JP2016506725A - アワビの水産養殖において用いるためのプロバイオティクスの製造 - Google Patents
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- Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures
Abstract
Description
本明細書に記載のビブリオ・ミダエは、生存できるが培養できない(VNBC)状態に入ることが知られている。しかしながら、本明細書に記載の方法及び培地は、ビブリオ・ミダエがこれらのプロバイオティクスの大規模製造のための培養可能な状態に入ることを可能にする。
ビブリオ・ミダエ接種源
ビブリオ・ミダエの冷凍バイアルを1つのみ用いて、各接種フラスコ(1.8リットル、フェルンバッハ)に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、1g/lのクエン酸、2.5ml/lのH3PO4、3g/lの(NH4)2SO4、0.4g/lのCa(NO3)2、0.04g/lのMnSO4.7H2O、0.032g/lのFeSO4.7H2O、1g/lのKCl、30g/lのNaCl、2.3g/lのMgCl2.6H2O、5g/lのカザミノ酸、5g/lの酵母エキス、10g/lのペプトン(Biolab)及び10g/lのグルコースからなるものであった。増殖培地のpHは、121℃にて15分間の殺菌の前に、10%v/vのH2SO4又は25%v/vのNH4OHを用いて6.5に調整した。接種に続いて、フラスコを30℃にてオービタルシェーカー(Innova 2300、New Brunswick Scientific、エジソン、ニュージャージー、米国)において180rpmの速度で4.5時間インキュベートした(OD660nm約2.0)。
ビブリオ・ミダエ発酵方法
接種したフラスコを1つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、15リットルのBiostat C(商標)発酵槽(Sartorius BBI systems、メルズンゲン、独国)中で稼働容積10リットルにて実行した。
ビブリオ・ミダエ株の後処理
Sharples−Stokes遠心分離器(Pennwalt、仏国)を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は15700gであり、発酵ブロス供給速度は30リットル/hであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝液(KH2PO4 0.11、K2HPO4 0.71、NaCl 2.91、H2O 96.27%m/m)を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー(パドル式撹拌機)を用いて、液体製品を均一化した(1000rpm)。
結果
ビブリオ・ミダエを24g/lのHTM及び54.4g/lのCSLを含有する培地中で培養したとき、6時間培養後に、最大細胞濃度9.7×1010細胞/ml及び最適密度11.1が得られた。(図5)。
デバリオマイセス・ハンセニイ接種源
デバリオマイセス・ハンセニイの冷凍バイアル(5.9×108CFU/ml)を1つのみ用いて、各接種フラスコ(1.8リットル、フェルンバッハ)に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、2.5g/lのクエン酸、16.3ml/lのH3PO4、30g/lの(NH4)2SO4、8.2g/lのMgSO4.7H2SO4、0.8g/lのCaCl2.2H2O、0.1g/lのNaCl、11.3g/lのKH2PO4、10g/lの酵母エキス及び10g/lのグルコースからなるものであった。増殖培地のpHは、121℃にて15分間の殺菌の前に、10%v/vのH2SO4又は25%v/vのNH4OHを用いて5.6に調整した。接種に続いて、フラスコを24℃にてオービタルシェーカー(Innova 2300、New Brunswick Scientific、エジソン、ニュージャージー、米国)において180rpmの速度で22時間インキュベートした(OD660nm約4.0)。
デバリオマイセス・ハンセニイ発酵方法
接種したフラスコを1つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、15リットルのBiostat C(商標)発酵槽(Sartorius BBI systems、メルズンゲン、独国)中で稼働容積10リットルにて実行した。
デバリオマイセス・ハンセニイ株の後処理
Sharples−Stokes遠心分離器(Pennwalt、仏国)を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は15700gであり、発酵ブロス供給速度は30リットル/hであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝液(KH2PO4 0.11、K2HPO4 0.71、NaCl 2.91、H2O 96.27%m/m)を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー(パドル式撹拌機)を用いて、液体製品を均一化した(1000rpm)。
