物(100ml中包含至少10%的固体,直接来自发酵收获物)加入到搅拌器中并保持在35℃。将胶、糖和水解的蛋白的干燥混合物缓慢加入到益生菌培养物中并在35℃混合10分钟。然后将粘性浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴落到含氮的槽中。然后从液氮中取出珠,并立即转移至干燥。
基础制剂的冷冻珠的干燥
将冷冻珠以100g/sq ft的负载容量平均铺展在托盘上,并立即置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。然后施加1000mTORR的真空压力并让固体冷冻珠驱气10分钟。然后将真空调整至2700mTORR并将架子温度升高至+30℃。将这些温度和真空压力维持3小时。然后在完全真空(150-200mTORR)并将架子温度升高至30℃来进行另外2小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥,通过Hygropalm Aw 1仪器(Rotonic InstrumentCorp.,Huntington,NY.)测量其水活度为Aw=0.23。
实施例16
包含益生菌鼠李糖乳杆菌LGG(Lactobacillus rhamnosus LGG)的稳定的干燥组合物
将鼠李糖乳杆菌LGG(来自商业来源的500g冷冻的浓缩物)在带夹套的双行星拌和器(DPM,1qt,Ross Engineering,Inc.Savannah,GA)中于37℃下解冻。两种玻璃形成剂;海藻糖(387g,Cargill Minneapolis,MN)和深度水解的酪蛋白(83g,Marcor,Carlstadt,NJ)以干燥的形式与两种基质形成剂均质地混合;海藻酸钠(15g,ISP Corp.,Wayne,NJ)和速溶菊粉(25g,CargillMinneapolis,MN)。将干燥的混合物缓慢加入到解冻的益生菌中并在40RPM和37℃混合10分钟。通过添加50-200ml的水将浆料的粘度调节至12,000Cp。然后将浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴落到含有液氮的容器中。然后从液氮中取出珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存数周。
为了干燥,将冷冻珠以100至500g/sq ft范围内的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。施加1000mTorr的真空压力并将架子温度调整至+20℃。允许固体冷冻珠进行1至30分钟时间范围的驱气。驱气步骤后,在将真空压力调整至2700mTORR并使架子温度升高至+30℃之后进行初级干燥步骤。将这些温度和真空压力保持12小时。然后在最大真空(150-200mTORR)下并将架子温度保持在30℃,进行另外4小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度为0.23Aw。图13示出了益生菌制剂的干燥曲线。
图10、11和14示出了在不同的温度(+4℃、-80℃和-180℃)下冷冻浆料之后和在包括冷冻珠的制备的干燥过程之后和在冷冻干燥器中干燥之后的活力损失。整个过程的活力损失一般小于<1log,这取决于细菌培养物的类型(冷冻或干燥的培养物)和粘性浆料的冻结温度。结果表明,益生菌在液氮(-180℃)中快速冷冻,相比于在-80℃冷冻,是一个具有较小破坏的过程。
图12和15示出了范围从0min(无驱气)至30min的多种驱气时间段对干燥组合物中的益生菌的初始计数和对在40℃和33%RH的加速储存条件下的储存稳定性的影响。结果表明,较长的驱气时间通常提高了干燥制剂中的细菌初始计数,但对益生菌制剂的储存稳定性没有影响。
实施例17
将海藻糖(752g,Cargill Minneapolis,MN)、深度水解的豌豆蛋白(167g,Marcor,Carlstadt,NJ)、海藻酸钠(30g,ISP Corp.,Wayne,NJ)和速溶菊粉(50g,Cargill Minneapolis,MN)以干燥形式均匀掺混。将干燥混合物缓慢添加到在带有夹套的双行星拌和器(DPM,1qt,Ross Engineering,Inc.Savannah,GA)中的80℃的1000ml热的去离子水中,并在40RPM混合10分钟。将混合物温度降低至37℃,缓慢加入从商业来源获得的100g鼠李糖乳杆菌LGG的干燥粉末,并继续混合20分钟。然后将浆料通过2mm孔针挤出到含有液氮的槽中。然后从液氮中取出串/珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存数周。为了干燥,将冷冻的串/珠以100至500g/sq ft范围内的负载容量均匀铺展在托盘上,将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)中的架子上,并如实施例16所述进行干燥。所有制剂均令人满意地被保留在托盘内,在所有负载水平下均没有观察到溅射或发泡。即使在较高负载容量下,制剂也被完全干燥,对于所有样品而言,测量到的水活度为0.26Aw和更低。
实施例18
包含益生菌双歧杆菌属的水凝胶制剂的制备。
根据实施例15制备浓缩的双歧杆菌属的益生菌浆料。向基础制剂加入0.5g的二碱式磷酸钙,然后加入0.5g的葡萄糖酸内酯。在接下来的2小时内使浆料在室温下硬化,以形成固体水凝胶。使用可商业购买的切片机/切碎机,将坚固的凝胶切成细且长的丝。将细丝在液氮中快速冷冻,以700g/sq ft的负载容量负载于托盘上并置于冷冻干燥器中,如实施例16所述进行干燥。制剂的水活度(Aw)为0.05(通过HygroPalm Aw1,Rotonic Huntington,NY进行测量)。使用标准锤式碾磨设备将干燥制剂进一步研磨成细粉末,并通过50-250微米筛网进行筛分。
实施例19
包含益生菌嗜酸乳杆菌的无过敏原组合物
将海藻糖(752g,Cargill Minneapolis,MN)、深度水解的豌豆蛋白(167g,Marcor,Carlstadt,NJ)、海藻酸钠(30g,ISP Corp.,Wayne,NJ)和速溶菊粉(50g,Cargill Minneapolis,MN)以干燥形式均匀掺混。通过将干燥混合物缓慢添加到在带有夹套的双行星拌和器(DPM,1qt,Ross Engineering,Inc.Savannah,GA)中的80℃的1000ml热的去离子水中对其进行消毒,并在40RPM混合10分钟,直至形成顺滑且清澈的浆料。将混合物的温度降低至37℃,缓慢加入从商业来源获得的1000g包含嗜酸乳杆菌的冷冻珠,并继续混合10分钟。然后将浆料通过2mm孔针挤出到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出串/珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中在-80℃储存数周。为了干燥,将冷冻的串/珠以1000g/sq ft的负载容量均匀铺展在托盘上,将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)中的架子上,并如实施例16所述进行干燥。干燥组合物中益生菌的初始CFU计数为10.53log/g,在40℃和33%RH的加速储存条件下储存42天后的活力损失为0.69log CFU/g。
实施例20
包含本发明的干燥制剂的婴儿配方奶粉
根据实施例16制备包含鼠李糖乳杆菌的稳定的干燥制剂,然后筛分成两个粒径组(大于50μm和小于150μm)。通过将99.9g的Nutramigen(MeadJohnson;Evansville,IL)与0.1g粒径范围在50μm和150μm之间的干燥的制剂颗粒混合制备婴儿配方。最终产品包含每100g婴儿配方奶粉约108cfu的鼠李糖乳杆菌。
实施例21
包含本发明的稳定的干燥制剂的益生菌添加物
将包含嗜酸乳杆菌的稳定的干燥组合物配制成口服剂型,如片剂、锭剂或胶囊。通过在旋转加工机(rotary machine)上使用1/2"圆形标准凹形压制工具(tooling)直接压制来制备包含99.9g压制剂(葡萄糖)和0.1g粒径范围在50μm和150μm之间的干燥制剂颗粒的橙味片剂。最终产品包含约108cfu/单位剂量。片剂的硬度在8-10kp范围内,崩解时间为约20秒。将压制的片剂以每瓶100片的量包装在180cc的HDPE瓶中,并暴露于40℃/33%RH的受控温度/湿度下。对产品进行每月微生物稳定性测试,共进行12个月的时间或直至在测定中观察到计数减少至低于1x106/单位剂量。
实施例22
包含本发明的稳定的干燥制剂的功能性饮料
