CN108472321B - 用于保存在生态系统中的微生物群的冻干组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种冻干组合物，其包含在生态系统中的微生物群(具体是排泄物)以及包含麦芽糖糊精和海藻糖的冷冻保护剂混合物，包含所述冻干组合物的胶囊，其用途及其制备方法。

Description

用于保存在生态系统中的微生物群的冻干组合物
技术领域
本发明涉及以冻干产物形式保存在生态系统中的微生物群(MDSE)的领域。更具体地，本发明涉及一种冻干的粪便组合物，其中排泄物微生物群可以保存长达数月，用于人移植目的。本发明还涉及所述组合物在人或动物中的治疗用途，特别是以用于口服施用的胶囊形式。
背景技术
许多研究已经证明了排泄物微生物群移植(TMF)对涉及在生态系统中排泄物微生物群失衡的某些病理的治疗性处理的重要性，在生态系统中排泄物微生物群失衡称为生态失调，如，例如艰难梭菌(Clostridium difficile)感染及其复发(Van Nood E.等人，2013)。TMF已经与高水平的临床证据相关联，因此在最新的欧洲(Debast SB等人，2014)和北美(Surawicz CM等人，2013)建议中提及了用于该目的的这种技术的实施。还设想将这种技术在其它生态失调的病理环境中实施，如炎性肠病、肠易激综合征、代谢综合征、肥胖症、糖尿病、耐多药细菌或神经系统发育障碍，其病因是不确定的或未知的(Vrieze A.等人，2013，Kelly CR等人，2015)。
尽管近年来医学界显示出热情，并且出现患者需求，目前还没有标准化的程序来进行TMF，也没有用于选择供体的方法、用于准备粪便的方法或选择施用途径的方法。
一般地，供体是在临床检查的基础上并且在筛选大范围的病原体(如细菌、病毒或寄生虫)之后选择的，这是在进行捐赠之前进行的；这导致潜在供体的验证率低于20％(Borody T.等人，2015)。除了获得病原体结果的延迟之外，这严重限制了可用捐赠的数量。
进行TMF施用的模式是不同的。排泄物微生物群可以通过鼻饲或鼻十二指肠探头，在结肠镜检查过程中施用，或者通过直肠灌肠施用(Kelly CR.等人，2015)，每种方法具有其自身的优势和缺点。例如，鼻饲或鼻十二指肠途径可被被治疗者严重感知，并且可以诱发呕吐或食入风险，在插入探头期间需要X射线监测。使用结肠探头是感兴趣的，因为它允许在施用期间观察粘膜；然而，它也具有显著的发病因素并且成本高。最后，直肠灌肠方法更容易实施并且成本更低；然而，难以确保施用的物质被治疗的个体保留。由于部分患者对制剂的感官性质不情愿，这些问题而变得更加复杂。
“Groupe
Figure BDA0001695966250000021
de Transplantation Fécale”(法国排泄物移植组织)关于艰难梭菌结肠炎(Sokol H.等人，2015)的目前建议和ANSM临床试验(ANSM，2015)的目前建议涉及在排便后6小时内发生施用。为了促进获得捐赠，建议在-80℃冷冻保存排泄物制剂，因此可供使用。它们的功效类似于采用新鲜物质移植所观察到的(Hamilton MJ等人，2012，Youngster I.等人，2014a，Lee等人，2016)。这些冷冻制剂需要在含有冷冻保护剂的溶液中稀释以保护微生物群免受冷冻的作用。文献中描述的用于冷冻用于移植目的的粪便的唯一冷冻保护剂是浓度为10％的甘油。采用含甘油的冷冻制剂进行的移植的有效性在其制剂后维持长达5个月(Younster I.等人，2014a)。
报道了填充了该物质并储存在-80℃的胶囊的口服施用具有令人满意的结果(Youngster I.等人，2014b；Younster等人，2016)。因此，这种制剂类型开创了一种盖伦(galénique)方法的新前景，促进向接受治疗的人，特别是患者施用。然而，它目前仍然涉及高度经验性的生产，并且需要在-80℃下保存，这导致储存问题。
