WO2011075862A1 - Alimento que contiene macroalgas y bacterias probioticas, util para el desarrollo y supervivencia del abalon. - Google Patents

Alimento que contiene macroalgas y bacterias probioticas, util para el desarrollo y supervivencia del abalon. Download PDF

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macroalgae
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Fernando Rodrigo Silva Aciares
Carlos Eduardo Riquelme Salamanca
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    • C12R2001/63—Vibrio

Definitions

  • the present invention comprises a food for molluscs based on macroalgae previously colonized with one or a mixture of probiotic bacteria that allow to improve the growth and survival of juveniles and adults of abalone.
  • the present invention also contemplates the process of obtaining and using said food.
  • the abalon is a mollusk of great importance for the economy of many countries, which have been adapting the technology according to their geographical situation as well as economic and material characteristics available in the area, resulting in diverse cultivation systems (Viana, 2002 ). Most of these crops use natural foods such as macroalgae, which are not always available or cover their nutritional requirements, since for optimal growth, larger amounts of protein are required than those found in them (Mai et al., nineteen ninety five).
  • the abalón is a mollusk that has a very efficient digestive system for the degradation of polysaccharides, proteins and lipids, also with the help of digestive bacteria with exoenzymatic activity. (Viana, 2002).
  • One of the requirements that the abalone diet must meet is maximum digestibility (part of the food that is absorbed by the animal, minus the part lost in the process of ingestion and digestion), so that its basal energy requirements are met and this requirement is one of the challenges for the aquaculture industry today.
  • Studies of enzymatic activity in postlarva to juvenile abalone states show that the dramatic increase in enzyme activity is similar to the pattern detected for the growth rate which is also increased from day 37 after metamorphosis (Takami & Kawamura, 2003).
  • Figure 1 Inhibitory activity (Translucent zone around the central macrocolony-Gray dashed arrow) of the Vibrio sp C21 UMA (continuous black arrow) bacterium against the growth of a mixture of pathogenic bacteria Vibrio alginolyticus and Vibrio parahaemolyticus (Black chopped arrow).
  • Figure 2 Evaluation of different culture media of total heterotrophic bacteria in the growth of the selected bacteria F15 UMA, C21 UMA and Fl UMA at incubation times of 24, 48 and 72 h at an initial inoculum concentration of 1 x 10 5 cells x mL '1 , at pH 7. The bars represent the average of 3 replicates and the vertical lines represent the standard deviation.
  • Figure 3 Evaluation of different pH and incubation temperatures in the growth of the selected bacteria F15 UMA, C21 UMA and Fl UMA in general culture medium of heterotrophic bacteria Tryptone Soya Broth (TSB) supplemented with 2% NaCl at 48 h and at a concentration of initial inoculum of 1 x 10 5 cells x mL '1 . The bars represent the average of 3 replicas and the vertical lines represent the standard deviation.
  • TTB Tryptone Soya Broth
  • FIG. 4 Evaluation of different dilutions of the culture medium of heterotrophic bacteria Tryptone Soya Broth (TSB) supplemented with 2% NaCl in the growth of the selected bacteria F15 UMA, C21 UMA and Fl UMA at 48 h of incubation, with a concentration of initial inoculum of 1 x 10 5 cells x mL "1 , pH 6.5 and 25 ° C.
  • the bars represent the average of 3 replicates and the vertical lines represent the standard deviation.
  • Figure 9 Effect of the mixture of probiotic bacteria (Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans albus Fl UMA and Vibrio sp F15 UMA) in the length mm (A), Weight g (B) and survival% (C) of H. rufescens post weaned, 210 days fed a diet supplemented with or without probiotics in a commercial crop. The values on the bar represents the average of three replicas.
  • Ct Control treatment without bacterial
  • the present invention comprises a food for abalones, in its preferred modality for Haliotis rufescens abalone, based on macroalgae previously colonized with one or a mixture of probiotic bacteria that allow to improve the growth and survival of juveniles and adults of this organism, the procedure of obtaining and use of said food.
  • the objective is achieved by periodically providing as feed the abalone of one or a mixture of pre-colonized macroalgae with one or a combination of one to three artificially cultivated probiotic bacteria which are subsequently applied and adhered to the surface.
  • macroalgal in ponds with previously disinfected and neutralized seawater.
  • this product comprises one or more of the following probiotic bacteria: marine bacteria with exo-enzymatic activity against carbohydrates, proteins and common lipids of abalon diets and a marine bacterium with proven inhibitory activity against Vibrio parahaemolyticus and Vibrio alginolyticus (pathogenic bacteria of mollusk culture).
  • said probiotic bacteria can be of the Agarivorans and Vibrio genera.
  • said probiotic bacteria can be Vibrio sp called C21 UMA, Agrivorans albus, called Fl UMA and Vibrio sp, called F15 UMA. These bacteria have been deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), under deposit numbers 7652, 7651, and 7653 respectively.
  • CECT Spanish Type Culture Collection
  • the present invention includes formulations or products that comprise one or a mixture of the probiotic bacteria mentioned in the preceding paragraph and which is used for the generation of abalone feed.
  • said culture media can be Tryptone Soya Agar (TSA Oxoid) supplemented with 2% NaCl or in plates with Marine Agar (Difco) and subsequently harvested and resuspended in sterile sea water and then this bacterial solution be incorporated in a range of concentration of 1 x 10 4 to 1 x 10 6 cells x mL "1 , an inoculum being more preferable at a concentration of 1 x 10 5 cells x mL " 1 in general culture medium of bacteria, within which they can be used : Marine Broth 2216 (MB, Difco TM), Triptone Soy Broth (TSB) supplemented with 2% NaCl, Laura Bertani Medium (LB) supplemented with 2% NaCl and ST-10 Medium supplemented
  • the present invention is related to the application and colonization of said bacterial cultures mentioned above on the surface of macroalgae that can be of the genera Macrocystis, Lessonia, Gracilaria, Ulva, Palmaria, laminaria and other macroalgae used as food for abalon, as an entry vector for these probiotic bacteria in the abalon's diet, the colonization of said bacterial cultures can be carried out in ponds of any type, with filtered seawater, disinfected with chlorine and neutralized with sodium thiosulfate in a regimen of constant aeration
  • the macroalgae are washed and distributed in ponds with sea water (sw) previously sterilized and neutralized with sodium thiosulfate (0.075 g / Lt Sw) for a period of 12 to 24 hours.
