KR20140135845A - 생물학적 물질용 안정화 조성물 - Google Patents

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Abstract

생활성 물질용 안정화 건조 조성물은 당 및 가수분해된 단백질을 포함하며, 정제 또는 그 밖의 형태로 형성될 수 있어 생활성 물질에 향상된 안정성을 부여한다. 생활성 물질을 함유하는 조성물은 (a) 생활성 물질을 수성 용매중의 다른 성분과 조합하여 점성 슬러리를 형성시키는 단계; (b) 액체 질소에서 슬러리를 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적 또는 스트링을 형성시키는 단계; (c) 단계 (b)의 생성물을 이의 동결 온도보다 높은 온도로 유지시키면서 진공하에서 수분 제거함으로써 일차 건조시키는 단계; 및 (d) 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 감소시키기에 충분한 시간 동안 20℃ 또는 그 초과의 온도 및 최대 진공 하에 단계 (c)의 생성물을 이차 건조시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

Description

생물학적 물질용 안정화 조성물 {STABILIZING COMPOSITION FOR BIOLOGICAL MATERIALS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 3월 29일 출원된 US 출원 번호 13/378,106의 일부 계속 출원이며, 이는 2011년 1월 28일 출원된 국제 출원 번호 PCT/US11/22821의 국내 단계 진입 건이며, 2010년 1월 28일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/299,315의 우선권을 주장한다. 본 출원은 또한, 2011년 8월 12일 출원된 US 출원 번호 13/208,459의 일부 계속 출원이며, 이는 2010년 8월 13일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/373,711의 우선권을 주장한다. 본 출원은 2012년 3월 23일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/614,994, 2012년 5월 3일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/642,094, 및 2012년 5월 13일 출원된 U.S. 가출원 번호 61/646,337의 우선권을 추가로 주장한다. 상기 출원 모두의 내용은 모든 목적으로 본원에 참조로서 통합된다.
고온 다습 하에 장기간 저장 동안 생물학적 물질의 구조 및 기능의 보존은 식품, 기능성 식품 및 제약 산업에 근본적으로 중요하다. 단백질, 효소, 세포, 박테리아 및 바이러스와 같은 민감한 생물학적 물질은 종종 추후 사용을 위해 장기간 저장 동안 보존되어야 한다. 저장시 생물학적 물질을 안정화시키기 위한 많은 방법이 시도되었지만, 많은 방법들이 민감한 생활성물 예컨대, 살아있거나 약화된 박테리아 및 바이러스에 대해 적합하지 않다. 예를 들어, 전통적인 동결-건조는 동결 및 건조 둘 모두로 인한 스트레스를 수반한다. 이러한 공정의 동결 단계는 단백질 및 효소의 변성 및 세포의 파괴와 같은 바람직하지 않은 효과를 가질 수 있다.
광범위한 생물학적 물질에 유용하며, 물질의 운송 및 저장 동안 직면하게 될 수 있는 바와 같은 증가된 온도 및 변화되는 습도하에 연장된 기간에 걸쳐 생물학적 물질의 탁월한 안정화 및 보존을 제공하면서 재수화시 상당량의 활성을 여전히 유지하는 안정화 조성물에 대한 요구가 존재한다. 정제화 (tableting) 동안 직면하게 될 고압 및 고온에 대부분 민감한 생물학적 물질의 활성의 과도한 손실 없이 정제화 적용에 사용될 수 있는 안정화 조성물에 대한 요구가 또한 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 약 10% 내지 80% 올리고사카라이드, 약 5% 내지 30% 디사카라이드 및 약 1% 내지 10% 폴리사카라이드를 포함하는 탄수화물 성분; 및 약 0.5% 내지 40% 가수분해된 동물성 또는 식물성 단백질을 포함하는 단백질 성분을 포함하는, 생활성 (bioactive) 물질에 대한 안정화 건조 조성물을 제공한다. 본 조성물은 생활성 물질과 조합될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생활성 물질과 조합된 상기 조성물을 제조하는 방법으로서, (a) 생활성 물질을 수성 용매중에서 적어도 탄수화물 성분 및 단백질 성분과 조합하여 점성 슬러리를 형성시키는 단계; (b) 액체 질소에서 슬러리를 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적 또는 스트링을 형성시키는 단계; (c) 단계 (b)의 생성물을 이의 동결 온도보다 높은 온도에서 유지시키면서 진공하에서 수분 제거함으로써 일차 건조시키는 단계; 및 (d) 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 감소시키기에 충분한 시간 동안 20℃ 또는 그 초과의 온도 및 최대 진공하에 단계 (c)의 생성물을 이차 건조시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 당 및 하나 이상의 가수분해된 단백질을 포함하는 유리질의 무정형 건조 조성물중에 임베딩된 (embedding) 민감한 생활성 물질의 압착에 의해 제조된 정제, 필 (pill) 또는 펠렛 (pellet)으로서, 조성물의 전체 건조 중량을 기준으로 하여 당이 약 10% 내지 60%를 차지하며, 가수분해된 단백질이 약 1% 내지 40%를 차지하는, 정제, 필 또는 펠렛을 제공한다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 유리질의 무정형 건조 조성물에 임베딩된 민감한 생활성 물질을 압착시키는 것을 포함하여 상기 언급된 정제, 필 또는 펠렛을 제조하는 방법으로서, 유리질의 무정형 건조 조성물이 (a) 생활성 물질을 수성 용매중에서 적어도 하나 이상의 당 및 하나 이상의 가수분해된 단백질과 조합하여 점성 슬러리를 형성시키는 단계; (b) 슬러리를 액체 질소에서 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적 또는 스트링을 형성시키는 단계; (c) 단계 (b)의 생성물을 이의 동결 온도보다 높은 온도에서 유지시키면서 진공하에서 수분 제거함으로써 일차 건조시키는 단계; 및 (d) 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 감소시키기에 충분한 시간 동안 20℃ 또는 그 초과의 온도 및 최대 진공하에 단계 (c)의 생성물을 이차 건조시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법을 제공한다.
도 1은 시판되는 프로바이오틱 박테리아 및 본 발명의 건조 조성물 중 프로바이오틱 박테리아의 가속 안정성을 도시한다.
도 2는 가속화 저장 조건하에 (37℃ 및 33%RH) 프로바이오틱 안정성 (L. 파라카세이 (L. paracasei)에 대한 조성물 중 유리 강화제 및 탄수화물 혼합물간의 다양한 몰 비의 효과를 도시한다.
도 3은 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스 (L. acidophilus)의 저장 안정성에 대한 본 발명의 조성물의 효과를 도시한다. 건조 프로바이오틱 박테리아의 안정성을 24℃ 및 33%RH에서 537일 동안의 가속화 저장 조건에서 평가하였다.
도 4는 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스의 저장 안정성에 대한 다양한 유리 강화제 화합물의 효과를 도시한다. 건조 프로바이오틱 박테리아의 안정성을 24℃ 및 43%RH에서 180일 동안의 가속화 저장 조건에서 평가하였다.
도 5는 프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스 (Bifidobacterium lactis)의 저장 안정성 (35℃ 및 43%RH)에 대한 다양한 단백질 가수분해물/당 비의 효과를 도시한다.
도 6은 프로바이오틱 L. 람노수스 (L. rhamnosus) (40℃ 및 33%RH에서 8주간의 가속화 저장 조건)의 최대 안정성에 대한 pH 최적화를 도시한다.
도 7 및 8. 본 발명의 방법에 따른 동결된 고체 비드로서, 다양한 매트릭스 및 유리 형성제를 함유하는 다양한 건조된 조성물의 육안 및 현미경 관찰.
도 9. 새로운 동결된 비드 또는 건조 분말 배양물로서의 L. 람노수스 배양 형성물의 건조 조성물중 이의 초기 CFU 계수에 대한 효과.
도 10. 액체 질소 또는 -80℃ 초저온 냉동고 (deep freezer)에서 동결된 고체 비드 및 +4℃에서 비-동결된 점성 슬러리로서의 L. 람노수스를 함유하는 조성물의 동결 온도의 건조 조성물중 박테리아 초기 CFU 계수에 대한 효과. 결과는 건조 전 추가적인 퍼징 단계가 없는 슬러리의 동결 온도의 효과만 보여준다.
도 11. 액체 질소중의 동결된 고체 비드 및 +4℃에서의 비-동결된 점성 슬러리로서의 비피도박테리움 아니말리스 (Bifidobacterium animalis)를 함유하는 조성물의 동결 온도의 건조 조성물중 박테리아 초기 CFU 계수에 대한 효과. 결과는 건조 전 추가적인 퍼징 단계가 없는 슬러리의 동결 온도의 효과만 보여준다.
도 12. 건조 조성물중 L. 람노수스의 초기 CFU 계수에 대한 동결된 고체 비드의 진공하의 퍼징 기간의 효과.
도 13. 본 발명의 방법에 따른 조성물의 동결 건조기에서의 건조 프로파일.
도 14. 본 발명의 조성물 및 건조 방법에서 L. 람노수스의 처리 및 건조 손실.
도 15. 40℃ 및 33% 상대 습도에서의 저장에서 건조 프로바이오틱 박테리아 즉, L. 람노수스 조성물의 안정성 경향.
도 16. 본 발명의 조성물 및 방법에서 포뮬레이션 후의 또는 일반적으로 동결 건조된 L. 아시도필러스 sp. (L. acidophilus sp.)의 40℃ 및 43% RH에서의 저장 안정성.
도 17. 본 발명의 조성물 및 방법에서 포뮬레이션 후의 또는 일반적으로 동결 건조된 L. 람노수스 sp의 40℃ 및 43% RH 및 30℃ 및 60% RH에서의 저장 안정성.
도 18은 본 발명의 조성물중에서 안정화되고 보호된 프로바이오틱 L. 람노수스의 40℃ 및 43% RH에서의 저장 안정성 및 생존력에 대한 타정기에서 압축의 효과를 입증한다.
도 19는 본 발명의 조성물중에 안정화되고 보호된 프로바이오틱 L. 람노수스의 생존력에 대한, 멀티비타민 및 미네랄의 혼합물과의 정제화 및 40℃ 및 43% RH에 노출되는 저장의 효과를 도시한다.
도 20은 본 발명의 조성물중에 보호된 또는 자유 형태의 프로테아제 및 리파제 효소의 활성에 대한 타정기에서의 압축의 효과를 보여준다. 효소들은 개별적으로 정제화되거나 동량으로 혼합된 후 정제화되었다.
정의
본원에 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기재할 목적이며, 제한하려는 것이 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같은 단수 형태는 문맥에 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "단백질"에 대한 언급은 하나의 단백질 또는 두 개 이상의 단백질의 조합물을 포함하고; "효소", "박테리아" 등에 대한 언급은 하나의 유형 또는 여러 유형의 혼합물 등을 포함한다.
본 발명을 기재하고 청구함에 있어서, 하기 용어는 하기에 개시된 정의에 따라 이용될 것이다.
"생활성 성분", "생활성 물질" 및 "생물학적 물질" 모두는 생물학적 활성을 허용하는 성분 또는 미생물을 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 생활성 물질은 펩티드, 단백질, 효소, 호르몬, 핵산, 항체, 약물, 백신, 효모, 진균류, 박테리아 (프로바이오틱 또는 기타의 것), 토양 미생물, 바이러스 및/또는 세포 현탁액을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
"생물학적 조성물"은 생활성 성분 또는 제제의 생물학적 활성이 명백하게 유효하도록 허용하는 그러한 형태의 제조물을 지칭한다.
"유리 강화제", "유리 강화 화합물" 및 "유리 형성제"는 임계 온도 즉, 유리 전이 온도 (Tg) 아래에서 무정형 또는 유리질 구조를 형성하는 능력을 갖는 화학적 화합물을 나타내는 것으로서 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 유리질 구조의 형성 동안, 생물학적 물질은 유리 구조내에 임베딩될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 유리 강화제는 비제한적으로 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산 등과 같은 유기산의 염을 포함한다. 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트 등과 같은 양이온을 포함할 수 있다. 그 밖의 유용한 유리 강화제는 단백질, 단백질 가수분해물, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 단일 조성물 내에서 유리 형성제의 조합물이 또한 고려된다. 본 발명의 목적을 위한 유리질 구조를 수득하는데 사용되는 공정은 일반적으로 용매 승화 및/또는 증발 기법이다. 이상적으로는, GRAS 화합물인 화합물이 GRAS가 아닌 것들에 비해 선호된다.
"당"은 탄소, 수소 및 산소로 주로 구성된 사카라이드를 지칭한다. 유용한 사카라이드는 환원당 및 비환원당, 및 당 알콜 및 디사카라이드를 포함한다. 함께 결합된 2개의 모노사카라이드가 디사카라이드를 형성한다. 디사카라이드를 형성하는데 사용되는 2개의 모노사카라이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 디사카라이드의 예로는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스, 이소말토스를 포함한다. 황산화된 디사카라이드가 또한 사용될 수 있다.
"탄수화물" 또는 "폴리히드록시 화합물"은 탄소, 수소 및 산소로 주로 구성된 사카라이드를 지칭한다. 사카라이드는 전형적으로 선형 또는 비선형 양상으로 결합된 반복 구조 단위의 당 백본으로 이루어지며, 이들 중 일부는 양 또는 음으로 하전된 화학기를 함유한다. 반복 단위는 2백만 내지 수 백만개의 범위일 수 있다. 유용한 사카라이드는 환원당 및 비환원당, 및 당 알콜, 디사카라이드, 올리고사카라이드, 수용성 폴리사카라이드 및 이들의 유도체를 포함한다. 함께 결합된 2 개의 모노사카라이드가 디사카라이드를 형성한다. 디사카라이드를 형성하는데 사용되는 2개의 모노사카라이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 탄수화물 혼합물에 사용될 수 있는 디사카라이드의 예는 수크로스, 트레할로스, 락토스, 말토스, 이소말토스를 포함한다. 황산화된 디사카라이드가 또한 사용될 수 있다. 함께 결합된 소수의 모노사카라이드 (전형적으로 3개 내지 20개)는 올리고사카라이드를 형성한다. 올리고사카라이드를 형성하는데 사용된 모노사카라이드는 동일하거나 상이한 성분 당일 수 있다. 사용하기 적합한 올리고사카라이드의 예로는 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프룩토-올리고사카라이드 (FOS), 갈락토-올리고사카라이드 (GOS), 만난-올리고사카라이드 (MOS) 및 이들의 조합물을 포함한다. 함께 결합된 다수의 모노사카라이드 (전형적으로 20개 초과)는 폴리사카라이드를 형성한다. 폴리사카라이드를 형성하는데 사용되는 모노사카라이드는 동일하거나 상이한 성분 당일 수 있다. 사용하기 적합한 폴리사카라이드의 예로는 비제한적으로 메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 및 하이프로멜로스; 용해성 전분 또는 전분 분획, 잔탄검, 구아검, 펙틴, 카라긴, 갈락토만난, 젤란검, (이들의 임의 유도체 포함), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 아카시아검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분 및 개질된 전분 및 시클로덱스트린을 포함한다.
"가수분해된 단백질"은 부분적으로 또는 전체적으로 산 또는 효소 가수분해되어 분자량이 약 1 kDa 내지 약 50 kDa인 가수분해된 단백질을 제공하는 단백질을 지칭한다. 일부 구체예에서, "광범위하게 가수분해된 단백질"로서 본원에 언급된 경우, 단백질 기질의 적어도 20%가 분자 질량이 200 내지 2000 돌턴인 펩티드로 전환된다. 가수분해된 단백질은 완전한 단백질과 대략 동일한 아미노산 조성을 지니고 임의의 수의 시판원으로부터 수득될 수 있다. 저자극성인 경우, 가수분해된 단백질은 유아 및 노인과 같은 과민한 소비자를 위한 특정 식품에 유리하게 사용될 수 있다.
"안정한" 포뮬레이션 또는 조성물은 그 안에 있는 생물학적으로 활성인 물질이 저장시에 그 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지시키는 것이다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도 및 습도 조건에서 측정될 수 있다. 경향 분석을 이용하여 물질이 실제로 그 기간 동안 저장되기 전에 예상 저장 수명을 예측할 수 있다. 살아 있는 박테리아의 경우, 예를 들어, 안정성은 온도, 습도 및 기간의 소정의 조건하에 건조 포뮬레이션 1 g 당 1 로그 (log)의 CFU를 잃는데 걸리는 시간으로서 정의된다.
박테리아와 관련된 "생존력"은 박테리아의 성장에 적합한 영양 배지 상에 콜로니 (CFU 또는 콜로니 형성 단위)을 형성하는 능력을 지칭한다. 바이러스와 관련된 생존력은 적합한 숙주 세포에 감염 및 재생되어 숙주 세포의 론(lawn) 상에 플라크를 형성시키는 능력을 지칭한다.
"주위" 실온 또는 조건은 주어진 환경에서의 어떠한 주어진 시간에서의 것들이다. 전형적으로, 주위 실온은 22-25℃이고, 주위 대기압 및 주위 습도는 용이하게 측정되며 연중 시기, 날씨 및 기후 조건, 고도 등에 따라 달라질 것이다.
건조된 포뮬레이션 조성물에 관한 "수분 활성도" 또는 "Aw"는 물의 이용도를 지칭하고 시스템에서 물의 에너지 상태를 나타낸다. 이것은 샘플 위의 수증기압을 동일한 온도에서 순수한 물의 증기압으로 나눈 것으로서 정의된다. 순수한 증류수는 정확히 1 즉, Aw=1.0의 수분 활성도를 갖는다.
저장 안정성에 관한 "상대 습도" 또는 "RH"는 주어진 온도에서 공기 중 수증기량을 지칭한다. 상대 습도는 일반적으로 공기를 포화시키는데 요구되는 것보다 낮으며 포화 습도의 백분율로 표시된다.
"건조" 및 이의 변형은 탈수화되거나 무수인 물리적 상태, 즉 실질적으로 액체가 없는 물리적 상태를 지칭한다. 건조는, 예를 들어, 분무 건조, 유동층 건조, 동결건조, 및 진공 건조를 포함한다.
"동결건조" 또는 냉동 건조는 신속한 동결 및 동결된 상태에서 탈수화 (때로 승화로서 지칭됨)에 의해 건조 형태의 조성물을 제조하는 것을 지칭한다. 동결건조는 당의 결정화를 유도하는 온도에서 일어난다. 이러한 공정은 동결된 생성물이 유지되기에 충분한 진공하에, 일부 구체예에서는 약 2000 mTORR 미만 (<2000 mTORR)에서 일어날 수 있다.