結果
デバリオマイセス・ハンセニイを25g/lのHTM及び24g/lのCSLを含有する培地中で培養したとき、22時間培養後に、最大細胞濃度8.4×109細胞/ml及び最適密度37.9が得られた。(図8)。
本発明の方法とMacey及びCoyne(2006年)によって記載された方法との比較評価を実行した。本発明者らは、本発明の製造培地に対し、Macey及びCoyneにおいて提示されている条件及び培地に従って育てられた培養物の製造コスト及び細胞増殖率を調査した。
結果
本発明の増殖培地及び方法並びに先行技術の増殖培地及び方法の比較評価の結果を、表1に提示する。
ビブリオ・ミダエ株の後処理
Sharples−Stokes遠心分離器(Pennwalt、仏国)を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は15700gであり、発酵ブロス供給速度は30リットル/hであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝食塩水(KH2PO4 0.11、K2HPO4 0.71、NaCl 2.91、H2O 96.27%m/m)を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー(パドル式撹拌機)を用いて、液体製品を均一化した(1000rpm)。
デバリオマイセス・ハンセニイ接種源
デバリオマイセス・ハンセニイの冷凍バイアル(5.9×108CFU/ml)を1つのみ用いて、各接種フラスコ(1.8リットル、フェルンバッハ)に接種した。各フラスコ中の増殖培地は、2.5g/lのクエン酸、16.3ml/lのH3PO4、30g/lの(NH4)2SO4、8.2g/lのMgSO 4 .7H 2 O、0.8g/lのCaCl2.2H2O、0.1g/lのNaCl、11.3g/lのKH2PO4、10g/lの酵母エキス及び10g/lのグルコースからなるものであった。増殖培地のpHは、121℃にて15分間の殺菌の前に、10%v/vのH2SO4又は25%v/vのNH4OHを用いて5.6に調整した。接種に続いて、フラスコを24℃にてオービタルシェーカー(Innova 2300、New Brunswick Scientific、エジソン、ニュージャージー、米国)において180rpmの速度で22時間インキュベートした(OD660nm約4.0)。
デバリオマイセス・ハンセニイ発酵方法
接種したフラスコを1つのみ用いて、各発酵槽に接種した。発酵方法は、15リットルのBiostat C(商標)発酵槽(Sartorius BBI systems、メルズンゲン、独国)中で稼働容積10リットルにて実行した。
デバリオマイセス・ハンセニイ株の後処理
Sharples−Stokes遠心分離器(Pennwalt、仏国)を用いて、発酵ブロスを遠心分離した。遠心管速度は15700gであり、発酵ブロス供給速度は30リットル/hであった。上澄み液を捨て、リン酸緩衝食塩水(KH2PO4 0.11、K2HPO4 0.71、NaCl 2.91、H2O 96.27%m/m)を用いてバイオマスを製剤化した。オーバーヘッドスターラー(パドル式撹拌機)を用いて、液体製品を均一化した(1000rpm)。
Claims (41)
- (i)クエン酸、
(ii)H3PO4、
(iii)約0g/lから約4g/lの(NH4)2SO4、
(iv)Ca(NO3)2、
(v)MnSO4.7H2O、
(vi)FeSO4.7H2O、
(vii)KCl、
(viii)約20g/lから約40g/lのNaCl、
(ix)MgCl2.6H2O、
(x)約42g/lから約255g/lのコーンスティープリカー、
(xi)約1g/lから約40g/lの転化高品質糖蜜、及び
(xii)約0.5ml/lから約5ml/lの消泡剤
を含み、pHが約5から約8である、細菌増殖培地。 - (i)約1g/lのクエン酸、
(ii)約2.5ml/lのH3PO4、
(iii)約0.4g/lのCa(NO3)2、
(iv)約0.040g/lのMnSO4.7H2O、
(v)約0.032g/lのFeSO4.7H2O、
(vi)約1g/lのKCl、
(vii)約30g/lのNaCl、
(viii)約2.3g/lのMgCl2.6H2O、
(ix)約54.4g/lのコーンスティープリカー、
(x)約24g/lの転化高品質糖蜜、及び
(xi)約1ml/lの消泡剤
を含み、pHが約6.5である、請求項1に記載の細菌増殖培地。 - マリンブロス(MB)培地より顕著に高い細胞増殖率(g/l/h)を支持する、請求項1又は2に記載の細菌増殖培地。
- 接種培地にビブリオ・ミダエ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物を調製する工程、
請求項1から3のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のpHを制御する工程、