制备干燥混合物,其包含(以重量计的百分比)71%的蔗糖、14%的麦芽糖糊精、10%的菊粉、2%的葡萄糖、1%的无水柠檬酸、0.3%的阿拉伯树胶、0.3%的调味剂、0.3%的磷酸三钙和0.1%的粒径范围在50μm和250μm之间的干燥益生菌制剂颗粒(嗜酸乳杆菌)。最终产品含有约109cfu/单位剂量(30g干燥混合物)。将产品包装在小铝箔袋中(30g单位剂量/袋),通过搅拌在340mil水中以供饮用。对饮料干燥混合物中的益生菌的稳定性进行每月的微生物稳定性测试,共进行12个月的时间或者直至在测定中观察到计数减少至低于1x107/单位剂量。
实施例23
益生菌宠物食品的制备
将可商业购买的犬用颗粒宠物食品在对流加热炉中干燥至水活度为0.1,然后涂覆上按实施例17所述制备的稳定的益生菌干燥制剂。将干燥颗粒喷涂上约5%的基于脂肪的防潮层(40%鸡脂肪、40%可可脂和20%蜂蜡的混合物),在转鼓中与干燥粉末制剂(通常为宠物食品总量的0.1-0.5%,其提供了10.sup.8CFU/g的剂量)混合,最后喷涂上另一层基于脂肪的防潮层。涂层总量为(宠物食品的)约15%。涂覆时间为约30分钟。
实施例24
具有数种益生菌微生物的鱼饲料的制备
用数种益生菌的混合物制备根据本发明的鱼用颗粒饲料。如实施例15所述制备包含鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和乳双歧杆菌的混合物的稳定的干燥益生菌制剂。首先将可商业购买的鲑鱼用鱼苗饲料(starter feed)(ZeiglerBros.,Gardners,PA)在对流加热炉中干燥至水活度为0.1,然后在转鼓中涂覆上益生菌制剂。首先将颗粒(1000g)喷涂上以重量计约5%的基于脂肪的防潮层(40%鱼油、40%可可脂和20%蜂蜡的混合物),然后与1g稳定的干燥益生菌制剂混合(以获得107cfu/g饲料的剂量),最后喷涂上另一层的基于脂肪的防潮层。涂层的总量为(鱼饲料的)约10%。
实施例25
包含酶的稳定干燥粉末
通过在1000g水溶液中混合600g如实施例18所述的制剂和400gSavinase(Novozymes,丹麦)制备包含40重量百分比的Savinase的水凝胶配方。将切碎的水凝胶制剂在液氮中快速冷冻,并在50℃的制剂干燥温度下在真空烘箱中进行干燥。为了测定干燥配方的载量和储存稳定性:精确称取(<100mg)的干燥样品至微量离心管中。加入200μl二甲基亚砜(DMSO)。通过涡旋振荡将制剂溶解在DMSO缓冲液中。向该样品加入0.8ml包含0.05NNaOH、0.5%SDS和0.075M的柠檬酸(三钠盐)的溶液。将管在45℃下超声10分钟,然后以5,000rpm短暂离心10分钟。取清澈的DMSO/NaOH/SDS/柠檬酸盐溶液的等份至微孔板的孔中,并使用Bradford测定法分析蛋白质含量。稳定的酶制剂的储存稳定性明显高于不含本发明制剂的干燥的酶。
实施例26
包含维生素A的稳定的干燥粉末
通过在1000g水中混合320g速溶菊粉、320g麦芽糖糊精DE-1(Tate&Lyle,London,英国)、50g羧甲基纤维素钠(Ashland Aqualon Functional Ingredients,Wilmington,DE)、10g抗坏血酸钠和300g维生素A晶体(BASF Corp.,FlorhamPark,N.J)来制备包含30重量百分比的维生素A的制剂。将湿制剂在Mobile-Minor喷雾干燥器(GEAProcess Engineering Inc.,Columbia MD)中喷雾干燥,其中入口和出口温度分别为180℃和80℃,或者在液氮中快速冷冻,然后以1000g/sq ft的负载容量铺展在托盘上,并如实施例16所述进行干燥。维生素A组合物在40℃和75%RH下稳定(>80%)3个月。
实施例27
在受保护的制剂中的具有增强的生物利用度的胡萝卜素类的制备
根据本发明的制剂和方法制备保护并提高胡萝卜素类的生物利用度的制剂,否则所述胡萝卜素类在储存期间或在喂给生物体后会遭受到饲料中其它成分的氧化。将包含6g水溶性壳聚糖的制剂(LSK BioPartners,Inc.Salt LakeCity,Utah)溶解在200g水中。向溶液加入90g天然虾青素(NaturoseTM,Cyanotech Corp.,Kailua-Kona,HI),并将浆料喷雾或挤出到包含5%三聚磷酸钠的槽中。使水凝胶化的微粒或串在室温下硬化4小时。将颗粒从交联槽中取出,用水洗涤,并与90g蔗糖和10g深度水解的酪蛋白的干燥掺混物混合。将负载有糖/蛋白质的颗粒快速冷冻,并立即以500g/sq ft置于托盘上,在冷冻干燥器中冻干,直到水活度降低到低于0.3。将干燥制剂进一步碾磨成所需的粒度分布并包装。
实施例28
攻击性物种诱饵的制备
根据本发明,制备特异性针对攻击性物种的颗粒诱饵。如实施例1所述,制备200g包含杀虫剂的制剂,并加入到200gm水中。向该溶液加入90gm的鱼藤酮和0.5gm的二碱式磷酸钙,然后加入0.5gm的葡萄糖酸内酯。让浆料在室温下硬化2小时。通过切片机/切碎机将坚固的凝胶切成细且长的丝。将细丝负载在托盘上,并置于冷冻干燥器中。将架子温度设定在-30℃并让制剂冷冻,然后施加完全真空,并将架子温度升高至+60℃,过夜干燥。将干燥制剂碾磨成对于靶向的特定物种的诱饵尺寸规格而言适合的粒度分布。
实施例29
水不溶性制剂中受保护的杀虫剂的制备
用本发明的制剂和方法制备杀虫剂的受保护的颗粒制剂,否则所述杀虫剂在储存期间或在应用到环境中后将会遭受制剂中其它成分的分解。向200g水中加入包含6g果胶和102g蔗糖的制剂。向该溶液加入90g敏感性杀虫剂的干燥制剂和包含1.5g二碱式磷酸钙和0.5g氯化钙的混合物,然后加入0.85g的葡萄糖酸内酯。让浆料在室温下硬化4小时,然后通过切片机/切碎机切成细且长的丝。将细丝负载在托盘上,在冷冻干燥器中干燥至水活度达到0.1。将干燥制剂进一步碾磨成所需的粒度分布并包装。
实施例30
受保护的植物益生菌制剂的制备
将生物控制剂如根瘤细菌(Rhizobacteria)制备在根据实施例18的干燥组合物中。在限菌条件下评估干燥的根瘤细菌组合物对莴苣生长的功效。将每株植物100mg根瘤细菌干燥组合物的剂量接种到含有沙土的罐中,并种植预先发芽(24h)的莴苣苗。向罐中的植物施加5ml无菌霍格兰(Hoagland)溶液的营养剂量。将罐随机排列在维持在28℃和12小时光照期的生长室中。在接种后每隔7天,将植物和附着的沙土小心地从罐中取出。将根在无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中清洗,并记录根长度的测量值。
实施例31
包含益生菌嗜酸乳杆菌(DSM-20356)的稳定的干燥组合物的制备
将冷冻的细菌浓缩物(10g,获取自本地发酵过程)在37℃的水浴中解冻,并用蒸馏水将固体含量调整至10%固体湿重。将约5g的水解的豌豆蛋白(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)完全溶解在50g温水中,并加入到解冻的细菌培养物中。将约2.5g海藻糖(Cargill Minneapolis,MN)、约5g速溶菊粉、约5g麦芽糖糊精DE-1(Cargill Minneapolis,MN)和约1.5g海藻酸钠(ISPCorp.,Wayne,NJ)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢加入到细菌培养物中,并使用小刮勺在37℃下混合20分钟。然后使浆料滴落到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存直至干燥。
为了干燥,将冷冻珠以500至1500g/sq ft范围的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。通过将真空压力调整至2000-2700mTORR之间并使产品温度升高并稳定于-10和-5℃之间,开始初级液体干燥步骤。随时间推移(约10-16h),产品温度升高至约20至25℃,在此时间点,在最大真空(150-200mTORR)下并将产品温度保持在30至40℃之间,开始另外14小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度低于0.3Aw。使用可商业购买的锤式碾磨机研磨制剂并将颗粒筛分到低于100微米。
依据在LMRS琼脂平板上稀释并铺板的标准程序,每周监测稳定的益生菌以及常用的细菌冷冻干燥粉末的活力。图16示出了,在40°RH 14天后,配制于本发明的组合物中的益生菌的稳定性比常用冷冻干燥的细菌的稳定性高两(2)log。这些结果证明,当使用了本发明的组合物和方法时,益生菌在高湿度和非冷冻储存条件下的稳定性显著提高了。
实施例32