본원에 기재된 공정들과 관련하여 "일차 수분 제거" 또는 "일차 건조" 단계 또는 "액체 건조"는 동결된 입자가 해동되는 시점으로부터 이차 건조가 시작되는 시점까지 일어나는 탈수화 건조를 지칭한다. 전형적으로, 대부분의 일차 건조는 대규모 증발에 의해 일어나는 한편, 생성물 온도는 열원의 온도보다 현저히 낮게 유지되었다. 이러한 공정은 해동된 생성물이 유지되기에 충분한 진공하에, 일부 구체예에서는, 약 2000 mTORR 초과 (>2000 mTORR)에서 일어날 수 있다.
본원에 기재된 공정들과 관련하여 "이차 건조"는 열원의 온도에 근접한 포뮬레이션 온도에서 일어나는 건조 단계를 지칭한다. 이러한 공정은 포뮬레이션의 수분 활성도를 감소시키기에 충분한 진공하에, 일부 구체예에서는, 약 1000 mTORR 미만 (<1000 mTORR)에서 일어날 수 있다. 전형적인 포뮬레이션 건조 공정에서, 이차 건조 단계는 포뮬레이션의 수분 활성도를 0.3 또는 그 미만의 Aw로 감소시킨다.
본 발명은 저장시 펩티드, 단백질, 호르몬, 핵산, 항체, 약물 백신, 효모, 박테리아 (프로바이오틱 또는 기타의 것), 바이러스 및/또는 세포 현탁액과 같은 민감한 생활성 물질을 보존하기 위한 조성물 및 건조 방법을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 건조 방법은 펩티드, 단백질, 호르몬, 핵산, 항체, 약물, 백신, 효모, 박테리아, 바이러스 및/또는 세포 현탁액과 같은 민감한 생활성 물질을 함유하는, 건조 상태로 현저하게 연장된 수명을 갖는 비용 효과적이고 산업적으로 확대될 수 있는 건조 포뮬레이션을 제공하고자 하는 문제를 해소한다. 본 발명은 고도로 용해성인 화합물의 무정형 유리질 구조로 둘러싸인 생물학적 물질을 포함하는 보존 조성물 및 건조 방법을 제공한다. 건조 과정은 액체 슬러리에 생물학적 물질 및 조성물을 혼합시키고, 상기 조성물 슬러리를 액체 질소에서 급속-동결시켜 점적, 스트링 또는 비드를 형성하고, 그 후, 조성물에 열을 가하면서 감압의 지배하에 수분을 증발시킴으로써 생활성 물질을 당 유리 형성물로 건조시키는 것을 포함한다.
본 발명은 생물학적 물질이 실질적인 활성을 유지하면서 유리질 구조내에 보호될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다. 생물학적 물질이 본 발명에 따라 조성물 혼합물과 배합되고 건조되었을 때, 가혹한 온도 및 습도 조건으로의 장기간 노출 동안 탁월한 안정성이 달성되었다. 본 발명은 생물학적 물질, 용해성 탄수화물과 유리 강화 카르복실산 염의 혼합물을 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 그 물리적 구조 및 기능에 있어서 전형적인 동결 건조 공정하에 단순히 건조된 비점성 또는 농축된 당질 조성물과 본질적으로 상이하다. 예를 들어, 미국특허 번호 6,919,172는 다양한 탄수화물과 소듐 시트레이트의 혼합물을 함유하는, 폐 투여용 에어로졸화 분말 조성물을 기재하고 있다. 그러나, 상기 특허에 기재된 조성물에는 고농도의 당을 지니는 용액의 건조 동안 요망되는 물리적 구조의 형성과 부가 안정성에 필수적인 추가의 단백질성 화합물이 결여되어 있다. 상기 특허에 기재된 조성물은 또한 개선된 유리 형성을 위해 해동되거나 동결되지 않은 용액의 효율적인 건조를 가능하게 하는 점도 또는 하이드로겔 구조가 결여되어 있다. 대조적으로, 본 발명의 조성물 및 건조 방법은 생물학적 물질의 탁월한 안정성을 달성하는 한편 이러한 모든 문제를 극복한다. 또한, 종래 기술은 생물학적 물질을 보호하고 안정화시키기 위해 가수분해된 단백질과 상승작용적으로 작용하는 부가적인 카르복실 성분이 결여되어 있다.
개선된 유리질 구조는 일반적으로 효과적인 건조를 촉진하기 위해 진공하에 용액을 발포시키거나 비등시킴에 의해 종래 분야에서 달성되었다. 발포 단계는 일반적으로 동결되지 않은 용액의 불가피한 건조 결과로서 용액의 광범위한 비등 및 폭발을 초래하고, 이에 따라 바이알 또는 용기에서 용액의 매우 낮은 로딩 용량만이 달성될 수 있다 (예를 들어 미국특허 번호 6,534,087 참조, 여기서 최종 발포 생성물의 두께는 2 mm 미만이다). 본 발명의 조성물 및 건조 방법은 포뮬레이션의 비등 및 발포를 피하므로 건조 면적 당 물질을 훨씬 더 많이 로딩할 수 있고, 결과적으로 특수하게 설계된 용기 및 트레이 또는 장비를 이용하지 않고도, 다량의 물질 생산으로 용이하게 확대될 수 있다.
본 발명에 따른 수성 보존 배지를 형성하기 위해 광범위한 생물학적 물질을 본 발명의 조성물에 이용할 수 있다. 이러한 보존 배지는 그 후 생물학적 물질의 안정한 건조 분말을 제조하기 위해 본 발명의 건조 방법으로 처리될 수 있다. 이러한 생물학적 물질은 비제한적으로 효소, 예컨대 췌장 효소, 리파제, 아밀라제, 프로테아제, 피타제, 락테이트 데하이드로게나제; 단백질, 예컨대 인슐린; 백신; 바이러스, 예컨대 아데노바이러스; 원핵생물 세포 (박테리아 및 진균류 포함) 및 진핵생물 세포를 포함하는 세포, 약물, 핵산, 펩티드, 호르몬, 비타민, 카로테노이드, 미네랄, 항생제, 살균제, 살진균제, 제초제, 살충제, 살정제, 항체 및 지질 소포체를 포함하는 그 밖의 생물학적 물질을 포함한다.
프로바이오틱 박테리아가 본 발명의 조성물 및 건조 방법에서 특히 유리한 것으로 나타났다. 안정한 건조 프로바이오틱 분말은, 프로바이오틱 박테리아의 신선하거나, 동결되거나 건조된 배양물을 탄수화물과 유리 강화 화합물의 혼합물과 혼합하고, 점성 포뮬레이션을 액체 질소에서 급속-동결시켜 동결된 고체 점적, 스트링 또는 비드를 형성시키고, 포뮬레이션 온도를 동결 온도보다 높게 증가시키기에 충분한 진공을 먼저 가하고 일차 수분 제거를 촉진하기 위해 20℃ 및 그 초과의 열원을 공급하여 건조시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 제조된다. 포뮬레이션의 온도를 동결점보다 높게 유지시키는 것은 진공 조정 및 포뮬레이션으로의 열 전도에 의해 달성될 수 있다. 건조 과정을 완료하고 포뮬레이션의 수분 활성도를 0.3 Aw 또는 그 미만 아래로 추가로 감소시키기 위해, 최대 진공하에서 70℃ 까지 상승된 온도로 이차 건조 단계가 적용된다. 이러한 조성물은 도 15에 도시된 바와 같이 30일 이상 동안 40℃ 및 33%RH의 저장 조건에서 안정적으로 유지될 수 있다.
압축된 정제내의 프로바이오틱 박테리아와 같은 살아있는 미생물은 본 발명의 조성물 및 건조 방법에서 특히 유리한 것으로 나타났다. 안정한 건조 생물학적 분말은, 단일 세포 유기체의 신선하거나, 동결되거나 건조된 배양물을 추가량의 폴리사카라이드 및 올리고사카라이드를 잠재적으로 포함하는 당, 가수분해된 단백질 및 항산화제의 혼합물 및 유리 강화 화합물과 혼합하고, 점성 포뮬레이션을 액체 질소에서 급속-동결시켜 동결된 고체 점적, 스트링 또는 비드를 형성시키고, 포뮬레이션 온도를 이의 동결 온도보다 높게 증가시키기에 충분한 진공을 먼저 가하여 수분을 증발시키고, 일차 수분 제거를 촉진하기 위해 20℃ 및 그 초과의 열원을 공급하는 것을 포함하는 본 발명의 방법 및 조성물에 따라 제조된다. 포뮬레이션의 온도를 동결점보다 높게 유지시키는 것은 진공 조정 및 포뮬레이션으로의 열 전도 또는 방출에 의해 달성될 수 있다. 건조 과정을 완료하고 포뮬레이션의 수분 활성도를 0.3 Aw 또는 그 미만 아래로 추가로 감소시키기 위해, 최대 진공하에서 70℃ 까지 상승된 온도로 이차 건조 단계가 적용된다.
본 발명의 조성물
일부 구체예에서, 포뮬레이션은 생활성 물질이 임베딩된 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드의 탄수화물 혼합물을 포함한다. 적합한 폴리사카라이드의 예는 비제한적으로 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 펙틴, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 메틸 셀룰로스, 카라기난, 젤란검, 구아검, 아카시아검, 잔탄검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분 및 개질된 전분을 포함한다. 적합한 올리고사카라이드의 예는 비제한적으로 시클로덱스트린, 프룩탄, 이눌린, FOS, 말토덱스트린, 덱스트란 등; 및 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 디사카라이드의 예는 비제한적으로 락토스, 트레할로스, 수크로스 등을 포함한다. 특정 일 구체예에서, 적합한 예시적인 폴리사카라이드는 소듐 알기네이트 또는 젤란검이다. 또 다른 구체예에서, 포뮬레이션은 총 건조 물질의 중량%로 0.1-20%의 소듐 알기네이트를 포함한다.
일부 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 총 건조 물질의 중량%로 0.1-10%의 폴리사카라이드, 1-10%의 올리고사카라이드 및 10-90%의 디사카라이드를 포함한다. 추가 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 10:0.1-4:0.1-2의 중량 비로 포함하거나, 여기서, 디사카라이드/올리고사카라이드/폴리사카라이드의 중량 비는 약 10:0.2:0.1 내지 약 10:2:1이다.
일부 구체예에서, 탄수화물 혼합물 중 디사카라이드 분획은 다양한 당 및 당 알콜을 포함한다. 적합한 디사카라이드는 동결 온도 (예컨대, -20℃ 미만)에서 수분 제거 동안 포뮬레이션 중 생물학적으로 활성인 물질을 결정화 및/또는 손상 또는 탈안정화시키지 않는 것이다. 예를 들어, 생활성 물질은 건조 공정을 통틀어 분자 구조의 보유를 촉진하고 건조 상태의 무정형 매트릭스에 구조적 강성을 부여하기 위해 수크로스, 락토스 또는 트레할로스와 같은 유리 형성 당의 존재하에 건조될 수 있다. 적합한 디사카라이드는 건조 동안 수화 손실된 물을 효과적으로 대체하여 세포막의 손상 및 효소의 변성을 막을 것이다 (참조: Crowe et al., 1998 검토됨). 조성물 중 디사카라이드의 그 밖의 기능은 파괴적인 광, 산소, 산화제 및 습기로의 노출로부터 생활성 물질을 보호하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 디사카라이드는 용액에 용이하게 용해되어야 한다. 트레할로스는 특히 매력적인 보호제인데, 그 이유는 그것이 가뭄 기간 동안 가사 상태로 유지되는 식물 및 살아 있는 유기체 (예컨대, 박테리아, 진균류 및 곤충 및 선충류와 같은 무척추동물)에서 발견되는 비환원 디사카라이드이기 때문이다. 일부 경우에, 결정 형성을 막고, 연장된 기간 동안 저장 조건에서 건조된 생활성 물질 포뮬레이션의 안정성을 개선시키고, 비용을 낮추기 위해 트레할로스와 수크로스의 혼합물과 같이 두 개 이상의 상이한 디사카라이드를 포함하는 것이 이로울 수 있다.
일부 구체예에서, 탄수화물 혼합물 중 올리고사카라이드 분획은 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프룩토-올리고사카라이드 (FOS), 갈락토-올리고사카라이드 (GOS), 만난-올리고사카라이드 (MOS) 및 이들의 조합물을 포함한다. 올리고사카라이드는 보존된 다양한 생물학적 물질에 대한 보호제로서 트레할로스만을 이용하는 것과 관련된 여러 문제를 완화시킨다. 탈수화 및 재수화 동안 생물학적 물질을 보호함에 있어서 매우 효과적일지라도, 안정화제로서 단독의 트레할로스는 연장된 기간 동안, 특히 고온 및/또는 다습 환경에서 바람직한 저장 안정성을 제공하지 못한다. 올리고사카라이드, 예를 들어, 이눌린을 탄수화물 혼합물에 첨가시킴에 의해 본 발명에서 이러한 문제를 해결하였다.
탄수화물 혼합물 중 사카라이드들의 적합한 예시적 질량 비는 10:0.1-10:0.1-2의 디사카라이드/올리고사카라이드/폴리사카라이드이고, 일부 구체예에서, 디사카라이드/올리고사카라이드/폴리사카라이드의 중량 비는 약 10:0.2:0.1 내지 약 5:10:1이다. 일부 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 총 건조 물질의 중량%로 10-90%의 디사카라이드, 1-10%의 올리고사카라이드 및 0.1-10%의 폴리사카라이드를 포함한다. 기타 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 총 건조 물질의 중량%로 10-50%의 디사카라이드, 10-80%의 올리고사카라이드 및 0.1-10%의 폴리사카라이드를 포함한다.
특정 구체예에서, 포뮬레이션은 올리고사카라이드의 혼합물을 포함한다. 올리고사카라이드 혼합물은 조성물중의 유리 강화 물질로서 단일의 올리고사카라이드만을 이용하는 것과 관련된 여러 문제를 완화시킨다. 유리 전이 온도를 상승시키는데 있어서 매우 효과적일지라도, 올리고사카라이드는 빠르게 결정화되고 침전되어 특히, 고온 및/또는 다습 환경에서 유리질의 무정형 구조를 단편화시킨다. 단일 유형의 올리고사카라이드 대신에 올리고사카라이드의 혼합물, 일부 구체예에서, 프룩탄과 낮은 DE 덱스트린의 혼합물의 첨가로 본 발명에서 이러한 문제를 해결하였다. 일부 구체예에서, 탄수화물 혼합물은 총 건조 물질의 중량%로 5-40% 프룩탄 및 5-40% 낮은 DE 덱스트린을 포함한다.
적합한 한 조성물은 적어도 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드를 포함하는 약 0.5% 내지 약 90%의 탄수화물 성분 및 약 0.5% 내지 약 40%의 가수분해된 단백질을 포함하는 단백질 성분을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 약 30% 내지 약 70%의 탄수화물 성분 및 단백질 가수분해된 단백질 및 카르복실산과 같은 약 10% 내지 약 40%의 유리 강화제 성분을 포함하고, 여기서 탄수화물 성분은 약 10% 내지 90% 또는 약 40% 내지 80%의 디사카라이드; 약 1% 내지 약 10% 또는 약 5% 내지 10%의 올리고사카라이드; 및 약 0.1 내지 약 10% 또는 약 5% 내지 약 10%의 폴리사카라이드를 포함한다. 조성물은 또 다른 유리 강화제 성분으로 고려되는 유기산의 염을 추가로 포함하며, 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.5% 내지 20%의 카르복실산을 포함한다.
추가적 구체예에서, 조성물은 소듐 알기네이트/올리고사카라이드의 중량비가 1:1-10 또는 1:1-5인 소듐 알기네이트와 올리고사카라이드의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 추가의 또 다른 구체예에서, 조성물은 이가 금속 이온과 가교되어 단단한 하이드로겔을 형성한다. 일부 구체예에서, 가교된 하이드로겔 포뮬레이션은 이가 금속 이온 용액을 함유하는 배쓰에서 슬러리를 아토마이징시키거나 압출시킴으로써 또는 이가 금속 이온을 슬러리에 직접 첨가함으로써 형성되며, 이는 포뮬레이션이 경화되게 하여 하이드로겔을 형성시킨다. 그 후 하이드로겔 포뮬레이션을 급속 동결시키고 본 발명의 건조 방법에 따라 건조시킨다.
또 다른 구체예에서, 조성물은 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산 등과 같은 유기산의 염을 포함하는 상당량의 유리 강화 화합물을 포함한다. 염은 소듐, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등과 같은 양이온을 포함할 수 있다. 예는 소듐 시트레이트, 소듐 락테이트, 소듐 말레에이트, 마그네슘 글루코네이트, 소듐 아스코르베이트 등을 포함한다. 높은 유리 전이 온도 (Tg) 및 높은 용해성을 갖는 염이 선호된다. 예시적인 유기산은 시트르산 및 이의 염 (예컨대, 소듐 또는 포타슘 시트레이트, 트리소듐 시트레이트 탈수화물) 및 아스코르브산 및 이의 염 (예컨대, 소듐 아스코르베이트, 포타슘 아스코르베이트, 마그네슘 아스코르베이트)을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 발명의 조성물은 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드의 탄수화물 혼합물 및 시트르산 및/또는 아스코르브산과 같은 유기산의 이온을 포함한다.
조성물에 사용되는 유리 강화제의 양은 전체 조성물 및 이의 의도된 건조 저장 조건에 따라 변화될 것이다. 일반적으로, 조성물중의 유기 강화 화합물의 양은 총 건조 물질의 이 (2) 중량%보다 많으며, 한편 용액 또는 분산액의 pH는 약 알칼리 (pH 7-7.5)로 유지된다. 이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 바와 같은 비교적 고함량의 유리 강화 화합물의 기능은 생성되는 건조 조성물의 바람직한 무정형의 강성 유리질 구조에 기여할 뿐만 아니라 파괴적인 광, 산소, 산화제 및 습기로의 노출로부터 생활성 물질을 보호하는 것으로 간주된다. 적합한 예시적인 조성물은 총 건조 물질의 중량%로 총 건조 물질의 1-20중량% 또는 약 2-10중량%의 유리 강화 화합물을 포함한다.
