JP6948339B2 - 糖類を全くまたはほとんど含有しない安定した乾燥組成物 - Google Patents

Description

本出願は、２０１５年１２月４日に出願された、「ＳＴＡＢＬＥ ＤＲＹ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＨＡＶＩＮＧ ＮＯ ＯＲ ＬＩＴＴＬＥ ＳＵＧＡＲＳ」と題した米国仮出願第６２／２６３，０６１号に関連し、当該米国仮出願の利益を主張するものであり、その内容は、参照により本明細書に援用される。

本発明は、糖類（すなわち単糖類および／または二糖類）を全くまたはほとんど含有しない生存微生物の安定した乾燥組成物、およびその製造方法に関する。

現在、ヒトを含む動物の消化器官を補うための様々な微生物が存在する。これらの微生物は、望ましい生物学的効果のために、動物の腸の内部で天然微小菌叢を調節することができる。

宿主に有効量の生菌を提供するための課題の１つは、典型的な工業的製造工程の厳しい条件下において、その生存能を保持し、高温および高湿で長期間貯蔵することである。生物物質を動物の消化系に送るためのカプセル化および製剤化技術に関する開発が行われているが、製造工程、流通および貯蔵の間に生菌の生存能を保護するカプセル化または安定化技術の開発はほとんどなされていない。特に高温および高湿に関連する様々な厳しい環境に曝されたときに生菌の生存を可能にする組成物および安定化技術が必要である。

さらに、消耗品そのものに備わっている水分が、通常、生菌が特に高温と組み合わせたときに水分活性に敏感になるという別の課題を提起する。これまで、どの技術も技法も、流通および貯蔵の間、中間の水分条件（すなわち約０．２以上、または最大約０．４以上の水分活性）および高温（少なくとも約３０℃、または最大約４０℃以上）下において、栄養製品および動物用飼料等の製品に組み入れられた場合、生菌を十分に保護するものとして特定されていない。したがって、プロバイオティクスの生存能が損なわれる可能性のある熱帯気候を含む様々な地理的位置における流通に適した安定した生菌組成物が必要である。

追加の課題として、幼児、小児、高齢者、および無糖の食品を摂取するように制限されている糖尿病の人々のような特定のグループが消費するのに適した従来の食品成分の使用に対する栄養および規制上の制限がある。従来の合成カプセル化および安定化合物、さらに乳タンパク質等のいくつかの天然化合物、ならびにショ糖、果糖、トレハロースおよびラクトース等のある特定の糖類は、これらの特別な処方食に使用することが推奨されていない。特別な食事用途に使用可能な栄養化合物の推奨リストは、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会によって規制されている。

米国特許出願公開第２０１３／２９６１６５号明細書

したがって、プロバイオティクス細菌等の生菌およびその他の適切な成分を含む安定した乾燥組成物、ならびにこのような組成物を作製するための安定化技術が望まれる。

本発明は、糖類（すなわち単糖類および／または二糖類）を全くまたはほとんど含有しない安定した乾燥組成物およびその製造に関する。他に断りがない限り、組成物中の成分の重量百分率（重量％）はすべて、組成物の総重量を基準とする。

乾燥組成物を提供する。組成物は、１または複数の生存微生物、少なくとも５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、ならびに１０重量％未満の１または複数の糖類を含み、当該糖類は単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択されるものである。各百分率は、乾燥組成物の総重量を基準とする。組成物は、さらに、１もしくは複数のオリゴ糖、１もしくは複数の多糖類、１もしくは複数のカルボン酸塩、またはその組合せを含んでもよい。１または複数の生存微生物は、生きた細菌、真菌、酵母、単細胞藻類、ウイルスおよびファージからなる群から選択されてもよい。

１または複数の加水分解タンパク質は、乳タンパク質、植物タンパク質、またはその組合せであってもよい。１または複数の加水分解タンパク質は、加水分解カゼイン、加水分解乳清タンパク質、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質、およびその組合せからなる群から選択されてもよい。

組成物は、乾燥組成物の総重量を基準として５〜３０重量％の１または複数のオリゴ糖をさらに含んでもよい。１または複数のオリゴ糖は、イヌリン、短鎖オリゴ糖、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストラン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）およびその組合せからなる群から選択されてもよい。１または複数のオリゴ糖は、イヌリン、短鎖オリゴ糖、またはシクロデキストリンであってもよい。

組成物は、乾燥組成物の総重量を基準として１〜１０重量％の１または複数の多糖類をさらに含んでもよい。１または複数の多糖類は、アルギン酸、アラビアゴム、ローカストビーンガム、カラゲナン、デンプン、加工デンプン、およびその組合せからなる群から選択されてもよい。

組成物は、乾燥組成物の総重量を基準として１〜１０重量％の１または複数のカルボン酸塩をさらに含んでもよい。１または複数のカルボン酸塩は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸、およびその組合せからなる群から選択される１または複数のカルボン酸の塩であってもよい。１または複数のカルボン酸塩は、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、およびその組合せからなる群から選択されてもよい。

組成物は、乾燥組成物の総重量を基準として１〜５重量％のビタミンＥをさらに含んでもよい。組成物は、少なくとも１×１０^１０ＣＦＵ／ｇの生存能を有し、生存能の低下が、温度４０℃および相対湿度３３％で８４日後に、１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇ未満であってよい。１または複数の加水分解タンパク質は、加水分解エンドウタンパク質または加水分解カゼインであってもよい。

１または複数の生存微生物、乾燥組成物の総重量を基準として少なくとも５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のオリゴ糖、１または複数の多糖類、および１または複数のカルボン酸塩を含む乾燥組成物を製造する方法を提供する。方法は、（ａ）１または複数の生存微生物、１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のオリゴ糖、１または複数の多糖類、および１または複数のカルボン酸塩をアルカリ水性溶媒中で合わせてスラリーを形成し、（ｂ）スラリーを液体窒素中で急速凍結して、ビーズ、液滴または紐の形態の凍結固体粒子を形成し、（ｃ）粒子の温度をその凍結温度より高く維持しながら、真空下で蒸発によって凍結固体粒子を一次乾燥し、それにより一次乾燥物を形成し、（ｄ）一次乾燥物を、全強度の真空、熱源温度２０℃以上で、一次乾燥物の水分活性が０．３Ａｗ以下に低下するのに十分な時間二次乾燥し、それにより組成物を製造する工程を含む。好ましくは、単糖類または二糖類は製造方法に加えない。

方法は、工程（ａ）において、１または複数の糖類をアルカリ水性溶媒に加えて、スラリーを形成することをさらに含んでもよく、ここで１または複数の糖類は、単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択され、得られる乾燥組成物は、乾燥組成物の総重量を基準として１０重量％未満の１または複数の糖類を含む。方法は、１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のオリゴ糖、１または複数の多糖類、１または複数のカルボン酸塩、および１または複数の糖類を工程（ａ）の前に滅菌する工程をさらに含んでもよい。

方法は、組成物を用いて製品を作製する工程をさらに含んでもよく、製品は、医薬品、栄養補助食品、食品、飼料、および特別な食事製品からなる群から選択される。特別な食事製品は、調製粉乳、フォローオン調製乳（ｆｏｌｌｏｗ−ｏｎ ｆｏｒｍｕｌａ）、加工シリアル食品、缶詰のベビーフード、または医療目的の特殊食品であってもよい。

本発明は、糖類（すなわち単糖類および／または二糖類）を全くまたはほとんど含有しない新規の安定した乾燥組成物、ならびにこのような組成物の作製方法に関する。これらの組成物は、意外にも生存微生物に対して良好な安定性および保護作用をもたらす。生存微生物は、流通経路を通じて、および極端な貯蔵条件下で、消耗品を作製する製造工程の間、保護されうる。例えば、大部分のプロバイオティクス微生物の調合剤は、有効量より１０倍、１００倍にもなりうる非常に多量の細菌細胞を製品に過剰に配合しており、製造工程、輸送および貯蔵の間にかなりの数の細胞が、結局、生存能を失って死んでしまうと考えられている。

