JP7377478B2 - 魚介類養殖方法、プロバイオティクス細菌液、およびプロバイオティクス細菌含有飼料 - Google Patents
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Description
細菌液処理工程S2は、移植対象の個体の飼育水にプロバイオティクス細菌を添加することによって、個体に飼育水を介してプロバイオティクス細菌を腸内に取り込ませる。細菌液処理工程S2は、肥育対象の個体を飼育している水槽等(以下、飼育槽)に、直接にプロバイオティクス細菌を投入することによって実行することができる。または、細菌液処理工程S2は、別の水槽(以下、処理槽)にプロバイオティクス細菌を添加した飼育水(プロバイオティクス細菌液)を準備して、その中に移植対象の個体を一時的に、例えば30~60分間浸漬してもよく、その後に飼育槽に戻す。あるいは、飼育槽から移植対象の個体を少量の飼育水と共に処理槽に移してから、処理槽にプロバイオティクス細菌を投入してもよい。処理槽で処理するこれらの方法であれば、プロバイオティクス細菌液への浸漬が一時的であるので、例えば移植対象の個体の全数が浸漬する程度の量のプロバイオティクス細菌液があればよい。したがって、細菌濃度の高いプロバイオティクス細菌液を得るために、プロバイオティクス細菌を多量に培養しなくてよい。そして、細菌濃度の高いプロバイオティクス細菌液によって、短時間で効率的にプロバイオティクス細菌を取り込ませることができる。プロバイオティクス細菌液の細菌濃度は、0.5~2重量%が好ましい。なお、処理槽で処理した個体を飼育槽に戻す際に、プロバイオティクス細菌液を共に飼育槽に投入して希釈させてもよい。ここで、プロバイオティクス細菌について説明する。
プロバイオティクス細菌とは、一般的に、宿主に有用な腸内細菌で、主に、経口摂取によって腸内への移植が可能なものが称される。本発明におけるプロバイオティクス細菌は、肥育対象とする魚介類の食餌成分に対して高分解性を示し、この魚介類の腸内に存在可能かつ経口的に腸内に移植可能な細菌である。例えば、アワビ(クロアワビ、エゾアワビ、マダカアワビ、メガイアワビ、トコブシ等を指す)は、海藻を食餌とする。本明細書において、「海藻」とは、海産種群の藻類の総称を指し、褐藻類、紅藻類、および緑藻類が包含され、例えば、褐藻類として、アラメ、ガゴメコンブ等が、紅藻類として、キリンサイ、クロバラノリ(スサビノリ)、トサカノリ、オゴノリ等が、緑藻類として、ヒトエグサ(アオサ)等が、それぞれ挙げられる。そして、分解される海藻の成分とは、アガー、アルギン酸、フコイダイン、カラギーナン、ペクチン、およびキシランといった多糖類であり、プロバイオティクス細菌はこのうちの少なくとも1種、好ましくは2種以上を分解するものが適用される。なお、プロバイオティクス細菌は、異なる多糖類を分解するものを2種以上適用してもよいし、2種以上の多糖類を分解する1種を適用してもよい。
給餌工程S3は、肥育対象とする個体に、プロバイオティクス細菌を添加した餌を給餌して摂食させることによって、個体に口からプロバイオティクス細菌を腸内に取り込ませる。プロバイオティクス細菌を添加される餌としては、肥育対象とする魚介類用の市販の配合飼料を使用することができる。例えばアワビ用であれば、コンブ等の海藻の粉末および魚粉を主原料として、一辺が数~30mm程度の板状または直径が数~20mm程度の円盤状に加圧成形した配合飼料が市販されている。この配合飼料に、プロバイオティクス細菌を水または海水に懸濁させた液体を噴霧する等して内部に含浸させて、プロバイオティクス細菌含有飼料とする。あるいは、プロバイオティクス細菌含有飼料は、配合飼料の成形前の材料にプロバイオティクス細菌を混合してから成形して製造することもできる。プロバイオティクス細菌含有飼料は、細菌含有割合2~5重量%が好ましく、また、含水量が多いと崩壊し易いので、水分10重量%以下が好ましい。また、含水量や配合飼料におけるプロバイオティクス細菌に分解される成分の含有量等にもよるが、プロバイオティクス細菌含有飼料は、プロバイオティクス細菌によって分解されて崩壊が進行するため、プロバイオティクス細菌を含浸させたら速やかに、例えば24時間以内に給餌することが好ましい。あるいは、プロバイオティクス細菌含有飼料は、プロバイオティクス細菌の分解活性が低い低温で保管されることが好ましい。
