ES2470340T3 - Vehículo de administración para bacterias probi�ticas que comprende una matriz seca de polisac�ridos, sac�ridos y polioles en forma vítrea - Google Patents

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Abstract

Una composición seca en forma vitrea solida adecuada para su administración oral, comprendiendo la composición una mezcla que incluye al menos un polisacarido, un sacarido, un poliol y bacterias probióticas, en la que el sacarido es trehalosa y la proporción entre el sacarido y el polio! es 3:1 a 1:3.

Description

Vehiculo de administracion para bacterias probioticas que comprende una matriz seca de polisacaridos, sacaridos y
polioles en forma vitrea.
Antecedentes de la divulgacion
LadivulgaciOn versa en general sobre el campo de un vehiculo de administracion de bacterias probioticas que comprende una matriz seca de polisacaridos, sacaridos y polioles en forma vitrea. Tambien se proporcionan procedimientos de fabricaci6n y uso del mismo.
Se definen los probioticos como microbios vivos que afectan beneficiosamente al anfitrion modulando la inmunidad mucosa y sisternica, asi como mejorando la funci6n intestinal y el equilibrio microbiano en el tracto intestinal. Se han atribuido diversos efectos nutricionales y terapeuticos a los probioticos, incluyendo: modulaciOn de la respuesta inmunitaria, disminuciOn de las concentraciones de colesterol en el plasma, mejora de los sintomas de intolerancia a la lactose, aumento de la resistencia a enfermedades intestinales infecciosas, disminuci6n de la duraci6n de la diarrea, reducci6n de la presion sanguinea y contribuci6n a prevenir el cancer de colon (lsolauri E y otros 2001, Kailasapathy K and J. 2000, Marteau PR y otros 2001, Perdigon G y otros 2001). Para ejercer sus efectos beneficiosos en el anfitrion, los probi6ticos deben permanecer viables y Ilegar al intestino en grandes numeros (Favaro-Trindade y Grosso 2002). Sin embargo, mantener la estabilidad a largo plazo de los probi6ticos requiere condiciones especiales de conservacion, dado que la viabilidad se deteriora rapidamente en un corto periodo de tiempo a temperatura y condiciones de humedad ambiente (Shah 2000). Adernas del deficiente periodo de validez, ocurre una significative perdida de viabilidad tras la exposici6n de los probiOticos a las condiciones gastricas de pH
bajo y enzimas digestives. Los procedimientos existentes de conservaciOn no logran proporcionar una viabilidad satisfactoria en la conservacion ni protecci6n gastrica, especialmente si las celulas se almacenan a temperatura y humedad ambiente o mas altas.
A menudo se usa la liofilizacion para la conservacion y el almacenamiento de bacterias debido a la exposici6n a temperaturas bajas durante el secado. Sin embargo, tiene las caracteristicas poco deseables de reducir
significativamente la viabilidad, asi como requerir mucho tiempo y energia. La liofilizaciOn implica poner las celulas en una soluciOn, congelar la soluciOn y exponer el solid� congelado al vacio en condiciones en las que permanece solid� y el agua y cualquier otro componente volatil son eliminados por sublinnacion. La temperatura estander de liofilizaciOn de -30�C a -70�C este por debajo del punto de congelacion del agua, pero este muy por encima de la temperatura de transicion vitrea (Tg) de la solucion de liofilizacion, lo que da como resultado el efecto no deseado de lacristalizacion del agua formando hielo. La congelacion de cultivos bacterianos da como resultado un deo fisico sustancial a la pared celular bacteriana y la consiguiente perdida de viabilidad. Por lo tanto, evitar la formaci6n de hielo durante la frigoconservaciOn de proteinas, virus, celulas, tejidos y organos es un problema importante de la criobiolog la.
Puede disminuirse el punto de congelaciOn del agua anadiendo solutos que reduzcan la presi6n de vapor del agua.
La depresi6n del punto de congelacion es la base fisica sobre la que actUan esencialmente todos los anticongelantes usados actualmente (por ejemplo, glicoles, azucares y sales). La desventaja de los depresores del punto de congelacion, denominados crioprotectores, es que se requieren grandes cantidades de solutos (10% o mas) para reducir el punto de congelacion tan solo algunos grados Celsius. A concentraciones suficientemente
elevadas (normalmente, el 50% o mas), los anticongelantes convencionales pueden impedir la formaci6n de hielo,
permitiendo que las soluciones acuosas se enfrien hasta temperaturas muy por debajo de 0�C sin congelarse. Sin embargo, generalmente los crioprotectores son tOxicos en las concentraciones elevadas requeridas para lograr la formaci6n vitrea o vitrificacion.
Otros procedimientos usados para crear preparaciones secas y estables de probiOticos, tales como la desecacion a temperatura ambiente y el secado por pulverizacion, tambien tienen inconvenientes. La desecaci6n a temperatura ambiente o reducida es lenta, requiere precauciones adicionales para evitar una contaminacion y a menudo produce
una viabilidad insatisfactoria. El secado por pulverizacion implica derives cortas hasta temperaturas de tratamiento relativamente elevadas y da como resultado perdidas de viabilidad y tiempos limitados de conservacion, incluso cuando se usan excipientes de estabilizacion (Lievense LC, van 't Riet K. 1994. Convective drying of bacteria. II. Factors influencing survival. Adv Biochem Eng Biotechnol. 51:71-89).
Simmonds y otros (2005) han descrito una formulaciOn viable y estable para dirigir los probioticos al intestino. El procedimiento requiere la granulacion de bacterias liofilizadas con estabilizadores de celulosa microcristalina, tales
la leche desnatada, sales o azucares de cadena coda, y un desintegrante tal como almidon o acid� alginico. Acto seguido, las bacterias semisecas granuladas son desecadas a 40-70�C para reducir el nivel de humedad residual a menos del 2 por ciento. Esto es seguido por su recubrimiento con un agente enteric� y un plastificante.
Este procedimiento de etapas mUltiples da como resultado un gran tame� de particula (de mas de 425 micr6metros) y sigue dando como resultado una perdida de viabilidad de hasta 1,5 magnitudes logaritmicas. Una ventaja adicional de este procedimiento es el elevado contenido de los agentes de revestimiento enteric� (mas del 25% del peso de la microesfera), que son sinteticos en su mayoria y no son reconocidos como materiales de calidad
alimentaria. Una desventaja inherente de un procedimiento de revestimiento es que la proporci6n relative entre el
como
revestimiento y el agente activo se eleva en una funci6n cubica de la particula, cuando el tamafio de particula disminuye, haciendo el procedimiento menos utilizable para la produccion de particulas de tamatios inferiores a 300 micrometros.