実施例１および実施例２により製造された非安定化乾燥プロバイオティクス製品および安定化乾燥プロバイオティクス製品の、４０℃、３３％ＲＨの加速化貯蔵条件下における貯蔵安定性を示すグラフである。 実施例２により製造された安定化乾燥プロバイオティクス製品の、４５℃、３３％ＲＨの加速化貯蔵条件下における貯蔵安定性を示すグラフである。

安定した乾燥組成物を提供する。組成物は、１または複数の生存微生物および１または複数の加水分解タンパク質を含むが、単糖類、二糖類、またはその組合せを全くまたはほとんど含まない。乾燥組成物は、１もしくは複数のオリゴ糖、１もしくは複数の多糖類、１もしくは複数のカルボン酸塩、またはその組合せをさらに含んでもよい。好ましくは、組成物は、少なくとも約５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、ならびに約１０重量％未満の１または複数の糖類を含み、糖類は単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択されるものであり、各百分率は乾燥組成物の総重量を基準とする。より好ましくは、組成物は、約５重量％、１重量％、または０．１重量％未満の、単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択される１または複数の糖類を含む。最も好ましくは、組成物は、単糖類または二糖類を含まない。

乾燥組成物中の各成分は、組成物の総乾燥重量（ｗ／ｗ）を基準として重量百分率で測定することができる。

用語「炭水化物」は本明細書で使用されるとき、主に炭素、水素および酸素から構成される有機化合物を指す。炭水化物は、単糖類、二糖類、オリゴ糖または多糖類であってもよい。オリゴ糖および多糖類は、典型的に、直線的または非直線的に連結される繰り返し構造単位の糖骨格から構成され、そのいくつかは正または負に荷電された化学基を含む。繰り返し単位は、３００万から数百万になりうる。有用な炭水化物として、還元および非還元糖類、糖アルコール、二糖類、オリゴ糖、水溶性多糖類、ならびにその誘導体が挙げられる。

用語「糖類」は、本明細書で使用されるとき、単糖類または二糖類を指す。

用語「単糖類」は、本明細書で使用されるとき、一単位の糖からなる炭水化物の最も単純な形態を指す。適切な単糖類の例として、グルコース、フルクトース、およびガラクトースが挙げられる。

用語「二糖類」は、本明細書で使用されるとき、一つに連結された２つの単糖類を有する糖を指す。二糖類における単糖類は同じであっても異なっていてもよい。適切な二糖類の例として、ショ糖、トレハロース、ラクトース、マルトース、イソマルトースが挙げられる。

用語「オリゴ糖」は、本明細書で使用されるとき、一つに連結された単糖類の少数の糖単位、典型的には３〜６０単位を有する炭水化物を指す。９単位未満の単糖類を有するオリゴ糖は、短鎖オリゴ糖としても知られている。オリゴ糖鎖における単糖類は同じであっても異なっていてもよい。オリゴ糖は、栄養的適用におけるプレバイオティクスとして考えられることが多い可溶性食物繊維である。有利なことに、可溶性食物繊維は、消化されずに胃を通過し、腸内微小菌叢によって消化可能となる。可溶性食物繊維を組み込むことによって、生存微生物を消化酵素や胃の高い酸性環境から保護することを助けることもできる。市販されているオリゴ糖製品は、単糖類および／または二糖類を含む場合がある。適切なオリゴ糖の例として、イヌリン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、デキストラン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）およびその組合せが挙げられる。オリゴ糖は、好ましくは、イヌリン、短鎖オリゴ糖、シクロデキストリン、またはマルトデキストリンであり、より好ましくはイヌリンである。

用語「多糖類」は、本明細書で使用されるとき、一つに連結された単糖類を多数、典型的には６０単位超、有する炭水化物を指す。多糖類における単糖類は同じであっても異なっていてもよい。適切な多糖類の例として、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、およびヒプロメロース；可溶性デンプンまたはデンプン画分、キサンタンガム、グアーガム、ペクチン、カラギーナン、ガラクトマンナン、ゲランガム、これらの任意の誘導体を含み、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、カルボキシメチルセルロース、アルギニン酸の塩（例えばアルギン酸ナトリウム）、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、アラビアゴム、ローカストビーンガム、キトサンおよびキトサン誘導体、コラーゲン、ポリグリコール酸、デンプンおよび加工デンプンならびにシクロデキストリンが挙げられる。多糖類は、アルギン酸、カラギーナン、グアーガム、アラビアゴム、ローカストビーンガム、デンプン、加工デンプン、およびその組合せからなる群、好ましくはアルギン酸、アラビアゴム、ローカストビーンガム、カラギーナン、デンプン、加工デンプン、およびその組合せからなる群、より好ましくはアルギン酸、ローカストビーンガムおよびグアーガムからなる群から選択されてもよい。

乾燥物質は、脱水された、または無水の、例えば、実質的に液体を失っている物質である。乾燥物質、例えば本発明に係る組成物は、１つ以上の乾燥工程、例えば、空気乾燥、真空乾燥、流動床乾燥、噴霧乾燥、または凍結乾燥によって乾燥されたものであってよい。

用語「水分活性（Ａｗ）」は、本明細書で使用されるとき、物質、例えば、本発明に係る組成物中の水の利用可能性を指し、物質中の水のエネルギー状態を示す。水分活性は、物質の水蒸気圧を、同じ温度における純水の水蒸気圧で割ったものとして規定することができる。純粋な蒸留水の水分活性は、厳密に１、すなわちＡｗ＝１．０である。乾燥物質のＡｗは約０．５以下であり、好ましくは約０．３以下であり、より好ましくは約０．２以下であり、最も好ましくは約０．１以下である。

用語「生存微生物」は、本明細書で使用されるとき、有効量を宿主に投与した場合に、宿主に対して、免疫原性応答を含む生物学的利益をもたらすまたは与える生きた微生物を指す。用語「有効量」は、本明細書で使用されるとき、生存微生物を、例えば医薬品、栄養補助食品、食事製品、または動物飼料を介して投与した場合に、望ましい生物学的利益を宿主にもたらすのに足る生存微生物の量を指す。生存微生物は、生きた細菌、真菌、酵母、単細胞藻類、ウイルスおよびファージからなる群から選択されてもよい。望ましい生物学的利益は、有益な健康、予防、または栄養効果であってもよく、例えば、健康な消化管菌叢を維持すること、成長を増進すること、再生を高めること、免疫を高めること、疾患、アレルギーおよび風邪を予防すること、または下痢、アトピー性皮膚炎、もしくは尿路感染症から守ることであってもよい。

組成物は、１または複数の生存微生物を約１〜３０重量％、１０〜２５重量％、１０〜２０重量％、または１５〜２０重量％含んでもよい。生存微生物は、生きた細菌、真菌、酵母、単細胞藻類、ウイルス、ファージまたはその組合せであってもよい。細菌は、プロバイオティクス細菌または非プロバイオティクス細菌であってもよい。非プロバイオティクス細菌は、減弱した病原菌であってもよい。適切な微生物として、限定されないが、任意の海水種または淡水種を含む微細藻類、サッカロマイセス、デバリオマイセス、カンジダ、ピキアおよびトルロプシス等の酵母；アスペルギルス、リゾパス、ムコール、ペニシリウムおよびトルロプシス等のカビ；ならびにビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、フソバクテリウム属、メリソコッカス属、プロピオニバクテリウム属、ストレプトコッカス属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、スタフィロコッカス属、ペプトストレポコッカス属、バチルス属、ペディオコッカス属、ミクロコッカス属、リューコノストック属、ウェイセラ属、アエロコッカス属、オエノコッカス属およびラクトバチルス属等の細菌が挙げられる。適切なプロバイオティクス微生物の特定の例は、以下の種によって表されてもよく、それらの種のすべての培養生物型を含んでもよい。当該種としては、例えば、アスペルギルス ニガー、Ａ．オリゼ、バチルス コアグランス、Ｂ．レンタス、Ｂ．リケニフォーミス、Ｂ．メセンテリカス、Ｂ．プミラス、Ｂ．サブティリス、Ｂ．ナットー、バクテロイデス アミロフィラス、Ｂａｃ．カピロサス、Ｂａｃ．ルミノコラ、Ｂａｃ．スイス、ビフィドバクテリウム アドレセンティス、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ブレブ、Ｂ．ビフィダム、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ラクティス、Ｂ．ロンガム、Ｂ．シュードロンガム、Ｂ．テルモフィラム、カンジダ ピントレペシー、クロストリジウム ブチリカム、エンテロコッカス クレモリス、Ｅ．ジアセティラクティス、Ｅ．フェシウム、、Ｅ．インターメディウス、Ｅ．ラクティス、Ｅ．ムンディー、Ｅ．サーモフィラス、エシェリキア コリ、クルベロマイセス フラジリス、ラクトバチルス アシドフィルス、Ｌ．アリメンタリウス、Ｌ．アミロボラス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ケース、Ｌ．カルバタス、Ｌ．セロビオサス、Ｌ．デルブルエッキ 亜種 ブルガリクス、Ｌ．ファルシミニス、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ガセリ、Ｌ．ヘルベティカス、Ｌ．ラクティス、Ｌ．プランタラム、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．リューテリ、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．サケイ、Ｌ．サリバリウス、ロイコノストック メセンテロイデス、Ｐ．セレビシエ（ダムノサス）、ペディオコッカス アシディラクティシ、Ｐ．ペントサセウス、プロピオニバクテリウム フロイデンライヒ、Ｐｒｏｐ．シェルマニイ、サッカロマイセス セレビシエ、スタフィロコッカス カルノサス、Ｓｔａｐｈ．キシロサス、ストレプトコッカス インファンタリウス、Ｓｔｒｅｐ．サリバリウス サーモフィラス、Ｓｔｒｅｐ．サーモフィルサンドおよびＳｔｒｅｐ．ラクティスならびにウイルスまたはファージが挙げられる。好ましくは、プロバイオティクス細菌は、乳酸菌およびビフィズス菌である。