包含益生菌嗜酸乳杆菌(DSM-20356)的稳定的干燥的熔化脂肪凝聚的组合物的制备
如实施例31所述,制备十(10)g干燥粉末组合物。将干燥粉末置于在40℃水浴中的烧杯中。将10g包含八(8)份可可脂和两(2)份硬脂酸(27-硬脂,LodersCroklaan,Channahon,IL)的熔化的脂肪混合物在搅拌下缓慢加入到温热的粉末中。将混合物冷却至10℃,同时继续混合直到获得凝聚的粉末的目视均匀的尺寸。
实施例33
包含益生菌鼠李糖乳杆菌属的干燥组合物在40℃和43%RH下或在30℃和60%RH下的货架储存稳定性。
如实施例31所述,制备十(10)g包含益生菌鼠李糖乳杆菌属(获得自本地发酵来源)的干燥粉末组合物。将干燥的稳定组合物置于干燥器中,并暴露于40℃和43%RH或30℃和60%RH下。依据在LMRS琼脂平板上稀释并铺板的标准程序,每周监测稳定的益生菌以及常用的细菌的冷冻干燥粉末的活力。图17示出了,在40℃和43%RH下14天后,配制于本发明的组合物中的益生菌的稳定性比常用冷冻干燥的细菌的稳定性高三(3)log。在30℃和60%RH下7天后,配制于本发明的组合物中的益生菌的稳定性也比常用冷冻干燥的细菌的稳定性高三(3)log。这些结果证明,当使用了本发明的组合物和方法时,益生菌在高湿度和非冷冻储存条件下的稳定性显著提高了。
实施例34
包含含有抗致病微生物的益生菌的稳定干燥组合物的动物饲料的生产
用3%油混合物在转鼓中顶部涂覆约10kg阉牛或鸡用的可商业购买的动物饲料,所述3%油混合物包含一份如实施例31或32所述的研磨的生物材料和两(2)份植物油(如玉米油)。益生菌的CFU计数为1E9/g饲料。将被涂覆的饲料置于40℃的43%相对湿度的室中,在此类极端条件下储存14天后,益生菌的活力损失小于初始CFU一(1)log。将另一种被涂覆的饲料置于30℃的33%相对湿度的室中,在此条件下储存六(6)个月后,益生菌的活力损失小于初始CFU一(1)log。这些实施例证明,用于治疗包括伴侣动物的各种动物的微生物如乳杆菌属,可以用本发明的组合物和干燥方法保存,然后涂覆在饲料上,以在通常储存未被涂覆的饲料的典型湿度和温度条件下,在货架上长期储存,或在饲料斗里储存至少两(2)周。
实施例35
包含单细胞真菌酿酒酵母(S.cerevisiae)的稳定干燥组合物的生产
将新鲜的面包酵母膏(100g,获得自当地经销商)置于10℃的水浴中。将约50g水解的豌豆蛋白(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)完全溶解在500g温水中。将溶液冷却至10℃,并在搅拌下加入到酵母膏中。将约25g蔗糖(获得自当地杂货店)、约50g速溶菊粉、约50g麦芽糖糊精DE-1(CargillMinneapolis,MN)、约12g抗坏血酸钠(Sigma)和约15g海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢加入到酵母培养物中并在40RPM和10℃下混合20分钟。然后将浆料转移到具有多孔底部的容器中,并使其滴落到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存数周。如实施例31所述,进行干燥和碾磨。
实施例36
包含单细胞真菌酿酒酵母的稳定干燥组合物的喷雾干燥
如实施例34所述,制备酵母浆料。将浆料进一步用冷(10℃)的蒸馏水稀释,获得约1000-2000cP的粘度。将稀释的浆料进行喷雾干燥(移动式小型喷雾干燥器,GEA Niro Inc.,Columbia,MD),使用的入口/出口温度设定为180℃/60℃。
实施例37
具有包含单细胞真菌的稳定干燥组合物的玉米种子的涂层
用3%熔化的油混合物在转鼓中于40℃顶部涂覆约10kg可商业购买的玉米种子,所述3%熔化的油混合物包含一份如实施例34或35所述的研磨的生物材料和两(2)份植物油,如棕榈油或椰子油。酵母CFU计数为1E8/g饲料。将被涂覆的饲料置于30℃的60%相对湿度的室中,在此类极端条件下储存三(3)个月后,酵母的活力损失小于初始CFU一(1)log。该实施例证明,用作农业接种物的微生物如青霉属(Penicillium sp.)的各种菌株,可以用本发明的组合物和干燥方法保存,然后涂覆在谷物上,以在通常储存未被涂覆的饲料的湿度和温度条件下长期储存。
实施例38
包含益生菌双歧杆菌属的水凝胶组合物的制备
根据实施例31制备双歧杆菌属的浓缩益生菌浆料。向粉末混合物加入5g的二碱式磷酸钙。将粉末混合物在搅拌下加入到益生菌培养物中,然后加入5g葡糖酸内酯。然后在接下来的两(2)小时内使浆料在室温下硬化,以形成固体水凝胶。使用可商业购买的切片机/破碎机,将坚固的凝胶切成细且长的丝。如实施例31所述,将细丝以湿的形式直接负载于托盘上或在液氮中快速冷冻,并以500g/sq ft的负载容量负载于托盘上,并置于冷冻干燥器中进行干燥。将干燥的制剂用标准锤式碾磨设备研磨成细粉,并通过50微米的筛网进行筛分。
实施例39
包含益生菌的稳定发酵奶(cultured milk)的制备
将二分之一(0.5)克的如实施例37所述的包含稳定益生菌的交联的粉末加入到一百(100)克巴氏消毒的纯发酵奶(plain culture milk)(Dannon,获得自当地杂货店)中。发酵奶中的初始CFU计数为1E9/g发酵奶。将发酵奶在4℃冰箱中储存六(6)周。冷藏的发酵奶中的益生菌的活力损失小于初始CFU一(1)log。此实施例证明,益生菌如乳酸杆菌和双歧杆菌的各种菌株均可以用本发明的组合物和干燥方法保存。然后,组合物中的益生菌可以被完全水合,并且在通常未受保护的益生菌无法存活的条件下使乳制品中的益生菌保持延长时间的活性。
实施例40
包含酶的稳定干燥组合物
通过在包含约50g水解的豌豆蛋白的500ml水溶液中混合如实施例34所述的250g粉末混合物和200g的肌醇六磷酸酶(Marcor,Carlstadt,NJ)来制备包含40重量百分比的肌醇六磷酸酶的水凝胶配方。将粉碎的水凝胶制剂在液氮中快速冷冻,并在50℃的初级和二级干燥温度下在真空烘箱中进行干燥。为了测定干燥组合物的负载和储存稳定性而言:将干燥样品精确称量(<100mg)于微量离心管中。加入200μl的二甲基亚砜(DMSO)。通过涡旋将制剂溶解在DMSO缓冲液中。向此样品加入0.8ml包含0.05N的NaOH、0.5%的SDS和0.075M的柠檬酸(三钠盐)的溶液。将试管在45℃下超声处理10min,然后5,000rpm短暂离心10min。将清澈的DMSO/NaOH/SDS/柠檬酸溶液的等份放入微孔板的孔中并使用Bradford测定法分析蛋白质含量。在95℃暴露20min之后,稳定的酶干燥组合物的稳定性明显高于不具有本发明的组合物的干燥酶。
实施例41
包含植物生物控制剂的稳定干燥组合物
根据实施例34,将生物控制剂如根瘤细菌(Rhizobacteria)制备于干燥组合物中。在限菌条件下评估干燥的根瘤细菌组合物对莴苣生长的功效。将每株植物100mg根瘤细菌的干燥组合物的剂量接种到含有沙土的罐中,并种植预先发芽(24h)的莴苣苗。向罐中的植物施加5ml无菌霍格兰(Hoagland)溶液的营养剂量。将罐随机排列在维持在28℃和12小时光照期的生长室中。在接种后每隔7天,将植物和附着的沙土小心地从罐中取出。将根在无菌磷酸盐缓冲液(pH7.0)中清洗,并记录根长度的测量值。用根瘤细菌组合物处理过的莴苣苗显示了比未经处理的苗更好的生长。
实施例42
包含益生菌鼠李糖乳杆菌属的稳定干燥组合物的片剂的生产
将冷冻的细菌浓缩物(10g,获得自本地发酵过程)在37℃的水浴中解冻,并用蒸馏水将固体含量调整至10%固体湿重。将约5g水解的豌豆蛋白(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)完全溶解于50g温水中,并加入到解冻的细菌培养物中。将约5g海藻糖(Cargill Minneapolis,MN)和约2.5g抗坏血酸钠以干燥形式均匀混合。任选地,还加入约5g速溶菊粉、约5g麦芽糖糊精DE-1(Cargill Minneapolis,MN)和约1.5g海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ),以形成所需粘度为约50,000cP的粘性浆料,并进一步提高干燥材料的玻璃质结构。将粉末混合物缓慢加入到细菌培养物中并在37℃下混合20分钟。然后将粘性细菌悬浮液缓慢滴落到液氮槽中。然后从液氮中取出冷冻珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存直至干燥。