Se ha descrito un procedimiento alternativo de conservacion bacteriana que usa una tecnica de formaciOn de
espuma a la vez que elimina la formaci6n de cristales de hielo (Bronshtein y otros 2004, Roser y otros 2004). Este procedimiento requiere concentraciones elevadas de azucares (una combinaci6n de mono, di y oligosacaridos metilados) en el medio de secado y un liofilizador que esta dotado de un sistema de vacio controlado y de
exposiciOn a la temperatura, y la adicion de elementos formadores de espuma y estabilizantes. A pesar de algunas ventajas de este procedimiento en el logro de la estabilidad de un mayor periodo de validez, las bacterias
conservadas en espuma no estan protegidas del transit� por el est6mago. Ademas, este procedimiento es dificil y costoso de ampliar de escala, porque la espuma requiere, por definicion, grandes volumenes de espacio a presi6n atmosferica reducida (es decir, en el vacio) para la produccion de una masa muy pequeria. Adernas, este material es
muy sensible a la humedad y el producto absorbe agua facilmente, disminuyendo la viabilidad de las bacterias.
Franks y otros (2003) propusieron una composicion que contenia un azOcar (trehalosa) parcialmente en la fase
vitrea amorfa y parcialmente en fase de hidrato cristalino. La fase de hidrato cristalino sirve de agente para deshidratar la fase amorfa, mejorando con ello la temperatura de transicion vitrea del estado vitreo amorfo. Se demostrO que esta composiciOn estabilizaba moleculas individuales, como proteinas o nucleotidos. La temperatura de transicion vitrea de una mezcla depende, entre otros factores, de su composici6n quimica (azOcares, proteinas, sales) y del contenido de humedad, actuando el agua como plastificante, deprimiendo la temperatura de transici6n
vitrea. Si, en cualquier momento, se supera la temperatura de transicion vitrea (Tg), ya sea por exposici6n al calor o
como consecuencia de una migracion de humedad al interior del producto, el estado vitreo amorfo puede Ilegar a ser susceptible de una separacion irreversible de fases por cristalizacion. Entonces, si ocurre la cristalizacion, cualquier fase amorfa residual estara compuesta de los demas componentes y la humedad, dando como resultado una depresion adicional de la temperatura de transici6n vitrea.
Unvidrio es un estado solid� amorfo que se obtiene por desecaci6n controlada de una solucion. La ventaja de la fase vitrea en la consecuci6n de estabilidad a largo plazo resulta del hecho de que la difusi6n en materiales vidriosos (vitreos) ocurre con velocidades sumamente bajas (por ejemplo, micrometros/atio). Normalmente, los materiales vitreos aparecen como sOlidos homogeneos, transparentes y quebradizos que pueden ser triturados o molidos hasta formar polvo. Los beneficios 6ptimos de la vitrificacion para la conservaciOn a largo plazo se observan en
condiciones en las que Tg es mayor que la temperatura de almacenamiento. La Tg depende directamente de la actividad y la temperatura del agua, y puede ser modificada seleccionando una combinaciOn apropiada de solutos (es decir, polisacaridos, azOcares, sales y proteinas).
La formacion vitrea ocurre de forma natural en algunas especies vegetales y de artropodos que son muy tolerantes a la desecacion. Varios musgos y helechos, denominados plantas de la resurreccion, pueden experimentar una desecacion grave y sobrevivir durante muchos afios en un estado metabolic� latente y luego revivir con el regreso del agua al entomb. En la mayoria de los casos, la caracteristica de adaptaci6n es para aumentar las concentraciones internas de ciertos sacaridos, como la trehalosa, hasta un nivel que forme estados vitreos. El documento US-B-6468782 ensefia procedimientos de secado y estabilizacion de celulas procariotas y las composiciones obtenidas por los mismos. En primer lugar, las celulas son cultivadas e incubadas en condiciones suficientes para inducir la trehalosa intracelular, suspendidas en una solucion estabilizante y secadas para formar un
vidrio sOlido. El producto resultante es estable en su conservacion a temperatura ambiente, mostrando poca perdida de viabilidad en su conservacion. El documento WO-A-2005/084646 da a conocer una formulacion en polvo que es una mezcla liofilizada de un material activo sensible (0,1-50% en peso) y un excipiente (50-99,99% en peso), estando al
menos un 0,1% en peso de la mezcla en un estado amorfo; la formulaciOn tiene una higroscopicidad sustancialmente reducida.
Antes de la presente divulgacion, nadie ha podido proporcionar una solucion comUn y rentable para los problemas separados que afronta la industria de los probioticos, concretamente mantener la estabilidad (es decir, la viabilidad) en un periodo de validez prolongado de celulas bacterianas a temperatura ambiente y actividad hidrica elevada (o
gran humedad), y proporcionar proteccion gastrica para minimizar las perdidas de la viabilidad probi6tica durante el transit� por el estomago. La presente invencion supera estos problemas.
Breve sumario de la divulgacion
La presente divulgaciOn abarca composiciones y procedimientos de produccion de microparticulas que comprenden una matriz solida en forma vitrea adecuada para su administraci6n oral. Las composiciones incluyen una combinacion de un polisacarido, un sacarido, un poliol y una bacteria probi6tica. Estas composiciones estan
disefiadas para proporcionar estabilidad en un periodo de validez mas prolongado a temperatura ambiente en entornos de gran actividad hidrica, y protecci6n gastrica del probiotico. Ademas, el procedimiento de produccion de esta matriz implica procesos que dan como resultado una minima perdida de la viabilidad del probiOtico.
En consecuencia, un aspecto de la presente invencion comprende una composicion seca en forma vitrea solida adecuada para su administraci6n oral, comprendiendo la composici6n una mezcla que incluye al menos un 3
polisacarido, un sacarido, un poliol y bacterias probi6ticas, en la que el sacarido es trehalosa y la proporcion entre el
sacarido y el poliol es 3:1 a 1:3.
En un aspecto preferente, las bacterias de la mezcla de conservacion de hidratos de carbono son bacterias probiOticas seleccionadas, sin limitaciOn, del grupo consistente en Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus, Propionobacterium, BacillusyStreptococcus vivos.