조성물의 안정성을 추가로 증가시키기 위해 조성물에 포함되는 그 밖의 적합한 유리 강화제는 단백질, 단백질 가수분해물, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 이들은 젤라틴, 알부민, 유장 단백질, 대두 단백질, 카세인, 카세이네이트, 면역글로불린, 대두 단백질, 완두 단백질, 목화씨 단백질 또는 그 밖의 식품 및 낙농 또는 식물성 단백질 및/또는 이들의 가수분해물, 또는 임의의 그 밖의 가수분해된 단백질을 포함한다. 폴리아미노산의 예는 폴리알라닌, 폴리아르기닌, 폴리글리신, 폴리글루탐산 등을 포함한다. 유용한 아미노산은 리신, 글리신, 알라닌, 아르기닌 또는 히스티딘뿐 아니라 소수성 아미노산 (트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등) 및 베타인과 같은 메틸아민을 포함한다.
일부 구체예에서, 카세인 또는 완두 단백질 또는 가수분해된 카세인 또는 가수분해된 완두 단백질이 사용된다. 일부 구체예에서, 조성물 혼합물중의 가수분해된 단백질 분획은 부분적으로 가수분해되거나 광범위하게 가수분해된 단백질, 폴리펩티드 및 아미노산을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 광범위하게 가수분해된 단백질은 단백질의 변형 (분해)를 위한 프로테아제의 사용을 통해 광범위한 효소 가수분해에 의해 수득된 것들이다. 일부 구체예에서, 가수분해된 동물성 또는 식물성 단백질 예컨대, 카세인, 유장, 대두 또는 완두 단백질, 또는 광범위하게 가수분해된 카세인 또는 완두 단백질이 사용된다. 일부 구체예는 분자량이 약 1 kDa 내지 약 50 kDa인 단쇄 펩티드를 80% 넘게 지니는 광범위하게 가수분해된 단백질을 사용하며, 단백질 기질의 적어도 20%는 분자 질량이 200 내지 2000 돌턴인 펩티드로 전환된다. 이론에 의해 제한되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 바와 같은 광범위하게 가수분해된 단백질 및 당으로부터 생성된 혼합물은 더욱 신속한 건조를 가능하게 하며, 생성되는 건조 조성물의 바람직한 무정형의 강성 유리질 구조에 기여하는 것으로 간주된다. 효소-가수분해된 단백질은 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조될 수 있거나 시판원으로부터 수득될 수 있다. 적합한 예시적인 조성물은 총 건조 물질의 중량%로 5-40%의 광범위하게 가수분해된 단백질을 포함한다.
건조 조성물중의 단백질, 가수분해된 단백질 또는 광범위하게 가수분해된 단백질 및 아미노산의 적합한 예시적인 총량은 건조 혼합물의 총 질량의 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 5% 내지 약 40%, 또는 약 10% 내지 약 30%이다.
조성물 중 유리 강화제의 적절한 양은 건조 조성물의 요망되는 특징에 의존할 수 있음이 주목되어야 한다. 예를 들어, 25℃ 및 25%RH와 같은 온건한 온도 및 상대 습도하에 저장하면서 생물학적 물질의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 탄수화물 혼합물 및 단백질 또는 단백질 가수분해물을 함유하는 조성물이 사용될 수 있다. 유리 강화제의 적절한 양 및 특히, 디사카라이드와 올리고사카라이드간의 상대 비율은 요망되는 저장 조건에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 25℃ 및 25%RH와 같은 온건한 온도 및 상대 습도하에 저장하면서 생물학적 물질의 화학적 안정성을 향상시키기 위해 높은 비의 디사카라이드/올리고사카라이드를 함유하는 조성물이 사용될 수 있다. 30℃ 및 40%RH 또는 그 초과와 같은 높은 온도 및 상대 습도하에 저장하면서 생물학적 물질의 화학적 안정성을 향상시키기 위해서는 낮은 비의 디사카라이드/올리고사카라이드를 함유하는 조성물이 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 더 높은 온도 및 습도 노출하에 부가된 안정화 이점을 수득하기 위해 유리 강화제로서 아스코르브산 이온이 선호될 수 있다. 대안적으로, 일부 구체예에서, 시트레이트 및/또는 아스코르베이트 이온과 또 다른 유리 강화제 예컨대, 단백질 또는 단백질 가수분해물의 조합물이 더욱 선호된다.
일부 구체예에서, 포뮬레이션은 생활성 활성 물질이 임베딩된, 당과 가수분해된 단백질의 혼합물을 포함한다. 적합한 당의 예로는 비제한적으로, 디사카라이드, 예컨대, 락토스, 트레할로스, 수크로스 및 이들의 혼합물을 포함한다. 적합한 가수분해된 단백질의 예로는 비제한적으로, 광범위하게 가수분해된 젤라틴, 알부민, 유장 단백질, 대두 단백질, 카세인, 카세이네이트, 면역글로불린, 대두 단백질, 완두 단백질, 목화씨 단백질 또는 낙농, 동물성 또는 식물성 기원의 임의의 그 밖의 광범위하게 가수분해된 단백질, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 건조 조성물중 당의 적합한 예시적인 총량은 건조 혼합물의 총 질량의 약 10% 내지 약 80%, 또는 건조 질량의 약 10% 내지 약 60%이다.
예시적인 일 구체예에서, 유리 형성제는 디사카라이드와 가수분해된 단백질의 혼합물을 포함한다. 특정 구체예에서, 적합한 예시적인 유리 형성제는 트레할로스와 가수분해된 단백질의 혼합물이다. 일부 구체예에서, 포뮬레이션은 총 건조 물질의 중량%로 10-90%의 트레할로스 및 0.1-30%의 가수분해된 단백질, 또는 20-80%의 트레할로스 및 0.1-20%의 가수분해된 단백질, 또는 40-80%의 트레할로스 및 0.1-20%의 가수분해된 단백질을 포함한다.
이상적으로, 일반적으로 안전하다고 볼 수 있는 (GRAS) 화합물인 화합물이 GRAS이지 않은 것에 비해 선호된다. 그 밖의 것으로는 부형제 염 예컨대, 마그네슘 설페이트; 폴리올 예컨대, 3가 또는 그 초과의 당 알콜 (예컨대, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨); 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉; 계면활성제; 및 이의 조합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 생물학적 물질은 살아 있는 박테리아 (예컨대, 프로바이오틱 박테리아)를 포함한다. 적합한 미생물의 예는 비제한적으로 사카로마이세스(Saccharomyces), 데바로마이세스(Debaromyces), 캔디다(Candida), 피키아(Pichia) 및 토룰롭시스(Torulopsis)와 같은 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 리조푸스(Rhizopus), 뮤코(Mucor), 페니실리움(Penicillium) 및 토룰롭시스(Torulopsis)와 같은 곰팡이, 및 비피도박테리움(Bifidobacterium), 클로스트리디움(Clostridium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 멜리소코쿠스(Melissococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacterium), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 코쿠리오(Kocuriaw), 스태필로코쿠스(Staphylococcus), 펩토스트레포코쿠스(Peptostrepococcus), 바실러스(Bacillus), 페디오코쿠스(Pediococcus), 마이크로코쿠스(Micrococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 바이스엘라(Weissella), 에어로코쿠스(Aerococcus), 에노코쿠스(Oenococcus) 및 락토바실러스(Lactobacillus) 속과 같은 박테리아를 포함한다. 적합한 프로바이오틱 미생물의 구체적인 예는 하기 종에 의해 나타낼 것이고 그러한 종내에서 모든 배양 생물형을 포함한다: 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), A. 오리자에(A. oryzae), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), B. 렌투스(B. lentus), B. 리체니포르미스(B. licheniformis), B. 메센테리쿠스(B. mesentericus), B. 푸밀루스(B. pumilus), B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 나토(B. natto), 박테로이데스 아밀로필루스(Bacteroides amylophilus), Bac. 카필로수스(Bac . capillosus), Bac. 루미노콜라(Bac . ruminocola), Bac. 수이스(Bac . suis), 비피도박테리움 아돌레센티스(Bifidobacterium adolescentis), B. 아니말리스(B. animalis), B. 브레베(B. breve), B. 비피둠(B. bifidum), B. 인펀티스(B. infantis), B. 락티스(B. lactis), B. 롱굼(B. longum), B. 슈도롱굼(B. pseudolongum), B. 써모필룸(B. thermophilum), 캔디다 핀토레페시이(Candida pintolepesii), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 엔테로코쿠스 크레모리스(Enterococcus cremoris), E. 디아세티락티스(E. diacetylactis), E. 파에시움(E. faecium), E. 인터메디우스(E. intermedius), E. 락티스(E. lactis), E. 문트디(E. muntdi), E. 써모필루스(E. thermophilus), 에스체리티아 콜라이(Escherichia coli), 클루이베로마이세스 프라질리스(Kluyveromyces fragilis), 락토바실러스 아시도필러스(Lactobacillus acidophilus), L. 알리멘타리우스(L. alimentarius), L. 아밀로보루스(L. amylovorus), L. 크리스파투스(L. crispatus), L. 브레비스(L. brevis), L. 카세(L. case) 4 L. 쿠르바투스(L. curvatus), L. 셀로비오수스(L. cellobiosus), L. 델브루엑키이(L. delbrueckii) ss. 불가리쿠스(ss . bulgaricus), L. 파르시미니스(L. farciminis), L. 페르멘툼(L. fermentum), L. 가세리(L. gasseri), L. 헬베티쿠스(L. helveticus), L. 락티스(L. lactis), L. 플란타룸(L. plantarum), L. 존스니이(L. johnsonii), L. 류테리(L. reuteri), L. 람노수스(L. rhamnosus), L. 사케이(L. sakei), L. 살리바리우스(L. salivarius), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), P. 세레비세아에(P. cereviseae) (단노수스 (damnosus)), 페디오코쿠스 아시딜락티시(Pediococcus acidilactici), P. 펜토사세우스(P. pentosaceus), 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이(Propionibacterium freudenreichii), Prop, 세르마니이(Prop . shermanii), 사카로마이세스 세리비세아에(Saccharomyces cereviseae), 스태필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), Staph . 자일로수스(Staph . xylosus), 스트렙토코쿠스 인펀타리우스(Streptococcus infantarius), Strep, 살리바리우스(Strep . salivarius) ss. 써모필루스(thermophilus), Strep. 써모필루스(Strep . Thermophilus) 및 Strep, 락티스(Strep . lactis).
조성물의 제조 방법
생물학적 물질 및 조성물의 적합한 한 혼합 공정은 총 건조 조성물 혼합물을 생물학적 물질을 함유하는 농축 배양물 또는 배지 용액에서 첨가시킴에 의해 수행된다. 배양 배지에서 생물학적 물질의 무게 질량은 전형적으로 약 5% 내지 30% w/v 또는 약 10% 내지 20% w/v이다. 배양 배지 중 조성물 혼합물의 부가된 무게 질량은 전형적으로 약 10% 내지 약 60% 또는 약 20% 내지 40%이다. 혼합된 슬러리에서 최종 고체 함량은 약 20% 내지 약 60%이고, 보다 특히 약 30% 내지 약 50%이다. 일부 구체예에서, 용액은 실온에서 혼합되거나 다소 가온되어 점성 용액에서 물질의 용해를 돕는다 (예컨대, 20℃ 내지 40℃). 본 발명의 변형에서, 포뮬레이션 중 탄수화물 혼합물의 총량은, 건조 단계 동안 일어날 수 있는 고무질 형성 또는 과도한 발포를 피하면서 효율적 건조가 가능하도록 하는 요망되는 포뮬레이션 점도 및 밀도를 달성하도록 조정된다. 적합한 예시적인 슬러리 점도는 약 1,000 cP 내지 약 500,000 cP 또는 약 5,000 cP 내지 약 300,000 cP이다. 최종 슬러리의 요망되는 점도 및 밀도는, 예를 들어 탄수화물 혼합물 중 폴리사카라이드의 양을 약간 조정하는 당 분야에 공지된 임의의 수단 또는 공기, 질소, 이산화탄소, 아르곤 등과 같은 가스를 탈기시키거나 주입시킴에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 생물학적 물질 슬러리는 전형적으로 -30℃ 내지 -180℃로 급속-동결되거나, 포뮬레이션은 액체 질소에서 아토마이징, 적하 또는 액체 질소 배쓰로의 주입에 의해 급속-동결된다. 액체 질소 배쓰로부터 입자, 비드, 스트링 또는 점적을 수집하고 동결 건조기 또는 진공 건조기에서 건조시키거나, 대안적으로 이들을 동결된 형태로 추후 사용을 위해 또는 예를 들어, 분무 건조에 의한 추후 건조를 위해 초저온 냉동고(-30℃ 내지 -80℃)에 저장한다.
일반적으로, 유용한 건조 공정 기법은 분무 건조; 또는 슬러리의 동결 온도보다 높은 온도(-20 내지 50℃)로 진공 오븐 또는 원심분리 증발기에서 비동결된 용액의 증발 건조 후 요망되는 입자 크기로 제분시키는 것을 포함한다. 생성된 분말 입자는 생물학적 물질이 대부분의 유리질 물질로 코팅된 유리질이다. 생물학적 물질을 유리질 물질로 코팅하는 이점은 생성물의 물리적 안정성을 증가시키고 입자내에서 유해한 분자간 반응을 감소시키는 것이다. 적합한 예시적 구체예에서, 동결된 입자는 트레이에 로딩된 즉시 진공 건조 챔버로 옮겨지는데, 여기서 건조 공정은 하기를 포함하는 3개의 주요 단계로 진행된다: (1) 2000 mTORR 미만 (<2000 mTORR)의 진공압하에 동결된 입자의 임의의 짧은 퍼징 및 구조 안정화 단계, (2) 2000 mTORR 초과 (>2000 mTORR)의 진공하에 슬러리의 동결점보다 높은 온도에서의 일차 건조 단계, 및 (3) 건조된 포뮬레이션의 수분 활성도를 0.3 Aw 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안 충분한 진공압하에 상승된 온도에서 무정형 유리질 물질의 이차 및 최종 건조 단계.
본 발명의 특정 일 구체예에서, 건조된 포뮬레이션은 극한의 온도 및 습도 조건에 노출되는 짧은 기간에 향상된 보존성을 수득하기 위해 용융된 지방의 혼합물과 과립화된다.
건조된 안정한 생물학적 조성물을 박편으로서 직접 이용할 수 있거나, 분말로 분쇄하고 약 10 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 평균 입자 크기로 체질될 수 있다. 포뮬레이션은 농축 분말로서, 재구성된 액체 (예컨대, 음료)로서, 인간을 포함하는 동물에게 직접 투여될 수 있거나, 박편 또는 분말 형태로 현존하는 식품 또는 사료 또는 농산품에 혼입될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명에 따른 생물학적 물질의 동결되거나 건조된 안정한 분말을 제조하기 위한 조성물은 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 포함한다. 그러한 물질은 생활성 물질과 혼합시 액체 질소에서 비드, 스트링 또는 점적을 형성하고 본 발명의 방법에 따라 무정형 유리질 구조에서 효율적으로 건조될 수 있어서 상기 생활성 물질의 저장 및 투여를 위한 다량의 안정한 건조 조성물을 제공한다 (건조 후 다양한 포뮬레이션의 육안 및 현미경 관찰 및 수분 활성도 (Aw)에 대한 도 7 및 8 참조). 탄수화물 혼합물은 고온 및 다습 예컨대, 30℃ 및 40%RH 초과하에 포뮬레이션에 구조적 안정성 및/또는 생활성 물질에 물리적 및 화학적 보호 이점을 제공하고 재구성 또는 재수화시 역효과를 예방하거나 감소시킨다.
탄수화물 혼합물 중 폴리사카라이드 분획은 포뮬레이션에 점도 증점성 및 진공하에 포뮬레이션 밀도 특성에 관해 양호한 제어성 및 본 발명의 건조된 포뮬레이션 조성물에 증가된 구조적 강도를 제공할 수 있다 (그러한 특정 포뮬레이션의 유리질 구조 및 건조에 대한 도 8-도면 4, 4b, 4c 참조). 특히 살아 있는 유기체에 적합한 폴리사카라이드는 수용성 검인데, 그 이유는 온건한 온도에서 점성 겔을 형성하는 이들의 독특한 특징 때문이다. 특정 농도의 검은 또한, 적절한 점도 및 밀도를 포뮬레이션에 제공하여 특정 점도에서의 일차 수분 제거 단계 동안 포뮬레이션이 효과적으로 건조되게 하여, 진공하 포뮬레이션 구조를 효과적으로 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 특정 검은 또한 이가 또는 다가 양이온 (예컨대, 알기네이트, 펙틴, 키토산)과 가교되거나 온도 또는 pH 변화에 의해 하이드로겔을 형성할 수 있다 (예컨대, 젤라틴, CMC, CAP, 젤란검). 하이드로겔화된 용액은 동결되지 않은 용액의 진공 건조와 관련된 문제를 회피할 것이다. 특정 농도의 검은 또한, 포뮬레이션을 효과적으로 안정화시키고 무정형 유리질 구조의 형성을 촉진하고 진공하 건조 프로파일을 개선시키는 것으로 밝혀졌다 (도 7 - 도면 3a, 3b, 3c, 4, 및 도 8 - 4c 및 도 13 참조).
특히, 하기 표 1에 제시된 결과와 함께 도 7의 도면을 살펴볼 경우, 샘플 3b, 3c, 4, 5 및 6이 모두 충분히 건조되어 무정형 유리질 구조에 일부 다공성을 부여하는 것으로 입증된다.
다양한 건조 조성물의 육안 관찰
1 2 3a 3b 3c 4 5 6
건조 비건조 비건조 비건조 건조 건조 건조 건조 건조
다공성 없음 없음 없음 존재 존재 존재 없음 부분적
Aw 0.847 0.923 0.916 0.216 0.183 0.376 0.171 0.112
유리 구조 없음 없음 없음 부분적 부분적 존재 부분적 부분적
예를 들어, 생활성 물질의 건조 형태는 조성물 분말 혼합물을 함유하는 용액 또는 현탁액으로 포뮬레이션화될 수 있다. 조성물 혼합물은 냉각 및 생활성 물질과의 혼합에 앞서 저 전단 교반을 이용하여 따뜻한 수용액중에 용해될 수 있다. 배양된 바이러스 또는 박테리아와 같은 생활성 물질은 포뮬레이션으로의 재현탁에 앞서 원심분리 또는 여과에 의해 농축되고 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 대안적으로, 포뮬레이션 중의 물 전체 또는 일부는 농축된 생물학적 물질의 액체내에서 제공된다. 현탁액은 실온보다 약간 높은 온도에서 유지되며 건조 조성물 분말 혼합물이 생물학적 물질을 함유하는 가온된 (25℃ 내지 40℃) 현탁액에 서서히 첨가된다. 현탁액은 모든 성분이 완전히 분산되거나 용해되고 균일한 슬러리가 수득될 때까지 자전공전식 믹서에서 약하게 교반된다.