因此，对粪便制剂的需求未得到满足，其中促进其制剂和储存，同时在其储存期间保持排泄物微生物群的原始质量。这种粪便制剂必须以盖伦形式提供，其通过舒适和非侵入性的施用途径使起初的小体积施用成为可能。
发明内容
在这种情况下，本发明人开发了一种在优化的冷冻保护剂混合物中稀释的冻干粪便组合物，以促进排泄物制剂的生产、可用性和长期储存，同时改善正在接受治疗的人的可接受性和舒适性。
冻干是制药工业中用于保存细菌菌株的保存方法。应在最佳条件下进行冻干，以维持不同细菌属的活力和平衡，特别是在复杂混合物的情况，如一般是MDSE，以及尤其是粪便的情况。使用合适的冷冻保护剂可确保细菌冷冻时全部或至少部分存活。
有三类用于活体生物体(具体用于细菌)的冷冻保护剂分子：
-具有高分子量并保持在细胞外介质中的分子，如蛋白和多糖，其促进冷冻阶段期间水从细胞流出，从而限制细胞内冰晶的形成。通过增加细胞外介质的粘度，这些分子还降低晶体生长；
-能够穿过细胞壁的分子，如氨基酸和寡糖；
-渗透细胞壁和细胞质膜的分子，如DMSO和甘油(Carvalho A.S.等人，2004)。
第二和第三类的渗透剂限制了细胞脱水并降低细胞内的冷冻温度，由此降低了盐浓度并降低了渗透压休克(BéaIC.等人，2015)。
为了优化排泄物微生物群的活体生物体的保存，发明人评估了单独或组合使用的几种冷冻保护剂。一般用于采用冷冻物质进行的TMF的10％甘油(Hamilton MJ等人，2012；Youngster I.等人，2014a)似乎不适合于生产冻干产物。在测试的冷冻保护剂中，两种已显示出一些希望：麦芽糖糊精和海藻糖。尽管海藻糖产生了良好的结果，在保持微生物群的活力(图1和图2)和维持其多样性(图5)方面，采用麦芽糖糊精和海藻糖的混合物所获得的结果进一步得到改善。维持多样性特别重要，因为TMF的目的正是为了恢复接受者肠生态系统中不同群体之间的平衡。麦芽糖糊精和海藻糖混合物对微生物群的保护作用在冻干后至少3个月，甚至在此后7个月内观察到(图3、图6和图7)。此外，麦芽糖糊精和海藻糖的混合物更有利于维持显示出氧极端敏感(EOS)的细菌(如柔嫩梭菌(Clostridium leptum)群体)的细菌的活力(图4和图8)。此外，与天然粪便相比，指示排泄物微生物群的功能能力的细菌代谢物(如短链脂肪酸)的浓度在冻干产物中得以保持甚至增加(图9)。最后，对于2株艰难梭菌，其中一种是产毒的(toxinogène)(菌株630)和另一种是非产毒的(PCD1菌株)，通过抑制细菌生长而体外证明了冻干产物的抗艰难梭菌活性(图10)。
因此，本发明涉及一种冷冻保护剂混合物用于保存冻干形式的在生态系统中的微生物群(MDSE)的用途，其特征在于，所述冷冻保护剂混合物包含麦芽糖糊精(M)和海藻糖(T)，其中M/T重量比为35/65至45/55。
麦芽糖糊精是一种不渗透细胞壁的多糖冷冻保护剂，而海藻糖是一种渗透细胞壁的寡糖冷冻保护剂。
术语“在生态系统中的微生物群”或MDSE描述了一种微生物群，其组成与体内天然存在的微生物群相比不变。微生物群及其生态系统构成复杂而丰富的混合物，主要由细菌、真菌、病毒和噬菌体组成，但也包括细胞碎片、由肠细胞和固有层细胞分泌的许多肽和蛋白以及它们的排泄/分泌产物，如分泌型IgA、钙卫蛋白、细胞因子和防御素类型的其它抗炎或抗微生物肽、分泌或不分泌的细菌产物(包括代谢物如短链脂肪酸、细菌素，以及由微生物群的细菌或其它微生物产生的任何其它生物活性分子)、粘液、单糖和多糖类型碳水化合物以及微量元素。因此，MDSE是一种复杂的基质，可以被描述为活体的，并且在其中发生许多分子和细胞相互作用。
根据本发明，MDSE可以通过使用麦芽糖糊精和海藻糖的混合物以冻干形式储存。作为示例，可以通过这种方法保存的MDSE是肠微生物群，先前称为肠菌群，粪便中含有的排泄物微生物群，和先前称为阴道菌群的阴道微生物群。这些微生物群的示例中的每种都以本领域技术人员公知的优势菌群表征。
在一个优选实施方案中，待保存的MDSE由粪便组成。