医薬品、栄養補助食品、食事製品、または動物飼料、例えば調製粉乳、フォローオン調製乳、加工シリアル食品、缶詰のベビーフード、または医療目的の特殊食品等の特別な食事製品において、宿主に生物学的利益またはプロバイオティクスの利益を提供するために、組成物は、有効量の１または複数の生存微生物を含んでよい。

用語「特別な食事用途」は、本明細書で使用されるとき、特別な食事製品を製造すること、または宿主に適用することを指す。好ましくは、特別な食事製品は、文書名「Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｒ Ｉｎｆａｎｔ Ｆｏｒｍｕｌａ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｓ Ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｒｐｏｓｅｓ Ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ Ｉｎｆａｎｔｓ， ＣＯＤＥＸ ＳＴＡＮ ７２−１９８１」（「ＵＳ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｃｏｄｅｘ７２」）」において、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会によって推奨されている。特別な食事製品の例には、調製粉乳、フォローオン調製乳、加工シリアル食品、缶詰のベビーフード、および医療目的の特殊食品が含まれる。特別な食事製品は、好ましくは調製粉乳である。

宿主は、ヒトまたは動物の哺乳動物を含む、任意の動物であってよい。宿主は、乳児、子どもまたは高齢者であってもよい。用語「乳児」は、本明細書で使用されるとき、出生してから約１２か月までのヒトを指す。用語「子ども」は、本明細書で使用されるとき、約１２か月から約１２歳のヒトを指す。用語「高齢者」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも約５５、約６０、約６５、または約７０歳、好ましくは少なくとも約６５歳のヒトを指す。

組成物は、少なくとも約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７５重量％、または約８０重量％、好ましくは少なくとも約５０重量％、より好ましくは少なくとも約６０重量％の１または複数の加水分解タンパク質を含んでもよい。例えば、組成物は、約４０〜８０重量％、約４０〜７０重量％、約５０〜６０重量％、約５０〜７０重量％、約５０〜７５重量％、または約５０〜８０重量％、好ましくは約４０〜８０重量％の加水分解タンパク質を含んでもよい。

用語「加水分解タンパク質」および「タンパク質加水分解物」は、本明細書で使用されるとき、互換的に使用され、より短いペプチド断片および／またはアミノ酸に加水分解または消化されたタンパク質を指す。加水分解または消化は、強酸、強塩基、酵素またはその組合せによって行われてもよい。加水分解タンパク質は、動物または植物由来であってもよい。加水分解タンパク質は、乳タンパク質、植物タンパク質、またはその組合せであってもよい。

加水分解タンパク質は、部分的または広範囲に加水分解されたものであってよく、好ましくは広範囲に加水分解されたものである。加水分解タンパク質は、ポリペプチドとアミノ酸との混合物であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％、または約９９重量％、好ましくは少なくとも約７５重量％の加水分解タンパク質は、約１００，０００、約７５，０００、約５０，０００、約２５，０００、約１０，０００、約５，０００、約１，０００または約５００ダルトン未満、好ましくは約５０，０００ダルトン未満、より好ましくは約１０，０００ダルトン未満、より好ましくは約２，０００ダルトン未満の分子量を有する。例えば、少なくとも約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、または約９０重量％、好ましくは少なくとも約７０重量％の加水分解タンパク質は、約２，０００ダルトン未満の分子量を有する。

本発明に係る組成物について加水分解タンパク質を製造するのに適したタンパク質として乳タンパク質、植物タンパク質、およびその組合せが挙げられる。例えば、適したタンパク質として、卵タンパク質、ゼラチン、乳タンパク質、カゼイン、乳清タンパク質、アルブミン、ダイズタンパク質、エンドウタンパク質、コメタンパク質、コムギタンパク質およびその他の植物タンパク質が挙げられる。非アレルギー性の食事用途に推奨されるタンパク質が好ましい。

加水分解タンパク質の例として、加水分解カゼイン、加水分解乳清タンパク質、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質、およびその組合せが挙げられる。一実施形態において、加水分解タンパク質は、加水分解カゼインまたは加水分解エンドウタンパク質を含み、その少なくとも約８０％は約２，０００ダルトン未満の分子量を有するものである。

組成物は、オリゴ糖と多糖類との炭水化物混合物を含んでもよく、そこには生存微生物が組み込まれる。炭水化物混合物と広範囲な加水分解タンパク質とを組み合わせることによって、マトリックスが形成され、より早く乾燥させ、得られる乾燥組成物を望ましい非晶質で、強固な構造にすることができる。

組成物は、約１〜３０重量％、約１〜２０重量％、約１〜１０重量％、約５〜３０重量％、約５〜２０重量％、約５〜１０重量％、約１０〜１５重量％、約１０〜２０重量％、または約１０〜２５重量％の１または複数のオリゴ糖を含んでもよい。好ましくは、組成物は、約５〜３０重量％の１または複数のオリゴ糖を含む。

組成物は、約０．１〜４０重量％、約０．５〜３０重量％、約１〜３０重量％、約１〜２０重量％、約１〜１０重量％、約１〜５重量％、または約５〜１０重量％の１または複数の多糖類を含んでもよい。好ましくは、組成物は、約１〜１０重量％の１または複数の多糖類を含む。

組成物は、０．１〜２０重量％、０．５〜２０重量％、１〜２０重量％、０．１〜１０重量％、０．５〜１０重量％、１〜１０重量％、または１〜５重量％の１または複数のカルボン酸塩、エステル、またはその誘導体を含んでもよい。用語「カルボン酸」、「カルボン酸塩」、「カルボン酸エステル」、および「カルボン酸誘導体」は、本明細書において互換的に使用され、カルボキシル基（−ＣＯＯ−）を含有する任意の有機化合物を指す。この成分は、組成物に高いマトリックス安定性をもたらし、生存微生物、宿主、またはその両方にさらに利益をもたらしうる。例えば、この成分は、組成物を受け取る宿主に治療的または免疫原性効果をもたらしうる。適切なカルボン酸は、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸およびその組合せからなる群から選択されてもよい。適切な塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびその組合せ等のカチオンを挙げてもよい。適切なカルボン酸塩として、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、グルコン酸マグネシウム、およびアスコルビン酸ナトリウムが挙げられ、好ましくは、クエン酸またはアスコルビン酸の塩（例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム、クエン酸三ナトリウム脱水物）が挙げられる。

組成物は、１または複数の追加の作用物質をさらに含んでもよい。例えば、組成物は、組成物の総重量を基準として１〜５重量％のビタミンＥをさらに含んでもよい。

一実施形態において、組成物は、約５０〜８０重量％の加水分解タンパク質、約５〜３０重量％のオリゴ糖、約１〜１０重量％の多糖類、約１〜１０重量％のカルボン酸塩、ならびに約１０重量％未満の１または複数の糖類（単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択される）を含み、好ましくは単糖類または二糖類を含まない。