그 후 금속 이온을 첨가하거나 슬러리의 온도 또는 pH를 변화시킴으로써 점성 슬러리를 가교시켜 하이드로겔 (폴리사카라이드 특성에 따라)을 형성시킨 다음 본 발명의 건조 방법에 따라 건조할 수 있다. 대안적으로, 슬러리를 노즐을 통해 아토마이징하거나, 적하하거나 드라이 아이스 또는 액체 질소 배쓰에 주입시킴으로써 급속-동결시켜 소입자 또는 고체 점적 스트링 또는 비드를 형성시킬 수 있다. 동결된 고체 입자는 안정한 동결된 생성물로서 추후 이용을 위해 또는 건조시까지 -30℃ 내지 -80℃의 초저온 냉동고에 저장될 수 있다. 적합한 예시적 건조 방법은, 생성물 온도가 그 동결 온도보다 약간 높게 유지되는 진공 건조이다. 동결된 점적 또는 비드를 트레이 상에 약 0.1 kg/sq ft 내지 약 1.5 kg/sq ft의 로딩 용량으로 놓고 본 발명의 방법에 따라 건조시킨다. 일부 구체예에서, 건조 과정이 짧은 퍼징 단계에 의해 개시되는데, 이러한 단계는 생성물을 동결된 입자의 초기 온도 및 구조에 순응시켜 이완 및 안정화시키고 과도한 공기를 탈기시킨다. 전형적으로, 퍼징 단계는 생성물 점도 및 트레이 로딩에 따라 1 내지 60분이 소요된다. 비드 또는 입자는 전체 퍼징 단계 동안 동결된 고체 형태로 유지되어야 한다. 그 후 생성물 온도는 그 동결 온도를 초과하게 되고, 모든 자유수가 생성물로부터 증발될 때까지 일차 수분 제거 단계가 이어진다. 일단 포뮬레이션 온도가 요망되는 온도에 도달하면, 그 온도가 유지되도록 열이 조정되고 증발에 의한 일차 액체 건조 단계가 진행된다. 이러한 단계에서, 포뮬레이션은 이미 해동되고 어떠한 비등 또는 발포 없이 가속화된 물 증발이 일어난다. 건조 과정은 최대 진공 및 상승된 온도에서 추가의 이차 건조 단계로 완료된다.
종래 기술의 전형적인 방법은 민감한 생물체에 손상을 줄 수 있는 광범한 발포 및/또는 튀임 (splattering) 및 극단적인 비등을 포함하며 고 로딩 용량의 산업적 규모로 확대하기에 어려움이 있다 (예를 들어, 가해진 진공압이 격렬한 비등 및 발포를 초래하는 미국특허 번호 6,534,087 참조). 그러나, 본 발명의 조성물 및 방법은 현저히 빠른 건조 속도를 달성하고 포뮬레이션의 고 로딩 용량을 가능하게 하면서 포뮬레이션의 비등 또는 발포도 회피한다. 추가로, 점성 액체 슬러리의 완전하고 효율적인 탈기는 어려우며, 연장된 기간이 필요할 수 있다. 이러한 단점들은 비등 및 과도한 발포 없이 유리질 구조를 형성하면서 효과적인 일차 수분 제거를 가능하게 하는 적합한 조성물을 이용함으로써 본 발명에서 모두 해소되었다. 슬러리 또는 점성 시럽에 반하여 트레이 상의 동결된 고체 입자의 로딩은 종래 기술에 따라 제공된 것보다 훨씬 더 많은 트레이 상의 건조 면적 당 로딩 용량을 가능하게 한다.
본 발명의 적합한 일례에서, 생물학적 물질은 살아 있는 농축된 프로바이오틱 박테리아 배양물이다. 분말 조성물 혼합물은 일부 구체예에서, 1-4%의 소듐 알기네이트 또는 젤란검, 50-75%의 트레할로스, 1-10%의 이눌린 또는 FOS, 10-20%의 단백질 가수분해물, 예컨대 카세인, 유장, 완두, 대두 또는 목화씨 가수분해물 및 1-10%의 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트를 함유한다. 프로바이오틱 배양물은 신선하거나, 동결되거나 건조 분말의 형태로 미리 건조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 적합한 예에서, 생물학적 물질은 살아 있는 농축된 미생물 배양물이다. 분말 조성물 혼합물은 1-4%의 소듐 알기네이트 또는 젤란검, 5-30%의 트레할로스, 5-40%의 이눌린, 5-40%의 낮은 DE 말토덱스트린, 10-30%의 광범위하게 가수분해된 단백질, 예컨대 카세인, 유장, 완두, 대두 또는 목화씨 단백질을 혼합함으로써 제조된다. 추가적인 0.1-10%의 유리 강화제 예컨대, 소듐 시트레이트, 소듐 글루타메이트 또는 소듐 아스코르베이트가 또한, 옵션으로서 조성물중에 포함될 수 있다. 미생물 또는 포자 배양물은 신선하거나 동결되거나 건조 분말 형태로 미리 건조될 수 있다.
조성물 혼합물이 농축된 프로바이오틱 배양 배지에 첨가되어 용액 혼합물의 고체 함량을 40-60% (w/w)로 만들고 pH를 포스페이트 또는 시트레이트 이온으로 6.5-7.5로 조정한다. 모든 성분들이 완전히 용해될 때까지 용액을 실온보다 약간 높은 온도에서 (전형적으로 25℃-37℃) 혼합시킨다. 점성 슬러리를 액체 질소에 적하시켜 소 점적 또는 비드를 형성시키고, 그 후 액체 질소로부터 제거하고, 백에 패킹시켜 건조시까지 -80℃의 초저온 냉동고에 저장한다.
살아 있는 프로바이오틱 박테리아의 전형적인 건조 방법은 트레이 상에 동결된 고체 비드를 균일한 층으로 100-1500 g/sq ft의 로딩 용량으로 스프레딩한 즉시 트레이를 동결 건조기에 넣는 것을 포함한다. 그 후 진공을 약 1000 mTORR 또는 그 미만으로 가하고, 동결 건조기 크기 및 열원의 유형에 따라, 입자가 약 -20 내지 약 -30℃에서 유지되도록 선반 온도를 조정한다. 동결된 고체 비드는 약 1 내지 약 60분간 퍼징될 수 있고 진공은 2000 내지 10,000 mTORR로 조정되며 열 전달은 포뮬레이션 온도가 -20℃ 내지 0℃ 또는 -10℃ 내지 0℃, 전형적으로 약 -10℃로 상승하도록 증가된다. 이러한 온도 및 진공압 조건은 트레이 로딩에 따라 수 시간에서 24시간 이하로 지속될 수 있는 일차 수분 제거 단계 동안 유지된다. 일차 건조 공정 동안의 일부 시점에, 용매의 증발 속도가 느려지고 포뮬레이션 온도가 건조 챔버에서의 열의 과잉 공급으로 인해 증가하기 시작한다. 이러한 시점이 본 발명의 일차 건조 단계의 끝을 나타내는 것이다. 용매가 포뮬레이션으로부터 제거됨에 따라, 용액 중의 유리 형성 화합물이 액체로서의 흐름을 멈출 때까지 농축되고 진해져서 무정형 및/또는 안정한 유리질 구조를 형성한다.
그 후 최대 진공 및 30℃ 내지 50℃의 포뮬레이션 온도에서 이차 건조 단계가 이어진다. 이차 건조 단계의 목적은 남아 있는 갇혔거나 결합된 수분을 제거하고 연장된 기간 동안 주위 온도에서 저장시 안정한 조성물을 제공하는 것이다. 이차 건조 단계는 수 시간 동안 지속될 수 있고 그 종말점은 포뮬레이션이 완전히 건조되어 그 수분 활성도가 0.3 Aw 보다 낮게 될 때이다.
본 발명의 건조 방법은 무정형 유리질 구조내에 감싸인 생물학적으로 활성인 물질을 생성함으로써 무정형 유리질 조성물 내에서 화합물 및 그 밖의 분자의 이동성을 크게 감소시킴으로 인해 단백질의 언폴딩 또는 변성을 예방하고 분자의 상호작용 또는 가교-반응성을 현저하게 늦춘다. 무정형 고체 구조가 그 유리 전이 온도 미만의 온도에서 유지되고 나머지 수분이 비교적 낮게 유지되는 한, 프로바이오틱 박테리아는 비교적 안정하게 유지될 수 있다. 도 15 참조. 일부 생물학적 물질이 더욱 결정질 상태로 보다 잘 유지될 수 있으므로 장기간 안정성을 위해 유리질 구조를 달성하는 것이 필수적인 것은 아님을 주목하여야 한다.
건조된 유리질 구조를 총괄하여 이용하거나, 요망되는 형상 및 크기로 절단하거나, 습윤 또는 건조 응집화, 과립화, 정제화, 치밀화, 펠렛화 또는 어떠한 그 밖의 종류의 전달 공정과 같은 용이한 다운스트림 가공을 제공하는 자유 흐름 분말로 분쇄하고 제분할 수 있다. 분쇄, 제분, 연삭 또는 미분을 위한 공정은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 해머 밀, 에어 밀, 임팩트 밀, 제트 밀, 핀 밀, 윌리 밀, 또는 유사한 제분 장치를 이용할 수 있다. 적합한 예시적인 입자 크기는 약 1000 ㎛ 미만이고, 일부 구체예에서, 500 ㎛ 미만이다.
본 발명의 또 다른 예에서, 생활성 물질을 함유하는 안정한 건조 분말이 용융된 지방과 응집된다. 건조 분말을 40℃의 자전공전식 믹서에 넣고, 코코아 버터, 천연 왁스 또는 경화유 (hydrogenated oil) 또는 이들의 혼합물과 같은 용융된 지방을 혼합하에 가온 분말에 서서히 첨가하고, 육안으로 관찰시 균일한 크기의 응집된 분말이 달성될 때까지 계속해서 혼합하면서 지방의 용융 온도 미만으로 혼합물을 냉각시킨다. 조성물중의 용융된 지방 혼합물의 무게 질량은 약 20% 내지 약 70%이며, 일부 구체예에서, 약 30-50%이다. 최종 생성물은 응집된 형태로 소모될 수 있거나 타정기 (tablet press machine)에서 압축될 수 있으며, 정제 형태로 소비될 수 있다.
특정 일례에서, 건조 분말은 타정기에서 압축되어 바람직한 형상 및 크기의 정제를 형성한다. 안정한 건조 생물학적 조성물은 선택적으로 충전제와 혼합되어 정제의 효능을 바람직한 투여량으로 조절한다. 충전제는 비제한적으로, 말토덱스트린, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 칼슘 카르복시-메틸셀룰로스, 콜로이드 실리카 디옥사이드, 및 이들의 조합물을 포함할 수 있다. 선택적으로, 붕해-촉진제가 또한 정제화 혼합물에 포함된다. 붕해-촉진제의 예는 비제한적으로, 소듐 크로스카르멜로스, 크로스포비돈 (불용성 폴리비닐피롤리돈), 소듐 스타치 글리콜레이트, 소듐 스타치 글리코네이트, 전호화분 스타치 등을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 정제화 혼합물은 선택적으로, 유동제 (flow agent)를 포함할 수 있다. 유동제는 비제한적으로, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 징크 스테아레이트, 스테아르산 및 흄드 실리카 예컨대, 친수성 또는 소수성 흄드 실리카를 포함할 수 있다.
안정한 생물학적 조성물 및 그 밖의 정제 성분으로부터 정제를 생성하는데 적합한 방법은 다층 정제를 생성하는데 통상적으로 사용되는 방법들을 포함하는 표준 가압 정제화 방법을 포함한다. 100N (Erweka 장비) 미만의 인장 강도에 상응하는 50 kN/cm2 이하의 정제화 압축압이 바람직하며, 그러나, 생물학적 물질이 살아있는 미생물인 그러한 경우에 온도 노출은 60℃ 미만으로 제한되어야 한다.
정제는 전체가 삼켜지거나, 씹히거나 발포 드링크 정제로서 소비되도록 설계될 수 있다. 정제를 소비시 입에서, 드링크에서 또는 위에서 든지 붕해되는 경우, 생물학적 물질은 정제 구조에 의해 서로 분리된 채 유지되었던 다른 활성 물질에 노출된다. 이는 손상 물질의 국소 농도가 매우 높은 경우 생물학적 물질에 잠재적으로 해로울 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 생물학적 활성 물질의 붕해는, 정제내의 다른 활성 성분의 내용물들이 희석되고 분산되는 것이 가능하도록 지연되는 것이 바람직하다. 이러한 문제는 본원에 기술된 바와 같이 경화되거나 가교되어 구조화된 조성물을 형성함으로써 본 발명에서 해결되었다. 일부 구체예에서, 생물학적 물질은 물에서 혼합시 조성물 매트릭스내에 온전하게 유지된다. 일부 구체예에서, 생물학적 물질은 동물의 소화관을 따라 요망되는 작용 부위에서 조성물 매트릭스로부터 손상되지 않고 방출된다.
본 발명에 따른 정제는 허용가능한 한도내에서 이들의 초기 건조 상태를 보존하는 방식으로 패키징될 수 있다. 이는 컨테이너내의 수분 활성도를 감소시키기 위해 물을 흡수하기 위한 실리카 겔과 같은 건조제를 함유하는 컨테이너 또는 블리스터 팩 (blister pack) 또는 튜브와 같은 수분 불투과성 컴파트먼트 내에 정제를 패키징하는 것을 포함할 수 있다. 산소에 대해 보호하기 위해, 이러한 팩은 또한, 탈산소제 물질 예컨대, FreshPax®, AgelessTM, 아스코르빌 팔미테이트 또는 그 밖의 아스코르베이트, 프로필 갈레이트 또는 그 밖의 갈레이트, 알파-토코페롤, 마그네슘 또는 소듐 설파이트, 부틸화된 하이드록시아니솔 또는 부틸화된 하이드록시톨루엔 등을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 생물학적 물질을 안정화시키고 그 활성을 연장된 저장 기간 동안 주위 온도 및 상대 습도 이상에서 보존시킨다. 예를 들어, 조성물을 상승된 온도 (예컨대, 40℃) 및 높은 습도 (예컨대, 33%RH 또는 43%RH)에서 처리하고 포뮬레이션의 생물학적 활성을 측정함으로써 조성물의 안정성에 대해 평가한다. 살아 있는 프로바이오틱 박테리아의 예로서, 이러한 연구 결과는 이러한 조성물로 포뮬레이션화된 박테리아가 적어도 60일간 안정함을 입증한다. 안정성은 1 로그 CFU/g 효능 손실에 대한 시간으로서 정의된다. 이러한 포뮬레이션은 고농도의 생물학적으로 활성인 물질을 사용할 때에도 안정하다. 따라서, 이러한 포뮬레이션은 이들이 실온 또는 실온 이상의 온도에서 장기간 운송되고 저장될 수 있다는 점에서 유리하다.
실시예
실시예 1
안정한 건조 조성물의 제조
기본 탄수화물 혼합물
약 70 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 5 g의 인스탄트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN) 및 약 3 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다.
기본 유리 강화제 혼합물
약 17 g의 카세인 가수분해물 또는 완두 가수분해물 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ) 및 5 g의 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다.
프로바이오틱 박테리아의 안정화
락토바실러스 람노수스의 신선한 농축물 (발효 수확물로부터 직접 입수, 10% 고형물을 갖는 100 ml)을 블렌더에 첨가하고 35℃에서 유지하였다. 약 78 g의 기본 탄수화물 혼합물 및 약 22 g의 기본 유리 강화제 혼합물을 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가하고 35℃에서 10분간 혼합하였다. 그 후 점성 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거한 즉시 건조를 위해 이동시켰다.
프로바이오틱 박테리아를 함유하는 동결된 비드의 건조
동결된 비드를 트레이 상에 200 g/sq ft의 로딩 용량으로 스프레딩한 직후 동결 건조기의 선반에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 그 후 진공을 2000-2700 mTORR로 조정하였고 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압 설정을 5시간 동안 유지하였다. 선택적으로, 동결된 비드의 온도를 약 -20℃로 순응시킨 후에 약 1000 mTORR의 진공압을 가함으로써 일차 액체 건조를 개시하고 동결된 고체 비드가 약 10분간 퍼징되게 하였다. 이어서 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함으로써 일차 건조 단계가 이어지게 하고, 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압 설정을 5시간 동안 유지시켰다. 그 후 완전한 진공 (150-200 mTORR)에서 이차 건조 단계가 이어지게 하고, 30℃ 내지 50℃의 선반 온도를 추가 3시간 동안 유지하였다. 포뮬레이션을 완전히 건조시켰으며, 그 수분 활성도는 Hygropalm Awl 기계 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.)에 의해 Aw = 0.23으로 측정되었다.
실시예 2
건조 프로바이오틱 박테리아의 저장 안정성
도 1은 40℃ 및 33%RH 그리고 30℃ 및 43%RH의 두 상이한 가속화 저장 조건하에 실시예 1로부터의 안정한 건조 프로바이오틱 박테리아 및 시판되는 건조 프로바이오틱 박테리아 (Culturelle, Amerifit, Inc., Cromwell, CT)의 저장 안정성을 도시한다. 시판되는 프로바이오틱 박테리아는 가속화 저장 조건하에 처음 수 주 내에 그 생존력을 완전히 상실한 반면, 본 발명의 프로바이오틱 박테리아의 건조 조성물은 30℃ 및 43%RH에서는 60일 후에 1.18 로그만을 손실하였으며 40℃ 및 33%RH에서는 1.09 로그만을 손실하였다.
실시예 3
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스를 함유하는 안정한 건조 조성물의 대규모 생산
락토바실러스 람노수스 (시판원으로부터 400 g의 동결된 농축물)를 피복된 이중 자전공전식 믹서 (DPM, lqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 37℃로 해동하고 고체 함량을 증류수를 이용하여 10 중량%의 고체로 조정하였다. 약 212 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 20 g의 인스탄트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN), 약 12 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ), 약 136 g의 카세인 가수분해물 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ) 및 약 20 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가하고 혼합을 40 RPM 및 37℃에서 10분간 수행하였다. 그 후 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수 주 동안 -80℃에서 초저온 냉동고에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 500 내지 1500 g/sq ft 이하의 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함으로써 일차 액체 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 온도에서 최대 진공 (150-200 mTORR)으로 이차 건조 단계를 개시하고 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지하였다. 포뮬레이션을 완전히 건조시켰으며, 그 수분 활성도는 0.23 Aw으로 측정되었다.