根据本发明，术语“冻干”描述了通过冷冻产品然后通过在真空中不经过液态蒸发冰而从产品中去除水的方法，这是称为升华的现象。这种技术对于本领域技术人员是公知的。在冻干周期中有三个主要阶段：
-冷冻，产品在-20℃至-80℃的温度下冷藏；水变成了冰；
-在真空中初步干燥，这是间隙(interstitielle)游离冰经历升华的阶段；
-最后干燥，由此通过解吸来提取在干燥产物表面捕集的水分子。
在本发明中，术语“粪便”用于描述吸收食物、消化和通过肠道后获得的排泄物物质。粪便通常由其重量的75-85％的水和其重量的15-25％的干物质组成(脱落的肠细胞和固有层的免疫细胞及其排泄/分泌产物，如分泌型IgA、钙卫蛋白、细胞因子和其它抗炎或抗微生物肽……、构成微生物群的元素(细菌、病毒、真菌、噬菌体)和分泌或不分泌的细菌产物，包括代谢物如短链脂肪酸、细菌素，以及由微生物群的细菌或其它微生物产生的任何其它生物活性分子；粘液；细胞碎片包括来自植物难消化部分的纤维和纤维素、脂质、铁、微量元素……)。根据本发明，术语粪便描述健康个体最近的排便。人中供体的选择和粪便制剂可以根据“法国排泄物移植组织”(Sokol等人，2015)的建议中Kapel N.等人，2014的标题为“Practical implementation of faecal transplantation”的文章和ANSM建议(2015)定义的方案和条件进行。
在用于保存本发明冻干形式的粪便的冷冻保护剂混合物中，麦芽糖糊精(M)与海藻糖(T)一起使用，M/T重量比为35/65至45/55，优选40/60。
根据本发明的优选实施方案，混合物中存在的冷冻保护剂仅是麦芽糖糊精和海藻糖。
根据本发明的另一个实施方案，混合物中存在的冷冻保护剂包括麦芽糖糊精和海藻糖以及至少一种其它的冷冻保护剂，其选自甘露糖醇、山梨醇、果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、明胶、淀粉、胎牛血清和乳。
本发明还涉及一种冻干组合物，其包含在生态系统中的微生物群(MDSE)和冷冻保护剂混合物，其中所述冷冻保护剂混合物包含以35/65至45/55的M/T重量比使用的麦芽糖糊精(M)海藻糖(T)，优选具有40/60的重量比。
在根据本发明的组合物中，麦芽糖糊精与海藻糖使用，具有的M/T重量比为35/65至45/55，优选重量比为40/60。
根据本发明的一个优选实施方案，存在于冻干组合物中的冷冻保护剂仅是麦芽糖糊精和海藻糖。
根据本发明的另一个实施方案，存在于冻干组合物中的冷冻保护剂包括麦芽糖糊精和海藻糖以及至少一种其它的冷冻保护剂，其选自甘露糖醇、山梨醇、果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、明胶、淀粉、胎牛血清和乳。
根据本发明的冻干组合物含有MDSE和冷冻保护剂的混合物，分别地，其重量含量分别为冻干组合物的15％至35％和85％至65％，并且优选以18％至28％和82％至72％的重量含量。这些重量含量可以根据不同的参数而变化，所述参数包括MDSE样品的水化程度及其脂质含量、纤维含量和细胞碎片含量，特别是在粪便的情况中它们可以变化。本领域技术人员将调整重量含量以优化经冻干的组合物。
因此，发明人已经显示，将包含粪便以及包含麦芽糖糊精和海藻糖的冷冻保护剂混合物的组合物进行冻干，允许在超过至少6个月的延长期间维持排泄物微生物群的活力和生物多样性。他们还证明，可以维持冻干产物中细菌代谢物的产生。另外，他们已经显示了冻干产物在体外抑制艰难梭菌生长的能力。
根据本发明，术语“微生物群的活力”涉及排泄物微生物群的活体部分。
“排泄物微生物群的生物多样性”表示MDSE中不同的微生物群体。可以通过检查微生物群中有代表性的微生物群体的稳定性来评估其组成群体的保存。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种冻干组合物，其包含粪便和冻干保护剂混合物，所述冻干保护剂混合物包含M/T重量比为35/65至45/55的麦芽糖糊精(M)和海藻糖(T)，以及优选重量比为40/60。