別の実施形態において、組成物は、約５０〜７５重量％の加水分解エンドウタンパク質、約１０〜２５重量％のイヌリン、約１〜５重量％のローカストビーンガム、約１〜１０重量％の１または複数のカルボン酸塩（クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸カリウム、およびその組合せからなる群から選択される）、ならびに約１０重量％未満の１または複数の糖類（単糖類、二糖類、およびその組合せからなる群から選択される）を含み、好ましくは単糖類または二糖類を含まない。

用語「生存能」は、本明細書で使用されるとき、組成物中の微生物が、微生物の増殖に適した栄養培地にコロニーまたはウイルスプラークを形成する能力を指し、組成物の重量に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）またはプラーク形成単位（ＰＦＵ）、例えば、ＣＦＵ／ｇとして表してもよい。

組成物は、少なくとも約１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１または１×１０^１２ＣＦＵ／ｇ、好ましくは少なくとも約１×１０^１０ＣＦＵ／ｇの初期生存能を有するものであってよい。組成物は、所定の貯蔵条件下で所定の期間経過後、その生存能が所定量低下するものであってよい。

所定の貯蔵条件は、所定の温度および所定の相対湿度（ＲＨ）を含んでもよい。用語「相対湿度（ＲＨ）」は、本明細書で使用されるとき、多くの場合、所定温度での空気中の水蒸気量を指す。相対湿度は、空気を飽和するのに必要な湿度より通常は低く、飽和湿度の百分率で表されることが多い。所定の温度は、少なくとも約２５、約３７、約４０、約４５、約５０または約５５℃であってもよい。所定の相対湿度（ＲＨ）は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約３３％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％または約８０％であってもよい。所定の条件は、加速化貯蔵条件であってもよい。例えば、所定の条件は、約４０℃および約３３％ＲＨ、または約４５℃および約３３％ＲＨを含んでもよい。

所定の期間は、少なくとも約１、約２、約３もしくは約４週間、または約１、約２、約３、約４、約５、約６、約１２、約１８、約２４または約３６か月、好ましくは少なくとも約１、約２、または約３か月、より好ましくは少なくとも約１または約３か月であってもよい。特定の期間は、その特定の期間の１０％以内の短い期間または長い期間を含んでもよい。用語「３か月」は、本明細書で使用されるとき、約８４〜９０日の期間を指す。用語「２か月」は、本明細書で使用されるとき、約５６〜６０日の期間を指す。用語「１か月」は、本明細書で使用されるとき、約２８〜３０日の期間を指す。

一実施形態において、組成物は、所定の期間の経過後に所定の条件下で、生存能が、約１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇ未満低下する。例えば、組成物は、約４０℃および３３％ＲＨ、または約４５℃および３３％ＲＨで、約１、約２または約３か月後に、生存能が、約１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇ未満低下するものであってよい。

一実施形態において、組成物は、少なくとも１×１０^１０ＣＦＵ／ｇの初期生存能を有し、４０℃および３３％ＲＨで３か月後（例えば８４日後）にその生存能が１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇ未満低下する。加水分解タンパク質は、好ましくは、加水分解エンドウタンパク質または加水分解カゼインである。

本発明に係る組成物は、当該技術分野で知られている技術によって製造してもよい。製造方法は、混合、凍結、凍結乾燥、周辺空気乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥、真空噴霧乾燥、またはその組合せ等の工程を含んでもよい。好ましくは、組成物の製造過程において、単糖類または二糖類は加えない。得られる組成物中の生存微生物は、単体の形態であっても食事製品等の製品に組み込まれた形態であっても、広範囲の温度および湿度条件に曝された場合において、高い生存能を有する。

本発明に係る組成物を製造するために使用される微生物は、好ましくは、固形細菌量が約５〜３０％（ｗ／ｖ）となるよう濃縮された、湿潤ペースト状の培養物である。濃縮物は、他の成分と合わせる前に、湿った、凍結または解凍されたペーストの形態であってもよく、あるいは乾燥形態の微生物を用いてもよい。

組成物の製造は、選択した微生物を濃縮する工程、成分と濃縮した微生物とを混合してスラリーを形成する工程、スラリーを液体窒素中で急速凍結して、液滴、紐またはビーズの形態の粒子を形成する工程、粒子に熱を供給しながら、減圧下で粒子中の湿気を蒸発させることによって粒子を乾燥させる工程を含んでもよい。得られる安定した乾燥組成物は、他の成分と包装または組み合わせて、医薬品、栄養補助食品、食事製品、または動物飼料等の製品を形成してもよい。特に、得られる組成物は、調製粉乳、フォローオン調製乳、加工シリアル食品、缶詰のベビーフード、または医療目的の特殊食品等の特別な食事製品を作製するために使用されてもよい。

適切な混合工程の一態様は、スラリーを形成するために、組成物中の微生物を除く成分のすべての乾燥混合物を、微生物を含む濃縮培地または培養液に直接加えることを含んでもよい。乾燥混合物は、２０〜８０℃で濃縮アルカリ溶液（例えば１Ｍまたは５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液）によりｐＨ８〜９に調整された水溶液に、予め溶解させてもよい。スラリーでは、微生物の乾燥重量が約５〜３０％（ｗ／ｖ）を占め、乾燥混合物が約２０〜６０％（ｗ／ｖ）または３０〜５０％（ｗ／ｖ）を占めてもよい。スラリー中の総固形量は、約２５〜９０％または約３０〜６０％であってもよい。乾燥の最中に生じうるゴム状物の形成または過剰な発泡を回避しながら効率的に乾燥するような望ましい粘度をスラリーが達成するように、乾燥混合物中の多糖類の量を調整してもよい。スラリーの望ましい密度は、当該技術分野で知られている任意の手段、例えば、真空下で脱気する、または空気、窒素、二酸化炭素、もしくはアルゴン等のガスを注入することによって達成することができる。

スラリーは約−３０℃もしくは約−８０℃に凍結してもよく、または液体窒素浴に噴射する、液滴する、または注入することによって液体窒素中で急速凍結してもよい。ビーズ、紐または液滴の形態で得られた粒子は、回収して凍結乾燥器または真空乾燥器中で乾燥させてもよい。あるいは、超低温冷凍庫（例えば−３０℃〜−８０℃の間）に貯蔵し、後に、凍結した形態で使用し、または、乾燥（例えば、凍結乾燥もしくは真空乾燥）してもよい。

概して、有用な乾燥技術は、解凍したスラリーを、真空オーブンもしくは遠心エバポレータにおいて凍結乾燥または蒸発乾燥すること、このとき、解凍した凍結スラリーまたは乾燥物は、凍結温度より高い温度（例えば−２０〜−５℃）に維持すること、続いて望ましい粒径に粉砕すること、を含む。微生物は、粒子中の結晶化していない非晶質物質によって被覆されていることが好ましい。非晶質状態の物質で微生物を被覆することの長所は、粒子の物理的安定性を高め、粒子内部で有害な結晶質が形成されるのを減少させることにある。結晶性がより高い環境でも良好な微生物も存在するため、結晶化していない非晶質構造の達成は、長期間の安定性にとって必要条件ではない。

急速凍結したスラリーを、約０．１ｋｇ／平方フィート〜約１．５ｋｇ／平方フィート容量でトレイに充填し、その後すぐに真空乾燥室に移してもよい。そこでの乾燥方法は左記を含む主要な３工程により進行させてもよい：（ａ）任意選択の短時間の温度順化を行い、＜１０００ｍＴＯＲＲ未満の真空圧下で凍結粒子の構造安定化工程を行うこと、（ｂ）真空下、粒子の凝固点より高い温度で、一次乾燥または一次蒸発乾燥すること、（ｃ）全強度の真空下、高い熱源温度で、得られた乾燥組成物の水分活性が例えば約０．３Ａｗ以下に低下するのに十分な時間、二次乾燥すること。得られた乾燥組成物は、ガラス様非晶質であってもよい。