为了干燥,将冷冻珠以500至1500g/sq ft范围的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。通过将真空压力调整至2000-2700mTORR之间并使产品温度升高并稳定于-10和-5℃之间开始初级除水步骤。随时间推移(约10-16h),产品温度升高至约20至25℃,在此时间点,在最大真空(50-200mTORR)下并将产品温度保持在30-45℃之间,开始另外14小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度低于0.3Aw。使用咖啡研磨机碾磨制剂并将颗粒筛分至低于250微米。
为了压片,将干燥且稳定的益生菌组合物(100mg)与400mg包含2%w/w的硬脂酸镁和2%w/w的亲水性气相二氧化硅(EvonikIndustries)的麦芽糖糊精DE-1混合,并在手持丸压设备(使用1/2"片剂直径壳体(tablet diameter housing))中压制。还制备了类似的包含益生菌的通常冷冻干燥粉末(松散的益生菌)(free probiotic)的片剂,用于与包含受保护的益生菌的片剂相比较。
依据在LMRS琼脂平板上稀释和铺板的标准程序,每周监测在压片之前和在压片之后和在40℃和43%RH下储存时,稳定的益生菌以及松散的益生菌的活力。图18示出了,在压片过程中松散的益生菌损失超过一个log的活力,而在压片过程之后受保护的细菌的活力基本上保持相同。在40℃和43%RH下储存14天后,配制于本发明的组合物中的益生菌的活力略微减少约0.3log,而通常冷冻干燥的细菌的活力进一步减少约0.6log。这些结果证明,本发明的组合物和方法提供了显著的保护,以对抗在益生菌压片过程以及在高湿度和非冷藏储存条件下储存时的压制压力和相关的热量。
实施例43
包含益生菌鼠李糖乳杆菌属的稳定干燥组合物的多种维生素/益生菌片剂的制备
然后,在包含多种维生素成分的片剂中进一步探究了如本文所公开的组合物和方法的保护作用。如实施例42所述,制备十(10)g干燥粉末组合物。为了压片,将干燥且稳定的益生菌组合物(100mg)与400mg包含2%w/w的硬脂酸镁和2%w/w的亲水性气相二氧化硅(EvonikIndustries)的可商业购买的多种维生素粉末(Pfizer)混合,并在手持丸压设备(使用1/2"片剂直径壳体)中压制。还制备类似的包含益生菌的通常冷冻干燥粉末(松散的益生菌)的片剂,并用于与包含受保护的益生菌的片剂相比较。然后测试所得到的片剂的总益生菌计数。结果示于图19。
如图19所示,松散的益生菌在与多种维生素成分压片的过程中损失超过两(2)log的活力,而受保护的细菌的活力降低小于一个log。在40℃和43%RH下储存14天后,配制于本发明的组合物中的益生菌的活力基本保持相同,而通常冷冻干燥的细菌的活力暴跌另外的三(3)log。这些结果证明,本发明的组合物和方法还为敏感的生物材料提供了对片剂混合物中其它有害化合物的显著保护,从而允许在一个片剂中混合多种生物材料,而不影响它们的整体效力。
实施例44
包含受保护的酶的稳定干燥组合物的压片
如实施例42所述,制备包含蛋白酶或脂肪酶(均来自Sigma)的干燥且稳定的组合物。最终的干燥组合物包含10%蛋白酶或脂肪酶、40%海藻糖、20%深度水解的豌豆蛋白、10%抗坏血酸钠。此外,组合物中还包含6%海藻酸钠和14%菊粉。
为了压片,将干燥的酶组合物(每个50mg)与包含2%w/w硬脂酸镁和2%w/w亲水性气相二氧化硅的450mg麦芽糖糊精DE-1混合,并在手持丸压设备(使用1/2"片剂直径壳体)中压制。还通过将25mg蛋白酶和25mg脂肪酶与450mg麦芽糖糊精DE1混合物混合来制备包含等量的两种受保护的酶的片剂。还制备了类似的包含松散形式的酶(松散的酶或两者的混合物)的干燥粉末的片剂,并用于与包含受保护的酶的片剂相比较。
根据本领域已知的方法,分别使用偶氮酪蛋白(Azocasein)和pNP-棕榈酸酯作为底物测定相对于压片前粉末混合物中的蛋白酶和脂肪酶的活性,压片后的蛋白酶和脂肪酶所存留的活性。
如图20所示,松散的蛋白酶单独压片或与松散的脂肪酶组合压片导致活性损失约40%,而当单独压片时受保护的蛋白酶未损失任何活性,当与受保护的脂肪酶混合压片时仅损失约17%。松散的或受保护的脂肪酶的压片没有造成任何显著的活性损失,然而,在松散的蛋白酶存在的情况下,松散的脂肪酶的压片导致活性损失64%,而在受保护的蛋白酶存在的情况下,受保护的脂肪酶的压片仅导致活性损失33%。这些结果证明,本发明的组合物和方法在酶的压片过程中提供了显著的保护,以抵抗压制压力和相关的热量。结果还表明,本发明的组合物和方法提供了在片剂混合物中对其它消化性酶的保护,从而允许在一个片剂中混合多种所需的酶,而不影响它们的整体效力。
实施例45
包含含有抗致病微生物的益生菌的稳定干燥组合物的动物饲料的压片
在包含动物饲料成分的片剂中进一步探究本文所公开的组合物和方法的保护作用。如实施例42所述,制备并干燥约100g包含益生菌嗜酸乳杆菌属的干燥且稳定的组合物。最终的干燥组合物包含10%干燥细菌细胞生物质、54%海藻糖、20%深度水解的豌豆蛋白、10%抗坏血酸钠。另外,组合物中还包含6%的海藻酸钠。
将约10kg可商业购买的狗粮或鸡成品饲料颗粒于40℃空气干燥过夜,然后精细研磨成自由流动的粉末。将稳定的干燥益生菌组合物与饲料粉末混合,并在手持丸压设备(使用1/8-7/8"丸直径外壳)中压制,以形成每克饲料包含约百(100)亿活细胞的约200-2000mg大小的丸剂。为了鸡的处理,将益生菌饲料丸剂在搅拌下缓慢倒入100kg标准商业饲料中。将处理过的成品饲料准备喂食禽类,以提高对病原体如沙门氏菌(salmonella)的抗性。为了稳定性测试,将益生菌丸剂置于40℃的43%相对湿度的室中,在这些极端条件下储存14天后,益生菌的活力损失小于初始CFU一(1)log。此实施例证明,用于处理包括伴侣动物的各种动物的微生物如各种乳酸杆菌属,可以用本发明的组合物和干燥方法保护,然后在压片机中压制,并在通常湿度和温度的条件下在通常的饲料斗里与标准饲料一起提供。
实施例46
包含益生菌的稳定干燥组合物的泡腾饮料片剂(fizzy effervescentbeverage tablet)的制备
如实施例42和45所述,制备并干燥约10g包含益生菌嗜酸乳杆菌属或双歧杆菌属的干燥且稳定的组合物的粉末。
将泡腾片剂如Alka或运动饮料精细研磨成自由流动的粉末。将稳定的干燥益生菌组合物与泡腾粉末混合并在手持丸压设备(使用7/8"片剂直径壳体)中压制,以形成每片剂包含约百(100)亿活细胞的约2000mg大小的片剂。为了稳定性测试,将益生菌泡腾片剂置于33℃的43%相对湿度的室中,在这些极端条件下储存90天后,益生菌的活力损失小于初始CFU一(1)log。此实施例证明,可以用本发明的组合物和干燥方法保护并稳定化敏感生物材料如活益生菌,然后在压片机中压制,并在湿度和温度的苛刻消费条件下储存。
实施例47
用于治疗阴道感染如酵母性或细菌性阴道病的包含益生菌的稳定干燥组合物的片剂的制备
如实施例1和4所述,制备并干燥约15g包含益生菌嗜酸乳杆菌属的干燥且稳定的组合物的粉末。
将74g乳糖、10g玉米淀粉、0.5g硬脂酸镁、0.01g羧甲基纤维素钠、0.01g聚乙烯吡咯烷和0.01g疏水性气相二氧化硅掺混到干燥的益生菌组合物中并混合15分钟。将粉末状混合物在手持压片设备中进行压制。所得片剂的重量为约1.5g。最大片剂硬度为6至8kg。片剂在水中约30秒崩解。
实施例48
包含益生菌嗜酸乳杆菌(DSM-20356)的稳定干燥组合物的油悬浮液的生产
将冷冻的嗜酸乳杆菌浓缩物(200g,获得自本地发酵过程)在37℃水浴中解冻,并加入200g的3%水解的豌豆蛋白(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)溶液。将细菌悬浮液4000g离心15min(Sorvall RC-5B,Du-Pont Company,Wilmington,DE)并倒出上清液。将细菌沉淀物用3%水解的豌豆蛋白溶液补充至原来的重量(200g)。将另外的50g水解的豌豆蛋白完全溶解于80g温水中,用20%的NaOH溶液将pH调整至9,并加入到细菌培养物中。将八十五点六(85.6)g蔗糖(获得自本地市场)、30g环糊精-7(Cargill Minneapolis,MN)、20g抗坏血酸钠(Sigma)和15g海藻酸钠(ISP Corp.,Wayne,NJ)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢加入到细菌培养物中,在37℃下在1qt的行星式拌和器(Charles Ross&Son Company,Hauppauge,New York)中混合20分钟。然后将浆料缓慢滴落到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出冷冻珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存直至干燥。