在这个优选实施方案中，其中MDSE由粪便组成，粪便重量配比占冻干组合物的15-35％，以及冷冻保护剂混合物的重量配比占冻干组合物的85-65％。
在这个更优选的实施方案中，其中MDSE由粪便组成，粪便重量配比占冻干组合物的15％至35％，冷冻保护剂混合物的重量配比占冻干组合物的85％至65％，并且冷冻保护剂混合物包含M/T重量比为35/65至45/55的麦芽糖糊精(M)和海藻糖(T)，以及优选重量比为40/60。
除了通过保持属于厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的优势菌群之间的平衡来维持细菌负荷以及其活力和多样性之外，根据本发明的组合物相对于细菌菌株混合物(Allen-Vercoe E.等人，2013)具有显著优势。事实上，根据本发明的粪便组合物允许将排泄物微生物群保留在其原始天然生态系统(排泄物生态系统)中。不同的组分之间的相互作用以及这种复杂物质的功能能力因此得以保留，接受TMF的个体具有与移植新鲜粪便或施用细菌滤液相同的优势(Ott等人，2016)。
根据本发明，术语“排泄物生态系统”是指构成粪便的所有物质，即不仅是细菌、病毒、真菌和噬菌体，还有分泌或不分泌的细菌产物，包括代谢物如短链脂肪酸、细菌素以及微生物群的细菌或其它微生物产生的生物活性分子，以及脱落或处于细胞凋亡状态的肠细胞(肠上皮细胞、固有层的免疫细胞)及其排泄/分泌产物(分泌型IgA、钙卫蛋白、细胞因子和其它抗炎或抗菌肽……)、碳水化合物单糖和多糖元素，如来自植物难消化部分的纤维和纤维素、蛋白和脂质残留物、微量元素、粘液……
本发明的组合物特别适合口服施用。
例如，它可以是以胃耐受性胶囊或片剂的形式，或者不需要再水化或使用喷雾的颗粒剂，这取决于所治疗的个体。
根据本发明的一个具体实施方案，冻干组合物以胶囊或胃耐受性片剂的形式。这种形式特别适合用于人口服施用。根据本发明，术语“胃耐受性胶囊或片剂”是指耐受胃液的口服盖伦和肠溶形式。
这种制剂还可以含有药学上可接受的载体，其使得冻干组合物适合施用于接受治疗的受试者。这种载体优选是惰性的，并且在任何情况下都能够维持在生态系统中的微生物群的活力和多样性，并在适当的位置释放冻干组合物。
因此，本发明还涉及一种包含如上所述的冻干组合物的胃耐受性胶囊。
所述胶囊的填充，手工或工业进行，都是通过体积方式(volumétriquement)来实现的。为此，有必要将冻干产物粉碎并且使待分配的粉末具有良好的流动性以确保胶囊的常规填充(Le Hir等人，2016)。
粉末的流动性质可以采用欧洲药典(欧洲药典，2016年)的测试“2.9.16Ecoulement”评估，它测量了测试样品流过具有标准化尺寸的漏斗孔口所需的时间。10秒或更少的时间/100克粉末被认为是优异的流动。相反，不流动的粉末的流动时间被分级为“无限”。这是未加工的排泄物冻干产物的情况，因此不能以该形式用于填充胶囊。
为了克服这种限制，发明人开发了包含如上所述的冻干组合物的胶囊，其补充有流动赋形剂如流动稀释剂和润滑剂，其能够改善排泄物冻干产物的流动。
含有根据本发明的冻干产物的胶囊中所含的流动赋形剂选自无机赋形剂，如磷酸二钙、麦芽糖糊精、滑石、亲水胶体二氧化硅和疏水胶体二氧化硅。
因此，根据本发明，胃耐受性胶囊包含与至少一种流动赋形剂混合的根据上述定义的冻干组合物，流动赋形剂选自用于直接压制的流动润滑剂和/或流动稀释剂。
根据一个具体的实施方案，流动赋形剂是以一般为此目而实施的量使用的流动润滑剂；优选与冻干产物混合的润滑剂的量为冻干产物和润滑剂混合物重量的0.1％至1％，优选润滑剂的量为冻干产物和润滑剂混合物重量的0.5％。
流动润滑剂可以选自滑石、疏水胶体二氧化硅或亲水胶体二氧化硅；优选使用疏水胶体二氧化硅。
根据一个具体的实施方案，流动赋形剂是以一般为此目而实施的量使用的用于直接压制的稀释剂；优选与冻干产物混合的稀释剂的量为冻干产物和稀释剂混合物重量的10％至90％，优选为冻干产物和稀释剂混合物重量的15％至75％或25％至50％。