  • one or all three probiotic bacteria at a concentration range from 1 x 10 6 to 1 x 10 8 cells x mL "1 are incorporated individually into these ponds with constant aeration, in a preferred embodiment, 1 x 10 7 x cells mL "1 from pre-stationary phase cultures, where the bacterial mixture can contain between 1% and 99% of each of the probiotics.
  • these probiotics are incorporated into the ponds, they are left incubating at room temperature for a period of 24 to 72 hours to obtain bacterial colonization in the macroalgae, in their preferred modality, this procedure can be performed two to three times per week with fresh macroalgae.
  • the present invention is related to the feeding of the abalons of different culture sizes (from pro-weaning sizes) with the pre-colonized macroalgae with the bacteria described above, to improve the survival and growth of this culture organism.
  • probiotic refers to bacterial strains that when used or inoculated as a supplement to the abalon's natural food (macroalgae), they increase the growth and survival of these culture organisms, either by an improvement in the digestibility of the food, as well as in a prevention of diseases of bacterial origin.
  • the process of the invention comprises the following steps:
  • A. PREPARATION OF PROBIOTIC BACTERIA (Illustrated from Figures 2 to 4) The bacteria Vibrio sp (C21 UMA), Agarivorans albus (Fl UMA) and Vibrio sp (F15 UMA) were seeded on plates with supplemented Tryptone Soya Agar (TSA Oxoid) with 2% NaCl or in Zobell Marine Agar (Difco) for 24 to 72 hours at an incubation temperature of 18 ° C to 25 ° C. These bacteria were subsequently fully extracted aseptically and resuspended in seawater previously sterilized at 121 ° C for 15 minutes.
  • TSA Oxoid Tryptone Soya Agar
  • Difco Zobell Marine Agar
  • this solution comprised between 1 x 10 4 to 1 x 10 6 cells x mL "1 , with an inoculum being more preferable at a concentration of 1 x 10 5 cells x mL " 1
  • general bacteria culture medium such as: Zobell Marine Broth 2216 (MB, Difco TM), Triptone Soy Broth (TSB) supplemented with 2% NaCl, Laura Bertani Medium (LB) supplemented with 2% NaCl and ST-10 Medium supplemented with 2% NaCl and subsequently grown for a period of 24 to 72 hours, with an incubation period of 48 hours being preferable (FIG. 2).
  • Algae fronds that can be of the genera Macrocystis, Lessonia, Gracilaria, Ulva, Palmaria, laminaria and other macroalgae used as abalone food, were washed with drinking water and distributed in ponds, with seawater (Sw) previously filtered in a range of 1 to 100 ⁇ and disinfected with chlorine (0.025 g / Lt Sw) for a time range of 12 to 24 hours and neutralized with sodium thiosulfate (0.075 g / Lt Sw) for a period of 12 to 24 hours.
  • probiotic bacteria were incorporated individually into these ponds with constant aeration at a concentration range from 1 x 10 6 to 8 cells x mL '1 , the optimum concentration being 1 x 10 7 cells x mL " 1 from pre-stationary phase cultures, grown in the above-mentioned culture media mentioned in letter A, where the bacterial mixture may contain between 1% and 99% of each of the probiotics, after which these probiotics are incorporated into the ponds were left incubating at room temperature for a period of 24 to 72 hours to obtain bacterial colonization in the macroalgae (FIG. 5 and 6) This procedure can be performed two to three times a week with fresh macroalgae.
  • the tanks with the bacterial load water present were chlorinated (0.025 g / Lt Sw) for a period of 2 to 4 hours, and subsequently neutralized (0.075 g / Lt Sw) with sodium thiosulfate for a period also of 2 to 4 hours. This procedure is performed in order to disinfect water with bacterial load before being discarded.
  • abalones were conditioned for a period of 1 to 2 weeks and fed with macroalgae that can be of the genera Macrocystis, Lessonia and Gracilaria, among others. After this preconditioning period the animals were fed with the macroalgae previously colonized with the probiotic bacteria according to the methodology described in letter B, in a percentage that varies from 10 to 25% of the body weight of the abalon in a frequency of 2 to 3 times per week Unconsumed food was removed from the pond the day after it was incorporated. The duration of the experience was 30 days, period in which the effect of the selected bacteria on the length (mm), weight (gr) and survival of the abalone was determined preliminary according to treatment.
  • Pro-weaning juvenile abalone of approximately 15-20 mm initial shell length were maintained in 65.48 liter ponds with a continuous flow of 3 refills per hour of filtered seawater at 1-0.5 ⁇ with a temperature of 16 ° C to 20 ° C and continuous air supply.
  • Acetic acid production of Vibrio halioticoli from alginate a possible role for establishment of abalone- V. halioticoli association. Aquaculture 219, 671-679.

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Abstract

Alimento para abalón que comprende una mezcla de especies de macroalgas pre-colonizadas con una o una mezcla de especies de bacterias probióticas. Formulación o producto que comprende la mezcla de bacterias probióticas. Método para preparar el inoculo de bacterias que contiene dicho alimento. Método para producir dicho alimento para abalón.

Description

ALIMENTO QUE CONTIENE MACROALGAS Y BACTERIAS PROBIOTICAS, UTIL PARA EL DESARROLLO Y SUPERVIVENCIA DEL ABALON.
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención comprende un alimento para moluscos en base a macroalgas previamente colonizadas con una o una mezcla de bacterias probióticas que permiten mejorar el crecimiento y sobrevivencia de juveniles y adultos de abalon. La presente invención contempla también el procedimiento de obtención y uso de dicho alimento.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
El abalon es un molusco de gran importancia para la economía de muchos países, los cuales han ido adaptando la tecnología de acuerdo a su situación geográfica así como características económicas y materiales disponibles en el área, dando por resultados diversos sistemas de cultivo (Viana, 2002). La mayoría de estos cultivos utilizan alimentos naturales como macroalgas, las cuales no siempre se encuentran disponibles o cubren sus requerimientos nutricionales, ya que para un óptimo crecimiento se requiere de cantidades de proteínas mayores a las que se encuentran en ellas (Mai et al., 1995).