ビブリオ・ミダエ細胞が安定形態であり且つ生細胞濃度が2×108細胞/mlから1×1011細胞/mlの範囲である、対数中期と静止期との間に、ビブリオ・ミダエ細胞を採取する工程、並びに
採取したビブリオ・ミダエ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。 - 液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項4に記載の方法。 - 回分法である、請求項4又は5に記載の方法。
- 反応器への気流が0.5から2.0v/v/mの範囲であり、好ましくは、反応器への気流が1v/v/mである、請求項4から6のいずれか一項に記載の方法。
- 発酵培地中の溶存酸素が、飽和度20から100%の範囲であり、好ましくは、溶存酸素を飽和度30%に維持する、請求項4から7のいずれか一項に記載の方法。
- 反応器内の背圧が0から250kPaの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が50kPaである、請求項4から8のいずれか一項に記載の方法。
- ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で20から34℃の範囲の温度にて培養し、好ましくは、ビブリオ・ミダエ細胞を培養培地中で30℃の温度にて培養する、請求項4から9のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地のpHが5.0から8.0の範囲であり、好ましくはpHが6.5である、請求項4から10のいずれか一項に記載の方法。
- ビブリオ・ミダエ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する、請求項4から11のいずれか一項に記載の方法。
- 採取したビブリオ・ミダエ細胞をリン酸緩衝食塩水中に再懸濁して、液体製品を製造する、請求項4から12のいずれか一項に記載の方法。
- 液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそれらの組み合わせからからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成する、請求項4から13のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項5から13のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマスペーストを30から70℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイオマスペーストを45℃の温度にて押出成形する、請求項5から15のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたビブリオ・ミダエ生細胞を含み、ビブリオ・ミダエ細胞は、培養物中における生細胞濃度が2×108細胞/mlから1×1011細胞/mlの範囲である、増殖の対数中期と静止期との間に採取されたものであり、採取されたビブリオ・ミダエ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバイオティクス組成物。
- 再懸濁されたビブリオ・ミダエ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バイオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項17に記載のプロバイオティクス組成物。
- アワビの水産養殖において用いるための、請求項17又は18に記載のプロバイオティクス組成物。
- 請求項17から19のいずれか一項に記載のプロバイオティクス組成物を含むアワビの餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの餌。
- (i)クエン酸、
(ii)H3PO4、
(iii)約18g/lから約30g/lの(NH4)2SO4、
(iv)MgSO4.7H2SO4、
(v)CaCl2.2H2O、
(vi)約0g/lから約40g/lのNaCl、
(vii)KH2PO4、
(viii)約8g/lから約212g/lのコーンスティープリカー、
(ix)約1g/lから約40g/lのグルコース又はHTM、及び
(x)約0.5ml/lから約5ml/lの消泡剤
を含み、pHが約4から約7である、酵母増殖培地。 - (i)約2.5g/lのクエン酸、
(ii)約16.3ml/lのH3PO4、
(iii)約18.5g/lの(NH4)2SO4、
(iv)約8.2g/lのMgSO4.7H2SO4、
(v)約0.8g/lのCaCl2.2H2O、
(vi)約0.1g/lのNaCl、
(vii)約11.3g/lのKH2PO4、
(viii)約204g/lのコーンスティープリカー、
(ix)約10g/lのグルコース又はHTM、及び
(x)約1ml/lの消泡剤
を含み、pHが約5.6である、請求項21に記載の酵母増殖培地。 - 酵母エキス、ペプトン及びグルコース(YPD)培地より顕著に高い細胞増殖率(g/l/h)を支持する、請求項21又は22に記載の酵母増殖培地。