用語「凍結乾燥」および「凍結乾燥させる」は、本明細書で使用されるとき、互換的に使用され、凍結状態で急速凍結し、脱水する（昇華ともいう）ことによって乾燥形態の組成物を調製することを指す。凍結乾燥は、組成物中の成分が結晶化しうる温度で行う。

用語「一次乾燥」は、本明細書で使用されるとき、産物の温度を熱源の温度、すなわち熱源温度または棚温度より実質的に低く維持して、一次乾燥産物を作製する乾燥ステップを指す。典型的には、一次乾燥ステップの最中に、産物の温度を凍結温度より高いが、熱源の温度よりかなり低く維持しながら、大部分の湿気が広範囲な蒸発により産物から取り除かれる。

用語「二次乾燥」は、本明細書で使用されるとき、一次乾燥された産物の温度を熱源の温度、すなわち熱源温度または棚温度付近に維持して、乾燥物を作製する乾燥ステップを指す。二次乾燥の工程は、得られた乾燥物の水分活性を低下させるのに十分な真空下で行ってもよい。典型的な乾燥工程において、二次乾燥工程は、組成物の水分活性を例えば約０．３Ａｗ以下に低下させる。

一実施形態において、１または複数の生存微生物、少なくとも約５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、１または複数の多糖類および１または複数のカルボン酸塩を含む乾燥組成物は、（ａ）生存微生物、加水分解タンパク質、オリゴ糖、多糖類、およびカルボン酸塩をアルカリ水性溶媒中で合わせて、スラリーを形成する工程、（ｂ）スラリーを液体窒素中で急速凍結して、ビーズ、液滴または紐の形態の凍結固体粒子を形成する工程、（ｃ）粒子の温度をその凍結温度より高く維持しながら、真空下、蒸発によって凍結固体粒子を一次乾燥し、それにより一次乾燥物を形成すること、ならびに（ｄ）一次乾燥物を全強度の真空、熱源温度２０℃以上で、一次乾燥物の水分活性が０．３Ａｗ以下に低下するのに十分な時間二次乾燥する工程、を含む方法によって製造する。好ましくは、この方法では単糖類または二糖類を加えない。

本発明に係る製造方法は、工程（ａ）のスラリーを形成するために、１または複数の糖類をアルカリ水性溶媒に加えることをさらに含んでもよい。１または複数の糖類は、単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択される。得られる乾燥組成物は、１０重量％未満の１または複数の糖類を含む。

方法は、工程（ａ）の前に、加水分解タンパク質、オリゴ糖、多糖類およびカルボン酸塩を滅菌することをさらに含んでもよい。工程（ａ）で単糖類および／または二糖類を加える場合、単糖類および／または二糖類は、工程（ａ）の前に滅菌してもよい。滅菌は当該技術分野で知られている方法により達成することができる。例えば、工程（ａ）の前に、加圧下で加水分解タンパク質、オリゴ糖、多糖類およびカルボン酸塩の水性混合物を加熱し、次に冷却する。

方法は、工程（ａ）の前に加水分解タンパク質、オリゴ糖、多糖類およびカルボン酸塩を可溶化することをさらに含んでもよい。工程（ａ）において単糖類および／または二糖類を加える場合、単糖類および／または二糖類は工程（ａ）の前に可溶化してもよい。

方法は、組成物を、切る、つぶす、粉砕する、または微粉砕し、流動性粉末にすることをさらに含んでもよい。粉末の粒径は、約１０，０００、約１，０００、約５００、約２５０または約１００μｍ未満、好ましくは約１，０００μｍ未満、より好ましくは約２５０μｍ未満であってもよい。

本発明に係る組成物は、フレークとして直接使用してもよいし、またはひいて粉末にしてもよいし、平均粒径が約１〜約１０，０００μｍ、好ましくは約１０〜約１０，０００μｍになるまで篩にかけてもよい。

本発明に係る組成物は、濃縮粉末または再構成した液体（例えば飲料）として投与してもよい。また、本発明に係る組成物は、フレークまたは粉末のいずれかの形態で、既存の食品に組み込んでもよい。

方法は、本発明に係る組成物を用いて医薬品、栄養補助食品、食事製品、または動物飼料を作製する工程をさらに含んでもよい。組成物は、当該製品において、プロバイオティクスの利益を宿主に提供するのに有効量の１または複数のプロバイオティクス微生物を含む。特別な食事製品の例には、調製粉乳、フォローオン調製乳、加工シリアル食品、缶詰のベビーフード、または医療目的の特殊食品を含んでもよい。好ましくは、特別な食事製品は調製粉乳である。

得られた生存微生物を含む安定した乾燥粉末は、融解脂肪に凝集してもよい。乾燥粉末を、４０〜５０℃のプラネタリーミキサー（遊星式混練機）に投入し、その温かい粉末に、ココアパウダー、天然ワックスまたはパーム油、ステアリン酸、ステレアン（ｓｔｅｒｅａｎｅ）またはその混合物等の融解脂肪をゆっくりと加えてもよい。混合物は、粉末凝集体が視覚的に均一な大きさになるまで混合しながら、脂肪の融解温度より低い温度に冷却してもよい。得られた組成物中の融解脂肪の重量質量（ｗｅｉｇｈｔ ｍａｓｓ）は約２０〜約７０％、好ましくは約３０〜約５０％であってもよい。

＜実施例１＞凍結保護物質としてトレハロースのみを含有する乾燥プロバイオティクス製品の安定性
ビフィドバクテリウム属の濃縮培養物を１０％（ｗ／ｗ）のトレハロースと共に液体窒素に入れ、急速凍結した。得られた凍結粒子（ビーズ）を加熱することなく完全真空下で４８時間凍結乾燥し、乾燥物にした。乾燥物の初期生存能は１１．６３ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであった。この乾燥物の試料を、４０℃、３３％ＲＨの加速安定性負荷条件に置いたところ、１４日後には１．４６ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇ、２８日後には３．１７ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇまで、生存能が低下した。これらの結果は、生存微生物および唯一の凍結保護物質としてトレハロースを含有する乾燥試料が、元来不安定であることを示す。

＜実施例２＞乾燥プロバイオティクス組成物の製造
本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物を製造した。加水分解エンドウタンパク質（７５ｇ、Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ Ｃａｐｉｎａ Ｄｏｍａ、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ）を７５℃の温かい蒸留水１００ｍＬに溶解した。得られたエンドウ溶液の水素イオン濃度を２０％の濃縮ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ８．５に調整した。ローカストビーンガム（３ｇ、Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）、イヌリン（７％の糖を含有するインスタントイヌリン１７ｇ、Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）およびアスコルビン酸ナトリウム（５ｇ、Ｓｉｇｍａ）を乾燥物のまま混合し、羽根車式ミキサーにより７００ｒｐｍでエンドウ溶液を攪拌しながら、そのエンドウ溶液に加えた。攪拌しながら、得られた混合液を冷却し、３５℃〜４０℃に維持した。

得られた混合液は半透明のあめ色で、シロップ状の稠度を有していた。制御温度ジャケットを備えたデュアルプラネタリーミキサー（ＤＰＭ、ｌｑｔ、Ｒｏｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｓａｖａｎｎａｈ、ＧＡ）に液体混合物を移した。ミキサーのジャケット温度は周囲の温度以下であった。ここに、凍結したプロバイオティクス細菌ビフィドバクテリウム属の濃縮物（１２０ｇ、細菌固形物１０％（ｗ／ｗ）を含有）を、２０ｒｐｍで２〜３分間、または全細菌が十分に解凍されて均一に分散するまで、混合しながら加えた。プロバイオティクススラリーを４℃に冷却し、この温度に３０〜６０分間保った。その後、液体窒素浴中にスラリーを滴下して急速凍結して凍結ビーズを作製した。これを液体窒素から回収し、後に乾燥させるため、−８０℃で貯蔵した。