El abalón es un molusco que posee un sistema digestivo muy eficiente para la degradación de polisacáridos, proteínas y lípidos, contando además con la ayuda de bacterias digestivas con actividad exoenzimática. (Viana, 2002). Uno de los requisitos que debe cumplir la dieta del abalón, es una máxima digestibilidad (parte del alimento que es absorbido por el animal, menos la parte perdida en el proceso de ingestión y digestión), de manera que se cubran sus requerimientos de energía basal y este requisito es uno de los desafíos para la industria acuícola en la actualidad. Estudios de la actividad enzimática en estados de postlarvas a juveniles de abalón demuestran que el drástico incremento en la actividad enzimática es similar al patrón detectado para la tasa de crecimiento la cual se incrementa también a partir del día 37 después de la metamorfosis (Takami & Kawamura, 2003). En diferentes estudios se revela la clara dependencia de la actividad de las enzimas digestivas polisacarolíticas, proteolíticas y lipolíticas y de bacterias con actividad exoenzimática, para la mejora de la digestibilidad de microalgas y macroalgas (Erasmus et al., 1997; Sawabe et al., 2003; Macey & Coney., 2005; Daume, 2006), la cual mejora considerablemente la tasa de crecimiento del abalon.
El uso de bacterias inhibitorias de microorganismos patógenos para la prevención de enfermedades y el mejoramiento de la nutrición en la acuicultura se esta volviendo una necesidad debido al incremento de la demanda por acuicultura amigable con el medioambiente. El rango de probióticos examinados en la acuicultura va desde bacterias Gram negativa, Gram positivas, bacteriófagos, levaduras y algas unicelulares. Recientemente se han intensificado los estudios tendientes al aislamiento de bacterias probioticas en el cultivo de especies marinas comercialmente valiosas (Macey & Coyne, 2006; Ten Doeschate & Coyne, 2008). En este contexto diversas publicaciones han descrito la utilización de estos microorganismos en el cultivo de peces (Gram et al., 1999; Robertson et al., 2000; Olafsen et al., 2001), crustáceos (Rengpipat et al., 2000; Gullian et al., 2004) y moluscos (Riquelme et al., 2000; Riquelme et al, 2001; Macey & Coyne, 2005; 2006). De esta manera, se ha demostrado que los probióticos son efectivos en un rango amplio de especies marinas para la promoción del crecimiento, mejoramiento de la nutrición, inmunidad y sobrevivencia. Varios mecanismos de acción de las bacterias benéficas han sido propuestas, las que incluyen la exclusión competitiva de bacterias patógenas, producción de sustancias que previenen el crecimiento de bacterias patógenas, provisión de nutrientes esenciales y producción de exoenzimas digestivas que tienen la capacidad de mejorar el crecimiento y de estimular el sistema inmunológico del organismo de cultivo. Estos antecedentes demuestran el efecto inmunoestimulatorio de probióticos incluidos en las dietas de abalón, resultando en un incremento en la sobrevivencia seguido por cambios con la bacteria patógena Vibrio anguillarum (Macey & Coyne, 2005). Una similar respuesta fue reportada en el abalón Haliotis tuburculata (Mahlham et al., 2003). Estos estudios indican que existe una fuerte relación entre el stress y el status del sistema inmune y sugieren que la inmunoestimulación podría mejorar la capacidad de los animales para responder a las infecciones más rápidamente que los animales que no están inmunoestimulados.
Uno de los principales desafíos en el desarrollo y uso de bacterias probióticas en el cultivo del abalon es seleccionar un adecuado método de colonización bacteriana efectiva y económicamente viable. Hasta el momento, se han realizado estudios de colonización de bacterias probióticas en el abalon a través del uso de pellet a base de macroalgas secas o pellet comerciales como vector de ingreso de estas bacterias en el tracto digestivo del organismo (Macey and Coyne 2005; 2006; ten Doeschate and Coyne, 2008; Iehata et al., 2009) que son en la actualidad métodos aun económicamente inviables en cultivos masivos de este molusco. Sin embargo, no existen reportes de la utilización de macroalgas frescas como vector de ingreso de bacterias probióticas en el tracto digestivo del abalon para mejora su sobrevivencia y crecimiento.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Actividad inhibitoria (Zona traslucida alrededor de la macrocolonia central-Flecha entrecortada gris) de la bacteria Vibrio sp C21 UMA (Flecha negra continua) contra el crecimiento de un mix de bacterias patógenas Vibrio alginolyticus y Vibrio parahaemolyticus (Flecha negra entrecortada).
Figura 2. Evaluación de diferentes medios de cultivo de bacterias heterótrofas totales en el crecimiento de las bacterias seleccionadas F15 UMA, C21 UMA y Fl UMA a tiempos de incubación de 24, 48 y 72 h a una concentración de inoculo inicial de 1 x 105 células x mL'1, a pH 7. Los barras representan el promedio de 3 replicas y las líneas verticales representan la desviación estándar. Figura 3. Evaluación de diferentes pH y temperaturas de incubación en el crecimiento de las bacterias seleccionadas F15 UMA, C21 UMA y Fl UMA en medio de cultivo general de bacterias heterótrofas Tryptone Soya Broth (TSB) suplementado con 2% NaCl a 48 h y a una concentración de inoculo inicial de 1 x 105 células x mL'1. Los barras representan el promedio de 3 replicas y las líneas verticales representan la desviación estándar.
Figura 4. Evaluación de diferentes diluciones del medio de cultivo de bacterias heterótrofas Tryptone Soya Broth (TSB) suplementado con 2% NaCl en el crecimiento de las bacterias seleccionadas F15 UMA, C21 UMA Y Fl UMA a 48 h de incubación, con una concentración de inoculo inicial de 1 x 105 células x mL"1, pH 6,5 y 25°C. Los barras representan el promedio de 3 replicas y las líneas verticales representan la desviación estándar.
Figura 5. Colonización bacteriana de Vibrio sp Al 5 UMA, Bacillus sp B9 UMA, Bacillus pumilus B18 UMA, Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans sp D23 UMA, Agarivorans albus Fl UMA y Vibrio sp F15 UMA (CFU x cm"2) en la macroalga Macrocystis integrifolia con respecto al número total de bacterias heterótrofas (total) a las 48 y 72 horas después de la incorporación de bacterias seleccionadas. Ct= Tratamiento control sin adición bacteriana. T= Tratamientos.Líneas verticales representan la desviación estándar. CFU= Unidad formadora de colonias.