- 接種培地にデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞の培養物を接種することによって、予備発酵培養物を調製する工程、
請求項21から23のいずれか一項に記載の増殖培地に、予備発酵培養物を接種する工程、
デバリオマイセス・ハンセニイ細胞の増殖期中、気流、酸素飽和度、背圧、温度及び増殖培地のpHを制御する工程、
生細胞濃度が4×107細胞/mlから2×1010細胞/mlの範囲である、増殖の対数中期と対数後期との間に、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を採取する工程、並びに
採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞を緩衝液中に再懸濁することによって、液体製品を製造する工程
を含む、プロバイオティクス組成物を製造する方法。 - 液体製品を、担体、安定剤又は充填剤とブレンドして、バイオマスペーストを形成する工程、及び
バイオマスペーストを乾燥して、乾燥製品を製造する工程
をさらに含む、請求項24に記載の方法。 - 流加回分法である、請求項24又は25に記載の方法。
- 反応器への気流が0.5から2.0v/v/mの範囲であり、好ましくは、反応器への気流が1v/v/mである、請求項24から26のいずれか一項に記載の方法。
- 発酵培地中の溶存酸素が、飽和度20から100%の範囲であり、好ましくは、溶存酸素を飽和度30%に維持する、請求項24から27のいずれか一項に記載の方法。
- 反応器内の背圧が0から250kPaの範囲であり、好ましくは、反応器内の背圧が50kPaである、請求項24から28のいずれか一項に記載の方法。
- デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で16から34℃の範囲の温度にて培養し、好ましくは、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を培養培地中で24℃の温度にて培養する、請求項24から29のいずれか一項に記載の方法。
- 培養培地のpHが4.0から7.0の範囲であり、好ましくはpHが5.6である、請求項24から30のいずれか一項に記載の方法。
- デバリオマイセス・ハンセニイ細胞を遠心分離又はろ過によって増殖培地から採取する、請求項24から31のいずれか一項に記載の方法。
- 採取したデバリオマイセス・ハンセニイ細胞をリン酸緩衝液に再懸濁して、液体製品を製造し、好ましくは、リン酸緩衝液が、約4〜20%m/mのトレハロース、好ましくは12.5%m/mのトレハロースを含み、緩衝液のpHが約4から6の範囲であり、好ましくはpHが4.5である、請求項24から32のいずれか一項に記載の方法。
- 液体製品を、微結晶セルロース、トレハロース、スクロース及びスキムミルク、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される担体と組み合わせて、ブレンド製品を形成する、請求項25から33のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマスペーストを押出成形し乾燥して、乾燥製品を形成する、請求項25から34のいずれか一項に記載の方法。
- バイオマスペーストを30から50℃の範囲の温度にて押出成形し、好ましくは、バイオマスペーストを45℃の温度にて押出成形する、請求項35に記載の方法。
- 請求項21から23のいずれか一項に記載の増殖培地中で培養されたデバリオマイセス・ハンセニイ生細胞を含み、デバリオマイセス・ハンセニイ細胞は、培養物中における生細胞濃度が4×107細胞/mlから2×1010細胞/mlの範囲である、増殖の対数中期と対数後期との間に採取されたものであり、採取されたデバリオマイセス・ハンセニイ細胞が緩衝液中に再懸濁されている、プロバイオティクス組成物。
- 再懸濁されたデバリオマイセス・ミダエ細胞が、担体、安定剤又は充填剤とブレンドされて、バイオマスペーストを形成しており、バイオマスペーストが乾燥されている、請求項37に記載のプロバイオティクス組成物。
- アワビの水産養殖において用いるための、請求項37又は38に記載のプロバイオティクス組成物。
- 請求項37から39のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス組成物を含むアワビの餌であって、プロバイオティクス組成物が、餌の押出成形前に予備ブレンドすること、予備調製されたアワビの餌へ真空注入すること、又は既存の餌にトップコーティングすることによって、アワビの餌と組み合わされている、アワビの餌。
- 請求項17から19のいずれか一項に記載のビブリオ・ミダエプロバイオティクス組成物と請求項37から39のいずれか一項に記載のデバリオマイセス・ハンセニイプロバイオティクス組成物との組み合わせを含む、アワビの餌。
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