En otro aspecto de la invencion, el polisacarido de la mezcla de conservacion proporciona protecci6n gastrica y un mecanismo de control de la liberacion que libera gradualmente los microbios en su lugar de acci6n en el intestino delgado y el intestino grueso del animal o del ser humano. Ejemplos de polisacaridos con protecciOn gastrica y un mecanismo de control de la liberacion son los polisacaridos formadores de hidrocoloides seleccionados del grupo
que incluye, sin limitacion, almidon (incluyendo el almidon no digestible), pectina, inulina, goma xantana, alginato, acido alginico, quitosano, carragenano, carboximetil celulosa, metil celulosa, goma guar, goma arabiga, goma garrofin y combinaciones de los mismos. Tambien preferentemente, la concentraci6n de los polisacaridos en la mezcla de conservaciOn es inferior al 10% p/v y, mas preferentemente, inferior al 5% p/v de la mezcla de
conservacion.
Enotro aspecto de la invencion, la combinacion de sacaridos/polioles en la mezcla de conservacion esta formulada para que no cristalice durante el secado y la conservaciOn a largo plazo a temperatura ambiente. Un sistema adecuado de formulaciOn vitrea incluye, sin limitacion, trehalosa/glicerol, trehalosa/manitol, trehalosa/maltitol, trehalosa/isomaltitol, trehalosa/adonitol, trehalosa/lactitol y trehalosa/sorbitol. La trehalosa es un disacarido no reductor que se da en la naturaleza que se asocia con la prevencion del datio por desecaci6n en ciertas plantas, microbios y animales que pueden secarse sin dafio y revivir cuando se rehidratan. Tambien se ha demostrado que la trehalosa es id en la prevencion de la desnaturalizacion de proteinas, virus y productos alimentarios durante la desecacion (Chen y otros 2001, Crowe and Crowe 1992, Liao y otros 2002). Comparada con la de la sacarosa, la temperatura de transicion vitrea de la trehalosa es significativamente mayor (110�C en comparacion con solo 65�C) (Crowe y otros 1998). Sin embargo, la trehalosa no siempre es suficiente para estabilizar bacterias, especialmente a temperatura y humedad elevadas. Adernas, las membranas son mas permeables a los alcoholes de azucar externos que a la trehalosa externa (Krallish I y otros 1997, Linders L J y otros 1997, Qiu L y otros 2000). Precisamente el efecto sinergico de la trehalosa y los alcoholes de azucar proporciona mayor protecci6n y mejora la viabilidad celular durante un periodo de conservacion prolongado. Preferentemente, la concentraci6n tanto del sacarido como del poliol en la mezcla es inferior al 60% p/v y, mas preferentemente, inferior al 40% p/v de la mezcla de conservacion. Preferentemente, la proporci6n entre el sacarido y el poliol es de aproximadamente 3:1 trehalosa/poliol, aunque una
proporciOn de 1:3 trehalosa/poliol es tambien similarmente efectiva en la conservacion de ciertas especies probioticas.
La presente divulgacion tambien proporciona procedimientos de secado de la mezcla en forma vitrea con una minima perdida de viabilidad. Se descubri6 que eran posibles la vitrificaciOn y el secado eficiente de la mezcla de conservacion al vacio sin la necesidad de formaciOn de espuma descrita por Bronshtein (2004). La gelificacion o reticulacion de los polisacaridos en la mezcla de conservacion y cortarla en trozos pequetios eliminaron la necesidad de espumar la mezcla para secarla al vacio. Tambien redujeron la formaci6n de un producto gomoso que se daba a menudo en el procedimiento de espumado. Preferentemente, se permite que la mezcla de conservacion, incluyendo el probiotico, gelifique a baja temperatura y luego es cortada y secada al vacio en condiciones adecuadas para la
formaci6n vitrea. Mas preferentemente, el polisacarido de la mezcla se selecciona del grupo de polisacaridos reticulables, tales como el alginato, la pectina o el quitosano. A continuaci6n, la mezcla es extrudida al interior de un balio de Ca las cuerdas o particulas son recogidas, enjuagadas con agua y luego empapadas en una mezcla adecuada de trehalosa/poliol, seguido por un secado al vacio en condiciones adecuadas para la formacion vitrea.
La presente divulgaciOn tambien proporciona procedimientos de secado al vacio de la matriz de conseniaciOn sin
espumado ni formaci6n de hielo. El procedimiento de secado por formacion vitrea comprende mantener la matriz a 40�C, aplicar un vacio inicial de aproximadamente 333,31 Pa durante un periodo de tiempo seguido por secado a menos de 13,33 Pa durante otro periodo de tiempo. Preferentemente, se mantiene la temperatura inicial del producto a o aproximadamente a 10-20�C durante el periodo a presion parcialmente reducida (333,31 Pa) y luego se aumenta
hasta 40-50�C cuando la presion atmosferica disminuye hasta menos de 13,33 Pa. Tambien puede resultar
beneficiosa una etapa final de secado a 20�C con un vacio maxim� (ca. 1,33 Pa) durante un periodo de tiempo adicional para la total eliminacion del agua. A continuaci6n, la matriz seca puede ser triturada o molida y, si es necesario, tamizada hasta obtener un polvo particulado deseado.
Breve sumario de varias vistas de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento de desecacion contracorriente de un hidrogel de matriz hurneda usando un sacarido pulverizado (trehalosa) como mezcla estabilizante.
La Figura 2 es un grafico que representa el efecto de la concentraci6n de trehalosa en el medio de secado sobre la viabilidad de las bacterias. La maxima viabilidad de L. rhamnosus se logro con una concentraci6n de trehalosa de
0,5 M. Se sec6 L. rhamnosus at aire durante 3 dias en una campana de flujo laminar en presencia de una
concentracion creciente de trehalosa.
La Figura 3 es un grafico de barras que representa el efecto de los sacaridos y los polioles (con una concentracion
total del 24% ply en el medio de secado) sobre la viabilidad de L. paracasei tras el secado.
5 La Figura 4 es un grafico de barras que representa el efecto de diferentes proporciones de sacaridos/polioles (trehalosa/manitol o trehalosa/isomaltitol) en una mezcla de polisacaridos (2% almidon, 1% alginato de sodio y 0,5% pectina) sobre la viabilidad de L. acidophilus tras el secado al vacio (la concentraci6n total de los sacaridos y los polioles es del 30% ply). 10 La Figura 5 es un grafico de barras que representa el efecto de la mezcla de polisacaridos (2% almidon, 1% alginato de sodio y 0,5% pectina) con 3:1 trehalosa/isomaltitol (la concentraci6n total de los sacaridos/polioles es del 40% ply) sobre la viabilidad de L.acidophilusseco a 45�C al 0% o el 33% de humedad relative.