Figura 6. Colonización bacteriana de una mezcla de probioticos Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans albus Fl UMA y Vibrio sp F15 UMA (CFU x cm" )en la macroalga Macrocystis integrifolia con respecto al número total de bacterias heterótrofas (total) a las 24 y 48 horas después de la incorporación de las bacterias seleccionadas en dos cultivos comerciales. Ct= Tratamiento control sin adición bacteriana. T= Tratamientos. Líneas verticales representan la desviación estándar. CFU= Unidad formadora de colonias
Figura 7. Experimento preliminar del efecto de bacterias seleccionadas Vibrio sp Al 5 UMA, Bacillus sp B9 UMA, Bacillus pumilus B18 UMA, Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans sp D23 UMA, Agarivorans albus Fl UMA y Vibrio sp F15 UMA) en la longitud mm (A), Peso g (B) y sobrevivencia % (C) de H. rufescens a los 30 días de alimentados con y sin una dieta suplementada con bacterias seleccionadas. Los valores sobre la barra representa la media de tres replicas. Ct= Tratamiento control sin adición bacteriana. Líneas verticales representan la desviación estándar.
Figura 8. Efecto de la mezcla de bacterias probioticas (Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans albus Fl UMA y Vibrio sp F15 UMA) en la longitud mm (A), Peso g (B) y sobrevivencia % (C) de H. rufescens post destetados, 210 días alimentado con una dieta suplementada con o sin probioticos en un cultivo comercial. Los valores sobre la barra representa la media de tres replicas. Ct= Tratamiento control sin adición bacteriana. Líneas verticales representan la desviación estándar. Figura 9. Efecto de una mezcla de bacterias probioticas (Vibrio sp C21 UMA, Agarivorans albus Fl UMA and Vibrio sp F15 UMA) en la longitud mm (A), Peso g (B) y sobrevivencia % (C) de adultos de H. rufescens a los 210 días de alimentado con o sin una dieta suplementada con probioticos en un hatchery comercial. Los valores sobre las barras representan la media de tres replicas. Ct= tratamiento control sin adición bacteriana. Líneas verticales representan la desviación estandard.
Tabla 1. Actividad de enzimas extracelulares (U/mL) y especificidad a sustratos específicos de polisacarasas (Agarosa, alginato, carragenano, carboxymethylcelulosa CMC and laminarina), lipasas (Tween 80) and proteasas (Caseína) de bacterias seleccionadas aisladas desde el cultivo de H. rufescens. Todos los datos presentados son la media ± desviación estándar.
Tabla 2. Crecimiento mensual de abalones Post-destetados (15-20 mm de talla inicial) alimentados con macroalgas con y sin precolonización de bacterias probioticas a los 210 días de cultivo. Los valores indican la media ± Desviación Standard
Diferentes números de (*), ) Ύ ( ) indican que existen diferencias significativas (ANO VA, test LSD, P .=0,O5) entre los datos obtenidos de abalones alimentados con la dieta control (Dieta macroalga) y la dieta probiotica (Dieta macroalga + Probioticos). Tabla 3. Crecimiento mensual de abalones adultos (talla inicial 36 mm) alimentados con macroalgas con y sin precolonización de bacterias probióticas a los 210 días de cultivo. Los valores indican la media ± Desviación Standard.
Diferentes números de (*), (*) y ( ) indican que existen diferencias significativas (ANOVA, test LSD, P_á),05) entre los datos obtenidos de abalones alimentados con la dieta control (Dieta macroalga) y la dieta probiotica (Dieta macroalga + Probioticos).
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención comprende un alimento para abalones, en su modalidad preferida para abalones Haliotis rufescens, en base a macroalgas previamente colonizadas con una o una mezcla de bacterias probióticas que permiten mejorar el crecimiento y sobrevivencia de juveniles y adultos de este organismo, el procedimiento de obtención y uso de dicho alimento.
Mediante el procedimiento de la invención se alcanzan significantes mejoras en la tasa de crecimiento (largo, ancho y peso) y porcentaje (%) de sobrevivencia de abalones de diferentes tallas de cultivo, incluyendo los recientemente destetados, a través del uso de macroalgas previamente colonizadas con bacterias probióticas, permitiendo de esta forma asegurar una buena productividad en términos de biomasa y sobrevivencia para los cultivos comerciales de esta especie, además de ser inocuo para el medio ambiente. Por otro lado se describe el método de colonización de las bacterias probióticas en la superficie de las macroalgas.
De acuerdo a la invención el objetivo es logrado al proveer periódicamente como alimento a los abalones de una o una mezcla de macroalgas pre-colonizadas con una o una combinación de una a tres bacterias probióticas cultivadas artificialmente las cuales posteriormente son aplicadas y adheridas en la superficie macroalgal en estanques con agua de mar previamente desinfectada y neutralizada.
En una preferente comprensión la presente invención, esta comprende una mezcla de probioticos aplicable al cultivo del abalon, de preferencia del abalón H. rufescens, para mejorar el crecimiento y sobrevivencia de este organismo de cultivo, en donde este producto en su conjunto comprende una o varias de las siguientes bacterias probióticas: bacterias marinas con actividad exo-enzimático contra carbohidratos, proteínas y lípidos comunes de dietas de abalon y una bacteria marina con comprobada actividad inhibidora contra Vibrio parahaemolyticus y Vibrio alginolyticus (bacterias patógenas de cultivo de moluscos). En su modalidad preferida, dichas bacterias probióticas pueden ser de los géneros Agarivorans y Vibrio. En otra modalidad preferida, dichas bacterias probióticas pueden ser Vibrio sp llamada C21 UMA, Agrivorans albus, llamada Fl UMA y Vibrio sp, llamada F15 UMA. Dichas bacterias han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), bajo los números de depósito 7652, 7651, y 7653 respectivamente.
La presente invención incluye formulaciones o productos que comprenden una o una mezcla de las bacterias probióticas mencionadas en el párrafo anterior y que es empleado para la generación de alimento para abalones.