乾燥させるため、凍結ビーズを予冷したトレイ（−２０℃）に８００ｇ／平方フィート容量で広げ、その後すぐに凍結乾燥器（Ｍｏｄｅｌ ２５ ＳＲＣ、Ｖｉｒｔｉｓ、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ）中の棚に置いた。９００〜１５００ｍＴＯＲＲの真空に調整し、棚温度を２０℃に上昇させて一次乾燥工程を開始した。これらの一次乾燥温度および真空圧の設定は１６時間維持した。一次乾燥の前に、加熱せず約１０００ｍＴＯＲＲの真空圧にして凍結ビーズの温度を約１０分間約−２０℃に安定させることにより、凍結ビーズの温度を約−２０℃に順化させてもよい。任意の順化工程の後、真空圧を９００〜１５００ｍＴＯＲＲ、棚温度を＋２０℃に調整することにより一次乾燥工程を行った。これらの温度および真空圧の設定は約１６時間維持した。一次乾燥工程の後、全強度の真空（すなわち１５０〜２００ｍＴＯＲＲ）で二次乾燥を行い、棚温度をさらに８時間で４０℃に上昇させた。その結果、組成物は完全に乾燥し、Ｈｙｇｒｏｐａｌｍ Ａｗ１ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｒｏｔｏｎｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）で測定した水分活性は０．３Ａｗより低かった。その後、乾燥材料を粉砕し、粒径≦２５０μｍになるまで篩にかけ、４℃で貯蔵した。

＜実施例３＞貯蔵安定性の比較
実施例１の乾燥プロバイオティクス製品および実施例２の乾燥プロバイオティクス組成物をそれぞれマルトデキストリンと等量（１：１の比）で混合し、加速化貯蔵条件下の防湿庫（デシケーター）に置いた。試料を定期的に採取し、標準微生物希釈液およびＬＭＲＳ寒天のプレーティング手順を用いて細菌のＣＦＵ評価を行った。

図１は、実施例１の乾燥プロバイオティクス製品（非安定化ビフィドバクテリウム属細菌）および実施例２の乾燥プロバイオティクス組成物（安定化ビフィドバクテリウム属細菌）について、４０℃、３３％ＲＨの加速化貯蔵条件下における貯蔵安定性の結果を示す。実施例１の乾燥プロバイオティクス製品は、最初の数週間で生存能を完全に失ったが、本発明に係る実施例２の乾燥プロバイオティクス組成物は、８４日経過後における生存能の低下量が、わずかに０．４９ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであった。

図２は、実施例２の乾燥プロバイオティクス組成物（安定化ビフィドバクテリウム属細菌）について、４５℃、３３％ＲＨの加速化貯蔵条件下における貯蔵安定性を示す。本発明に係る実施例２の乾燥プロバイオティクス組成物は、３０日経過後における生存能の低下量が、わずかに０．５９ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであった。

＜実施例４＞二糖類が安定性に及ぼす影響
二糖類のラクトースが本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物の安定性に及ぼす影響を評価した。実施例２に記載の方法により、乾燥物成分と凍結ビフィドバクテリウム属プロバイオティクス細菌（１２０ｇ、細菌固形物１０％（ｗ／ｗ）を含有）とを混合することによって５つの乾燥組成物を製造した。乾燥物成分には、ラクトースの量を増加させ、それに比例して加水分解エンドウタンパク質の量を減少させたものを含めた。その後、実施例３に記載の方法により安定性の試験を行った。

表１は、各成分の重量百分率（ｗ／ｗ）、初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）、ならびに、４０℃、３３％ＲＨで、組成物１〜３について１か月後の生存能の低下量（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇの低下）および組成物４〜５について３カ月後の生存能の低下量を示す。組成物４（ラクトース８．９％（ｗ／ｗ）、加水分解エンドウタンパク質５８％（ｗ／ｗ））および組成物５（ラクトースなし、加水分解エンドウタンパク質６６．９％（ｗ／ｗ））は、４０℃、３３％ＲＨで８４日経過後に、生存能の低下量が１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ未満であった。組成物１〜３（ラクトース１７％（ｗ／ｗ）以上および加水分解エンドウタンパク質４９．１％（ｗ／ｗ）以下）は、４０℃、３３％ＲＨで１か月経過後に、生存能の低下量が１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇを超えた。

表１．ラクトースが安定性に及ぼす影響（％（ｗ／ｗ））

＜実施例５＞カルボン酸塩が安定性に及ぼす影響
カルボン酸塩、アスコルビン酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムが本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物の安定性に及ぼす影響を評価した。実施例２に記載の方法により、乾燥物成分と凍結ビフィドバクテリウム属プロバイオティクス細菌（１２０ｇ、細菌固形物１０％（ｗ／ｗ）を含有）とを混合することによって６つの乾燥組成物を製造した。乾燥物成分には、アスコルビン酸ナトリウム（組成物３〜５）、クエン酸ナトリウム（組成物６）およびビタミンＥ（組成物２〜４）を含めた。その後、実施例３に記載の方法により安定性の試験を行った。

表２は、得られた乾燥組成物について、各成分の重量百分率（ｗ／ｗ）、初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）、および４０℃、３３％ＲＨで８４日後の生存能の低下量（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇの低下）を示す。組成物３〜６（アスコルビン酸ナトリウム０．９〜４．５％（ｗ／ｗ）またはクエン酸ナトリウム４．５％（ｗ／ｗ）を含有）は、４０℃、３３％ＲＨで８４日経過後に、生存能の低下量が１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ未満であった。

表２．カルボン酸塩が安定性に及ぼす影響（％（ｗ／ｗ））

＜実施例６＞オリゴ糖が安定性に及ぼす影響
オリゴ糖、イヌリン、短鎖オリゴ糖およびガンマシクロデキストリンが本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物の安定性に及ぼす影響を評価した。カゼイン加水分解物（ＤＭＶ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｍｅｒｓｆｏｏｒｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を７５ｇ、シクロデキストリン（Ｗａｃｋｅｒ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、イヌリン（糖類７％を含有するインスタントイヌリン、Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）または短鎖オリゴ糖（糖類５％を含有するＯｒａｆｔｉ Ｐ−９５、Ｂｅｎｅｏ、Ｔｉｅｎｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を１７ｇ、アラビアゴム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）を３ｇ、およびクエン酸ナトリウムとアスコルビン酸ナトリウムとの混合物（１：１（ｗ／ｗ）、Ｓｉｇｍａ）を５ｇ含有する組成物を、実施例２に記載の方法により製造した。続いて、実施例３に記載の方法により安定性の試験を行った。短鎖オリゴ糖を用いて製造した乾燥組成物は、単糖類および／または二糖類を１％（ｗ／ｗ）未満含んでいた。これらの組成物はすべて、初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）が１１．２〜１１．３ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、４０℃、３３％ＲＨで３か月後の生存能の低下量が０．４３〜０．６６ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであった。

＜実施例７＞多糖類の影響
多糖類、ローカストビーンガム、アラビアゴム、カラギーナンおよびアルギン酸が本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物の安定性に及ぼす影響を評価した。カゼイン加水分解物（ＤＭＶ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｍｅｒｓｆｏｏｒｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を７５ｇ、シクロデキストリン（Ｗａｃｋｅｒ、Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１７ｇ、アラビアゴム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）、ローカストビーンガム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）、アルギン酸（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）またはカラゲナン（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）を３ｇ、およびクエン酸ナトリウムとアスコルビン酸ナトリウムとの混合物（１：１（ｗ／ｗ）、Ｓｉｇｍａ）を５ｇ含有する組成物を、実施例２に記載の方法により製造した。続いて、実施例３に記載の方法により安定性試験を行った。これらの組成物はすべて、初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）が１１．２〜１１．３ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、４０℃、３３％ＲＨで３か月後の生存能の低下量が０．４６〜０．８１ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであった。

＜実施例８＞タンパク質源の効果
タンパク質源、エンドウタンパク質加水分解物、カゼイン加水分解物、およびコムギタンパク質加水分解物が本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物の安定性に及ぼす影響を評価した。カゼイン加水分解物（ＤＭＶ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、コムギ加水分解物（Ｍａｒｃｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｔａｄｔ、ＮＪ）またはエンドウタンパク質加水分解物（Ｆｒｉｅｄｓｌａｎｄ Ｃａｍｐｉｎａ Ｄｏｍｏ、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ）を６５ｇ、シクロデキストリン（Ｗａｃｋｅｒ、Ｍｕｎｃｈｅｎ Ｇｅｒｍａｎｙ）を２７ｇ、アラビアゴム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）を３ｇ、およびビタミンＥとアスコルビン酸ナトリウムとの混合物（４：１（ｗ／ｗ）、Ｓｉｇｍａ）を５ｇ含有する組成物を実施例２に記載の方法により製造した。また、ダイズ加水分解物（Ｓｉｇｍａ）を７５ｇ、イヌリン（糖類７％を含有するインスタントイヌリン、Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を１７ｇ、ローカストビーンガム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）、アルギン酸（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）またはカラギーナン（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）を３ｇ、およびクエン酸ナトリウムとアスコルビン酸ナトリウムとの混合物（１：１（ｗ／ｗ）、Ｓｉｇｍａ）を５ｇ含有する組成物を実施例２に記載の方法により製造した。続いて、実施例３に記載の方法により安定性試験を行った。