15 La Figura 6 es un grafico de barras que representa el efecto de jugos gastricos simulados correspondientes a despues de corner (12% de leche desnatada, 2% de glucose, 1% de extract� de levadura y 0,05% de cisteina; pH 2)
o en ayunas (0,32% de pepsina, 0,2% de cloruro sodico; pH 1,2) sobre L. paracasei seco en forma libre o en forma vitrea de la mezcla de polisacaridos/sacaridos/polioles.
20 LaFigura 7 es un grafico de barras que representa el efecto de jugos gastricos simulados correspondientes a en ayunas (0,32% de pepsina, 0,2% de cloruro sodico; pH 1,2) sobre L. acidophilus seco en forma libre o en forma vitrea de la mezcla de polisacaridos/sacaridos/polioles.
La Figura 8 es un par de graficos que representan el efecto de una mezcla de hidratos de
25 carbono/polisacaridos/albumina de huevo (trehalosa/alginato/pectina/alburnina de huevo 30:1,5:0,5:10) sobre la viabilidad de Lactobacillus GG seco a 40�C al 15% o el 33% de humedad relative.
DescripciOn detallada
La divulgacion versa acerca de una composici6n que este en una matriz vitrea solida que comprende un polisacarido, sacaridos, polioles y bacterias probioticas y procedimientos para la produccion eficiente de esta 30 composici6n a gran escala.
Definiciones
Segun se usan en el presente documento, cada uno de los terminos siguientes tiene el significado asociado con el en esta secci6n.
"Polisacaridos" se refiere a compuestos que consisten en un gran numero de monosacaridos ligados con enlaces 35 glucosidos. Segun se usa en el presente document�, el termino polisacaridos se refiere unicamente a aquellos que contienen mas de diez residuos monosacaridos.
"Sacaridos" incluye monosacaridos, disacaridos y oligosacaridos.
"Polioles" se refiere en general a compuestos quimicos que contienen multiples grupos hidroxilo. Segon se usa en el presente documento, el termino poliol significa alcohol de azocar, que es una forma hidrogenada de hidrato de 40 carbono cuyo grupo carbonilo (azucar reductor de aldehido o cetona) ha sido reducido a un grupo hidroxilo primario
o secundario. Algunos alcoholes de azUcar comunes son: manitol, sorbitol, xilitol, isomaltitol, maltitol, lactitol.
"VitrificaciOn" (es decir, formaciOn de vidrio) significa formacion de un material amorfo vitreo o no cristalino. Segun se usa en el presente documento, el termino vidrio o estado vitreo significa una fase liquida de tan alta viscosidad y bajo contenido en agua que todas las reacciones quimicas son ralentizadas hasta casi su paralizacion, y las celulas
45 bacterianas se vuelven latentes.
"Cristalizacion" se refiere a la formacion de cristales solidos a partir de una soluciOn homogenea. Es esencialmente una separaci6n entre solidos y liquidos.
"Crioprotector" se refiere a un compuesto o una sustancia quimica que se usa para impedir la formacion de cristales de hielo durante el sobreenfriamiento de una mezcla que contiene agua.
50 Descripcion detallada
Un polisacarido capaz de formar una matriz de gel resistente es fundamental para esta invencion. Preferentemente, esta matriz retiene bacterias y la mezcla de conservacion aun despues de ser cortada en trozos pequeflos o conformada en hilos delgados, cuerdas o particulas. Adernas, la matriz de polisacaridos posee preferentemente un
mecanismo de liberaciOn controlada que protege las bacterias en el est6mago, y que es capaz de liberar las 55 bacterias en su lugar de acciOn en el intestino.
Varios polisacaridos presentan estos requisitos y son adecuados para el uso descrito en el presente documento. El almidOn con alto contenido de amilosa es un polisacarido capaz de formar un gel firme tras hidratar los granulos de almidon en agua en ebullicion, dispersar los granulos con la ayuda de un mezclador de alta velocidad y enfriar luego la solucion hasta aproximadamente 0-10�C. La firmeza y la resistencia del gel dependen de la concentraci6n de almidOn en la soluciOn, con una concentraci6n trabajable maxima de hasta el 10% p/v. La matriz cortada de gel de almidon tambien es capaz de retener las bacterias vivas en la mezcla de conserved& y, dado que es en su mayor parte no digestible por los jugos intestinales o gastricos, las bacterias son protegidas de la destruccion gastrica mientras se encuentren dentro de la matriz de almidon. Se proporciona el mecanismo de liberacion controlada por el hecho de que el almidon con un alto contenido de amilosa es digestible por la microflora intestinal, momento en el
cual las bacterias vivas administradas son liberadas en su forma intacta.
La pectina es otro polisacarido adecuado que se comporta de forma muy similar al almidon con alto contenido de amilosa. La pectina tiene una ventaja adicional, dado que la resistencia de la matriz de gel de pectina puede aumentar adicionalmente con la adicion de cationes divalentes, como Ca, que forman puentes entre los grupos carboxilo de los polimeros de azimar.
En una realizaciOn preferente de la presente invencion se usan alginato o una combinaci6n de alginato y almidon no digestible. El alginato puede formar una matriz de gel firme por reticulaci& con cationes divalentes. La solucion de conserved& que contiene alginato puede ser endurecida hasta crear una matriz de gel firme al reticularse internamente los polisacaridos de alginato con Ca luego cortar el gel en trozos pequefios mientras las bacterias y la mezcla de conservaciOn estan completamente retenidas dentro de la matriz de gel. Otro procedimiento de
reticulado de la solucion que contiene alginato y mezcla de conserved& es extrudiendo hilos o cuerdas delgados de la solucion en un bafio de Ca. Las cuerdas endurecen instantaneamente tras la interacci6n con el Ca. Las cuerdas delgadas son recogidas, enjuagadas con agua potable y luego empapadas nuevamente en la solucion de conservaciOn, pero sin la presencia de polisacaridos. Otro procedimiento adecuado es inyectar los hilos delgados en el befio de Ca, que tambien contiene una mezcla de conserved& con igual concentraci6n y proporci6n que las de la soluciOn extrudida. Un procedimiento alternativo de preparaci6n de la matriz es atomizar la mezcla al interior de un balk) que contiene cationes de Ca. En tal procedimiento se producen pequefias microparticulas de 50 a 500 micr6metros. Tales particulas son recogidas, enjuagadas y empapadas en el medio de conservaciOn, o el propio bah� puede contener la mezcla de conserved& segun se ha descrito mas arriba para la producci6n de los hilos o las cuerdas delgados.