为了干燥,将冷冻珠以500至1500g/sq ft范围的负载容量平均铺展在托盘上,并将托盘置于冷冻干燥器(25SRC型,Virtis,Gardiner,NY)的架子上。通过将真空压力调整至2000-2700mTORR之间并使产品温度升高并稳定于-12和-5℃之间,开始初级液体干燥步骤。随时间推移(约10-16h),产品温度升高至约20-25℃,在此时间点,在最大真空(100-150mTORR)下并将产品温度保持在30-40℃之间,开始另外14小时的二级干燥步骤。制剂被完全干燥并测定其水活度低于0.3Aw。使用可商业购买的锤式碾磨机碾磨制剂并将颗粒筛分至低于250微米。
以干燥粉末形式或在玉米油悬浮液(将1g干燥粉末混合在100g油中)中或在将10g油悬浮液涂覆于45g鸡饲料颗粒上(首先将饲料颗粒在33%RH湿度的室中适应两周)之后于40℃和43%RH下测试益生菌稳定组合物的活力14天。在40℃和43%RH下孵育14天后,当保持干燥形式时,益生菌仅损失0.5log的CFU/g,当混合于油悬浮液中时损失0.34log,当涂覆于鸡饲料上时损失0.65log。这些结果证明,当使用本发明的组合物和方法时,在暴露于高湿度和非冷藏储存条件下14天之后,能在不同的饲料应用中保存益生菌的活力。
实施例49
包含抗鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的活噬菌体的稳定干燥组合物的生产
将浓缩的活噬菌体培养物(100g,获得自制造商)置于10℃的带有夹套层的行星式拌和器中。将约50g水解的豌豆蛋白(超滤的水解物,Marcor,Carlstadt,NJ)完全溶解在300g温水中。将溶液冷却至10℃,并在搅拌下加入到噬菌体培养物中。将一百七十四(174)g蔗糖(获得自本地市场)、60g环糊精-7(Cargill Minneapolis,MN)、40g抗坏血酸钠(Sigma)、30g海藻酸钠(ISPCorp.,Wayne,NJ)以干燥形式均匀混合。将粉末混合物缓慢加入到噬菌体培养物中并在10℃下在1qt行星式拌和器中混合20分钟。然后将浆料缓慢滴落到包含液氮的槽中。然后从液氮中取出冷冻珠,置于密封的包有铝箔的袋子中,在低温冰箱中于-80℃储存直至干燥。如实施例48所述,进行干燥和碾磨。将十(10)克干燥组合物粉末与100g鱼油混合,并将悬浮液涂覆在10kg大西洋鲑鱼饲料颗粒上。然后,将涂覆的饲料储存在通常仓库储存条件下。当使用本发明的组合物和方法时,在高湿度和非冷藏储存条件下暴露14天之后,鱼饲料中的噬菌体的活力被保留。
虽然通过参考具体实施方式对本发明进行了解释和描述,但本发明并不意图受所示的细节限制。相反,可能对权利要求等同方案(equivalents)的广度(scope)和范围(range)内的细节做出各种修改而不脱离本发明。
Claims (41)
1.一种用于生物活性材料的干燥的稳定化组合物,其包括碳水化合物组分和蛋白质组分,其中,按组合物的总重量计,碳水化合物组分包括介于约10%和80%之间的寡糖、介于约5%和30%之间的二糖和介于约1%和10%之间的多糖,蛋白质组分包括介于约0.5%和40%之间的水解的动物或植物蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物,其中水解的蛋白组分包含水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白、水解的豌豆蛋白、水解的大豆蛋白或其混合物。
3.如权利要求2所述的组合物,其中水解的酪蛋白、水解的乳清蛋白、水解的豌豆蛋白、水解的大豆蛋白是深度水解的蛋白。
4.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中多糖包括邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、羧甲基纤维素、果胶、海藻酸钠、海藻酸盐、羟基丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉菜胶、结冷胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、黄原胶、刺槐豆胶、脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉、修饰的淀粉或其混合物。
5.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中寡糖包括环糊精、菊粉、麦芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露寡糖(MOS)或其混合物。
6.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中二糖包括海藻糖、蔗糖、乳糖或其混合物。
7.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中组合物进一步包含羧酸组分,其中,按组合物的总重量计,羧酸组分包括介于约0.5%和10%之间的羧酸。
8.如权利要求7所述的组合物,其中羧酸组分包含乳酸、抗坏血酸、马来酸、草酸、丙二酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸、葡糖酸、谷氨酸、其盐或其混合物。
9.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中组合物与生物活性材料组合。
10.如权利要求9所述的组合物,其中生物活性材料包括活的、死的或减毒的细胞、微生物、病毒、细菌、益生菌、植物细菌、土壤细菌、真菌、酵母、细胞培养物、蛋白质、重组蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、药物或其混合物。
11.如前述权利要求任一项所述的组合物,其中组合物以无定形玻璃质形态干燥。
12.如权利要求11所述的组合物,其中组合物通过选自空气干燥、真空干燥、流化床干燥和喷雾干燥的一种或多种方法进行干燥。
13.一种用于制备权利要求9所述的组合物的方法,其包括:(a)将生物活性材料与至少碳水化合物组分和蛋白质组分在水性溶剂中组合以形成粘性浆料;(b)将浆料在液氮中快速冷冻以形成固体冷冻颗粒、珠、滴或串;(c)在真空下将步骤(b)的产物除水来进行初级干燥并将该产物保持在高于其冻结温度的温度下;和(d)在最大真空和20℃或更高的温度下使步骤(c)的产物经充分时间的二级干燥,以将其水活度降低至低于0.3Aw。
14.如权利要求13所述的方法,其中在快速冷冻之前通过pH或温度变化或通过将聚合物链与金属离子交联将浆料固化成坚固的水凝胶。
15.如权利要求14所述的方法,其中浆料被塑形成所需的形状。
16.如权利要求13所述的方法,其中在高于>2000mTORR的真空压力下进行初级除水步骤。
17.如权利要求13所述的方法,其中将干燥的材料切割、压碎、碾磨或分别粉碎成自由流动的粉末。
18.一种通过权利要求17所述的方法制造的组合物,其中粒径小于约1000μm。
19.一种包括权利要求9所述的组合物的重建的液体、研磨的粉末、片剂、颗粒、胶囊、食品或饲料或涂覆的种子产品。
20.一种包括权利要求9所述的组合物的营养食品、药物、农产品或疫苗产品。
21.一种包括权利要求9所述的组合物的棒、液体配方、胶体悬浮液、粉末、片剂、胶囊和涂覆的种子形式的食品、食品添加剂、动物饲料、动物饲料添加剂、营养食品、药物、农产品或疫苗产品。
22.一种通过权利要求13所述的方法制造的组合物。
23.一种通过压制包埋在干燥的玻璃质和无定形组合物中的敏感生物活性材料制造的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物包含一种或多种糖和一种或多种水解的蛋白,其中,按组合物的总干重计,糖介于约10%和60%之间,水解蛋白介于约1%和40%之间。
24.如权利要求23所述的片剂、丸剂或颗粒,其中生物活性材料包括活的、死的或减毒的细胞、微生物、病毒、细菌、益生菌、植物和土壤细菌、真菌或酵母、细胞培养物、蛋白质、重组蛋白、酶、肽、激素、疫苗、抗生素、药物或其混合物。
25.如权利要求23或24所述的片剂、丸剂或颗粒,其中水解的蛋白包括深度水解的酪蛋白、乳清蛋白、豌豆蛋白、大豆蛋白或其混合物。
26.如权利要求23-25任一项所述的片剂、丸剂或颗粒,其中糖是选自海藻糖、蔗糖、乳糖和其混合物的二糖。
27.如权利要求23-26任一项所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物中包括玻璃增强化合物,其中,按组合物总干重计,玻璃增强化合物介于约1%和20%之间。