En una adicional comprensión la presente invención, esta relacionada a la obtención de los inóculos de las bacterias probióticas en donde estas son crecidas en una primera etapa en placas con medio de cultivo comúnmente descritos en el estado del arte para dichos fines, en su modalidad preferida, dichos medios de cultivo pueden ser Tryptone Soya Agar (TSA Oxoid) suplementada con 2% de NaCl o en placas con Marine Agar (Difco) y posteriormente cosechadas y resuspendida en agua de mar estéril para luego esta solución bacteriana ser incorporada en un rango de concentración de 1 x 104 a 1 x 106 células x mL"1, siendo mas preferible un inoculo a una concentración de 1 x 105 células x mL"1 en medio de cultivo general de bacterias, dentro de las cuales se pueden usar: Marine Broth 2216 (MB, Difco™), Triptone Soya Broth (TSB) suplementada con 2% NaCl, Medio Laura Bertani (LB) suplementada con 2% NaCl y Medio ST-10 suplementada con 2% NaCl. Además dichas bacterias pueden ser crecidas en diluciones de los medios de cultivo anteriormente mencionados desde 1/1 a 1/25 sin una reducción significativa de su producción. El volumen de cultivo de estas bacterias no es limitativo.
Para una adicional comprensión, la presente invención esta relacionada a la aplicación y colonización de dichos cultivos bacterianos mencionados anteriormente en la superficie de macroalgas que pueden ser de los géneros Macrocystis, Lessonia, Gracilaria, Ulva, Palmaria, laminaria y otras macroalgas utilizadas como alimento de abalon, como vector de ingreso de estas bacterias probióticas en la dieta del abalon, la colonización de dichos cultivos bacterianos puede ser realizada en estanques de cualquier tipo, con agua de mar filtrada, desinfectada con cloro y neutralizada con tiosulfato de sodio en un régimen de aireación constante. En una modalidad más preferente, las macroalgas son lavadas y distribuidas en estanques con agua de mar (sw) previamente esterilizada y neutralizada con tiosulfato de sodio (0,075 g/Lt Sw) por un periodo de 12 a 24 horas. Posteriormente son incorporadas individualmente en estos estanques con aireación constante, una o las tres bacterias probióticas a un rango de concentración comprendida desde 1 x 106 a 1 x 108 células x mL"1, en una modalidad preferida, 1 x 107 células x mL"1 provenientes de cultivos en fase pre-estacionaria, en donde la mezcla bacteriana puede contener entre 1% hasta 99% de cada uno de los probióticos. Posteriormente, una vez incorporado estos probióticos en los estanques, se deja incubando a temperatura ambiente por un período comprendido de 24 a 72 horas para obtener la colonización bacteriana en las macroalgas, en su modalidad preferida, este procedimiento se puede realizar de dos a tres veces por semana con macroalgas frescas.
Para una adicional comprensión, la presente invención esta relacionada a la alimentación de los abalones de diferentes tallas de cultivo (desde tallas pro-destete) con las macroalgas precolonizadas con las bacterias descritas anteriormente, para mejorar la sobrevivencia y crecimiento de este organismo de cultivo.
El término "probiotico" o "bacterias probióticas" se refieren a las cepas bacterianas que cuando son usadas o inoculadas como suplemento del alimento natural (macroalgas) del abalon, aumentan el crecimiento y sobrevivencia de estos organismos de cultivo, ya sea por una mejora en la digestibilidad del alimento, como también en una prevención de enfermedades de origen bacteriano.
Los siguientes protocolos experimentales describen las consideraciones preferidas y no se deben considerar como limitación del alcance de la actual invención.
EJEMPLOS
Los siguientes protocolos experimentales describen las consideraciones preferidas y no se deben considerar como limitación del alcance de la actual invención.
El procedimiento de la invención comprende las siguientes etapas:
A. PREPARACIÓN DE LAS BACTERIAS PROBIÓTICAS (Ilustrada desde Figuras 2 a 4) Las bacterias Vibrio sp (C21 UMA), Agarivorans albus (Fl UMA) y Vibrio sp (F15 UMA) fueron sembradas en placas con Tryptone Soya Agar (TSA Oxoid) suplementada con 2% de NaCl o en Zobell Marine Agar (Difco) de 24 a 72 horas a una temperatura de incubación de 18°C a 25°C. Estas bacterias posteriormente fueron totalmente extraídas de forma aséptica y resuspendida en agua de mar previamente esterilizada a 121°C por 15 minutos. Luego una concentración de esta solución comprendida entre 1 x 104 a 1 x 106 células x mL"1, siendo mas preferible un inoculo a una concentración de 1 x 105 células x mL"1 fueron incorporadas en medio de cultivo general de bacterias como lo son: Zobell Marine Broth 2216 (MB, Difco™), Triptone Soya Broth (TSB) suplementada con 2% NaCl, Medio Laura Bertani (LB) suplementada con 2% NaCl y Medio ST-10 suplementada con 2% NaCl y posteriormente crecidas por un periodo de 24 a 72 horas, siendo preferible un periodo de incubación de 48 horas (FIG. 2). Estas bacterias tienen la capacidad de crecer en un amplio margen de pH comprendidos de 6 a 9, siendo su óptimo crecimiento a un pH de 7,5 y un margen de temperatura de 18°C a 30°C, siendo su óptimo a 25°C (FIG. 3). Además se determinó que estas bacterias pueden ser crecidas en diluciones de los medios de cultivo anteriormente mencionados desde 1/1 a 1/25 sin una reducción significativa de su producción (FIG. 4).
B. COLONIZACIÓN DE BACTERIAS PROBIOTICAS EN MACROALGAS (Ilustrada en Figura 5 y 6).
Frondas de algas que pueden ser de los géneros Macrocystis, Lessonia, Gracilaria, Ulva, Palmaria, laminaria y otras macroalgas utilizadas como alimento de abalon, se lavaron con agua potable y se distribuyen en estanques, con agua de mar (Sw) previamente filtrada en un rango de 1 a 100 μιη y desinfectada con cloro (0,025 g/Lt Sw) por un rango de tiempo de 12 a 24 horas y neutralizada con tiosulfato de sodio (0,075 g/Lt Sw) por un periodo de 12 a 24 horas. Posteriormente se incorporaron individualmente en estos estanques con aireación constante, una o las tres bacterias probióticas a un rango de concentración comprendida desde 1 x 10 6 a l x lO 8 células x mL'1, siendo la concentración óptima de 1 x 107 células x mL"1 provenientes de cultivos en fase pre-estacionaria, cultivadas en los medios de cultivo anteriormente mencionados en la letra A, en donde la mezcla bacteriana puede contener entre 1% hasta 99% de cada uno de los probióticas. Posteriormente una vez incorporado estos probióticos en los estanques, se dejó incubando a temperatura ambiente por un período comprendido de 24 a 72 horas para obtener la colonización bacteriana en las macroalgas (FIG. 5 y 6). Este procedimiento se puede realizar de dos a tres veces por semana con macroalgas frescas.