用于直接压制的稀释剂可以选自磷酸二钙或雾化麦芽糖糊精。
根据另一个具体实施方案，流动赋形剂包含如上定义的并且按照所述配比的流动润滑剂和用于直接压制的稀释剂。
例如，MDSE冻干产物和流动赋形剂混合物由以下组成：
-疏水胶体二氧化硅的配比为总混合物重量的0.1％至1％，优选为0.5％；
-亲水胶体二氧化硅的配比为总混合物重量的0.1％至1％，优选0.5％，磷酸二钙的配比为总混合物重量的10％至90％，优选15％至75％，优选25％至50％；
-滑石的配比为总混合物重量的0.1％至1％，优选0.5％，雾化麦芽糖糊精的配比为总混合物重量的10％至90％，优选15％至75％。
在这种情况下，由冻干组合物制备的胃耐受性胶囊的开发在制剂的感官性质、移植材料的可用性、制剂的保存和接受治疗的人的舒适性方面是显著的进步。
冻干可以去除粪便中存在的水。事实上，正常的粪便一般含有75％至85％的水配比。冷冻后，50g粪便对应于大约7.5-12.5g冻干的微生物群，向其中加入冷冻保护剂混合物。
与粪便施用(新鲜的或冷冻的粪便)相关的常规方法相比，能够以包括在胃耐受性胶囊中的冻干产物形式的施用，因此促进了标准化的制剂方法，并且改善了接受治疗的人的可接受性。因此，当在医疗实践中以冻干产物形式口服施用被良好建立时，可以降低发病率，并且可以降低排泄物移植的成本。事实上，TMF作为冻干制剂的口服施用将不再涉及需要专业人员和需要日间住院的技术方法，如目前通过鼻十二指肠施用、结肠镜检查或直肠施用新鲜或冷冻的粪便制剂的情况。与冷冻胶囊施用相比，以冻干产物形式施用将促进制造和储存方法，从而改善制剂的标准化。此外，冻干制剂的使用将改善TMF设备的可及性，这是对可能遇到的紧急情况作出响应时的关键点，例如，在复发性艰难梭菌感染的情况下。
因此，本发明还涉及一种通过冻干保存粪便的方法，以及涉及如上定义的冷冻保护剂混合物的用途。通过确保如上所述的微生物群的持续活力和多样性，该方法允许将冻干的粪便保存至少3个月，以及保存长达7个月甚至更长期间。
根据本发明保存的冻干粪便可以作为同种异体或自体TMF的一部分施用。事实上，TMF可以包括在相同物种的两个个体之间转移粪便，或者在相同个体施用，在给定时期，起初是健康的供体，并且在以后成为接受治疗的人。因此，健康个体随后可以在他/她需要的时期使用包含由他/她的捐赠制成的粪便制剂的冻干组合物。
本发明的另一个目的涉及一种如上所述的冻干组合物或胃耐受性胶囊，其用作药物的用途。
因此，本发明涉及上述冻干组合物或胃耐受性胶囊，用于治疗与肠微生物群失衡相关的疾病或病症的用途。
事实上，肠微生物群是一种持续自身调节的平衡生态系统。不同的攻击有可能打破这种平衡。营养不良是由于过量的有害微生物和/或对宿主有益的微生物相对不足造成的微生物多样性损失或失衡。因此，根据本发明的冻干组合物的指示的用途与生态失调相关用途相同。因此，术语“与肠微生物群失衡相关的疾病或病症”被认为包括艰难梭菌结肠炎及其复发、慢性炎性肠病如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎、肠易激综合征、耐多药细菌的存在、便秘、旅行者腹泻、胃肠感染、自身免疫性疾病、憩室病、1型和2型糖尿病、代谢综合征、肥胖症、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和骶髂关节炎、慢性疲劳综合征、口臭、过敏症、痤疮、失眠症、抑郁症和神经精神疾病，如，例如帕金森病和自闭症谱系疾病。
在优选的实施方式中，根据本发明的冻干组合物用于治疗艰难梭菌结肠炎。在这种情况下，保存在冻干产品中的细菌代谢物的存在可以在对抗艰难梭菌中具有主要的有益作用。
冻干组合物也可用于治疗炎性肠病、耐多药细菌、1型和2型糖尿病、代谢综合征、肥胖症和自闭症谱系疾病。
保护与微生物群相关的环境可显著促进TMF的治疗作用。
根据本发明的冻干组合物或胃耐受性胶囊还可以用作接替口服抗生素治疗，如甲硝唑或万古霉素(用于治疗艰难梭菌感染的一线疗法)，特别是用于治疗复发性艰难梭菌结肠炎，其中受试者对重复的抗生素治疗变得不敏感。