28.如权利要求27所述的片剂、丸剂或颗粒,其中玻璃增强化合物包括甲酸、草酸、抗坏血酸、磷酸或其组合的离子。
29.如权利要求23-28任一项所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物进一步包括多糖或寡糖或其混合物。
30.如权利要求29所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物包括选自乙酸邻苯二甲酸纤维素(CAP)、羧甲基纤维素、果胶、海藻酸钠、海藻酸盐、羟基丙基甲基纤维素(HPMC)、甲基纤维素、角叉菜胶、结冷胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、黄原胶、刺槐豆胶、脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物、胶原、聚乙醇酸、淀粉、修饰的淀粉和其混合物的多糖,其中多糖介于组合物总干重的约0.1和10%之间。
31.如权利要求29或30所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物包含选自环糊精、菊粉、麦芽糖糊精、葡聚糖、低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、甘露聚糖(MOS)和其混合物的寡糖,其中寡糖介于组合物总干重的约0.5和20%之间。
32.如权利要求23-31任一项所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物以无定形玻璃质形态干燥。
33.如权利要求32所述的片剂、丸剂或颗粒,其中组合物通过包括选自空气干燥、真空干燥、流化床干燥和喷雾干燥的一种或多种方法的方法进行干燥。
34.一种制备权利要求23-33任一项所述的片剂、丸剂或颗粒的方法,其包括压缩包埋在干燥的玻璃质和无定形组合物中的敏感生物活性材料,其中干燥的玻璃质和无定形组合物通过下述方法制造:(a)将生物活性材料与至少一种或多种糖和一种或多种水解的蛋白在水性溶剂中组合,以形成粘性浆料;(b)将浆料在液氮中快速冷冻,以形成固体冷冻颗粒、珠、滴或串;(c)在真空下将步骤(b)的产物除水来进行初级干燥并将该产物保持在高于其冻结温度的温度下;和(d)在最大真空和20℃或更高的温度下使步骤(c)的产物经充分时间的二级干燥,以将其水活度降低至低于0.3Aw。
35.如权利要求34所述的方法,其中在快速冷冻之前,通过pH或温度变化或通过将聚合物链与金属离子交联将浆料固化成坚固的水凝胶。
36.如权利要求34所述的方法,其中在2000mTORR或更多的真空下进行初级除水步骤。
37.如权利要求34所述的方法,其中将干燥的材料切割、压碎、碾磨或分别粉碎成自由流动的粉末。
38.如权利要求37所述的方法,其中粉末的粒径小于约1000μm。
39.如权利要求23-33任一项所述的片剂、丸剂或颗粒,其中生物活性材料在压片设备中压实或压制时是稳定的。
40.一种包括权利要求23-33任一项所述的片剂、丸剂或颗粒的饮料、食品、动物饲料、营养食品、药物、农产品或疫苗产品。
41.一种通过权利要求34所述的方法制造的片剂、丸剂或颗粒。
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Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105504050A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-04-20 | 河南欧普生物科技有限公司 | 一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法 |
CN106819418A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-13 | 张军军 | 一种超高脂饲料及其制备方法 |
CN107250354A (zh) * | 2015-02-11 | 2017-10-13 | 普瑞特克微生物有限责任公司 | 用于包埋活大肠杆菌的经改进干基质、其制备方法及其用途 |
CN108289476A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-07-17 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 动物的水合 |
CN108347982A (zh) * | 2015-07-29 | 2018-07-31 | 高级生物营养公司 | 用于特殊饮食用途的稳定的干燥益生菌组合物 |
CN108368474A (zh) * | 2015-12-04 | 2018-08-03 | 高级生物营养公司 | 没有或几乎没有糖的稳定的干组合物 |
CN108472321A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-31 | 国家农艺研究院 | 用于保存在生态系统中的微生物群的冻干组合物 |
CN109561710A (zh) * | 2016-06-14 | 2019-04-02 | 普瑞特克微生物有限责任公司 | 包含饲料添加剂的动物饲料颗粒、其制备和使用方法 |
CN109922670A (zh) * | 2016-10-28 | 2019-06-21 | 株式会社三养社 | 具有改进稳定性的低聚糖糖浆 |
CN110769838A (zh) * | 2017-06-05 | 2020-02-07 | 普罗比公司 | 微生物组合物 |
CN110923145A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-27 | 天康生物股份有限公司 | 支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法 |
CN114196579A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-03-18 | 张峰 | 一种建筑通风工程用的甲醛微生物净化器 |
CN114845549A (zh) * | 2019-10-22 | 2022-08-02 | 麻省理工学院 | 递送促进植物生长的微生物的基于生物材料的组合物 |
CN113614055B (zh) * | 2018-12-07 | 2023-12-26 | 皮沃特生物股份有限公司 | 用于固氮微生物产品的具有提高的稳定性的聚合物组合物 |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20140255583A1 (en) * | 2013-03-06 | 2014-09-11 | Sunny Delight Beverages Company | Protein suspension as a beverage opacifier system |
US10766799B2 (en) | 2014-05-23 | 2020-09-08 | Nch Corporation | Method for improving quality of aquaculture pond water using a nutrient germinant composition and spore incubation method |
CN108884434B (zh) | 2016-04-05 | 2023-06-09 | Nch公司 | 富含营养的萌发剂组合物及孢子培养方法 |
US10897922B2 (en) | 2016-04-05 | 2021-01-26 | Nch Corporation | Composition and method for germinative compounds in probiotic food and beverage products for human consumption |
WO2017219106A1 (pt) | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Yessinergy Holding S/A | Composição imunomoduladora e promotora de crescimento e de controle da população de bactérias indesejáveis da microbiota intestinal e seu uso |