Una vez retirada la macroalga inoculada con bacterias, los estanques con el agua presente de carga bacteriana fueron clorados (0,025 g/Lt Sw) por un periodo de 2 a 4 horas, y posteriormente neutralizado (0,075 g/Lt Sw) con tiosulfato de sodio por un periodo también de 2 a 4 horas. Este procedimiento se realiza con el fin de desinfectar el agua con carga bacteriana antes de ser desechada.
C. ALIMENTACIÓN DE JUVENILES POST-DESTETE DE H. RUFESCENS CON MACROALGAS COLONIZADAS CON BACTERIAS PROBIOTICAS Y SU EFECTO EN EL CRECIMENTO Y SOBREVIVENCIA EN BIOENSAYOS A CORTO PLAZO A NIVEL DE LABORATORIO (Ilustrada en Figura 7).
Abalones de tallas recién destetadas de aproximadamente 15-20 mm de longitud inicial de concha fueron mantenidos en estanques de cultivos con un flujo continuo de 3 a 4 recambios por hora de agua de mar (Sw) filtrada a 1-10 μιη con una temperatura de 15°C a 20°C y suministro de aire continuo.El volumen de estos estanques no es limitativo.
Estos abalones fueron acondicionados por un período de 1 a 2 semanas y alimentados con macroalgas que pueden ser de los géneros Macrocystis, Lessonia y Gracilaria, entre otras. Posteriormente a este período de preacondicionamiento los animales fueron alimentados con las macroalgas previamente colonizadas con las bacterias probióticas según metodología descrita en la letra B, en un porcentaje que varia desde un 10 a 25% del peso corporal del abalon en una frecuencia de 2 a 3 veces por semana. El alimento no consumido se elimino del estanque al día siguiente de la incorporación de este. La duración de la experiencia fue de 30 días, período en el cual se determinó preliminarmente el efecto de las bacterias seleccionadas en el Largo (mm), peso (gr) y sobrevivencia de los abalones según tratamiento.
Los resultados revelaron un mayor crecimiento estadísticamente significativo (P<0,05) comparado al control a los 30 días (Fig. 7A), de los tratamientos con las bacterias Agarivoras albus Fl UMA (26,3 mm), Vibrio sp F15 UMA (26,2 mm) y Vibrio sp C21 UMA (25,9 mm) lo que equivale a un porcentaje de mejora de un 9,9%, 9,5% y 8,5%, respectivamente. Para los tratamientos con las cepas Bacillus sp B9 UMA y Bacillus pumilus B18 UMA no hubo diferencias significativas (P>0,05) en el crecimiento con respecto al control. Sin embargo, los tratamientos con las bacterias Agarivorans sp D23 UMA y Vibrio sp Al 5 UMA mostraron un efecto negativo significativo (P>0,05) en el crecimiento de juveniles de H. rufescens de 14,7% y 15,2%, respectivamente, comparado al control.
Con respecto al peso (g) (fig. 7B), los resultados a los 30 días revelaron la misma tendencia obtenida con el tamaño de los abalones, mostrando que con los tratamientos con las bacterias Agarivoras albus Fl UMA (2,23 g), Vibrio sp Y\5 UMA (2,23 g) y Vibrio sp C21 UMA (2,21 g) se obtuvo un mayor crecimiento significativo (P<0,05) lo que equivale a un porcentaje de mejora de un 21%, 21% y 17,3%, respectivamente. Para los tratamientos con las cepas Bacillus sp B9 UMA y Bacillus pumilus B18 UMA no hubo diferencias significativas (P>0,05) en peso con respecto al control. Por otro lado, los tratamientos con las bacterias Agarivorans sp D23 UMA y Vibrio sp Al 5 UMA mostraron un efecto negativo significativo (P>0,05) en el peso de los abalones de 14,7% para los dos tratamientos, comparado al control.
Los abalones alimentados con la dieta suplementada con las bacterias seleccionadas Agarivoras albus Fl UMA, Vibrio sp Y\5 UMA y Vibrio sp C21 UMA tuvieron una sobrevivencia a los 30 días del 100%, la cual fue estadísticamente significante (P<0,05) comparada con el control que fue de un 94%. Con respecto a Bacillus sp B9 UMA y Bacillus pumilus B18 UMA con valores de sobrevivencia de 92% y 93%, respectivamente, no tuvieron diferencias significativas (P>0,05) en relación al control. Los mas bajos valores de sobrevivencia (P<0,05) se mostraron en Agarivorans sp D23 UMA y Vibrio sp Al 5 UMA con valores de 72% y 80%, respectivamente (fig. 7C).
D. ALIMENTACION DE JUVENILES POST-DESTETE Y DE H. RUFESCENS CON MACROALGAS COLONIZADAS CON UN MIX DE BACTERIAS PROBIOTICAS Y SU EFECTO EN EL CRECIMENTO Y SOBREVIVENCIA EN BIOENSAYOS A LARGO PLAZO A NIVEL PILOTO (Ilustrada en Figura 8 y tabla 2).
Abalones juveniles pro-destete de aproximadamente 15-20 mm de longitud inicial de concha fueron mantenidos en estanques de 65,48 litros con un flujo continuo de 3 recambios por hora de agua de mar filtrada a 1-0,5 μπι con una temperatura de 16°C a 20°C y suministro de aire continuo.