腸内細菌減数処理工程S1は、肥育対象とする個体の腸内に存在している細菌を減数する工程であり、その後の細菌液処理工程S2または給餌工程S3で経口的に移植されるプロバイオティクス細菌が腸内に留まり易くするために実行される。腸内細菌減数処理工程S1は、処理対象の個体の飼育水中に、酸素を含有する気体を、直径1μm以下の気泡すなわちウルトラファインバブル(UFB)として供給することによって行うことができる。液中にウルトラファインバブルを供給するUFB発生装置は、市販されているものを使用することができる。ウルトラファインバブルを供給された飼育水(UFB水)は、魚介類の生息、成長に不適な環境とならないように、溶存酸素量(DO値)を処理前以上とし、処理前よりも多くすることが好ましく、飽和(平衡)状態とすることがさらに好ましい。魚介類がこのようなUFB水を取り込むと、腸内細菌を排出し易くなって細菌数が減少する。そのために、ウルトラファインバブルとする気体は、酸素を空気相当以上に含有する気体が好ましい。なお、空気を供給することもできるが、窒素を多く含有するので、過飽和に溶存させると、魚介類の種類や処理時間によっては窒素ガス病を発症する場合がある。これらのことから、酸素や空気中の酸素を高濃度化した(例えば約90%以上)気体を供給することが好ましい。例えば、酸素をウルトラファインバブルとして飼育水に供給した場合、酸素を供給され続けて飼育水のDO値が平衡に到達すると、酸素がウルトラファインバブルのまま飼育水中に存在する。このような飼育水(高酸素UFB水)に処理対象の個体が30分間以上浸漬されることが好ましい。処理時間が長くなると、UFB発生装置の運転時間が長くなって効率が低下するので、120分間以下が好ましく、60分間以下がより好ましい。
エゾアワビが食餌とする海藻に対して高分解性を示すプロバイオティクス細菌を特定、採取した。
北海道の噴火湾側の海岸(北海道虻田郡豊浦町)と日本海側の海岸とのそれぞれで捕獲した野生のエゾアワビ(Haliotis discus hannai)を、翌日に解剖して腸内容物を採取した。腸内容物をフィルター滅菌した人工海水(Instant Ocean、Aquarium Systems社)に懸濁させ、懸濁液をMarine Broth(Difco社)の1.5%寒天培地に画線塗布し、15℃、好気条件下で10日間培養した。培養後、寒天培地に複数のコロニーが形成され、噴火湾側のエゾアワビの腸内容物については、寒天上に生えるコロニーだけでなく、寒天を凹ませながら生育するコロニーが観察された。
これら8株について、アガー分解活性およびアルギン酸分解活性を測定した。
(1)酵素溶液の調製
単離した細菌をMarine Broth液体培地に懸濁して振とう培養(15℃、24h)し、遠心分離(2,800rpm、20分間、4℃)後の上澄み液をフィルター滅菌(DISMIC-25、0.45μm)して菌体外酵素を得た。
基質溶液に、0.25%のアガー(試薬特級、富士フイルム和光純薬)を含有する10mMリン酸緩衝液(pH6.8)を使用した。酵素液とリン酸緩衝液(pH6.8)とを混合した後、基質溶液を添加混合して、30℃で30分間反応させた。遠心分離(7000rpm、4℃、5分間)後の反応液上清にジニトロサリチル酸試薬を加え、100℃で5分間加熱した。氷冷後、吸光度を545nmで測定した。アガロース分解の生成物であるガラクトースを用いて検量線を作成し、ガラクトース生成量を酵素活性とした。
酵素液と0.1M Tris-HCl緩衝液(pH7.5)とを混合した後、1%(w/v)アルギン酸ナトリウム含有0.1M Tris-HClを添加混合して、30℃で30分間反応させた。遠心分離(8,000rpm、4℃、5分間)後の反応液上清の吸光度を235nmで測定した。酵素活性は、吸光度を1分間あたり0.01増加させる酵素活性を1Uと定義した。アルギン酸分解酵素活性測定については、Inoue A.et. al., “Characterization of an Alginate Lyase, FlAlyA, from Flavobacterium sp. Strain UMI-01 and Its Expression in Escherichia coli”, Marine Drugs, Volume 12, pp.4693-4712, August 2014 を参考にした。