US10323226B2 (en) * | 2017-03-30 | 2019-06-18 | Nch Corporation | Feed material for biomass generator |
US11401500B2 (en) | 2018-08-29 | 2022-08-02 | Nch Corporation | System, method, and composition for incubating spores for use in aquaculture, agriculture, wastewater, and environmental remediation applications |
WO2020130770A1 (es) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Ajtzakbio S.A.P.I. De C.V. | Composición probiótica de alto valor sin necesidad de cadena de frio, desarrollada para reducir el impacto ambiental, aumentar la producción y mejorar la supervivencia de larvas de camarón |
WO2021055352A1 (en) * | 2019-09-16 | 2021-03-25 | Vedanta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for preserving bacteria |
US11576937B2 (en) | 2020-02-06 | 2023-02-14 | Nch Corporation | Method of reducing gut inflammation reduction in humans by consuming a heated probiotic composition |
US20230080017A1 (en) * | 2020-02-19 | 2023-03-16 | Zantebio Limited | Coated microcapsules and methods for the production thereof |
RU2746022C1 (ru) * | 2020-04-03 | 2021-04-06 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Способ стабилизации бактериальных клеток чумного микроба перед сублимационным высушиванием |
RU2736064C1 (ru) * | 2020-04-03 | 2020-11-11 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт" Министерства обороны Российской Федерации | Защитная среда для стабилизации клеток возбудителя туляремии в процессе приготовления и хранения сухих препаратов |
EP4252541A1 (en) * | 2020-12-25 | 2023-10-04 | Hayashibara Co., Ltd. | Method for improving productivity in livestock and/or poultry and method for improving intestinal flora in livestock and/or poultry |
WO2022171617A1 (en) * | 2021-02-10 | 2022-08-18 | Dsm Ip Assets B.V. | Powderous composition (i) |
JP2024506466A (ja) * | 2021-02-10 | 2024-02-14 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー.ブイ. | 粉末状組成物(ii) |
CN112843328B (zh) * | 2021-02-25 | 2022-05-13 | 山东大学 | 一种具有抑菌作用的鲍鱼壳粉/ZnO复合材料掺杂的智能水凝胶伤口敷料的制备方法 |
CN113621519B (zh) * | 2021-08-11 | 2023-07-18 | 河南农业大学 | 一种复合酵母冻干保护剂 |
WO2023204734A1 (ru) * | 2022-04-21 | 2023-10-26 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Кинетик-Фарм" | Средство для интравагинальной доставки активного компонента, способ получения и применения средства |
CN117247305A (zh) * | 2023-09-16 | 2023-12-19 | 鲁东大学 | 一种促进植物根系生长的水凝胶及制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004024177A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Quest International Services B.V. | Method of treating or preventing obeisity and lipid metabolism disorders and compositions for use therein |
CN101951789A (zh) * | 2007-12-20 | 2011-01-19 | 雅培制药有限公司 | 稳定的营养粉 |
CN102186360A (zh) * | 2008-10-20 | 2011-09-14 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 具有抗反流性质的营养组合物 |
WO2012021783A2 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Advanced Bionutrition Corporation | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
PT1212045T (pt) * | 1999-08-24 | 2016-11-22 | Abic Biological Laboratories Ltd | Composição de vacina e método de utilização da mesma |
ES2162746B1 (es) * | 1999-10-21 | 2003-02-16 | Lipotec Sa | Microcapsulas para la estabilizacion de productos cosmeticos, farmaceuticos o de alimentacion. |
EP1296656B1 (en) | 2000-06-27 | 2006-08-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for preparing a composition |
US20020044988A1 (en) * | 2000-08-22 | 2002-04-18 | Fuchs Eileen C. | Nutritional composition and method for improving protein deposition |
JP4902103B2 (ja) * | 2002-04-11 | 2012-03-21 | メディミューン・エルエルシー | 凍結乾燥フォームによる生物活性材料の保存 |
US8871266B2 (en) * | 2003-10-01 | 2014-10-28 | Commonwealth Scientific & Industrial Research Organisation | Probiotic storage and delivery |