A cada estanque se incorporó 120 abalones distribuidos en 2 bandejas de malla plástica, donde cada bandeja confinó 60 abalones. Estos fueron acondicionados por 1 semana y alimentados con macroalgas (Macrocystis pyrifera). Los animales fueron alimentados con las macroalgas sin bacterias probioticas (Contol) y con macroalgas precolonizadas con bacterias probioticas (según metodología procedimiento letra B) tres veces por semana y el alimento no consumido fue quitado del estanque al día siguiente de la incorporación de este.
La longitud y peso de todos los organismos fueron medidos mensualmente a través de todo el período experimental de 210 dias (Fig. 8 A y B).
La sobrevivencia fue medida mensualmente, descontando aquellos organismos muertos (Fig.8C). Los datos obtenidos a través de los muéstreos de los tratamientos en triplicado fueron analizados estadísticamente con análisis ANOVA (tabla 2).
Los análisis estadísticos al inicio de la experiencia no muestran diferencias significativas (P>0.05) entre el tratamiento control (Macroalgae) y el tratamiento probiótico
(Macroalgae+Probiotics) tanto para la Longitud (mm) y el peso (gramos).
Sin embargo, en el muestreo de los 30, 60, 90, 120, 150, 180 y 210 días se muestra diferencias estadísticamente significantes (P< 0.05) en el largo Y peso de los abalones entre el tratamiento control y el tratamiento con el mix probiótico, dando mejores resultados en el tratamiento probiótico (fig. 8 A y B; tabla 2).
Con respecto a al porcentaje de sobrevivencia, estos mostraron valores de 95,8 y 99,7% para los tratamientos Control y Probiótico, respectivamente (fig 8C).
E. ALIMENTACION DE ADULTOS Y DE H. RUFESCENS CON MACROALGAS COLONIZADAS CON UN MIX DE BACTERIAS PROBIOTICAS Y SU EFECTO EN EL CRECIMENTO Y SOBREVIVENCIA EN BIOENSAYOS A LARGO PLAZO A NIVEL PILOTO (Ilustrada en Figura 9 y tabla 3).
Abalones de aproximadamente 40 mm de longitud inicial de concha fueron mantenidos en estanques de 65,48 litros con un flujo continuo de 3 recambios por hora de agua de mar filtrada a 1-0,5 μιη con una temperatura de 16°C a 20°C y suministro de aire continuo.
A cada estanque se incorporó 70 abalones distribuidos en 2 bandejas de malla plástica, donde cada bandeja confinó 35 abalones. Estos serán acondicionados por 1 semana y alimentados con macroalgas (Macrocystis pyrifera). Los animales fueron alimentados con las macroalgas sin bacterias probioticas (Contol) y con macroalgas precolonizadas con bacterias probioticas (según metodología procedimiento letra B) tres veces por semana y el alimento no consumido fue quitado del estanque al día siguiente de la incorporación de este.
La longitud y el peso de todos los organismos fueron medidos mensualmente a través de todo el período experimental de 210 días (FIG. 9A y B).
La sobrevivencia fue medida mensualmente, descontando aquellos organismos muertos (FIG. 9C).
Los datos obtenidos a través de los muéstreos de los tratamientos en triplicado fueron analizados estadísticamente con análisis ANO VA (TABLA 3).
Los análisis estadísticos al inicio de la experiencia no muestran diferencias significativas (P>0.05) entre el tratamiento control (Macroalgae) y el tratamiento probiótico (Macroalgae+Probiotics) tanto para la Longitud (mm) y el peso (gramos).
Sin embargo, a los 210 días de cultivo se muestra diferencias estadísticamente significantes (P< 0.05) en el largo y peso de los abalones entre el tratamiento control y el tratamiento con el mix probiótico, dando mejores resultados en el tratamiento probiótico (FIG 9A y B; TABLA 3).
Con respecto a al porcentaje de sobrevivencia, estos mostraron valores de 90,48 y 100 % para los tratamientos Control y Probiótico, respectivamente (FIG 9 C).
TABLA 1
Cepa bacteriana Origen Agarosa Alginato Carragenano CMC Laminarina Tween 80 Caseína
Vibrio Al 5 60mLS 0,32±0,02 90,61±3,51 0,0±0,0 92,04±5,9 29,03±4,44 0,57±0,10 71 ,10±4,76
Bacillus B9 40mSC 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 128,96±39,76 58,76±2,31 0,45±0,10 77,43±5,00
Bacill s B18 lOOmLS 0,0±0,0 38,81±4,1 1 0,0±0,0 130,97±14,32 64,42±6,54 0,16±0,03 57,19±4,40
Vibrio C21 LsLS 0,0±0,0 0,0±0,0 0,0±0,0 838,94±56,87 0,0±0,0 2,76±0,50 60,74±7,70
Agarivorans D23 20mSC 0,33±0,03 169,91±15,20 2,5±0,1 1 265,49±23,96 169,91±10,01 0,05±0,01 77,43±6,70
Agarivorans Fl 20mLS 2,52±0,23 127,43±10,00 5,3±0,23 258,41±15,55 55,22±6,98 0,26±0,01 74,19±9,08
F<¿>no F15 60mSC 0,33±0,02 176,99±13,33 0,0±0,0 1217,70±78,65 147,26± 9,99 0,24±0,01 1 14,06±9,90
TABLA 2
Dieta macroalga Dieta Macroalga + Probioticos
Tiempo (días) Longitud (mm) Ancho (mm) Peso (g) Longitud (mm) Ancho (mm) Peso (g)
10
0 18,85±0.23* 10,87±0,19+ 0,81 ±0,04* 18,88±0,39* 10,88±0,40+ 0,81 ±0,02"
30 23,94±0,31 * 16,16±0,24+ 1,74±0,08# 25,10±0,12** 17,08±0,15',+ 2,09±0,04"
60 28,64±0,40* 19,21±0,39+ 3,15±0,15* 30,57±0,33** 20,54±0,28++ 3,86±0,13#
90 31 ,53±0,44* 21,06±0,30+ 4,24±0,17# 32,93±0,53** 21 ,94±0,34++ 4,99±0,22
120 34,92±0,46* 23,04±0,37+ 6,12±0,24* 36,75±0,41 ** 24,35±0,46++ 7,45±0,29#*
150 38,32±0,41* 25,52±0,29+ 8,85±0,64# 40,48±0,36** 27,26±0,17++ 10,45±0,42#
180 40,75±0,35* 27,21±0,34+ 10,37±0,42* 42,57±0,22** 28,49±0,12++ 12,44±0,22#
210 42,86±0,34* 38,42±0,18+ 12,09±0,34# 44,72±0,23** 29,99±0,89++ 14,48±0,29#
20
TABLA 3
Dieta Macroalga Dieta Macroalga + Probioticos
Tiempo (días) Longitud (mm) Ancho (mm) Peso (g) Longitud (mm) Ancho mm) Peso (g)
0 36,01±0,44* 23,74±0,15+ 6,99±0,32# 36,23±0,73* 7,07±0,67#
30 38,83±0,73* 25,59±0,38+ 8,95±0,35# 40,82±0,82** 10±0,86**
60 43,38±0,67* 28,57±0,45+ 12,85±1 ,17# 45,11±0,91 ** 13,56±0,93*
90 46,83±0,73* 31 ,17±0,67+ 16,13±0,84 48,48±0,90** 16,61±0,92#
120 50,28±0,79* 33,44±0,55+ 19,55±1,10* 51 ,53±0,82** 20,71±1,09*
150 52,34±0,66* 34,69±0,61+ 21,59±1 ,22* 53,88±0,65** 23,47±1,56##
180 53,44±0,62* 35,44±0,44+ 24,51 ±0,96* 55,09±1 ,75* 25,77±1 ,36*
210 55,35±0,90* 36,74±0,66+ 27,30±1 ,51 58,15±0,64**
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LITERATURA CITADA
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un alimento para abalón CARACTERIZADO porque comprende una o una mezcla de especies de macroalgas pre-colonizadas con una o una mezcla de especies de bacterias probióticas.