设计根据本发明的冻干MDSE的组合物以施用于人或动物。
在涉及抗生素治疗以限制耐多药细菌发展风险的行动计划不断增加的情况下，这种冻干组合物的使用为兽医，尤其是有机农业提供了替代方案。因此，根据本发明的冻干组合物可用于人，但也可用于动物，如猪、牛、羊、啮齿动物、兔形目动物、食肉动物、马(équidés)、鸟、爬行动物，尤其是猪、牛、鸡、大鼠、兔、狗、猫和马(cheval)。TMF是一种经过多年经验使用并在兽医领域取得重大进展的方法，其以冻干粪便的形式施用将明显促进其实施。
为了促进将其施用于动物的目的，可以制备不需要再水化或喷雾的颗粒形式的MDSE的冻干组合物。本领域技术人员将根据正在接受治疗的动物，调整盖伦形式以使其尽可能合适。
本发明的另一个目的涉及一种制备根据本发明的MDSE冻干组合物的方法，包括以下步骤：
-收集MDSE，具体是粪便；
-采用如上所述的冷冻保护剂混合物稀释MDSE，M/T重量比为35/65至45/55，并且优选的M/T重量比为40/60；
-冻干前一步骤中获得的混合物并获得冻干组合物。
根据一个具体的实施方案，冻干可以通过施加-20℃至-80℃的冷冻温度持续数十分钟至数小时的期间进行。在一个优选的实施方案中，冷冻步骤在-80℃进行30分钟。本领域技术人员将调整这些条件。
如上所述，MDSE和冷冻保护剂混合物是这样的，它包含占冻干组合物总重量的重量配比15-35％的MDSE和重量配比85-65％的冷冻保护剂，优选重量含量18％至28％和82％至72％。这些重量含量可以取决于不同的参数而变化，所述参数包括MDSE样品的水化程度及其脂质含量、纤维含量和细胞碎片含量，它们可以变化，特别是在粪便的情况中。本领域技术人员将调整重量含量以优化经冻干的组合物。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种制备包含根据本发明的冻干组合物的胃耐受性胶囊的方法，其包括以下步骤：
-制备冻干组合物；
-对冻干产物进行喷雾形成粉末形式；
-任选地，添加改善冻干产物流动的一种或多种赋形剂；
-采用所述冻干混合物填充胃耐受性胶囊的包膜；
-密封胶囊。
以下实施例中描述了具体实施方式。它们的目的仅是说明本发明并使其更易于理解，而绝不限于此。
附图说明
图1：表示在天然粪便中、以及在NaCl 9‰中稀释或在包含6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的麦芽糖糊精冷冻保护剂混合物(MT)中生长后恢复的主要菌群和酵母。图1中显示的结果对应于对于粪便3获得的结果。
图2：表示取决于冷冻保护剂的性质，重建冻干产物后原始粪便的活细菌负荷：5％麦芽糖糊精(M)、5％海藻糖(T5)、10％海藻糖(T10)、6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(MT)或乳(L)。
图3：表示取决于冷冻保护剂的性质，随时间的细菌负荷的变化：5％海藻糖(T5)、10％海藻糖(T10)和6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(MT)。J0表示冻干前；M0是冻干后；M4是冻干后4个月以及M7是冻干后7个月。
图4：表示取决于冷冻保护剂的性质，在M0时EOS细菌百分比：5％麦芽糖糊精(M)、5％海藻糖(T5)、10％海藻糖(T10)、6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(MT)。J0表示冻干前；M0是冻干后。
图5：表示取决于冷冻保护剂的性质，直接制剂后在天然粪便和冻干产物中发现的主要菌群：5％海藻糖(T5)、10％海藻糖(T10)、6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(MT)。图5中所示结果显示了对于粪便3获得的结果。