EP1616486A1 (en) * | 2004-07-13 | 2006-01-18 | Friesland Brands B.V. | Powdered compositions containing an edible oil and their use in food products |
ES2470340T3 (es) * | 2005-12-28 | 2014-06-23 | Advanced Bionutrition Corporation | Vehículo de administración para bacterias probi�ticas que comprende una matriz seca de polisac�ridos, sac�ridos y polioles en forma vítrea |
CA2673120C (en) * | 2006-12-18 | 2012-08-07 | Advanced Bionutrition Corporation | A dry food product containing live probiotic |
TWI468157B (zh) * | 2009-04-29 | 2015-01-11 | Intervet Int Bv | 形成錠劑的方法,進行該方法的系統及包含該錠劑的包裝物 |
US20110070334A1 (en) * | 2009-09-20 | 2011-03-24 | Nagendra Rangavajla | Probiotic Stabilization |
-
2013
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-
2014
- 2014-09-22 PH PH12014502092A patent/PH12014502092A1/en unknown
- 2014-09-23 CL CL2014002506A patent/CL2014002506A1/es unknown
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004024177A1 (en) * | 2002-09-16 | 2004-03-25 | Quest International Services B.V. | Method of treating or preventing obeisity and lipid metabolism disorders and compositions for use therein |
CN101951789A (zh) * | 2007-12-20 | 2011-01-19 | 雅培制药有限公司 | 稳定的营养粉 |
CN102186360A (zh) * | 2008-10-20 | 2011-09-14 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 具有抗反流性质的营养组合物 |
WO2012021783A2 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Advanced Bionutrition Corporation | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
US20120039956A1 (en) * | 2010-08-13 | 2012-02-16 | Moti Harel | Dry storage stabilizing composition for biological materials |
Cited By (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107250354B (zh) * | 2015-02-11 | 2021-04-23 | 伊兰科加拿大有限公司 | 用于包埋活大肠杆菌的经改进干基质、其制备方法及其用途 |
CN107250354A (zh) * | 2015-02-11 | 2017-10-13 | 普瑞特克微生物有限责任公司 | 用于包埋活大肠杆菌的经改进干基质、其制备方法及其用途 |
CN108347982A (zh) * | 2015-07-29 | 2018-07-31 | 高级生物营养公司 | 用于特殊饮食用途的稳定的干燥益生菌组合物 |
CN108368474A (zh) * | 2015-12-04 | 2018-08-03 | 高级生物营养公司 | 没有或几乎没有糖的稳定的干组合物 |
CN108368474B (zh) * | 2015-12-04 | 2021-11-16 | 高级生物营养公司 | 没有或几乎没有糖的稳定的干组合物 |
CN108472321B (zh) * | 2015-12-18 | 2022-04-15 | 法国国家农业食品与环境研究院 | 用于保存在生态系统中的微生物群的冻干组合物 |
CN108289476A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-07-17 | 雀巢产品技术援助有限公司 | 动物的水合 |
CN108472321A (zh) * | 2015-12-18 | 2018-08-31 | 国家农艺研究院 | 用于保存在生态系统中的微生物群的冻干组合物 |
CN105504050A (zh) * | 2016-03-03 | 2016-04-20 | 河南欧普生物科技有限公司 | 一种抗安卡拉病毒鸡卵黄抗体的制备方法 |
CN109561710A (zh) * | 2016-06-14 | 2019-04-02 | 普瑞特克微生物有限责任公司 | 包含饲料添加剂的动物饲料颗粒、其制备和使用方法 |
CN109922670A (zh) * | 2016-10-28 | 2019-06-21 | 株式会社三养社 | 具有改进稳定性的低聚糖糖浆 |
CN106819418A (zh) * | 2017-03-27 | 2017-06-13 | 张军军 | 一种超高脂饲料及其制备方法 |
CN110769838A (zh) * | 2017-06-05 | 2020-02-07 | 普罗比公司 | 微生物组合物 |
CN110769838B (zh) * | 2017-06-05 | 2023-10-17 | 普罗比公司 | 微生物组合物 |
CN113614055B (zh) * | 2018-12-07 | 2023-12-26 | 皮沃特生物股份有限公司 | 用于固氮微生物产品的具有提高的稳定性的聚合物组合物 |
CN114845549A (zh) * | 2019-10-22 | 2022-08-02 | 麻省理工学院 | 递送促进植物生长的微生物的基于生物材料的组合物 |
CN110923145A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-27 | 天康生物股份有限公司 | 支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法 |
CN110923145B (zh) * | 2019-12-16 | 2021-07-20 | 天康制药(苏州)有限公司 | 支原体的冻干保护剂与冻干支原体及其制备方法 |
CN114196579A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-03-18 | 张峰 | 一种建筑通风工程用的甲醛微生物净化器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR112014023234A2 (pt) | 2017-06-20 |
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MX356072B (es) | 2018-05-14 |
MX2014011122A (es) | 2014-12-05 |
AU2013234931B2 (en) | 2017-12-07 |
RU2666601C2 (ru) | 2018-09-11 |
AU2013234931A2 (en) | 2014-12-04 |
KR102062645B1 (ko) | 2020-01-06 |
AU2013234931A1 (en) | 2014-09-18 |
JP6229188B2 (ja) | 2017-11-15 |
IN2014DN08599A (zh) | 2015-05-22 |
PH12014502092A1 (en) | 2014-11-24 |
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