실시예 4
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스를 함유하는 안정한 건조 조성물의 대규모 생산
비피도박테리움 락티스 (시판원으로부터 400 g의 동결된 농축물)를 피복된 이중 자전공전식 믹서 (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 37℃로 해동하였다. 약 212 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 20 g의 인스탄트 이눌린 (Cargill Minneapolis, MN), 약 12 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ) 및 약 20 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma, St. Louis, MO)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가하였다. 약 136 g의 완두 가수분해물 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 80 g의 증류수에 용해시키고 완전히 용해될 때까지 혼합물에 잠시 마이크로파를 가하거나 수조에서 60℃로 가온시킨 다음 약 35℃로 냉각시켰다. 건조 믹스 분말 및 완두 단백질 가수분해물을 함유하는 용액을 프로바이오틱 농축물에 첨가하고 혼합을 40 RPM 및 37℃에서 20분간 수행하였다. 그 후 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수 주 동안 -80℃의 초저온 냉동고에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 800 g/sq ft의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함으로써 일차 액체 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 온도에서 최대 진공 (150-200 mTORR)으로 이차 건조 단계를 개시하고 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지하였다. 포뮬레이션을 완전히 건조시켰으며, 그 수분 활성도는 0.23 Aw로 측정되었다.
실시예 5
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스를 함유하는 하이드로겔 포뮬레이션의 제조
비피도박테리움 락티스의 농축된 프로바이오틱 슬러리를 실시예 1에 따라 제조하였다. 기본 포뮬레이션에 0.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 다음 2시간에 걸쳐 실온에서 경화시켜 고체 하이드로겔이 형성되게 하였다. 시판되는 슬라이서/슈레더 (shredder)를 사용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 쓰레드 (thread)로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 500g/sq ft의 로딩 용량으로 습윤 형태로 트레이 상에 직접 로딩하거나 액체 질소에서 급속-동결시키고 트레이 상에 로딩하고, 건조를 위해 실시예 3에 기술된 바와 같이 동결 건조기에 넣었다. 포뮬레이션의 수분 활성도 (Aw)는 0.05이었다 (HygroPalm Awl에 의해 측정됨, Rotonic Huntington, NY). 건조 포뮬레이션을 표준 해머 밀 장비를 사용하여 미세 분말로 추가로 분쇄하고 50-250 마이크론 스크린을 통해 체질하였다.
실시예 6
유리 강화제 및 탄수화물 혼합물 간의 몰 비의 최적화
유리 강화제 및 탄수화물 혼합물을 다양한 몰 비로 함유하는 여러 조성물을 실시예 1에 따라 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 파라카세이의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하고, 슬러리를 급속-동결 및 퍼징 단계 없이 습윤 형태로 트레이 상에 바로 로딩하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 건조 조성물로 제조하였다. 슬러리를, 선반 온도를 일차 및 이차 건조 단계 동안 40℃로 상승시킨 것을 제외하고, 실시예 1 및 3에 기술된 바와 같이 일차 및 이차 단계로 건조시켰다. 안정한 분말을 37℃ 및 33%RH에서 84일간의 가속화 저장 조건하에 두었다. 도 2는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 다양한 몰 비의 효과를 도시한다. 이러한 결과는 유리 강화제 및 탄수화물 혼합물 간의 최적 몰 비가 약 0.12-0.15임을 제시하였다.
실시예 7
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스의 저장 안정성에 대한 본 발명의 조성물의 효과
실시예 1에 기술된 바와 같이 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제 혼합물을 함유하는 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기술된 바와 같이 건조 조성물로 제조하고 안정한 분말을 24℃ 및 33%RH에서 537일간의 가속화 저장 조건으로 처리하였다. 도 3은 본 발명의 조성물로 포뮬레이션화된 프로바이오틱의 탁월한 안정성을 입증한다. 이러한 결과는, 프로바이오틱 생존력이 상세된 조건하에 537일의 선반 저장 동안 0.18 로그만이 감소하였음을 나타낸다.
실시예 8
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스의 저장 안정성에 대한 다양한 유리 강화제 화합물의 효과
실시예 1에 기재된 탄수화물 혼합물 및 카세인 가수분해물과 소듐 시트레이트 또는 소듐 아스코르베이트 또는 둘 모두의 조합물을 함유하는 유리 강화제 혼합물을 함유하는 여러 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하고, 슬러리를 급속-동결 및 퍼징 단계 없이 습윤 형태로 트레이 상에 바로 로딩시키는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 같이 건조 조성물로 제조하였다. 슬러리를 실시예 1 및 3에 기술된 바와 같이 일차 및 이차 단계로 건조시키고 안정한 분말을 24℃ 및 43%RH에서 180일간의 가속화 저장 조건으로 처리하였다. 도 4는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 다양한 유리 강화 화합물의 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 단백질 가수분해물의 상부에 추가의 유리 강화제를 포함시킴으로써 현저히 양호한 안정성이 달성되었음을 제시하였다. 특히, 동량의 소듐 아세테이트 및 소듐 아스코르베이트를 포함시키는 것이 가장 안정한 조성물을 제공하였다. 실시예 5 및 6 둘 모두로부터의 결과는 또한 다양한 유리 강화제가 박테리아 균주에 따라 더욱 효과적이거나 심지어 탈안정화제로서 작용할 수 있음을 제시하였다.
실시예 9
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스의 저장 안정성에 대한 다양한 단백질 가수분해물/당 비의 효과
실시예 1에 기술된 바와 같이 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 함유하는 여러 조성물 및 동량이지만 다양한 비의 완두 가수분해물/트레할로스를 소듐 아스코르베이트와 함께 또는 소듐 아스코르베이트 없이 함유하는 조성물을 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 락티스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기술된 바와 같이 건조 조성물로 제조하였고 안정한 분말을 35℃ 및 43%RH에서 7주간의 가속화 저장 조건으로 처리하였다. 도 5는 건조된 박테리아의 안정성에 대한 소듐 아스코르베이트의 존재 또는 부재하의 1:4, 1:2.5 및 1:1.5 비의 완두 가수분해물/트레할로스의 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 현저히 양호한 안정성이 증가된 비의 완두 가수분해물/트레할로스에서 달성되었음을 제시하였다. 특히, 1:1.5 비의 완두 가수분해물/트레할로스가 더욱 안정한 조성물을 제공하였다. 보다 높은 완두 가수분해물/트레할로스 비에서 소듐 아스코르베이트를 포함시키는 것이 소듐 아스코르베이트를 배제시킨 포뮬레이션에 비해 탁월한 안정성을 유도하였다.
실시예 10
프로바이오틱 L. 람노수스의 최대 안정성에 대한 pH 최적화
실시예 1에 기술된 바와 같이 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 함유하는 여러 조성물을 다양한 pH로 제조하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 람노수스의 농축된 배양물을 시판원으로부터 수득하여 실시예 1 및 3에 기술된 바와 같이 건조 조성물로 제조하였다. 안정한 분말을 40℃ 및 33%RH에서 8주간의 가속화 저장 조건으로 처리하였다. 도 6은 건조된 박테리아의 안정성에 대한 슬러리의 pH 효과를 도시한다. 이러한 결과는, 최적 안정성이 중성 pH (~7)에서 달성되었음을 제시하였다.
실시예 11
효소를 함유하는 안정한 건조 분말
실시예 1 및 4에 기술된 바와 같은 400 g의 탄수화물 혼합물 및 200 g의 유리 강화제 혼합물, 및 400 g의 피타제 (BASF, GmBH)를 1000 ml의 물에서 혼합하여 40 중량%의 피타제를 함유하는 하이드로겔 포뮬레이션을 제조하였다. 슈레딩된 하이드로겔 포뮬레이션을 액체 질소에서 급속-동결시키고 50℃의 일차 및 이차 건조 온도에서 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조된 포뮬레이션의 로딩 및 저장 안정성의 측정을 위해, 건조 샘플을 미세원심분리 튜브에서 정확하게 칭량하였다 (<100 mg). 200 ㎕ 부분의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)을 첨가하였다. 포뮬레이션을 볼텍싱에 의해 DMSO 완충제에 용해시켰다. 이러한 샘플에 0.05 N NaOH, 0.5% SDS 및 0.075 M 시트르산 (트리소듐 염)을 함유하는 0.8 ml의 용액을 첨가하였다. 튜브를 10분간 45℃에서 초음파처리한 후에, 5,000 rpm에서 10분간 짧게 원심분리하였다. 투명한 DMSO/NaOH/SDS/시트레이트 용액의 분취량을 마이크로플레이트의 웰로 취하고 Bradford 검정 방법을 이용하여 단백질 함량에 대해 분석하였다. 95℃에 20분간 노출시킨 후에 안정한 효소 건조 조성물의 안정성은 본 발명의 조성물이 없는 건조 효소보다 월등히 더 높았다.
실시예 12
전염성 연어 빈혈 바이러스 (ISAV) 백신을 함유하는 안정한 건조 분말
0.5% 아세트산 중의 4% 키토산 용액 20 ml를 ISAV 백신 농축물, 탄수화물 혼합물 및 유리 강화제를 함유하는 슬러리에 첨가하는 것을 제외하고는, ISAV 백신 (Novozyme, Denmark)의 농축된 슬러리를 실시예 4에 따라 제조하였다. 0.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 다음 2시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 하여 고체 하이드로겔을 형성시켰다. 시판되는 슬라이서/슈레더를 사용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 쓰레드로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 1500g/sq ft의 로딩 용량으로 습윤 형태로 트레이 상에 직접 로딩시키거나 액체 질소에서 급속-동결시킨 후 트레이 상에 로딩시키고 건조를 위해 실시예 3에 기술된 바와 같이 동결 건조기에 넣었다. 포뮬레이션의 수분 활성도 (Aw)는 0.25이었다. 건조 포뮬레이션을 표준 해머 밀 장비를 사용하여 미세 분말로 추가로 분쇄하고 50-150 마이크론 스크린을 통해 체질하였다. 통상의 사료를 건조 조성물로 탑 코팅시키고 대서양 연어에게 공급함에 의해 안정한 건조 ISAV 조성물을 경구 백신용으로 이용하였다.
실시예 13
침습성 종 미끼의 제조
살충제를 함유하는 본 발명에 따른 특정하게 표적화된 침습성 종을 위한 펠렛화 미끼를 제조하였다. 실시예 9에 기술된 바와 같은 200 g의 포뮬레이션을 제조하고 200 gm의 물에 첨가하였다. 이러한 용액에 90 gm의 로테논 및 0.5 gm 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 gm의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 즉시 표준 산업적 분무 건조기에서 분무 건조시키고, 건조 포뮬레이션을 환경에 유해한 독소 효과 없이 또는 생태계에 근접하게 특정한 침습성 종을 표적화하는데 이용하였다.
실시예 14
보호된 식물 프로바이오틱 포뮬레이션의 제조
리조박테리아와 같은 생물학적 조절제를 실시예 4에 따라 건조 조성물로 제조하였다. 건조 리조박테리아 조성물의 유효성을 무균 조건하에 상추 성장에 대해 평가하였다. 식물 당 100 mg의 리조박테리아 건조 조성물의 용량을 모래가 있는 항아리에 접종시키고 미리 발아된 (24 h) 상추 모종을 심었다. 5 ml의 살균된 Hoagland 용액의 영양 용량을 항아리의 식물에 적용시켰다. 항아리를 28℃에서 12 h 광주기를 이용하여 유지된 성장 챔버에 무작위로 정렬시켰다. 접종 후 매 7일 간격으로 식물과 붙어 있는 모래를 항아리에서 조심스럽게 분리시켰다. 살균 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로 뿌리를 세척하고, 뿌리 길이의 측정치를 기록하였다.
실시예 15
안정한 건조 프로바이오틱 물질의 제조
기본 포뮬레이션
75 g 부분의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN) 및 22 g의 광범위하게 가수분해된 카세인 (Marcor, Carlstadt, NJ)을 3 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)와 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 락토바실러스 아시도필러스의 신선한 농축물 (발효 수확물로부터 직접 입수, 적어도 10% 고형물을 함유하는 100 ml)을 블렌더에 첨가하고 35℃에서 유지시켰다. 검, 당 및 가수분해된 단백질의 건조 믹스를 프로바이오틱 배양물에 서서히 첨가하고 35℃에서 10분간 혼합하였다. 그 후 점성 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거한 즉시 건조를 위해 이동시켰다.
기본 포뮬레이션의 동결된 비드의 건조
동결된 비드를 트레이 상에 100 g/sq ft의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩한 직후 동결 건조기의 선반에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 그 후 1000 mTORR의 진공압을 가하고, 동결된 고체 비드를 10분간 퍼징되게 하였다. 그 후, 진공을 2700 mTORR로 조정하고 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압을 3시간 동안 유지하였다. 그 후 완전한 진공 (150-200 mTORR)에서 이차 건조 단계가 이어지게 하고, 선반 온도를 추가로 2시간 동안 30℃로 상승시켰다. 포뮬레이션을 완전히 건조시키고, 그 수분 활성도는 Hygropalm Aw1 기계 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.)에 의해 Aw = 0.23로 측정되었다.
실시예 16
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스 LGG를 함유하는 안정한 건조 조성물
락토바실러스 람노수스 LGG (시판원으로부터 500 g의 동결된 농축물)를 피복된 이중 자전공전식 믹서 (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 37℃로 해동시켰다. 2가지의 유리 형성제; 트레할로스 (387 g, Cargill Minneapolis, MN) 및 광범위하게 가수분해된 카세인 (83 g, Marcor, Carlstadt, NJ)을 2가지의 매트릭스 형성제; 소듐 알기네이트 (15 g, ISP Corp., Wayne, NJ) 및 인스탄트 이눌린 (25 g, Cargill Minneapolis, MN)과 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 건조 혼합물을 해동된 프로바이오틱 박테리아에 서서히 첨가하고, 혼합을 40 RPM 및 37℃에서 10분간 수행하였다. 50-200 ml의 물을 첨가하여 슬러리의 점도를 12,000 Cp로 조정하였다. 그 후 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 용기로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수 주 동안 -80℃에서 초저온 냉동고에 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 100 내지 500 g/sq ft 이하의 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 1000 mTORR의 진공압을 가하고, 선반 온도를 +20℃로 조정하였다. 동결된 고체 비드를 1 내지 30분 범위의 기간 동안 퍼징되게 하였다. 퍼징 단계 후, 진공압을 2700 mTORR로 조정한 후 일차 건조 단계가 이어지게 한 후, 선반 온도를 +30℃로 상승시켰다. 이러한 온도 및 진공압을 12시간 동안 유지하였다. 그 후 완전한 진공 (150-200 mTORR)에서 이차 건조 단계가 이어지게 하고, 선반 온도를 추가로 4시간 동안 30℃로 유지하였다. 포뮬레이션을 완전히 건조시키고, 그 수분 활성도는 Aw = 0.23으로 측정되었다. 도 13은 프로바이오틱 포뮬레이션의 건조 프로파일을 나타낸다.
다양한 온도 (+4℃, -80℃ 및 -180℃)에서의 슬러리 동결 후 및 동결된 비드의 제조 및 동결-건조기에서의 건조를 포함하는 건조 공정 후의 생존력 손실이 도 10, 11 및 14에 제시된다. 전체 공정에 대한 생존력 손실은 일반적으로, 박테리아 배양 유형 (동결 또는 건조 배양) 및 점성 슬러리의 동결 온도에 따라 1 로그 미만 (<1 log)이었다. 결과는 액체 질소 (-180℃)에서 프로바이오틱 박테리아의 급속-동결이 -80℃에서의 동결보다 덜 손상되는 공정이었음을 보여준다.
도 12 및 15는 건조 조성물중의 프로바이오틱 박테리아의 초기 계수 및 40℃ 및 33%RH의 가속화 저장 조건하에서 저장 안정성에 대한 0분 (퍼징 비처리) 내지 30분 범위의 다양한 퍼징 기간의 효과를 보여준다. 결과는 더 긴 퍼징 시간이 건조 포뮬레이션중의 박테리아 초기 계수를 일반적으로 증가시키나, 프로바이오틱 포뮬레이션의 저장 안정성에는 영향을 끼치지 않았음을 시사한다.
실시예 17
트레할로스 (752 g, Cargill Minneapolis, MN), 광범위하게 가수분해된 완두 단백질 (167g, Marcor, Carlstadt, NJ), 소듐 알기네이트 (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) 및 인스탄트 이눌린 (50 g, Cargill Minneapolis, MN)을 건조 형태로 균일하게 블렌딩하였다. 건조 믹스를 피복된 이중 자전공전식 믹서 (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 80℃에서 1000 ml의 고온의 탈이온수에 서서히 첨가하고, 혼합을 40 RPM에서 10분간 수행하였다. 혼합물 온도를 37℃로 저하시키고, 시판원으로부터 수득한 100 g의 락토바실러스 람노수스 LGG의 건조 분말을 서서히 첨가하고 20분 동안 혼합을 계속하였다. 그 후, 슬러리를 액체 질소를 함유하는 배쓰로 2 mm 오리피스 니들을 통해 압출시켰다. 그 후, 스트링/비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수 주 동안 -80℃에서 초저온 냉동고에 저장하였다. 건조를 위해, 동결된 스트링/비드를 트레이 상에 100 내지 500 g/sq ft 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두고, 실시예 16에 기술된 바와 같이 건조하였다. 모든 포뮬레이션은 트레이 내에 충분히 보유되었으며, 모든 로딩 수준에서 어떠한 튀임 (splattering) 또는 발포도 관찰되지 않았다. 포뮬레이션은 심지어 더 많은 로딩 용량에서도 완전하게 건조되었으며, 수분 활성도는 모든 샘플에 있어서 0.26 Aw 및 그 미만으로 측정되었다.