得られた６つの乾燥組成物の初期生存能は、１１．０１〜１１．３４ ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇであった。４０℃、３３％ＲＨで８４日後の生存能の低下量は、エンドウ加水分解物、ダイズ加水分解物またはカゼイン加水分解物を含有する組成物では０．５１〜０．８１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであったが、コムギタンパク質加水分解物を含有する組成物では、２．０１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであった。

＜実施例９＞様々なプロバイオティクス細菌種の安定性
様々なプロバイオティクス細菌、Ｌ．アシドフィルスおよびビフィドバクテリウム属細菌について、本発明に係る乾燥プロバイオティクス組成物における安定性を評価した。エンドウタンパク質加水分解物（Ｆｒｉｅｄｓｌａｎｄ Ｃａｍｐｉｎａ Ｄｏｍｏ、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ）を７５ｇ、イヌリン（Ｃａｒｇｉｌｌ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を１７ｇ、ローカストビーンガム（Ｔｉｃ ｇｕｍ、Ｂｅｌｃａｍｐ、ＭＤ）を３ｇ、クエン酸ナトリウムとアスコルビン酸ナトリウムとの混合物（１：１（ｗ／ｗ）、Ｓｉｇｍａ）を５ｇ含有する組成物を実施例２に記載の方法により製造した。続いて、実施例３に記載の方法により安定性試験を行った。Ｌ．アシドフィルス組成物の初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）は、１０．５７ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、４０℃、３３％ＲＨで３か月後の生存能の低下量は０．６４ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであった。ビフィドバクテリウム属細菌組成物の初期生存能（ｌｏｇ ｕｎｉｔ ＣＦＵ／ｇ）は、１１．１１ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、４０℃、３３％ＲＨで３か月後の生存能の低下量は０．４１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ／ｇであった。

＜実施例１０＞乳児用調製粉乳
実施例２に従って、生きたビフィドバクテリウム属細菌を含有する安定した乾燥組成物を製造し、粒径５０〜２５０μｍになるまでふるいにかけた。粒径５０μｍ〜２５０μｍの乾燥組成物粒子０．１ｇを、Ｇｅｒｂｅｒ Ｇｏｏｄ Ｓｔａｒｔ（Ｎｅｓｔｌｅ Ｉｎｆａｎｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ、ＮＪ）１９．９ｇと混合して、プロバイオティクス細菌を含有する乳児用調製粉乳を製造した。最終製品は、８．０３ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇのビフィドバクテリウム属細菌を含有していた。プロバイオティクス乳児用調製粉乳を未開封の１８０ｃｃのＨＤＰＥボトルに詰め、２５℃および４０℃に制御された温度環境に曝した。ボトルの内部の水分活性は０．２Ａｗであった。９か月間、または測定結果が１ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇ未満に減少するまで、毎月、微生物の安定性を測定した。乳児用調製粉乳中のビフィドバクテリウム属細菌の生存能の低下量は、２５℃で貯蔵したときは０．０９ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであり、４０℃で貯蔵したときは０．８２ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇであった。

＜実施例１１＞プロバイオティクス補助食品
実施例２に従って、ラクトバチルス アシドフィルスを含有する安定した乾燥組成物を製造し、錠剤、カプレットまたはカプセル等の経口剤形に製剤化する。圧縮剤（ブドウ糖）１９．９ｇおよび粒径が５０μｍ〜２５０μｍの乾燥組成物粒子０．１ｇを含有するオレンジ味の錠剤を、１／２”ｒｏｕｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｃａｖｅ ｔｏｏｌｉｎｇを用いてロータリー打錠機で直接圧縮することによって調製する。最終製品は、約５Ｅ＋８ＣＦＵ／単位用量を含有する。錠剤の硬度は８〜１０ｋｐであり、分解時間は約２０秒である。圧縮した錠剤は、１００錠ずつ１８０ｃｃのＨＤＰＥボトルに詰め、４０℃、３３％ＲＨに制御された温湿度環境に曝す。１２ヶ月間、または測定結果が１Ｅ＋６ＣＦＵ／単位用量未満に減少するまで、毎月、微生物の安定性を測定する。

＜実施例１２＞機能性飲料
実施例２に従って、ラクトバチルス アシドフィルスを含有する安定した乾燥組成物を製造する。そして、重量％で、ショ糖７１％、マルトデキストリン１４％、イヌリン１０％、ブドウ糖２％、無水クエン酸１％、アラビアゴム０．３％、香料０．３％、リン酸三カルシウム０．３％、および粒径５０μｍ〜２５０μｍの乾燥プロバイオティクス組成物（Ｌ アシドフィルス）０．１重量％を含有する乾燥混合物をつくる。最終製品は、約１Ｅ＋９ＣＦＵ／単位用量（乾燥混合物３０ｇ）を含有する。製品はアルミ箔製の小袋に詰め（１単位用量／袋）、３４０ｍＬの水に攪拌して飲用に供する。プロバイオティクスを含有する飲料用乾燥混合物について、１２ヶ月間、または測定結果が１Ｅ＋７ＣＦＵ／単位用量未満に減少するまで、毎月、微生物の安定性を測定する。

＜実施例１３＞マルチビタミン／プロバイオティクス錠剤
実施例２の記載に従って、プロバイオティクスＬ．カゼイを含有する乾燥粉末１０ｇを製造する。錠剤にするために、乾燥した安定プロバイオティクス組成物（１００ｍｇ）をステアリン酸マグネシウム２％（ｗ／ｗ）および親水性ヒュームドシリカ２％（ｗ／ｗ）（ＡＥＲＯＳＩＬ（登録商標）２００、Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を含有する市販のマルチビタミン粉末４００ｍｇ（Ｃｅｎｔｒｕｍ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）と混合し、（１／２”錠剤直径容器を使用して）小型の錠剤プレス装置で圧縮する。各錠剤は、約１Ｅ＋７ＣＦＵ／錠剤を含有する。錠剤は、１００錠ずつ１８０ｃｃのＨＤＰＥボトルに詰め、４０℃、３３％ＲＨに制御された温湿度環境に曝す。このボトルについて、１２ヶ月間、または測定結果が１Ｅ＋６ＣＦＵ／単位用量未満に減少するまで、毎月、微生物の安定性を測定する。

＜実施例１４＞種子接種材料
実施例２に従って、根圏細菌（Ｒｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ）のような生物学的制御剤を乾燥組成物の形態で製造する。１Ｅ＋６ＣＦＵ／種子の用量で、乾燥組成物粉末により被覆したダイズで、乾燥根圏細菌組成物の有効性を評価する。被覆した種子を紙袋に詰め、室温（２３〜２５℃）で保管する。この紙袋について、１２ヶ月間、または測定結果が１Ｅ＋５ＣＦＵ／単位用量未満に減少するまで、毎月、微生物の安定性を測定する。

＜実施例１５＞プロバイオティクスペットフード
市販のペレット状のイヌ用ペットフードを水分活性が０．１になるまでコンベクションオーブンで乾燥し、実施例２の記載に従って製造した安定したＬ．アシドフィルス乾燥組成物で被覆する。乾燥ペレットに、約５％の脂肪を基剤とする水分バリア（鶏脂４０％、ココアバター４０％および蜜蝋２０％の混合物）を噴霧し、ドラムタンブラーで、乾燥粉末製剤（通常、ペットフード総量の０．１〜０．５％。当該量で１Ｅ＋８ＣＦＵ／ｇ用量となる）と混合し、最後に、脂肪を基剤とする水分バリアを追加して噴霧し、被覆する。被覆物の総量は（ペットフードの）約１５％である。被覆時間は約３０分である。