图6：表示取决于冷冻保护剂的性质，制剂后(M0)在天然粪便和冻干产物中发现的主要菌群：5％海藻糖(T5)、10％海藻糖(T10)、6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(MT)。结果显示在冻干后立即和在4℃下储存3个月(+3)和8个月(+8)后。图6中所示结果显示了对于粪便3获得的结果。
图7：表示和天然粪便(NS)相比，三种粪便样品(S4、S5、S6)中冻干(L72h)和保存冻干产物3个月(L3M)和6个月(L6M)对主要菌群活力的影响。(A)不同的严格厌氧菌群的作用。(B)对不同的任选的需氧/厌氧菌群的作用。
图8：表示与天然粪便(NS)相比，在不同粪便样品中(S4、S5、S6)冻干(L72h)和保存冻干产物3个月(L3M)和6个月(L6M)对极氧敏感的(EOS)细菌的活力的影响。
图9：通过在天然粪便(NS)和冻干粪便(L72H)上进行的气相色谱法评估细菌代谢物的变化。
图10：评估天然(S或NS)和冻干粪便(L72h)的抗艰难梭菌的作用。
具体实施方式
实施例1
1.材料和方法
1.1.排泄物采样
冻干条件的选择基于对由健康的独立志愿者提供的3份粪便的研究，并且在排放后立即置于样品罐中，所述样品罐中存在已装入用于孵育的
Figure BDA0001695966250000131
系统。样品在排放后在少于1小时内直接送到实验室。将每份粪便的一部分与
Figure BDA0001695966250000132
一起保存，作为即时分析对照。
1.2.冷冻保护剂的选择
用于本研究的冷冻保护剂是：
-10％甘油(G)
-10％重建的脱脂和巴氏消毒乳粉(L)。
-麦芽糖糊精，浓度为5％(M)。
-海藻糖，浓度为5％(T5)和10％(T10)。
-浓度为6.7％的麦芽糖糊精和浓度为10％的海藻糖，或M/T重量比为40/60的混合物(MT)。
-浓度为9‰的NaCl溶液作为对照，因为它一般用于稀释新鲜的排泄物物质。
将每种溶液包装在无菌罐中并在+4℃下储存直至使用。
1.3.制备排泄物冻干产物
将粪便在冷冻保护剂溶液中稀释10倍，并使用配有一次性杆的
Figure BDA0001695966250000133
型均化器匀浆。将悬浮的溶液置于冻干小瓶中，3ml的体积对应于300mg天然粪便样品。
对于每种测试条件和3份分析的粪便中的每份，立即将悬浮液小瓶置于
Figure BDA0001695966250000134
系统的存在下，以评估不同冷冻保护剂对每种稀释的和非冻干粪便的微生物群中的细菌的活力的作用。
其余的小瓶立即放置在-80℃。冷冻30分钟后，将小瓶置于冻干机(
Figure BDA0001695966250000142
6升，Freeze Dry System，型号77530，Labcono Corporation,堪萨斯城,MO,USA)中，其中阱已经在自动循环下冷却24小时期间。在该冻干期间结束时，将小瓶真空密封并采用铝盖固定。
对于每种粪便和每种冷冻保存条件，将一系列小瓶送到微生物学实验室进行微生物群分析，2个批次储存在4℃下进行3-4个月和7-8个月用于稳定性研究。
1.4.取决于冻干条件的微生物群的活力的体外研究
微生物研究的第一步是分析非冻干稀释的粪便，以测试在不同冷冻保护剂存在下的稀释对维持微生物群多样性及其活力的作用。为此目的，在制备排泄物冻干产物后，采用10％乳(L)、10％甘油(G)、5％麦芽糖糊精(M)、5％海藻糖(T)、10％海藻糖(T10)和6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(即M/T重量比为40/60)(MT)制成的一定量的稀释物，立即置于厌氧条件下并立即进行微生物培养。
该方法第二步涉及冻干产物的研究。在制剂后一周期间，以及在4℃下储存3-4个月和7-8个月后进行分析。采用3ml无菌蛋白胨水重建每种冻干产物，其对应于起初存在于每个小瓶中的稀释粪便的体积。