실시예 18
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 sp.를 함유하는 하이드로겔 포뮬레이션의 제조
피비도박테리움 sp.의 농축된 프로바이오틱 슬러리를 실시예 15에 따라 제조하였다. 기본 포뮬레이션에 0.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후, 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 다음 2시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 하여 고체 하이드로겔을 형성시켰다. 시판되는 슬라이서/슈레더를 사용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 쓰레드로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 액체 질소에서 급속-동결시키고, 700g/sq ft의 로딩 용량으로 트레이 상에 로딩시키고, 실시예 16에 기술된 바와 같이 건조를 위해 동결 건조기에 넣었다. 포뮬레이션의 수분 활성도 (Aw)는 0.05이었다 (HygroPalm Aw1 (Rotonic Huntington, NY)에 의해 측정됨). 건조 포뮬레이션을 표준 해머 밀 장비를 사용하여 미세한 분말로 추가로 분쇄하고, 50-250 마이크론 스크린을 통해 체질하였다.
실시예 19
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 아시도필러스를 함유하는 알레르겐 비함유 조성물
트레할로스 (752 g, Cargill Minneapolis, MN), 광범위하게 가수분해된 완두 단백질 (167g, Marcor, Carlstadt, NJ), 소듐 알기네이트 (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) 및 인스탄트 이눌린 (50 g, Cargill Minneapolis, MN)을 건조 형태로 균일하게 블렌딩하였다. 건조 믹스를 피복된 이중 자전공전식 믹서 (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,)에서 80℃에서 1000 ml의 고온의 탈이온수에 서서히 첨가하여 살균시키고, 부드럽고 투명한 슬러리가 형성될 때까지 혼합을 40 RPM에서 10분간 수행하였다. 혼합물 온도를 37℃로 저하시키고, 시판원으로부터 수득한 락토바실러스 아시도필러스를 함유하는 1000 g의 동결된 비드를 서서히 첨가하고 10분 동안 혼합을 계속하였다. 그 후, 슬러리를 액체 질소를 함유하는 배쓰로 2 mm 오리피스 니들을 통해 압출시켰다. 그 후, 스트링/비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수 주 동안 -80℃에서 초저온 냉동고에 저장하였다. 건조를 위해, 동결된 스트링/비드를 트레이 상에 1000 g/sq ft의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두고, 실시예 16에 기술된 바와 같이 건조하였다. 건조 조성물중의 프로바이오틱 박테리아의 초기 CFU 계수는 10.53 로그/g이며, 40℃ 및 33%RH의 가속화 저장 조건하에서 42일 저장 후 생존력 손실은 0.69 로그 CFU/g이었다.
실시예 20
본 발명의 건조 포뮬레이션을 함유하는 영유아 유동식
락토바실러스 람노수스를 함유하는 안정한 건조 포뮬레이션을 실시예 16에 따라 제조한 후, 2개의 입자 크기 그룹으로 체질하였다 (50㎛ 초과 내지 150㎛ 미만). 영아용 유동식을, 99.9 g의 누트라미겐 (Nutramigen) (Mead Johnson; Evansville, IL)과 50㎛ 내지 150㎛ 범위의 크기의 0.1g의 건조 포뮬레이션 입자를 혼합함으로써 제조하였다. 최종 생성물은 100 g의 영유아 유동식 당 약 108 cfu의 락토바실러스 람노수스를 함유하였다.
실시예 21
본 발명의 안정한 건조 포뮬레이션을 함유하는 프로바이오틱 보충제
락토바실러스 아시도필러스를 함유하는 안정한 건조 조성물을 경구 투여 형태 예컨대, 정제, 캅셀 또는 캡슐로 포뮬레이션하였다. 99.9 g의 압축제 (덱스트로스) 및 50㎛ 내지 150㎛ 크기 범위의 0.1 g의 건조 포뮬레이션 입자를 함유하는 오렌지향 정제를 1/2" 둥글고 오목한 표준 툴링을 사용한 회전 기기상에서의 직접 압축에 의해 제조하였다. 최종 생성물은 약 108 cfu/단위 용량을 함유하였다. 정제의 경도는 8-10 kp 범위이며, 붕해 시간은 약 20초이다. 압축된 정제를 180 cc HDPE 버틀에 각 100개 정제로 패키징시키고, 40℃/33%RH의 제어된 온도/습도에 노출시켰다. 12 개월의 기간에 걸쳐 또는 1 x 106/ 단위 용량 미만의 검정 계수에서의 감소가 관찰될 때까지 생성물에 대한 미생물 안정성 평가를 매달 수행하였다.
실시예 22
본 발명의 안정한 건조 포뮬레이션을 함유하는 기능성 음료 드링크
71% 수크로스, 14% 말토덱스트린, 10% 이눌린, 2% 덱스트로스, 1% 시트르산 무수물, 0.3% 아카시아검, 0.3% 향미제, 0.3% 트리칼슘 포스페이트 및 50㎛ 내지 250㎛ 크기 범위의 0.1% 건조 프로바이오틱 포뮬레이션 입자 (L. 아시도필러스)를 함유하는 건조 믹스를 제조하였다 (중량%). 최종 생성물은 약 109 cfu/단위 용량 (30g 건조 믹스)을 함유하였다. 생성물을 340 mil 물중에 교반함으로써 음용을 위한 작은 알루미늄 호일 백 (30g 단위 용량/백)에 패키징하였다. 12개월의 기간에 걸쳐 또는 1 x 107/ 단위 용량 미만의 검정 계수에서의 감소가 관찰될 때까지 음료용 건조 믹스중의 프로바이오틱 박테리아의 안정성을 미생물 안정성 평가로 매달 수행하였다.
실시예 23
프로바이오틱 애완용 먹이 제조
시판되는 개를 위한 펠렛화된 애완용 먹이를 대류식 오븐에서 0.1의 수분 활성도로 건조시킨 후, 실시예 17에 기술된 바와 같이 제조된 안정한 프로바이오틱 건조 포뮬레이션으로 코팅하였다. 건조 펠렛에 약 5%의 지방-기반 수분 배리어 (40% 닭 지방, 40% 코코아 버터 및 20% 밀랍의 혼합물)를 분무하고, 건조 분말 포뮬레이션 (10.sup.8 CFU/g의 용량을 제공하는, 일반적으로 총 애완용 먹이의 0.1-0.5%)과 드럼 텀블러에서 혼합하고, 최종적으로 지방-기반 수분 배리어의 추가적 코트로 분무하였다. 코팅의 총량은 (애완용 먹이의) 약 15%이었다. 코팅 시간은 약 30분이었다.
실시예 24
여러 프로바이오틱 미생물을 갖는 양어 사료의 제조
여러 프로바이오틱의 혼합물을 갖는 본 발명에 따른 어류용의 펠렛화된 사료를 제조하였다. L. 람노수스, L. 아시도필러스 및 비피도박테리움 락티스의 혼합물을 함유하는 안정한 건조 프로바이오틱 포뮬레이션을 실시예 15에 기술된 바와 같이 제조하였다. 연어를 위한 시판되는 출발 사료 (Zeigler Bros., Gardners, PA)를 대류 오븐에서 0.1의 수분 활성도로 먼저 건조시킨 후, 드럼 텀블러에서 프로바이오틱 포뮬레이션으로 코팅시켰다. 펠렛 (1000 g)에 약 5 중량%의 지방-기반 수분 배리어 (40% 어유, 40% 코코아 버터 및 20% 밀랍의 혼합물)를 먼저 분무한 후, 1 g의 안정한 건조 프로바이오틱 포뮬레이션과 혼합하고 (107 cfu/g 사료의 용량을 수득하도록), 최종적으로 지방-기반 수분 배리어의 추가적 코트로 분무하였다. 코팅의 총량은 (양어 사료의) 약 10%이다.
실시예 25
효소를 함유하는 안정한 건조 분말
실시예 18에 기재된 600 g의 포뮬레이션과 400 g의 사비나제 (Savinase) (Novozymes, Denmark)를 1000 g의 수용액에서 혼합시켜 40 중량%의 사비나제를 함유하는 하이드로겔 포뮬레이션을 제조하였다. 슈레딩된 하이드로겔 포뮬레이션을 액체 질소에서 급속-동결시키고, 50℃의 포뮬레이션 건조 온도로 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조된 포뮬레이션의 로딩 및 저장 안정성의 측정을 위해; 건조 샘플을 미세원심분리 튜브에서 정확하게 칭량하였다 (<100 mg). 200 ㎕의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 첨가하였다. 포뮬레이션을 볼텍싱에 의해 DMSO 완충제에 용해시켰다. 이러한 샘플에 0.05 N NaOH, 0.5% SDS 및 0.075 M 시트르산 (트리소듐 염)을 함유하는 0.8 ml의 용액을 첨가하였다. 튜브를 10분간 45℃에서 초음파처리한 후에, 5,000 rpm에서 10분간 짧게 원심분리하였다. 투명한 DMSO/NaOH/SDS/시트레이트 용액의 분취량을 마이크로플레이트의 웰로 취하고 Bradford 검정 방법을 이용하여 단백질 함량에 대해 분석하였다. 안정한 효소 포뮬레이션의 저장 안정성은 본 발명의 포뮬레이션이 없는 건조 효소보다 월등히 더 높았다.
실시예 26
비타민 A를 함유하는 안정한 건조 분말
30 중량%의 비타민 A를 함유하는 포뮬레이션을 1000 g의 물중에 320 g 인스탄트 이눌린, 320 g 말토덱스트린 DE-1 (Tate&Lyle, London, UK), 50 g 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (Ashland Aqualon Functional Ingredients, Wilmington, DE), 10 g 소듐 아스코르베이트 및 300 g의 비타민 A 결정체 (BASF Corp., Florham Park, NJ)을 혼합함으로써 제조하였다. 습식 포뮬레이션을 각각 180℃ 및 80℃의 입구 및 출구 온도의 Mobile-Minor 분무 건조기 (GEA Process Engineering Inc., Columbia MD)에서 분무-건조시키거나 액체 질소에서 급속-동결시키고, 이어서 1000g/sq ft의 로딩 용량으로 트레이상에 스프레딩시키고, 실시예 16에 기술된 바와 같이 건조하였다. 비타민-A 조성물은 3개월 동안 40℃ 및 75% RH에서 안정적이었다 (>80%).
실시예 27
향상된 생체이용율을 갖는 보호된 포뮬레이션중의 카로텐 제조
카로텐의 생체이용율을 보호하고 향상시키는 (그렇지 않으면, 카로텐은 저장 동안 또는 유기체에 먹인 후 사료중의 다른 성분들에 의해 산화 처리될 것임) 포뮬레이션을 본 발명의 포뮬레이션 및 방법에 따라 제조하였다. 6 g의 수용성 키토산 (LSK BioPartners, Inc. Salt Lake City, Utah)을 함유하는 포뮬레이션을 200 g의 물에 용해시켰다. 이러한 용액에 90 g의 천연 아스타잔틴 (NaturoseTM Cyanotech Corp., Kailua-Kona, HI)을 첨가하고, 슬러리를 5% 소듐 트리폴리포스페이트를 함유하는 배쓰내로 압출시키거나 아토마이징시켰다. 하이드로겔화된 미세입자 또는 스트링을 4시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 하였다. 입자를 가교 배쓰로부터 제거하고, 물로 세척하고, 90 g의 수크로스 및 10 g의 광범위하게 가수분해된 카세인의 건조 블렌드와 혼합하였다. 당/단백질 로딩된 입자를 급속-동결시킨 직후, 500 g/sq ft로 트레이 상에 두고, 수분 활성도가 0.3 미만으로 감소될 때까지 동결 건조기에서 동결건조시켰다. 건조 포뮬레이션을 요망되는 크기 분포로 추가로 제분하고 패키징하였다.
실시예 28
침습성 종 미끼의 제조
특정하게 표적화된 침습성 종을 위한 펠렛화된 미끼를 본 발명에 따라 제조하였다. 실시예 1에 기술된 바와 같이 살충제를 함유하는 200 g의 포뮬레이션을 제조하고 200 gm의 물에 첨가하였다. 이러한 용액에 90 gm의 로테논 및 0.5 gm의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가한 후에 0.5 gm의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리가 2시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 하였다. 슬라이서/슈레더를 통해 단단한 겔을 얇고 긴 쓰레드로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 트레이 상에 로딩시키고 동결 건조기에 넣었다. 선반 온도는 -30℃로 설정하고, 포뮬레이션이 동결되게 한 후 충분한 진공을 가하고, 선반 온도를 밤새 건조를 위해 +60℃로 상승시켰다. 건조 포뮬레이션을 표적이 되는 특정 종에 대한 미끼 크기 사양에 적합한 크기 분포로 분쇄하였다.
실시예 29
불수용성 포뮬레이션에서 보호된 살충제의 제조
살충제의 보호된 (그렇지 않으면 저장 동안 또는 환경에서의 적용 후 포뮬레이션중의 다른 성분들에 의해 분해될 것임) 과립 포뮬레이션을 본 발명의 방법 및 포뮬레이션으로 제조하였다. 6 g의 펙틴 및 102 g의 수크로스를 함유하는 포뮬레이션을 200 g 물에 첨가하였다. 이러한 용액에 민감한 살충제의 건조 포뮬레이션 90 g 및 1.5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트 및 0.5 g의 칼슘 클로라이드를 함유하는 혼합물을 첨가한 후, 0.85 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리가 4시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 한 후, 슬라이서/슈레더를 통해 얇고 긴 쓰레드로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 트레이 상에 로딩하고, 동결 건조기에서 건조시켜 수 활성도가 0.1에 도달하게 하였다. 건조 포뮬레이션을 요망되는 크기 분포로 추가로 제분하고 패키징하였다.
실시예 30
보호된 식물 프로바이오틱 포뮬레이션의 제조
리조박테리아와 같은 생물학적 조절제를 실시예 18에 따라 건조 조성물로 제조하였다. 건조 리조박테리아 조성물의 유효성을 무균 조건하에 상추 성장에 대해 평가하였다. 식물 당 100 mg의 리조박테리아 건조 조성물의 용량을 모래가 있는 항아리에 접종시키고 미리 발아된 (24 h) 상추 모종을 심었다. 5 ml의 살균된 Hoagland 용액의 영양 용량을 항아리의 식물에 적용시켰다. 항아리를 28℃에서 12 h 광주기를 이용하여 유지된 성장 챔버에 무작위로 정렬시켰다. 접종 후 매 7일 간격으로 식물과 붙어 있는 모래를 항아리에서 조심스럽게 분리시켰다. 살균 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로 뿌리를 세척하고, 뿌리 길이의 측정치를 기록하였다.
실시예 31
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 아시도필러스 (DSM-20356)를 함유하는 안정한 건조 조성물의 생성
동결된 박테리아 농축물 (현지 발효 공정으로부터 수득된 10g)을 37℃의 수조에서 해동시키고, 고체 함량을 증류수로 10 중량% 고체 습식물로 조절하였다. 약 5 g의 가수분해된 완두 단백질 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 50 g의 온수에 완전히 용해시키고, 해동된 박테리아 배양물에 첨가하였다. 약 2.5 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN), 약 5 g의 인스탄트 이눌린, 약 5 g의 말토덱스트린 DE-1 (Cargill Minneapolis, MN) 및 약 1.5 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 박테리아 배양물에 서서히 첨가하고, 37℃에서 20분간 작은 스패툴라를 사용하여 혼합을 수행하였다. 그 후, 슬러리를 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 그 후, 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 건조될 때까지 -80℃의 초저온 냉동고에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 500 내지 1500 g/sq ft 이하의 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함에 의해 일차 액체 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 지점에서 최대 진공 (150-200 mTORR)으로 이차 건조 단계를 개시하고, 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지시켰다. 포뮬레이션을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도는 0.3 Aw 미만으로 측정되었다. 포뮬레이션을 시중의 입수가능한 해머 밀을 사용하여 분쇄하고 입자를 100 마이크론 미만으로 체질하였다.
통상의 동결 건조된 박테리아 분말과 함께 안정한 프로바이오틱 박테리아의 생존력을, 희석 및 LMRS 아가 플레이트상으로의 플레이팅의 표준 공정 후에 주 단위로 모니터링하였다. 도 16은 40% RH에서 14일 후, 본 발명의 조성물중에 포뮬레이션화된 프로바이오틱 박테리아의 안정성이 통상의 동결 건조된 박테리아의 안정성보다 이 (2) 로그 더 높았음을 보여준다. 이러한 결과는 프로바이오틱 박테리아의 안정성이 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 경우 다습의 비-냉장 저장 조건에서 현격하게 향상됨을 입증한다.
실시예 32
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 아시도필러스 (DSM-20356)를 함유하는 용융 지방 응집된 안정한 건조 조성물의 생성
십 (10) g의 건조 분말 조성물을 실시예 31에 기술된 바와 같이 생성하였다. 건조 분말을 40℃ 수조내의 비이커중에 넣었다. 팔 (8) 부의 코코아 버터 및 이 (2) 부의 스테아레이트 (27-Stearine, Loders Croklaan, Channahon, IL)를 함유하는 10 g의 용융된 지방 혼합물을 혼합하에 가온 분말에 서서히 첨가하였다. 육안으로 관찰시 균일한 크기의 응집된 분말이 달성될 때까지 혼합을 계속하면서 혼합물을 10℃로 냉각시켰다.
실시예 33
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스 sp.를 함유하는 건조 조성물의 40℃ 및 43%RH 또는 30℃ 및 60%RH에서의 저장 안정성
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스 sp. (현지 발효원으로부터 수득함)를 함유하는 십 (10) g의 건조 분말 조성물을 실시예 31에 기술된 바와 같이 생성하였다. 안정한 건조 조성물을 데시케이터에 넣고 40℃ 및 43%RH 또는 30℃ 및 60%RH에 노출시켰다. 통상의 동결 건조된 박테리아 분말과 함께 안정한 프로바이오틱의 생존력을, 희석 및 LMRS 아가 플레이트상으로의 플레이팅의 표준 공정 후에 주 단위로 모니터링하였다. 도 17은 40℃ 및 43% RH에서 14일 후, 본 발명의 조성물중에 포뮬레이션화된 프로바이오틱 박테리아의 안정성이 통상의 동결 건조된 박테리아의 안정성보다 삼 (3) 로그 더 높았음을 보여준다. 또한, 30℃ 및 60% RH에서 7일 후, 본 발명의 조성물중에 포뮬레이션화된 프로바이오틱 박테리아의 안정성이 통상의 동결 건조된 박테리아의 안정성보다 삼 (3) 로그 더 높았다. 이러한 결과는 프로바이오틱 박테리아의 안정성이 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하는 경우 다습의 비-냉장 저장 조건에서 현격하게 향상됨을 입증한다.