Semonitoriza constantemente el nivel de Ca el batio y solo se afiade de una vez una cantidad suficiente de cationes necesaria pare reticular el alginato. Esto elimina la necesidad de enjuagar el exceso de Ca las cuerdas
o particulas, reteniendo con ello todo el azucar en la matriz, que, Si no, se perderia por lavado. En un modo preferente de la presente invencion, monitorizar los cationes de Ca un intervalo del 0,25-0,5% p/v en el bark) reticulante es suficiente para endurecer la soluciOn de alginato extrudido sin ningim dello a las bacterias probioticas.
Laproteccion gastrica y el desencadenante de la liberacion controlada tambien se cumplen mediante el uso del polisacarido de alginato. Una matriz polimerica que contiene alginato permanece firme en el entorno acid� del est6mago, protegiendo con ello a las bacterias, pero se desintegra rapidamente en el entorno de mayor pH y rico en fosfatos del intestino. Esto da como resultado la liberacion de las bacterias probi6ticas en su lugar de acci6n en el intestino.
El prop6sito de la mezcla de conserved& es proporcionar protecci6n contra derives de temperatura y humedad del producto final sin la indebida perdida de viabilidad de las bacterias probi6ticas. Una mezcla ideal contiene una combined& de sacaridos y alcoholes de azucar que forman una fase vitrea amorfa con una temperatura de transiciOn vitrea (Tg) muy por encima de la temperatura ambiente y actividad hidrica del producto. La trehalosa por Si sole no siempre es suficiente para estabilizar las bacterias, especialmente con una temperatura y una humedad
elevadas. Se descubrio que una mezcla mas adecuada era una combined& de trehalosa y alcohol de azircar adicional, que proporciona un efecto sinergico de mayor proteccion y viabilidad celular mejorada en periodos de conserved& prolongados. Adernas de alcoholes de azircar y otros polialcoholes de cadena large, otros conservadores incluyen sacarosa, lactosecarose, refinose, maltodextrosa, sefarosa y dextrano. Estos compuestos pueden mejorar sinergicamente la conserved& de ciertas especies de bacterias.
La concentraci6n y la proporcion de diferentes hidratos de carbono en la mezcla de conserved& dependen de varios factores, y, muy en particular, de la especie de las bacterias, de su cepa y de las condiciones de secado. La presente invenciOn da a conocer varies concentraciones optimas y proporciones de azucares adecuadas para su inclusion en la mezcla de conservaciOn para varies bacterias probioticas. Preferentemente, la concentraciOn de hidratos de carbono deberia ser inferior a aproximadamente el 50%, ya que concentraciones mayores pueden
interferir en el secado efectivo.
La mezcla de conserved& puede incluir opcionalmente otros aditivos que contribuyen a la estabilidad general de las bacterias probiOticas. Aditivos adecuados incluyen proteinas, aminoacidos, diluyentes, quelantes, tampones, conservantes, estabilizadores, antioxidantes y lubricantes. Ejemplos especificos de tales aditivos incluirian, sin limitacion: aminoacidos: lisina, glicina, leucina L, isoleucina, arginina, cisteina; proteinas: proteinas del plasma humano, albumina de huevo, gelatine; tampones: diversos tampones de fosfato de sodio, tampones citricos/de
citrato; conservantes: derivados de los acidos hidroxibenzoicos; antioxidantes: vitamina E, acido ascorbico;
lubricantes: silicona/silicatos miscibles en agua; quelantes: acid� citrico, EDTA, EGTA.
En un modo preferente de la presente divulgaciOn, el gel cortado o los hilos o las cuerdas delgados son secados de tal modo que se forme un vidrio. Pueden emplearse varios procedimientos de secado, incluyendo, sin limitacion,
secado al aire a temperatura ambiente, secado por pulverizacion, secado en lecho fluidizado, secado al vacio y liofilizado. Segun se usa en el presente documento, el vidrio que contiene las celulas bacterianas secadas contiene, preferentemente, un contenido de humedad residual inferior a aproximadamente el 5% y, mas preferentemente, inferior a aproximadamente el 2%.
Preferentemente, el secado se Ileva a cabo al vacio en un liofilizador con una temperatura del producto por encima
dela temperatura de congelacion del agua en tales condiciones. En general, el secado por vacio se Ileva a cabo en dos etapas. La primera etapa implica una presi6n moderadamente reducida (ca. 333,31 Pa) a temperaturas templadas (20�C), mientras que la segunda etapa implica presiones menores (es decir, un vacio mayor: 13,33 Pa) a temperatura mas alta (hasta aproximadamente 50�C). Puede lograrse este procedimiento usando un sistema de control programable para la presion de vacio y la temperatura del producto. Las condiciones de vacio y de
temperaturas para la primera etapa de secado son ajustadas empiricamente segOn el tame() del secador, la capacidad de transferencia del calor y la carga de producto, pero la meta es mantener el producto por encima de su temperatura de congelacion maximizando la tasa de evaporacion del agua. En una realizacion, la temperatura se mantiene inicialmente a aproximadamente 20�C durante aproximadamente 16 horas, seguido por un aumento gradual de la temperatura hasta aproximadamente 50�C durante las 48 horas siguientes. Estas condiciones de secado permiten la formacion de un estado vitreo en el que las bacterias estan bloqueadas en un estado latente dentro de la matriz de polisacaridos.
En una realizacion preferente, las bacterias probioticas son secadas como sigue: la presi6n inicial de vacio se regula a aproximadamente 333,31 Pa, con una temperatura inicial de almacenamiento de 40�C durante 12 horas, seguido por una reduccion incremental de la presion atmosferica (es decir, aumento del vacio) hasta menos de 13,33 Pa a una tasa de 16,67 Pa/hora. Una vez que el vacio alcanza 13,33 Pa, se mantiene la muestra a 40�C durante 12 horas adicionales. Siguiendo este protocolo, el procedimiento de secado se completa en menos de 48 horas sin comprometer sustancialmente la viabilidad. Segun la presente invencion, la gran area superficial del gel o las cuerdas cortados o picados aumenta muchisimo la tasa de evaporacion sin la necesidad de hervir ni espumar el producto, eliminando asi condiciones incoherentes de secado y salpicaduras de la solucion espumante del producto
enla camara de vacio. Ademas, la composici6n y el procedimiento de secado dados a conocer dan como resultado una mayor capacidad de carga de producto en comparaci6n con el procedimiento de secado por espuma, que permite unicamente que se espume y se segue eficientemente una capa delgada de la solucion.