Toyoura001株の、アガーおよびアルギン酸以外も含めた多糖類の分解活性について評価した。25℃で24時間、0.01%アガーおよび0.02%アルギン酸を含むMB培地で培養したToyoura001株を、アガー、アガロース、アルギン酸、フコイダン、κ-カラギーナン、λ-カラギーナン、ラミナラン、デンプン、ペクチン、キシラン、CMセルロース、イヌリン、プルラン、およびゲランガムをそれぞれ唯一の炭素源とする培地(L A Ensor, S K Stosz, R M Weiner, “Expression of multiple complex polysaccharide-degrading enzyme systems by marine bacterium strain 2-40”, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 23, Issue 2, pp. 123-126, August 1999に準拠)に接種して、25℃で48時間培養して濁度を比較した。なお、アガロースおよびκ-カラギーナンについては、培地がゲル化したため濁りを目視で確認した。結果を表1に示す。アガー、アガロース、アルギン酸、フコイダン、κ-カラギーナン、λ-カラギーナン、デンプン、ペクチン、キシラン、プルラン、ゲランガムにおいて菌の増殖が確認された。また、アガロースおよびκ-カラギーナンについては、ゲル化した培地の液状化も確認された。このことから、Toyoura001株がアガー、アルギン酸、フコイダン、カラギーナン、ペクチン、キシラン分解活性を有することが示された。
エゾアワビ、海水で飼育したメダカ(海水メダカ)、およびクルマエビについて、UFB処理による腸内細菌数への影響を調査した。エゾアワビは殻長約32mmのものを12個体、クルマエビは体重27gのものを16個体、メダカは体長約30mmのものを12個体、それぞれ準備した。
エゾアワビについて、本発明に係る魚介類養殖方法による成長速度への影響を、比較例と比較して調査した。
(供試体、飼料)
供試体として、公益社団法人北海道栽培漁業振興公社熊石事業所で約1年間飼育された殻長約32mmのエゾアワビを、約80個体ずつ実施例と比較例とに準備し、それぞれ100L水槽内の網かごで90日間飼育した。また、飼育水として、汲み上げた地下海水を使用し、水温20℃に調整した。飼料として、海藻由来材料を含有する9~12mmの板状の圧片に成形された市販のアワビ用配合飼料(あわび3号N、日本農産工業株式会社)を使用した。
プロバイオティクス細菌として、実施例1で野生のエゾアワビの腸内容物から採取、単離した206株(Toyoura001株)を使用した。プロバイオティクス細菌を、アガーおよびアルギン酸をそれぞれ添加したMarine Broth液体培地で培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、滅菌人工海水で洗浄した。調整した菌体を滅菌人工海水に懸濁し、スプレーボトルで市販のアワビ用配合飼料に噴霧し、細菌含有割合2重量%(アガー培地由来1重量%、アルギン酸培地由来1重量%)、水分10重量%のプロバイオティクス細菌含有飼料を得た。また、菌体を飼育海水に添加して、細菌濃度2重量%(アガー培地由来1重量%、アルギン酸培地由来1重量%)のプロバイオティクス細菌液を調整した。
腸内細菌減数処理工程は、試験開始時およびその後の約1月毎に実施した。飼育用の水槽とは別の水槽に飼育水を入れ、実施例2と同様に、水温20℃に調整して、ウルトラファインバブル発生装置を運転し、運転開始30分間経過後に、実施例のエゾアワビを網かごごと投入し、30分間浸漬した。同様に、比較例のエゾアワビについても、別の水槽で実施した。また、2回目以降(試験開始1月後以降)は、浸漬時間60分間とした。
実施例のエゾアワビについて、腸内細菌減数処理工程後に引き続いて、20℃のプロバイオティクス細菌液を入れた水槽に投入して、30分間浸漬した後、飼育用の水槽に戻した。比較例のエゾアワビについては、腸内細菌減数処理工程後は、そのまま飼育用の水槽に戻した。