실시예 34
병원성 미생물에 반하는 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 안정한 건조 조성물을 함유하는 동물 사료의 생성
시판되는 닭 또는 수소용 동물 사료 약 10 kg을, 실시예 31 또는 32에 기술된 바와 같은 분쇄된 생물학적 물질 1부 및 옥수수유와 같은 식물성 오일 이 (2)부를 함유하는 3% 오일 혼합물로 드럼 텀블러에서 탑 코팅하였다. 프로바이오틱 박테리아의 CFU 계수는 1E9/g 사료이었다. 코팅된 사료를 40℃의 43% 상대 습도 챔버에 넣고, 이러한 극한의 조건하에서의 14일 저장 후; 프로바이오틱 박테리아의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 또 다른 코팅된 사료를 30℃의 33% 상대 습도 챔버에 넣고, 이러한 조건하에서 육 (6)개월 저장 후; 프로바이오틱 박테리아의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 이러한 예는 반려 동물을 포함하는 다양한 동물을 치료하는데 사용되는 락토바실러스 sp.와 같은 미생물이 본 발명의 조성물 내에 및 건조 방법으로 보존될 수 있고, 이어서 선반에서의 장기간 저장을 위해 또는 비코팅된 사료가 저장되는 전형적인 습도와 온도 조건하에 공급 호퍼 내에서 적어도 이 (2)주 동안을 위해 사료 상으로 코팅될 수 있음을 입증한다.
실시예 35
단세포 진균류 S. 세레비시아에를 함유하는 안정한 건조 조성물의 생성
신선한 베이커리 효모 페이스트 (현지 배급업체로부터 수득된 100 g)를 10℃의 수조에 넣었다. 약 50 g의 가수분해된 완두 단백질 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 500 g 온수에 완전히 용해시켰다. 이러한 용액을 10℃로 냉각시키고, 혼합하면서 효모 페이스트에 첨가하였다. 약 25 g의 수크로스 (현지 식료품점으로부터 수득함), 약 50 g의 인스탄트 이눌린, 약 50 g의 말토덱스트린 DE-1 (Cargill Minneapolis, MN), 약 12 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma) 및 약 15 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 효모 배양물에 서서히 첨가하고, 혼합을 40 RPM 및 10℃에서 20분 동안 수행하였다. 그 후, 슬러리를 천공된 바닥을 갖는 용기로 옮겨 액체 질소를 함유하는 배쓰로 적하되게 하였다. 이어서 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 수주 동안 -80℃의 초저온 냉동고에서 저장하였다. 건조 및 제분을 실시예 31에 기술된 바와 같이 수행하였다.
실시예 36
단세포 진균류 S. 세레비시아에를 함유하는 안정한 건조 조성물의 분무 건조
효모 슬러리를 실시예 34에 기술된 바와 같이 제조하였다. 슬러리를 차가운 (10℃) 증류수로 추가로 희석하여 약 1000-2000 cP의 점도를 수득하였다. 희석된 슬러리를 180℃/60℃의 입구/출구 온도 설정을 이용하여 분무 건조하였다 (Mobile Minor spary drier, GEA Niro Inc., Columbia, MD).
실시예 37
단세포 진균류를 함유하는 안정한 건조 조성물로의 옥수수 씨앗 코팅
약 10 kg의 시판되는 옥수수 씨앗을, 실시예 34 또는 실시예 35에 기술된 바와 같은 분쇄된 생물학적 물질 1부 및 팜 또는 코코넛 오일과 같은 식물성 오일 이 (2)부를 함유하는 3% 용융 오일 혼합물로 40℃의 드럼 텀플러에서 탑코팅하였다. 효모 CFU 계수는 1E8/g 씨앗이었다. 코팅된 씨앗을 30℃의 60% 상대 습도 챔버에 넣고, 이러한 극한 조건하에서 삼 (3)개월 저장 후, 효모의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 이러한 예는 다양한 계통의 페니실리움 sp.와 같은 농업용 접종원으로서 사용되는 미생물이 본 발명의 조성물 및 건조 방법으로 보존되고, 그 후, 비코팅된 씨앗이 저장되는 전형적인 습도와 온도하에서의 장기간 저장을 위해 곡물상으로 코팅될 수 있음을 입증한다.
실시예 38
프로바이오틱 박테리아 비피도박테리움 sp.를 함유하는 하이드로겔 조성물의 제조
비피도박테리움 sp.의 농축된 프로바이오틱 슬러리를 실시예 31에 따라 제조하였다. 분말 혼합물에, 5 g의 이염기성 칼슘 포스페이트를 첨가하였다. 분말 혼합물을 혼합하에 프로바이오틱 배양물에 첨가한 후 5 g의 글루코노락톤을 첨가하였다. 슬러리를 다음 두 (2)시간에 걸쳐 실온에서 경화되게 하여 고체 하이드로겔을 형성시켰다. 시판되는 슬라이서/슈레더를 사용하여, 단단한 겔을 얇고 긴 쓰레드로 슬라이싱하였다. 얇은 쓰레드를 500g/sq ft의 로딩 용량으로 습윤 형태로 트레이상에 직접 로딩하거나 액체 질소에서 급속-동결시킨 후 트레이상에 로딩하고, 실시예 31에 기술된 바와 같이 건조를 위한 동결 건조기에 넣었다. 건조된 포뮬레이션을 표준 해머 밀 장비를 사용하여 미세한 분말로 분쇄하고, 50-마이크론 스크린을 통해 체질하였다.
실시예 39
프로바이오틱 박테리아를 함유하는 안정한 배양된 우유의 생성
백 (100) 그램의 저온살균된 플레인 배양 우유 (Dannon, 현지 식료품점에서 수득함)에 실시예 37에 기술된 바와 같은 안정한 프로바이오틱을 함유하는 가교된 분말 반 (0.5) 그램을 첨가하였다. 배양 우유의 초기 CFU 계수는 1E9/g 배양 우유이었다. 배양된 우유를 육 (6)주 동안 4℃의 냉장고에서 보관하였다. 냉각된 배양 우유 중의 프로바이오틱 박테리아의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 이러한 예는, 다양한 계통의 락토바실러스 및 비피도박테리움과 같은 프로바이오틱 박테리아가 본 발명의 조성물 및 건조 방법으로 보존될 수 있음을 입증한다. 그 후, 조성물 중의 프로바이오틱 박테리아는 비보존된 프로바이오틱 박테리아는 생존하지 못할 전형적인 조건하에서 연장된 기간 동안 유제품 중에 충분히 수화되고 활성인 채 유지될 수 있다.
실시예 40
효소를 함유하는 안정한 건조 조성물
40중량%의 피타아제 (Marcor, Carlstadt, NJ)를 함유하는 하이드로겔 포뮬레이션을 약 50 g의 가수분해된 완두 단백질을 함유하는 500ml의 수용액중에서 200g의 피타아제와 실시예 34에 기술된 바와 같은 250 g의 분말 혼합물을 혼합함으로써 제조하였다. 슈레딩된 하이드로겔 포뮬레이션을 액체 질소에서 급속-동결시키고 진공 오븐에서 50℃의 일차 및 이차 건조 온도로 건조시켰다. 건조된 조성물의 로딩 및 저장 안정성의 측정을 위해: 건조 샘플을 미세원심분리 튜브에서 정확하게 칭량하였다 (<100 mg). 200 ㎕의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)을 첨가하였다. 포뮬레이션을 볼텍싱에 의해 DMSO 완충제에 용해시켰다. 이러한 샘플에 0.05 N NaOH, 0.5% SDS 및 0.075 M 시트르산 (트리소듐 염)을 함유하는 0.8 ml의 용액을 첨가하였다. 튜브를 10분간 45℃에서 초음파처리한 후에, 5,000 rpm에서 10분간 짧게 원심분리하였다. 투명한 DMSO/NaOH/SDS/시트레이트 용액의 분취물을 마이크로플레이트의 웰로 취하고 Bradford 검정 방법을 이용하여 단백질 함량에 대해 분석하였다. 95℃에 20분간 노출시킨 후에 안정한 효소 건조 조성물의 안정성은 본 발명의 조성물이 없는 건조 효소보다 월등히 더 높았다.
실시예 41
식물 생물학적 조절제를 함유하는 안정한 건조 조성물
리조박테리아와 같은 생물학적 조절제를 실시예 34에 따라 건조 조성물로 제조하였다. 무균 조건하에 상추 성장에 대한 건조 리조박테리아 조성물의 유효성을 평가하였다. 식물 당 100 mg의 리조박테리아 건조 조성물의 용량을 모래가 있는 항아리에 접종시키고 미리 발아된 (24 h) 상추 모종을 심었다. 5 ml의 살균된 Hoagland 용액의 영양 용량을 항아리의 식물에 적용시켰다. 항아리를 28℃에서 12 h 광주기를 이용하여 유지된 성장 챔버에 무작위로 정렬시켰다. 접종 후 매 7일 간격으로 식물과 붙어 있는 모래를 항아리에서 조심스럽게 분리시켰다. 살균 포스페이트 완충제 (pH 7.0)로 뿌리를 세척하고, 뿌리 길이의 측정치를 기록하였다. 리조박테리아 조성물로 처리된 상추 모종이 비처리된 모종보다 향상된 성장을 나타내었다.
실시예 42
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스 sp.의 안정한 건조 조성물을 함유하는 정제의 생성
동결된 박테리아 농축물 (현지 발효 공정으로부터 수득된 10g)을 37℃의 수조에서 해동시키고, 고체 함량을 증류수로 10 중량% 고체 습식물로 조절하였다. 약 5 g의 가수분해된 완두 단백질 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 50 g의 온수에 완전히 용해시키고, 해동된 박테리아 배양물에 첨가하였다. 약 5 g의 트레할로스 (Cargill Minneapolis, MN) 및 약 2.5 g의 소듐 아스코르베이트를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 선택적으로, 약 5 g의 인스탄트 이눌린, 약 5 g의 말토덱스트린 DE-1 (Cargill Minneapolis, MN) 및 약 1.5g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 또한 첨가하여 약 50,000 cP의 바람직한 점도의 점성 슬러리를 형성시키고, 건조 물질의 유리질 구조로 추가로 강화시켰다. 분말 혼합물을 서서히 박테리아 배양물에 첨가하고, 혼합을 37℃에서 20분간 수행하였다. 그 후, 점성의 박테리아 현탁액을 액체 질소 배쓰 내로 서서히 적하시켰다. 그 후, 동결된 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 건조될 때까지 -80℃의 초저온 냉동고에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 500 내지 1500 g/sq ft 이하의 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고, 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함으로써 일차 수분 제거 단계를 시작하였고, 생성물 온도가 증가 되게 하고 -10 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 지점에서 최대 진공 (50-200 mTORR)으로 이차 건조 단계를 개시하고 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 45℃에서 유지시켰다. 포뮬레이션을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도는 0.3 Aw 미만으로 측정되었다. 포뮬레이션을 커피 그라인더를 사용하여 제분하고 입자를 250 마이크론 미만으로 체질하였다.
정제화를 위해, 안정한 건조 프로바이오틱 조성물 (100 mg)을, 2% w/w 마그네슘 스테아레이트 및 2% w/w 친수성 흄드 실리카 (AEROSIL®200, Evonik Industries)을 함유하는 400 mg의 말토덱스트린 DE-1과 혼합하고, 수동 타정기 (1/2" 정제 직경 하우징 이용)로 압축하였다. 또한, 통상의 동결 건조된 프로바이오틱 박테리아 분말 (자유 프로바이오틱)을 함유하는 유사한 정제를 제조하고, 보호된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 정제와의 비교에 사용하였다.
자유 프로바이오틱과 안정한 프로바이오틱 박테리아의 정제화 전 및 후 및 40℃ 및 43% RH에서의 저장 동안의 생존력을 희석 및 LMRS 아가 플레이트상으로의 플레이팅의 표준 공정 후에 주 단위로 모니터링하였다. 도 18은 자유 프로바이오틱 박테리아의 생존력이 정제화 공정에서 1 로그 넘게 손실된 반면, 보호된 박테리아의 생존력은 정제화 공정 후에도 실질적으로 동일하게 유지되었음을 보여준다. 40℃ 및 43% RH에서 14일 저장 후, 본 발명의 조성물중에 포뮬레이션화되는 프로바이오틱 박테리아의 생존력은 약 0.3 로그 만큼 약간 감소된 반면, 통상의 동결 건조된 박테리아의 생존력은 약 0.6 로그 만큼 추가로 감소되었다. 이러한 결과는, 본 발명의 조성물 및 방법이 프로바이오틱 박테리아의 정제화 동안 그리고, 다습의 비-냉장 저장 조건하에서의 저장 동안 압축압 및 관련 열에 대한 상당한 보호를 제공함을 입증한다.
실시예 43
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 람노수스 sp.의 안정한 건조 조성물을 함유하는 멀티비타민/프로바이오틱 정제의 제조
이어서, 본원에 기술된 바와 같은 방법 및 조성물의 보호를 멀티비타민 성분을 함유하는 정제에서 추가로 연구하였다. 십 (10) g의 건조 분말 조성물을 실시예 42에 기술된 바와 같이 생성하였다. 정제화를 위해, 안정한 건조 프로바이오틱 조성물 (100 mg)을, 2% w/w 마그네슘 스테아레이트 및 2% w/w 친수성 흄드 실리카 (AEROSIL®200, Evonik Industries)을 함유하는 400 mg의 시판되는 멀티비타민 분말 (Centrum® Pfizer)과 혼합하고, 수동 타정기 (1/2" 정제 직경 하우징 이용)로 압축하였다. 또한, 통상의 동결 건조된 프로바이오틱 박테리아 분말 (자유 프로바이오틱)을 함유하는 유사한 정제를 제조하고, 보호된 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 정제와의 비교에 사용하였다. 그 후, 생성된 정제를 총 프로바이오틱 계수에 대해 평가하였다. 결과는 도 19에 도시되어 있다.
도 19에 도시된 바와 같이, 멀티비타민 성분과의 정제화 공정에서 자유 프로바이오틱 박테리아의 생존력은 이 (2) 로그 초과로 손실된 반면, 보호된 박테리아의 생존력은 1 로그 미만으로 감소되었다. 40℃ 및 43% RH에서 14일 저장 후, 본 발명의 조성물중에 포뮬레이션화된 프로바이오틱 박테리아의 생존력은 실질적으로 동일하게 유지된 반면, 통상의 동결 건조된 박테리아의 생존력은 추가로 삼 (3) 로그만큼 급감하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 조성물 및 방법이 또한, 정제 믹스중의 다른 손상 화합물로부터 민감한 생물학적 물질에 대한 상당한 보호를 제공하며, 따라서 다양한 생물학적 물질이 이들의 전반적인 효능에 영향을 끼치지 않으면서 하나의 정제에서 혼합가능하게 됨을 입증한다.
실시예 44
보호된 효소를 함유하는 안정한 건조 조성물의 정제화
프로테아제 또는 리파제 (둘 모두 Sigma로부터 입수)를 함유하는 안정한 건조 조성물을 실시예 42에 기술된 바와 같이 제조하였다. 최종 건조 조성물은 10% 프로테아제 또는 리파제, 40% 트레할로스, 20% 광범위하게 가수분해된 완두 단백질, 10% 소듐 아스코르베이트를 함유하였다. 또한, 6% 소듐 알기네이트 및 14% 이눌린을 조성물중에 포함시켰다.
정제화를 위해, 건조 효소 조성물 (각 50 mg)을, 2% w/w 마그네슘 스테아레이트 및 2% w/w 친수성 흄드 실리카를 함유하는 450 mg의 말토덱스트린 DE-1과 혼합하고, 수동 타정기 (1/2" 정제 직경 하우징 이용)로 압축하였다. 또한, 25 mg 프로테아제 및 25 mg 리파제를 450 mg 말토덱스트린 DE1 믹스와 혼합시킴으로써 동량의 두 보호된 효소를 함유하는 정제를 제조하였다. 또한, 자유 형태의 효소 (자유 효소 또는 이 둘의 혼합물)의 건조 분말을 함유하는 유사한 정제를 제조하고, 보호된 효소를 함유하는 정제와의 비교에 사용하였다.
정제화 전의 분말 믹스중의 프로테아제 및 리파제의 활성 대비 정제화 후 이들의 잔존 활성을 기질로서 각각 Azocasein 및 pNP-팔미테이트를 사용하여 본 기술분야에 공지된 방법에 따라 측정하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, 자유 프로테아제 단독의 또는 자유 리파제와 조합된 정제화는 약 40%의 활성 손실을 초래한 반면, 보호된 프로테아제는 단독으로 정제화되는 경우에 어떠한 활성 손실도 없었으며, 보호된 리파제와 혼합되어 정제화되는 경우에는 약 17% 손실만 초래되었다. 자유 또는 보호된 리파제 정제화는 활성에 있어서 어떠한 상당한 손실도 초래하지 않았으나, 자유 프로테아제의 존재하에 자유 리파제의 정제화는 64%의 활성 손실을 초래한 반면, 보호된 프로테아제의 존재하의 보호된 리파제의 정제화는 33%의 활성 손실만을 초래하였다. 이러한 결과는, 본 발명의 조성물 및 방법이 효소 정제화 동안 압축압 및 관련 열에 대한 상당한 보호를 제공함을 입증한다. 또한, 결과는 본 발명의 조성물 및 방법이 정제 믹스중의 다른 분해 효소로부터의 보호를 제공하며, 따라서, 다양한 요망되는 효소를 이들의 전반적인 활성에 영향을 끼치지 않으면서 하나의 정제에서 혼합가능하다는 것을 보여준다.
실시예 45
병원성 미생물에 대한 프로바이오틱 박테리아를 함유하는 안정한 건조 조성물을 함유하는 동물 사료의 정제화
본원에 기술된 조성물 및 방법의 보호를 동물 사료 성분을 함유하는 정제에서 추가로 연구하였다. 프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스 sp.를 함유하는 약 100 g의 안정한 건조 조성물을 실시예 42에 기술된 바와 같이 제조하고 건조하였다. 최종 건조 조성물은 10% 건조 박테리아 세포 바이오매스, 54% 트레할로스, 20% 광범위하게 가수분해된 완두 단백질, 10% 소듐 아스코르베이트를 함유하였다. 추가로, 6% 소듐 알기네이트를 또한 조성물에 포함시켰다.