Un procedimiento alternativo de secado para las cuerdas o las particulas de la matriz recien preparadas incluye una desecacion controlada de la matriz mediante adiciOn del hidrogel hasta un cierto volumen (preferentemente 1:10 en peso) de sacarido seco en polvo, tal como trehalosa o mezcla seca pulverizada de conservacion. Durante este procedimiento, el hidrogel es desecado rapidamente a temperatura ambiente, concentrandose el material de conservaciOn en la propia matriz. Preferentemente, el procedimiento se realiza contracorriente, ariadiendose por un extremo de la corriente de tratamiento la matriz de hidrogel completamente hidratado que contiene las bacterias y, desde la direccion opuesta, flujos de sacaridos de conservacion secos en polvo (Figura 1). El material humedecido
delos sacaridos en polvo se seca a temperatura elevada y vuelve a usarse mientras que el hidrogel parcialmente desecado va entonces a la segunda etapa de secado por vacio descrita mas arriba. Este procedimiento reduce significativamente el tiempo de secado y los costes de tratamiento.
El material vitreo resultante acotado por la matriz, que contiene las bacterias probioticas secadas y estabilizadas tiene una Tg suficientemente elevada para conservar las bacterias a temperatura ambiente (hasta 30�C) con una humedad relativa del 33%. Generalmente, cuanto mas alta sea la Tg, mayores seran la temperatura y la humedad permisibles de conservacion. La Tg de la mezcla de conservacion vitrea seca de la presente invencion es determinada usando tecnicas estandar de la tecnica, tales como la calorimetria diferencial de barrido.
Los procedimientos y las composiciones de la invencion facilitan el desarrollo de varios productos, incluyendo, sin vacunas de bacterias vivas en forma estable seca, nutraceuticos (probioticos) bacterianos vivos en forma estable seca, fermentos bacterianos vivos en forma estable seca, bacterias vivas en forma estable seca para usos agricolas, en acuacultura o biorremediaci6n, y cultivos de bacterias vivas en forma estable seca para la industria
biotecnologica.
Los ejemplos siguientes ilustran diversos aspectos de la presente invenciOn relativos a la produccion de un vehiculo de administracion que comprende una matriz seca y estable de polisacaridos, sacaridos, polioles y bacterias probi6ticas en forma vitrea. Las composiciones y los procedimientos de secado esta adaptados para estabilizar y conservar varias bacterias probioticas en almacenamiento y un entorno gastrico.
Ejemplos
Ahora se describe la materia de esta divulgacion con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son
facilitados Cinicannente con fines ilustrativos, y la materia no esta limitada a estos ejemplos, sino que, mas bien,
abarca todas las variaciones que son evidentes como resultado de la enserianza proporcionada en el presente
documento.
5 Ejemplo 1
Se mezclo almidon con alto contenido de amilosa (100 g de Novation�, National Starch and Chemical, Bridgewater, Nueva Jersey) con 150 ml de agua a temperatura ambiente. A continuacion, la mezcla de almidon fue ariadida lentamente a 850 ml de agua en ebullicion con un mezclado vigoroso usando una batidora domestica estandar. Una vez que se observe) una completa dispersi6n de los granulos de almidon (usando un microscopio binocular), se dejo 10 enfriar la solucion de almidon y, a continuaci6n, se disolvieron en la mezcla 300 g de trehalosa y 100 g de isomaltitol (ambos de Cargill Minneapolis, Minnesota). Se arladio alginato de sodio (15 g) a la suspension espesa y se dej6 enfriar toda la mezcla hasta la temperatura ambiente. A continuaciOn, se mezclo bien Lactobacillus paracasei (200 g de pasta congelada, directamente de la recoleccion de fermentacion) en la suspension espesa y la suspensi6n espesa fue extrudida al interior de un ban� de 1000 ml (mantenido a 0-5�C) que contenia 5 g de CaCl2, 300 g de
15 trehalosa y 100 g de isomaltitol usando una jeringa equipada con una aguja 18 G. El ban� de CaCl2 fue agitado ligeramente mientras se inyect6 la suspensi6n espesa. Se dej6 que las cuerdas de la matriz se reticulasen durante 30 minutos y luego fueron recogidas y escurridas sobre una toalla de papal. La Tabla 1 proporciona la composici6n de la matriz de gel.
Tabla 1. Composicion de la matriz de gel (g peso seco/100 g)
amilosa elevada (70% de amilosa) 10g
trehalosa 30g
isomaltitol 10g
alginato de sodio 1,5g
L. paracasei 20 g
agua 100g 20
Los hilos delgados fueron cargados en una bandeja (13 x 25,4 cm) y colocados en un liofilizador (Vials Advantage, Virtis, Gardiner, Nueva York). Se fijo el condensador a -70�C y se fijo la temperatura de almacenamiento a 40�C. Cuando el producto se hubo calentado hasta la temperatura de almacenamiento (medida por un par de sensores de temperatura metidos en el material humedo), se inicio y se controlo el vacio a aproximadamente 333,31 Pa con un 25 controlador extern() de vacio (Thyr-Cont, Electronic, GmbH). A medida que disminuye) la presion atmosferica, la temperatura del product� cayo y se estabilizO a aproximadamente -2�C. Despues de 12 horas, la temperatura del producto habia aumentado hasta aproximadamente 10�C. En este punto, la presion atmosferica cayo en aproximadamente 66,66 Pa cada 4 horas hasta que se establecio la presiOn de vacio total de 1,33 Pa. En este periodo de tiempo de vacio creciente, se mantuvo cuidadosamente la temperatura del producto a o por encima de
30 5�C. Doce horas despues de establecer el vacio total, el producto secado fue sacado del liofilizador y triturado hasta obtener un polvo fino usando un molinillo de café estandar.
Ejemplo 2
Se atiadieron 100 g de trehalosa y 300 g de isomaltitol (ambos de Cargill Minneapolis, Minnesota) a 1000 ml de agua y se dej6 que se disolvieran. Se mezclo alginato de sodio (15 g) en la suspensi6n espesa y se dej6 enfriar
35 hasta la temperatura ambiente. A continuaciOn, se atiadio Lactobacillus paracasei (200 g de pasta congelada, como en el Ejemplo 1) a la suspension espesa, seguido por 5 g de fosfato calcico dibasic� y 5 g de gluconolactona. Se dej6 que la suspension espesa reticulase a temperatura ambiente durante las 4 horas siguientes. El gel firme fue cortado formando hilos delgados y largos pasando por un rallador de queso y escurriendo sobre una toalla de papal. La Tabla 2 proporciona la composiciOn de la matriz de gel.