＜実施例１６＞魚用飼料
本発明に係るペレット状の魚用プロバイオティクス飼料をいくつかのプロバイオティクス混合物を用いて製造する。実施例２に記載の方法により、Ｌ．ラムノサス、Ｌ．アシドフィルスおよびビフィドバクテリウム ラクティスの混合物を含有する、安定した乾燥プロバイオティクス組成物を製造する。まずサケ用の市販のスターター飼料（Ｚｅｉｇｌｅｒ Ｂｒｏｓ．、Ｇａｒｄｎｅｒｓ、ＰＡ）を水分活性が０．１になるまでコンベクションオーブンで乾燥し、その後、ドラムタンブラーでプロバイオティクス組成物を被覆する。最初に、飼料ペレット（１０００ｇ）に、約５重量％の脂肪を基剤とする水分バリア（魚油４０％、ココアバター４０％および蜜蝋２０％の混合物）を噴霧し、安定した乾燥プロバイオティクス組成物１ｇ（１Ｅ＋７ＣＦＵ／ｇ飼料の用量となる）と混合し、最後に脂肪を基剤とする水分バリアを追加して噴霧し、被覆する。被覆物の総量は（魚用飼料の）約１０％である。

＜実施例１７＞動物用飼料
実施例２に記載の方法により製造した安定した乾燥Ｌ．アシドフィルス組成物を１部、および、コーン油等の植物油を２部含有する油混合物３％を、市販の肉食牛用またはニワトリ用飼料約５００ｇに、ドラムタンブラーでトップコートする。プロバイオティクス細菌のＣＦＵ数は約ｌＥ＋９／ｇ飼料となる。被覆した飼料を、４０℃、相対湿度４３％のチャンバーに置く。係る極端な条件で１４日間貯蔵した後のプロバイオティクス細菌の生存能の低下量は、最初のＣＦＵ数の１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ未満であると予想される。プロバイオティクスを被覆した別の飼料を３０℃、相対湿度３３％のチャンバーに置く。当該条件で６ヶ月間貯蔵した後のプロバイオティクス細菌の生存能の低下量は、最初のＣＦＵ数の１ ｌｏｇ ｕｎｉｔ未満であると予想される。

＜実施例１８＞ビブリオ アングイラルムに対する生きたファージを含有する乾燥組成物
実施例２に記載の方法により、生きたファージを含有する安定組成物１０ｇを製造する。乾燥した生存ファージ組成物を魚油２０ｇと混合し、得られた懸濁液をティラピア飼料ペレット１ｋｇに被覆する。被覆した飼料を典型的な倉庫の貯蔵条件で保管する。魚餌中のファージの生存能は、本発明に係る組成物および方法を使用すると、高湿度の非冷蔵保管条件に１４日間曝されても維持されると予想される。

これらの例は、異なる微生物、例えば、ヒトや魚類、ニワトリ、スウェインおよび愛玩動物を含む様々な動物を治療するために使用されるプロバイオティクス細菌、真菌およびウイルスが、本発明に係る組成物および本発明に係る乾燥方法で保存され、食品または飼料に被覆あるいは混合することができ、包装内で長期間、あるいは、被覆されていない飼料が貯蔵される典型的な温湿度条件下の飼料容器中で少なくとも２週間、貯蔵できることを実証する。

本明細書で使用される用語「約」は、量、百分率等の測定可能な値を指す場合、指定した値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、よりさらに好ましくは±０．１％のばらつきは妥当であるため、このようなばらつきを含むことを意味する。

すべての文書、書籍、手順書、論文、特許、公開特許出願、ガイド、要約、および本明細書で引用するその他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示される発明の明細書および実施形態を考慮すると、当業者に明らかとなるだろう。明細書および例は例示に過ぎず、本発明の範囲と趣旨は以下の請求項によって示される。

Claims (24)

1. １または複数の生存微生物、少なくとも５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のカルボン酸塩、ならびに５重量％未満の１または複数の糖類を含む乾燥組成物であって、前記糖類は単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択されるものであり、前記加水分解タンパク質は、加水分解乳タンパク質、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質およびその組合せからなる群から選択されるものであり、各百分率は前記乾燥組成物の総重量を基準とする、前記乾燥組成物。
2. １または複数の生存微生物が、生きた細菌、真菌、酵母、単細胞藻類、ウイルスおよびファージからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
3. 細菌がプロバイオティクス細菌である、請求項２に記載の組成物。
4. １または複数の加水分解タンパク質が、加水分解カゼイン、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
5. １または複数の加水分解タンパク質が、加水分解カゼイン、加水分解エンドウタンパク質およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
6. １または複数のオリゴ糖をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
7. 乾燥組成物の総重量を基準として、５〜３０重量％の１または複数のオリゴ糖を含む、請求項６に記載の組成物。
8. １または複数のオリゴ糖が、イヌリン、短鎖オリゴ糖、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストラン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）およびその組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
9. １または複数のオリゴ糖が、イヌリン、短鎖オリゴ糖またはシクロデキストリンである、請求項６に記載の組成物。
10. １または複数の多糖類をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
11. 乾燥組成物の総重量を基準として、１〜１０重量％の１または複数の多糖類を含む、請求項１０に記載の組成物。
12. １または複数の多糖類が、アルギン酸、アラビアゴム、ローカストビーンガム、カラギーナン、デンプン、加工デンプンおよびその組合せからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
13. 乾燥組成物の総重量を基準として、１〜１０重量％の１または複数のカルボン酸塩を含む、請求項１に記載の組成物。
14. １または複数のカルボン酸塩が、乳酸、アスコルビン酸、マレイン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、グルコン酸、グルタミン酸およびその組合せからなる群から選択されるカルボン酸の塩である、請求項１に記載の組成物。
15. １または複数のカルボン酸塩がアスコルビン酸塩、クエン酸塩およびその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
16. 少なくとも１×１０^１０ＣＦＵ／ｇの初期生存能を有し、生存能の低下量が、温度４０℃、相対湿度３３％で３ヶ月後に、１ ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇ未満である、請求項１に記載の組成物。
17. １または複数の加水分解タンパク質が、加水分解エンドウタンパク質または加水分解カゼインである、請求項１６に記載の組成物。
18. 乾燥組成物の総重量を基準として、１〜５重量％のビタミンＥをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
19. １または複数のオリゴ糖および１または複数の多糖類をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
20. １または複数の生存微生物、少なくとも５０重量％の１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のカルボン酸塩、ならびに５重量％未満の１または複数の糖類を含む乾燥組成物であって、前記糖類は単糖類、二糖類およびその組合せからなる群から選択されるものであり、前記加水分解タンパク質は、加水分解乳タンパク質、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質およびその組合せからなる群から選択されるものであり、各百分率は前記乾燥組成物の総重量を基準とする、前記乾燥組成物を製造する方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）を含む前記方法；
    （ａ）１または複数の生存微生物、１または複数の加水分解タンパク質、１または複数の糖類および１または複数のカルボン酸塩をアルカリ水性溶媒中で合わせてスラリーを形成する工程、
    （ｂ）前記スラリーを液体窒素中で急速凍結して、ビーズ、液滴または紐の形態の凍結固体粒子を形成する工程、
    （ｃ）前記凍結固体粒子の温度をその凍結温度より高く維持しながら、真空下で蒸発によって前記凍結固体粒子を一次乾燥し、それにより一次乾燥物を形成する工程、
    （ｄ）全強度の真空、熱源温度２０℃以上で、水分活性が０．３Ａｗ以下に低下するのに十分な時間、前記一次乾燥物を二次乾燥し、それにより乾燥組成物を調製する工程。
21. １または複数のオリゴ糖および１または複数の多糖類をアルカリ水性溶媒に加えて工程（ａ）のスラリーを形成する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
22. 工程（ａ）の前に、１または複数の加水分解タンパク質、１または複数のオリゴ糖、１または複数の多糖類、１または複数のカルボン酸塩および１または複数の糖類を滅菌する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 組成物で製品を作製する工程をさらに含み、前記製品が医薬品、栄養補助食品、食品、飼料および特別な食事製品からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
24. １または複数の加水分解タンパク質が、加水分解カゼイン、加水分解エンドウタンパク質、加水分解ダイズタンパク質およびその組合せからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。

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