2. Un alimento para abalón según la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque dichas macroalgas utilizadas son seleccionadas entre los géneros Macrocystis, Lessonia, Gracilaria, Ulva, Palmaria, laminaria y otras macroalgas utilizadas normalmente como alimento de abalon.
3. Un alimento para abalón de acuerdo a las reivindicaciones anteriores, CARACTERIZADO porque dichas bacterias probióticas pueden ser de los géneros Agarivorans y/o Vibrio.
4. Un alimento para abalón según las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque comprende una o una mezcla de las siguientes bacterias, Agarivorans albus Fl UMA, Vibrio sp
F15 UMA y Vibrio sp C21 UMA; dichas bacterias han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), bajo los números de depósito 7651 ,7653, y 7652, respectivamente 5. Un alimento para abalón según las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque puede ser utilizado en cultivos de ejemplares juveniles y adultos de abalón, dicho alimento permite el crecimiento y sobrevivencia de los ejemplares.
6. Una formulación o producto que comprende una mezcla de bacterias probióticas susceptibles de ser usadas para producir alimentos para abalón CARACTERIZADA porque está compuesto por una o una mezcla de bacterias de los géneros Agarivorans y/o Vibrio.
7. Una formulación o producto que comprende una mezcla de bacterias probióticas susceptibles de ser usadas para producir alimentos para abalón CARACTERIZADA porque las bacterias probióticas son seleccionadas entre las siguientes, Agarivorans albus Fl UMA, Vibrio sp F15 UMA y Vibrio sp C21 UMA; dichas bacterias han sido depositadas en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), bajo los números de depósito 7651, 7653 y 7652, respectivamente. .
8. Un método para preparar un inoculo de bacterias utilizado para preparar el alimento o mezcla de bacterias descritos en las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO porque comprende las etapas de:
en una primera etapa, crecer dichas bacterias en placas con medio de cultivo para bacterias marinas normalmente utilizado en el estado del arte;
en una segunda etapa, cosechar las bacterias y resuspenderlas en agua de mar estéril;
en una tercera etapa, incorporar dichas bacterias en un rango de concentración de 1 x 104 a 1 x 106 células x mL"1 en medio de cultivo normalmente utilizado en el estado del arte para crecer bacterias marinas; dichas bacterias pueden ser crecidas en diluciones de los medios de cultivo anteriormente mencionados desde 1/1 a 1/25 sin una reducción significativa de su producción.
9. Un método para preparar un inoculo de bacterias según la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo empleado en la primera etapa es seleccionado entre Tryptone Soya Agar (TSA Oxoid) suplementada con 2% de NaCl o en placas con Marine Agar (Difco).
10. - Un método para preparar un inoculo de bacterias según la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque preferentemente, luego de cosechadas y resuspendidas, las bacterias son incorporadas en un medio de cultivo general de bacterias en una concentración de 1 x 105 células x mL"1.
11. - Un método para preparar un inoculo de bacterias según la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo general puede ser Marine Broth 2216 (MB, Difco™), Triptone Soya Broth (TSB) suplementada con 2% NaCl, Medio Laura Bertani (LB) suplementada con 2% NaCl y Medio ST-10 suplementada con 2% NaCl.
12. - Un método para producir un alimento para abalón según la reivindicación 1 a 4, CARACTERIZADO porque la colonización de las macroalgas por una o una mezcla de bacterias puede ser realizado previamente en estanques de cualquier tipo, con agua de mar filtrada, desinfectada con cloro y neutralizada con tiosulfato de sodio en un régimen de aireación constante.
13. Un método para producir un alimento para abalón según la reivindicación 12, CARACTERIZADO porque las macroalgas son lavadas y distribuidas en estanques con agua de mar (sw) previamente esterilizada y neutralizada con tiosulfato de sodio (0,075 g/Lt Sw) por un periodo de 12 a 24 horas; posteriormente son incorporadas individualmente en estos estanques con aireación constante, una o una mezcla de bacterias probióticas a un rango de concentración comprendida desde 1 x 106 a 1 x 108 células x mL"1, provenientes de cultivos en fase pre- estacionaria, en donde la mezcla bacteriana puede contener entre 1% hasta 99% de cada uno de los probióticas; posteriormente una vez incorporado estos probióticos en los estanques, se deja incubando a temperatura ambiente por un período comprendido de 24 a 72 horas para obtener la colonización bacteriana en las macroalgas.
14. Un método para producir un alimento para abalón según la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque las bacterias son incorporadas en una concentración de 1 x 107 células x mL"1.
15. Un método para producir un alimento para abalón según las reivindicaciones 12 a la 15, CARACTERIZADO porque dicho método se puede realizar de dos a tres veces por semana con macroalgas frescas.
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