Tabla 2. Composicion de la matriz de gel (g peso seco/100 g) trehalosa 10g isomaltitol 30g alginato de sodio 1,5g
L.paracasei 20 g agua 100g
40 Los hilos delgados fueron cargados en una bandeja (13 x 25,4 cm) y colocados en un liofilizador para su secado segun se ha esbozado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Se atiadieron 300 g de trehalosa (Cargill Minneapolis, Minnesota) y 100 g de manitol (Sigma) a 1000 ml de agua y se dej6 que se disolvieran. Se mezclaron alginato de sodio (15 g) y pectina (5 g) en la suspension espesa y se dejO 45 ala suspensiOn espesa enfriar hasta la temperatura ambiente. Se mezclo bien en la suspension espesa
Lactobacillus acidophilus (200 g de pasta congelada, directamente de la recoleccion de fermentaciOn). Acto seguido,
la suspension espesa fue extrudida par media de una jeringa equipada con una aguja 18 G al interior de un batio de
1000 ml (0-5�C) que contenia 5 g de CaCl2, 300 g de trehalosa y 100 g de manitol. El ban() de CaCl2 fue agitado
ligeramente mientras se extrudi6 la suspension espesa. Se dej6 que las cuerdas formadas se reticulasen durante 30 5 minutos y luego fueron recogidas y escurridas sabre una toalla de papal. La Tabla 3 proporciona la composici6n de
la matriz de gel.
Tabla 3. Composicion de la matriz de gel (g peso seco/100 g)
trehalosa
30 g
manitol
10 g
alginato de sodio
1,5g
pectina 0,5g
L. acidophilus 20 g agua 100g
Los hilos delgados fueron cargados en una bandeja (33 x 25,4 cm) y colocados en un liofilizador para su secado segun se ha esbozado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 4
10 Optimizacion de la concentracion de trehalosa en el media de conservacion
Se anadio L. rhamnosus seco en polvo (LCS -742, Morinaga Milk Industry Co., LTD., Kanagawa, Japan) a diversas concentraciones de trehalosa en un media de cultivo bacteriano y (L.MRS) y se dej6 que se desecara en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 3 dias. Al final del periodo de secado de tres dias se midio la viabilidad de las bacterias en funci6n de la concentracion de trehalosa. Se reconstituyeron el polvo bacteriano
15 seco o muestras desecadas en tampon esteril de 50 mM PBS, pH 7,4. Tras la homogeneizacion, las soluciones de los cultivos reconstituidos fueron diluidas (en incrementos de magnitudes de 10) en tamp6n de PBS y puestas en placas par triplicado sabre agar L.MRS. Tras la incubacion a 35�C durante 48-72 horas, se determin6 el numero de unidades formadoras de colonias (UFC) y se descubrio que la viabilidad de L. rhamnosus era maxima con una concentraci6n inicial de trehalosa de 0,5 M (Figura 2).
20 Ejemplo 5
Efecto de diferentes alcoholes de azkar sabre la conservacion de L. paracasei
Se prepar6 y se sec6 L. paracasei segun se ha descrito en el Ejemplo 2, salvo que la concentracion total de azkar era del 24% y la concentraci6n de almidOn era del 2% en el media de conservaciOn. Se someti6 a ensayo a varios alcoholes de azOcar para averiguar su efecto sabre la viabilidad de las bacterias despues del secado. La Figura 3
25 muestra que la trehalosa y el sorbitol proporcionaron la mejor proteccion para las bacterias usando este procedimiento de secado y conservacion.
Ejemplo 6
Efecto de diferentes alcoholes de azOcar sabre la conservacion de L. acidophilus
Se secO L. acidophilus segOn se describe en el Ejemplo 3, salvo que se usaron proporciones diferentes de
30 trehalosa/manitol o trehalosa/isomaltitol y la mezcla final contenia una combinaciOn de 3 polisacaridos (2% almidon, 1% alginato de sodio y 0,5% pectina). En la Figura 4 se muestra la viabilidad de L. acidophilus tras el secado par vacio. En todos los casos, las bacterias conservadas tenian una viabilidad mucho mayor en comparaciOn con bacterias secadas sin las mezclas de sacaridos/polioles, y las diferentes proporciones entre sacaridos y polioles
usadas en las mezclas de conservacion produjeron prestaciones de proteccion similares para L.acidophilus.
35 Ejemplo 7
Estabilidad de L. acidophilus a 45�C al 0% o el 33% de humedad relativa
Se seco L. acidophilus segun se describe en el Ejemplo 6. Las bacterias secadas fueron puestas en una incubadora con control de la temperatura y la humedad regulada a 45�C y al 0% de humedad relativa, o a 45�C y al 33% de humedad relativa durante 4 horas. La viabilidad de las bacterias fue medida antes y despues de la exposicion a la
40 temperatura y la humedad. La Figura 5 muestra que la mezcla de polisacaridos (2% almidon, 1% alginato de sodio y 0,5% pectina) proporciono proteccion adicional a la de trehalosa/isomaltitol par si solos o la de bacterias libres.
Ejemplo 8
Estabilidad de la composici6n de la presente invencion en jugos gastricos simulados
9
Se prepararon y se secaron L. acidophilusy L.paracaseisegun se ha descrito en el Ejemplo 2. A continuaci6n, las bacterias de la matriz vitrea seca en polvo fueron expuestas durante 2 horas a jugo gastric� simulado (despues de corner: 12% de !eche desnatada, 2% de glucosa, 1% de extracto de levadura y 0,05% de cisteina; pH 2; o en ayunas: 0,32% de pepsina, 0,2% de cloruro sodico; pH 1,2). Se registraron las viabilidades bacterianas antes y
5 despues de la exposicion a los jugos gastricos simulados. Las Figuras 6 y 7 demuestran una protecci6n significativa de las bacterias en la composicion de secado de la presente invencion en las diferentes condiciones gastricas.
Ejemplo 9
Se ariadieron 300 g de trehalosa (Cargill Minneapolis, Minnesota) y 100 g de albumina de huevo (Sigma) a 1000 ml de agua y se dej6 que se disolvieran. Se mezclaron alginato de sodio (15 g) y pectina (5 g) en la suspension espesa 10 yse dejo a la suspension espesa enfriar hasta la temperatura ambiente. A continuacion, se ariadio a la suspension espesa Lactobacillus GG (200 g de pasta congelada, directamente de la recolecciOn de fermentaci6n), seguido por 5 g de fosfato calcico dibasic� y 5 g de gluconolactona. Se dej6 que la suspensi6n espesa reticulase a temperatura ambiente durante las 4 horas siguientes. El gel firma fue cortado formando hilos delgados y largos pasando por un rallador de queso y escurriendo sobre una toalla de papal. La Tabla 4 proporciona la composici6n de la matriz de
15 gel.