試験期間中、2~5日間に1回、実施例のエゾアワビにプロバイオティクス細菌含有飼料を、比較例のエゾアワビに市販の配合飼料を、それぞれ給餌した。その際、残餌や斃死個体を除去した。
試験期間中、約1月毎に、実施例、比較例のエゾアワビ全個体の殻長を計測し、表2に平均値を示す。図9に平均殻長および生残率の推移を示す。また、表2に平均成長速度を示す。
90日間の飼育完了後、運動能力の評価として、各10個体を水槽の底に裏返して載置し、裏返し状態から反転して匍匐運動し始めるまでの時間を計測した。表2に平均値および標準偏差を示す。また、各5個体を解剖して腸を摘出し、腸管組織をHE(Hematoxylin-Eosin)染色して、顕微鏡により40倍で観察した。図10に、腸管組織の顕微鏡写真を示す。
S2 細菌液処理工程(移植工程)
S3 給餌工程(移植工程)
Claims (11)
- アガー、アルギン酸、フコイダイン、カラギーナン、ペクチン、およびキシランから選択される1種以上の成分を食餌成分に含む魚介類、または藻類を食餌とする魚介類の養殖方法であって、
前記成分に対して分解活性を有するプロバイオティクス細菌を、肥育対象とする個体の腸内に経口的に移植する移植工程を1回以上行い、
前記プロバイオティクス細菌が、アガリボランス(Agarivorans)属細菌を含むことを特徴とする魚介類養殖方法。 - 前記アガリボランス属細菌は、受託番号NITE BP-02802として寄託されたアガリボランス属細菌またはその変異株である請求項1に記載の魚介類養殖方法。
- 前記プロバイオティクス細菌は、前記魚介類の肥育対象とする個体よりも成長速度が速い個体から採取したものを培養したものである請求項1または請求項2に記載の魚介類養殖方法。
- 少なくとも1回の前記移植工程の前に、移植対象の個体の腸内細菌を減数する腸内細菌減数処理工程を行う請求項1乃至請求項3のいずれか一項に記載の魚介類養殖方法。
- 藻類を食餌とする魚介類の養殖方法であって、
アガー、アルギン酸、フコイダイン、カラギーナン、ペクチン、およびキシランの少なくとも1種に対して分解活性を有するプロバイオティクス細菌を、肥育対象とする個体の腸内に経口的に移植する移植工程を1回以上行い、
少なくとも1回の前記移植工程の前に、移植対象の個体の腸内細菌を減数する腸内細菌減数処理工程を行うことを特徴とする魚介類養殖方法。 - 肥育対象とする魚介類の個体の腸内に、前記個体よりも成長速度が速い個体の腸内細菌を経口的に移植する移植工程を1回以上行い、
少なくとも1回の前記移植工程の前に、移植対象の個体の腸内細菌を減数する腸内細菌減数処理工程を行うことを特徴とする魚介類養殖方法。 - 前記腸内細菌減数処理工程は、移植対象の個体の飼育水中に、酸素を含有する気体をウルトラファインバブルとして供給する請求項4乃至請求項6のいずれか一項に記載の魚介類養殖方法。
- 前記腸内細菌減数処理工程は、前記飼育水中に、酸素を含有する気体をウルトラファインバブルとして供給した後に、前記個体を浸漬する請求項7に記載の魚介類養殖方法。
- 前記魚介類は、アワビおよびサザエを含む巻貝、ウニ、またはナマコである請求項1乃至請求項8のいずれか一項に記載の魚介類養殖方法。
- アガー、アルギン酸、フコイダイン、カラギーナン、ペクチン、およびキシランから選択される1種以上の成分を食餌成分に含む魚介類、または藻類を食餌とする魚介類の飼育水に、前記成分に対して分解活性を有するプロバイオティクス細菌を添加したプロバイオティクス細菌液であって、
前記プロバイオティクス細菌が、アガリボランス(Agarivorans)属細菌を含むプロバイオティクス細菌液。 - アガー、アルギン酸、フコイダイン、カラギーナン、ペクチン、およびキシランから選択される1種以上の成分を食餌成分に含む魚介類、または藻類を食餌とする魚介類を給餌対象とし、前記成分に対して分解活性を有するプロバイオティクス細菌を配合したプロバイオティクス細菌含有飼料であって、
前記プロバイオティクス細菌が、アガリボランス(Agarivorans)属細菌を含むプロバイオティクス細菌含有飼料。
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Patent Citations (8)
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