약 10 kg의 시판되는 개 먹이 또는 닭 비육용 사료 펠렛을 40℃에서 밤새 공기 건조시킨 후, 자유 유동 분말로 미세하게 분쇄하였다. 안정한 건조 프로바이오틱 조성물을 사료 분말과 혼합하고 수동 타정기 (1/8-7/8" 필 직경 하우징 이용)로 압축하여 사료 1 그램당 약 백 (100)억 개의 살아있는 세포를 함유하는 약 200-2000 mg 크기 필을 형성시켰다. 닭 처리에 있어서, 프로바이오틱 사료 필을 100 kg의 시중의 표준 사료에 혼합하면서 서서히 부었다. 처리되어 마무리된 사료는 조류에 공급되어 살모넬라와 같은 병원균에 대한 내성을 증폭시킬 준비가 되었다. 안정성 평가를 위해, 프로바이오틱 필을 40℃의 43% 상대 습도 챔버에 넣고, 이러한 극한의 조건하에 14일 저장 후, 프로바이오틱 박테리아의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 이러한 예는 반려 동물을 포함하는 다양한 동물을 치료하는데 사용되는 미생물 예컨대, 다양한 락토바실러스 sp.가 본 발명의 조성물 및 건조 방법으로 보호될 수 있으며, 그 후 타정기에서 압축되어 전형적인 습도와 온도 조건하에 통상적인 공급 호퍼에서 기본 사료와 함께 공급될 수 있음을 입증한다.
실시예 46
프로바이오틱 박테리아의 안정한 건조 조성물을 함유하는 거품이 이는 발포형 음료 정제의 제조
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스 sp. 또는 비피도박테리움 sp.를 함유하는 약 10 g의 안정한 건조 분말 조성물을 실시예 42 및 45에 기술된 바와 같이 제조하고 건조시켰다.
Alka Seltzer®, Fizzies® 또는 스포츠 드링크와 같은 발포형 정제를 자유 유동 분말로 미세하게 분쇄하였다. 안정한 건조 프로바이오틱 조성물을 발포형 분말과 혼합하고 수동 타정기 (7/8" 정제 직경 하우징 이용)로 압축하여 정제당 약 백 (100)억 개의 살아있는 세포를 함유하는 약 2000mg 크기의 정제를 형성시켰다. 안정성 평가를 위해, 프로바이오틱 발포형 정제를 33℃의 43% 상대 습도 챔버에 넣고, 이러한 극한의 조건하에 90일 저장 후, 프로바이오틱 박테리아의 생존력 손실은 초기 CFU의 일 (1) 로그보다 적었다. 이러한 예는 민감한 생물학적 물질 예컨대, 살아있는 프로바이오틱 박테리아가 본 발명의 조성물 및 건조 방법으로 보호되고 안정화되고, 그 후, 타정기로 압축되고 가혹한 습도 및 온도 소비 조건하에 저장될 수 있음을 입증한다.
실시예 47
효모 또는 세균 질증과 같은 질 감염을 치료하기 위한 프로바이오틱 박테리아의 안정한 건조 조성물을 함유하는 정제의 제조
프로바이오틱 박테리아 L. 아시도필러스 sp.를 함유하는 약 15 g의 안정한 건조 분말 조성물을 실시예 1 및 4에 기술된 바와 같이 제조하였다.
프로바이오틱 건조 조성물을 74 g 락토스, 10 g 옥수수 전분, 0.5 g 마그네슘 스테아레이트, 0.01 g 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 0.01 g 폴리비닐피롤리딘 및 0.01 g 소수성 흄드 실리카와 블렌딩하고, 15 분 동안 혼합하였다. 분말 혼합물을 수동 타정기로 압축하였다. 생성된 정제의 중량은 약 1.5 g이었다. 최대 정제 경도는 6 내지 8 kg이었다. 정제는 물중에서 약 30초 후에 붕해되었다.
실시예 48
프로바이오틱 박테리아 락토바실러스 아시도필러스 (DSM-20356)의 안정한 건조 조성물을 함유하는 오일 현탁액의 생성
동결된 L. 아시도필러스 농축물 (현지의 발효 공정으로부터 수득된 200 g)을 수조에서 37℃에서 해동시키고, 200 g의 3% 가수분해된 완두 단백질 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ) 용액을 첨가하였다. 박테리아 현탁액을 15분 간 4000g로 원심분리하고 (Sorvall RC-5B, Du-Pont Company, Wilmington, DE), 상청액을 따라 내었다. 박테리아 침전물을 3% 가수분해된 완두 단백질 용액을 지닌 원래 중량 (200g)으로 되돌렸다. 추가의 50 g의 가수분해된 완두 단백질을 80 g의 온수에 완전히 용해시키고, pH를 20% NaOH 용액으로 9로 조정하고, 박테리아 배양물에 첨가하였다. 팔십오점육 (85.6) g의 수크로스 (현지 마켓으로부터 수득), 30 g의 시클로덱스트린-7 (Cargill Minneapolis, MN), 20 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma) 및 15 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 박테리아 배양물에 서서히 첨가하고, 혼합을 37℃의 1 qt 자전공전식 믹서 (Charles Ross & Son Company, Hauppauge, New York)에서 20분간 수행하였다. 그 후, 슬러리를 액체 질소를 함유하는 배쓰에 서서히 적하시켰다. 그 후, 동결된 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고, 건조까지 -80℃의 초저온 냉동고에서 저장하였다.
건조를 위해, 동결된 비드를 트레이 상에 500 내지 1500 g/sq ft 이하의 범위의 로딩 용량으로 평평하게 스프레딩하고 트레이를 동결 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 진공압을 2000-2700 mTORR로 조정함으로써 일차 건조 단계를 시작하였고, 생성물 온도를 상승시키고 -12℃ 내지 -5℃에서 안정화시켰다. 시간 경과에 따라 (약 10-16 h) 생성물 온도가 약 20 내지 25℃로 증가하였고, 이 지점에서 최대 진공 (100-150 mTORR)으로 이차 건조 단계를 개시하고, 추가로 14시간 동안 생성물 온도를 30 내지 40℃에서 유지하였다. 포뮬레이션을 완전히 건조시키고 그 수분 활성도는 0.3 Aw 미만으로 측정되었다. 포뮬레이션을 시판되는 해머 밀을 사용하여 제분하고 입자를 250 마이크론 미만으로 체질하였다.
프로바이오틱 박테리아의 안정한 조성물의 생존력을 건조 분말 형태로 또는 옥수수유 현탁액 (100 g 오일중에 혼합된 1g 건조 분말)으로 또는 45 g 닭 사료 펠렛을 10 g 오일 현탁액으로 코팅한 후 14일 동안 40℃ 및 43%RH에서 평가하였다 (사료 펠렛을 2주 동안 33%RH 습도 챔버에서 먼저 순응시켰다). 40℃ 및 43% RH에서 14일 인큐베이션 후, 프로바이오틱 박테리아는 건조 형태로 유지시 단지 0.5 로그의 CFU/g 손실만 있었으며, 오일 현탁액중에서 혼합되는 경우 0.34 로그 및 닭 사료 상으로 코팅되는 경우 0.65 로그의 손실이 있었다. 이러한 결과는, 다습의 비-냉장 저장 조건하에서 14일 노출된 후 다양한 사료 적용에서 프로바이오틱 박테리아의 생존력이 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하는 경우 보존됨을 입증한다.
실시예 49
비브리오 앵길라룸 (Vibrio anguillarum)에 대한 살아 있는 파지를 함유하는 안정한 건조 조성물의 생성
농축된 살아 있는 파지 배양물 (제조업자로부터 수득된 100 g)을 10℃의 피복된 자전공전식 믹서에 넣었다. 약 50 g의 가수분해된 완두 단백질 (한외 여과된 가수분해물, Marcor, Carlstadt, NJ)을 300 g 온수중에 완전히 용해시켰다. 용액을 10℃로 냉각시키고, 혼합하면서 파지 배양물에 첨가하였다. 백칠십사 (174) g의 수크로스 (현지 마켓에서 수득됨), 60 g의 시클로덱스트린-7 (Cargill Minneapolis, MN), 40 g의 소듐 아스코르베이트 (Sigma) 및 30 g의 소듐 알기네이트 (ISP Corp., Wayne, NJ)를 건조 형태로 균일하게 혼합하였다. 분말 혼합물을 파지 배양물에 서서히 첨가하고, 혼합을 20분 동안 10℃에서 1 qt 자전공전식 믹서에서 수행하였다. 그 후, 슬러리를 액체 질소를 함유하는 배쓰에 서서히 적하시켰다. 그 후, 동결된 비드를 액체 질소로부터 제거하고, 밀봉된 알루미늄 호일 백에 넣고 건조까지 -80℃의 초저온 냉동고에 저장하였다. 건조 및 제분을 실시예 48에 기술된 바와 같이 수행하였다. 십 (10) 그램의 건조 조성물 분말을 100 g의 어유와 혼합하고, 현탁액을 10 kg 대서양 연어 사료 펠렛 상으로 코팅시켰다. 그 후, 코팅된 사료를 전형적인 창고 저장 조건하에서 저장하였다. 양어 사료중 파지의 생존력은 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하는 경우 다습의 비-냉장 저장 조건에서 14일 노출 후에 보존되었다.
본 발명은 특정 구체예와 관련하여 본원에서 설명되고 기술되었지만, 본 발명을 기술된 상세 내용으로 제한하고자 하는 것은 아니다. 그보다는, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 청구범위의 등가의 범주 및 범위 내에서 다양한 변형이 자세히 이루어질 수 있다.

Claims (41)

  1. 조성물의 총 중량을 기준으로 하여, 약 10% 내지 80% 올리고사카라이드, 약 5% 내지 30% 디사카라이드 및 약 1% 내지 10% 폴리사카라이드를 포함하는 탄수화물 성분; 및 약 0.5% 내지 40% 가수분해된 동물성 또는 식물성 단백질을 포함하는 단백질 성분을 포함하는, 생활성 물질용 안정화 건조 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 가수분해된 단백질 성분이 가수분해된 카세인, 가수분해된 유장 단백질, 가수분해된 완두 단백질, 가수분해된 대두 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 가수분해된 카세인, 가수분해된 유장 단백질, 가수분해된 완두 단백질 및 가수분해된 대두 단백질이 광범위하게 가수분해된 단백질인, 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서, 폴리사카라이드가 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 펙틴, 소듐 알기네이트, 알긴산의 염, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 메틸 셀룰로스, 카라기난, 젤란검, 구아검, 아카시아검, 잔탄검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분, 개질된 전분 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 올리고사카라이드가 시클로덱스트린, 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프룩토-올리고사카라이드 (FOS), 갈락토-올리고사카라이드 (GOS), 만난-올리고사카라이드 (MOS) 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 디사카라이드가 트레할로스, 수크로스, 락토스 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.5% 내지 10%의 카르복실산을 포함하는 카르복실산 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 카르복실산 성분이 락트산, 아스코르브산, 말레산, 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 시트르산, 글루콘산, 글루탐산, 이들의 염 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 생활성 물질과 조합된 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 생활성 물질이 살아있거나 죽었거나 약화된 세포, 미생물, 바이러스, 박테리아, 프로바이오틱 박테리아, 식물성 박테리아, 토양 박테리아, 진균류, 효모, 세포 배양물, 단백질, 재조합 단백질, 효소, 펩티드, 호르몬, 백신, 항생제, 약물 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항에 있어서, 무정형 유리질 상태로 건조된 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 공기 건조, 진공-건조, 유동층 건조 및 분무-건조로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정에 의해 건조된, 조성물.
  13. 제 9항에 따른 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 생활성 물질을 수성 용매중에서 적어도 탄수화물 성분 및 단백질 성분과 조합하여 점성 슬러리를 형성시키는 단계;
    (b) 액체 질소에서 슬러리를 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적 또는 스트링을 형성시키는 단계;
    (c) 단계 (b)의 생성물을 이의 동결 온도보다 높은 온도에서 유지시키면서 진공하에서 수분 제거함으로써 일차 건조시키는 단계; 및
    (d) 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 감소시키기에 충분한 시간 동안 20℃ 또는 그 초과의 온도 및 최대 진공하에 단계 (c)의 생성물을 이차 건조시키는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13항에 있어서, 슬러리가 급속 동결 전에 폴리머 사슬과 금속 이온의 가교에 의해 또는 pH 또는 온도 변화에 의해 단단한 하이드로겔로 고형화되는, 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 슬러리가 요망되는 형상으로 몰딩되는, 방법.
  16. 제 13항에 있어서, 일차 수분 제거 단계가 2000 mTORR 보다 높은 진공압 (>2000 mTORR) 하에서 수행되는, 방법.
  17. 제 13항에 있어서, 건조된 물질이 자유 유동 분말로 절단되거나, 분쇄되거나, 제분되거나 각각 미분되는, 방법.
  18. 제 17항의 방법에 의해 제조된 조성물로서, 입자 크기가 약 1000 ㎛ 미만인 조성물.
  19. 제 9항의 조성물을 포함하는, 재구성된 액체, 분쇄 분말, 정제, 펠렛 (pellet), 캡슐 (capsule), 식품 또는 사료 또는 코팅된 씨앗 제품.
  20. 제 9항의 조성물을 포함하는 기능성, 약제학적, 농업 또는 백신 제품.
  21. 제 9항의 조성물을 포함하는, 바 (bar), 액체 포뮬라 (liquid formula), 콜로이드 현탁액, 분말, 정제, 캡슐 및 코팅된 씨앗 형태의 식품, 식품 첨가제, 동물 사료, 동물 사료 첨가제, 기능성, 약제학적, 농업 또는 백신 제품.
  22. 제 13항의 방법에 의해 제조된 조성물.
  23. 하나 이상의 당 및 하나 이상의 가수분해된 단백질을 포함하는 무정형 유리질 건조 조성물에 임베딩(embedding)된 민감한 생활성 물질을 압착시킴으로써 제조된 정제, 필 (pill) 또는 펠렛으로서, 조성물의 총 건조 중량을 기준으로 하여, 당이 약 10% 내지 60%를 차지하고, 가수분해된 단백질이 약 1% 내지 40%를 차지하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  24. 제 23항에 있어서, 생활성 물질이 살아있거나, 죽었거나 약화된 세포, 미생물, 바이러스, 박테리아, 프로바이오틱 박테리아, 식물성 및 토양 박테리아 진균류 또는 효모, 세포 배양물, 단백질, 재조합 단백질, 효소, 펩티드, 호르몬, 백신, 항생제, 약물 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 가수분해된 단백질이 광범위하게 가수분해된 카세인, 유장 단백질, 완두 단백질, 대두 단백질 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  26. 제 23항 내지 제 25항 중의 어느 한 항에 있어서, 당이 트레할로스, 수크로스, 락토스 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 디사카라이드인, 정제, 필 또는 펠렛.
  27. 제 23항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 있어서, 유리 강화 화합물이 조성물중에 포함되며, 유리 강화 화합물이 조성물의 전체 건조 중량을 기준으로 하여 약 1% 내지 20%를 차지하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  28. 제 27항에 있어서, 유리 강화 화합물이 포름산, 옥살산, 아스코르브산, 인산 또는 이들의 조합의 이온을 포함하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  29. 제 23항 내지 제 28항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  30. 제 29항에 있어서, 조성물이 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 카르복시-메틸-셀룰로스, 펙틴, 소듐 알기네이트, 일간산의 염, 히드록실 프로필 메틸 셀룰로스 (HPMC), 메틸 셀룰로스, 카라기난, 젤란검, 구아검, 아카시아검, 잔탄검, 로커스트빈검, 키토산 및 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 전분, 개질된 전분, 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 폴리사카라이드를 포함하며, 폴리사카라이드가 조성물의 총 건조 중량의 약 0.1 내지 10%를 차지하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 조성물이 시클로덱스트린, 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란, 프룩토-올리고사카라이드 (FOS), 갈락토-올리고사카라이드 (GOS), 만난-올리고사카라이드 (MOS) 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 올리고사카라이드를 포함하며, 올리고사카라이드가 조성물의 총 건조 중량의 약 0.5 내지 20%를 차지하는, 정제, 필 또는 펠렛.
  32. 제 23항 내지 제 31항 중의 어느 한 항에 있어서, 조성물이 무정형 유리질 상태로 건조된, 정제, 필 또는 펠렛.
  33. 제 32항에 있어서, 조성물이 공기 건조, 진공-건조, 유동층 건조 및 분무-건조로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 공정을 포함하는 방법에 의해 건조된, 정제, 필 또는 펠렛.
  34. 무정형 유리질 건조 조성물에 임베딩된 민감한 생활성 물질을 압착시키는 것을 포함하여 제 23항 내지 제 33항 중의 어느 한 항의 정제, 필 또는 펠렛을 제조하는 방법으로서, 무정형 유리질 건조 조성물이 (a) 생활성 물질을 수성 용매중에서 적어도 하나 이상의 당 및 하나 이상의 가수분해된 단백질과 조합하여 점성 슬러리를 형성시키는 단계;
    (b) 액체 질소에서 슬러리를 급속-동결시켜 동결된 고체 입자, 비드, 점적 또는 스트링을 형성시키는 단계;
    (c) 단계 (b)의 생성물을 이의 동결 온도보다 높은 온도에서 유지시키면서 진공하에서 수분 제거함으로써 일차 건조시키는 단계; 및
    (d) 수분 활성도를 0.3 Aw 미만으로 감소시키기에 충분한 시간 동안 20℃ 또는 그 초과의 온도 및 최대 진공하에 단계 (c)의 생성물을 이차 건조시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 슬러리가 급속 동결 전에 폴리머 사슬과 금속 이온의 가교에 의해 또는 pH 또는 온도 변화에 의해 단단한 하이드로겔로 고형화되는, 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 일차 수분 제거 단계가 2000 mTORR 또는 그 초과의 진공하에 수행되는, 방법.
  37. 제 34항에 있어서, 건조된 물질이 자유 유동 분말로 절단되거나, 분쇄되거나, 제분되거나 각각 미분되는, 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 분말의 입자 크기가 약 1000 ㎛ 미만인, 방법.
  39. 제 23항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 있어서, 생활성 물질이 타정기에서의 압착 또는 압축에 안정한, 정제, 필 또는 펠렛.
  40. 제 23항 내지 제 33항 중의 어느 한 항에 따른 정제, 필 또는 펠렛을 포함하는 음료, 식품, 동물 사료, 기능성, 약제학적, 농업 또는 백신 제품.
  41. 제 34항의 방법에 따라 제조된 정제, 필 또는 펠렛.
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