Tabla 4. Composicion de la matriz de gel (g peso seco/100 g)
trehalosa 30g
albornina de huevo 10g
alginato de sodio 1,5g
pectina 0,5g
Lactobacillus GG 20 g
agua 100g
Los hilos delgados fueron cargados en una bandeja (13 x 25,4 cm) y colocados en un liofilizador para su secado segun se ha esbozado en el Ejemplo 1.
Ejemplo 10
Estabilidad de la composici6n de la presente invencion a 40�C y al 15% o el 33% de humedad relativa
20 Se sec6 Lactobacillus GG segim se ha descrito en el Ejemplo 9. Las bacterias secadas fueron puestas en una incubadora con control de la temperatura y la humedad regulada a 40�C y al 15% de humedad relativa, o a 40�C y al 33% de humedad relativa durante 4 semanas. La viabilidad de las bacterias fue medida cada 7 dias. La Figura 8 muestra que la mezcla de hidratos de carbono/polisacaridos/albiimina de huevo (30% trehalosa, 10% alburnina de huevo, 1,5% alginato de sodio y 0,5% pectina) proporcion6 proteccion adicional a la de trehalosa/isomaltitol por Si
25 solos o la de bacterias libres.
Referencias
En el presente documento se cita la siguiente bibliografia:
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Aunque se ha divulgado esta materia con referencia a realizaciones especificas, es evidente que los expertos en la tecnica pueden idear otras realizaciones y variaciones sin apartarse de la materia descrita en el presente documento. Las reivindicaciones adjuntas incluyen todas las realizaciones y las variaciones equivalentes de ese tipo.

Claims (4)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composicion seca en forma vitrea solida adecuada para su administraci6n oral, comprendiendo la composici6n una mezcla que incluye al menos un polisacarido, un sacarido, un poliol y bacterias probi6ticas, en la que el sacarido es trehalosa y la proporci6n entre el sacarido y el polio! es 3:1 a 1:3.
    5 2. La composici6n segOn la reivindicacion 1 en la que el poliol se selecciona del grupo constituido por glicerol, manitol, maltitol, isomaltitol, adonitol, lactitol y sorbitol.
  2. 3. La composici6n segun las reivindicaciones 1 o 2 en la que el polisacarido se selecciona de almidOn, de almidOn no digestible, de pectina, inulina, goma xantana, alginato, acid� alginico, quitosano, carragenano, carboximetil celulosa, metil celulosa, goma guar, goma arabiga, goma garrofin y combinaciones de los mismos.
    10 4. La composici6n segun la reivindicacion 1 en la que las bacterias probi6ticas se seleccionan del grupo constituido por Lactobacillus,Bifidobacterium,Enterococcus,Propionobacterium,BacillusyStreptococcusvivos.
  3. 5. La composici6n segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en la que la composici6n es secada al vacio por evaporacion y sin espumado ni formaci6n de hielo, y en la que la composici6n proporciona protecci6n gastrica de la bacteria probi6tica.
    15
    Fig. 1
    del haft() al secado de Ca' por vacio
    -0"cuerdas" de la matriz "cuerdas"1Z la matriz
    de hidrogel hinneda parcialmente desecada
    \bandeja de/ \andeja de/ \bandeja dy \cedazo cedazo \cedazo
    4419 trehalosa en polvo trehalosaen polvo humedecida seca
    reciclar (secado)
    Fig. 2
    Efecto de la concentracion de trehalosa en el medio de secado sobre la viabilidad de L.rhamnosus
    0,1
    0,0 0 100 200 300 400 500 600
    Concentracion de trehalosa (mM)
    Fig. 3
    Efecto de los sacaridos y los polioles (24% p/v en el medio de secado) sobre la viabilidad de L.paracaseitras el secado al vacio
    2,50E+10
    -a.
    . 5
    E 2,00E+10
    (DC
    1,50E+10
    o Antes de t. seco
    1,00E+10
    — • Despues de t. seco
    E
    C
    5,00E+09 —
    0
    u_
    0,00E+00
    Ningun azucar Sorbitol
    Trehalosa Adonitol Xilitol
    Fig. 4
    Efecto de la liofilizacion sobre la viabilidad del L. acidophilus en diferentes proporciones de sacaridos/polioles:
    1,E+11
    1,E+10
    1,E+09
    —1,E+08
    —1,E+07
    —1,E+06 Bacterias fibres 3:1 Tre/ Man 3:1 Tre/ leo 2:2 Tre/ Is� 1:3 Tre/ Iso
  4. 3. ) N
    Fig. 5
    Viabilidad de L. acidophilus tras 4 horas a 45 grados C a diferentes porcentajes de humedad relativa:
    90 80 70 60 50 40 30 20 10 o
    I Bacterias libres 3:1 trefiso mezcla de polisacaridos + 3:1 trediso 045C; 33%HR • 45C; 0%HR
    Fig. 6
    Efecto de diferentes jugos gastricos sobre L.paracaseiseco libre y encapsulado en una mezcla de polisacaridos/sacaridos/polioles
    o Control
    1,E+12
    • JG despues de corner 1,E+11
    JG en ayunas 1,E+10 ,E+09 1,E+08 1,E+07 1,E+06
    N'T
    1,E+05 Alginato + 3:1 trefiso Bacterias libres
    Fig. 7
    Efecto del jugo gastric� estomacal en ayunas sobre L. acidophilus en forma libre seca o encapsulado en una mezcla de alginatos/sacaridos/polioles
    1,E+09
    —1,E+08 1,E+07 1,E+06
    1,E+05 0Ningun JG 1,E+04 •JG
    1,E+03 1,E+02 1,E+01 1,E+00 1 1
    Bacterias secas libres Alginato + 3:1 tre/iso
    • m 4
    Fig. 8A
    Perdida de L. GGtras cuatro semanas a 40�C con una humedad del 15%
    1,E+10
    1,E+09
    --e--Tre/lso --IN--Tre/alb. huevo
    1,E+08
    1,E+07 0 1 2 3 4 5 Tiempo (semanas)
    Fig. 8B
    Perdida de L.GGtras cuatro semanas a 40�C con una humedad del 33%
    1,E+10 ,
    1,E+09
    --*--Tre/lso
    1,E+08
    —is— Tre/alb. huevo
    —1,E+07
    1,E+06 ,
    5
    o 1 2 34
    Tiempo (semanas)
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