对于严格需氧和厌氧微生物群的分析，将非冻干粪便和重建的冻干产物稀释10到10倍，并接种于选择性和非选择性介质上(Rougé等人，2010)。表1显示在需氧和在厌氧单元(N2/CO2/H2:80/10/10)中于37℃孵育的介质。
表1：用于分析每种培养物的微生物群的介质
Figure BDA0001695966250000141
Figure BDA0001695966250000151
极氧敏感的(EOS)细菌如柔嫩梭菌(Clostridium leptum)群体的细菌的定量，通过在氧存在或不存在下的不同培养进行。为此，将新鲜粪便样品(TO)和在蛋白胨水中再水化的不同冻干样品在非常丰富的无选择性培养介质(YBHI，相当于富含酵母提取物的脑-心介质，补充有纤维二糖、麦芽糖和半胱氨酸)系列稀释。开发这种介质，以使得能够培养极难培养的细菌，如柔嫩梭菌群(Faecalibacterium prausnitzii)。一旦在严格厌氧条件下完成临时稀释，它们抵抗或不抵抗氧存在的能力通过在2个皿中的平行培养物进行评估，其中一个皿经受需氧环境60分钟，而另一个皿没有。该方法允许评估冻干后不同时间不同样品中严格存活的厌氧细菌的百分比。
2.结果
2.1.不同冷冻保护剂对冻干前微生物群多样性和活力的作用。
在不同的评估的冷冻保护剂中，以及具体地在MT混合物中稀释粪便，与天然粪便或在9％NaCl中稀释粪便(对应于采用新鲜粪便用于TMF的制剂)相比，它们对细菌负荷没有显著影响，并且不影响可培养的微生物群不同主要属的平衡(图1)。微生物群的主要群体保持活力。
2.2.基于使用的冷冻保护剂，冻干对的微生物群的活力的作用
在冻干后的一周期间或在MO时评估总细菌负荷。结果如图2所示。测试的三种冷冻保护剂，即5％海藻糖溶液(T5)、10％海藻糖溶液(T10)和6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖的混合物(TM)，在冻干期间，允许提供高于可培养细菌总细菌负荷90％的稳定性；这个结果对应于与天然粪便中存在的或者在冻干之前稀释在9％NaCl中稀释粪便的负荷相比，损失约1个对数。
冻干后长达7个月测得的总细菌负荷没有太大变化(图3)。
此外，这三种冷冻保护剂在冻干期间允许有效保存EOS细菌(图4)。
2.3.取决于使用的不同冷冻保护剂，冻干对微生物群多样性的作用
在以上测试的三种冷冻保护剂中，对于粪便3，6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖(或重量比为40/60)的冷冻保护剂混合物得到保持构成排泄物微生物群主要属的活性的最佳结果，尽管在某些严格厌氧属中降低约1至2个对数(图5)(以及其它粪便至多4个对数，未显示)。相反，10％甘油溶液对于需氧属和厌氧属都不是很保护(结果未显示)。
当研究在冻干后一周内进行时，严格厌氧属(梭菌属和拟杆菌属)保持优势(图6)。在4℃下保存冻干产物几乎没有影响，并且显示拟杆菌属在4℃储存3个月后约1.5个对数的额外损失，梭菌属在8个月时损失1个对数(图6)。在任何情况下，在保存期间，微生物群的优势属保持优势。
富含双歧杆菌属的粪便2获得的结果显示，在MT混合物中冻干后长达6个月群体的稳定性(结果未显示)。
综上所述，这些结果显示，在活力和多样性方面，以及在冻干后长达6个月期间，MT混合物允许最佳保存冻干的排泄物微生物群。
实施例2
1.材料和方法
根据实施例1中描述的方法，在6.7％麦芽糖糊精和10％海藻糖(或M/T重量比为40/60)的冷冻保护剂混合物存在下，将鉴定为S4、S5和S6的三份额外的排泄物样品稀释，然后冻干。
2.结果
2.1.储存6个月后，冻干产物中细菌生态系统的稳定性
2.1.1.储存6个月后冻干产物中细菌活力和多样性的分析
基于代表性菌群(双歧杆菌属和拟杆菌属)的数量分析严格厌氧群。
对于双歧杆菌属，在6个月的保存期间，它保持了优势微生物群的完整部分，没有显著变化。
对于拟杆菌属，在超过6个月期间，存在个体间差异，导致损失约1.5至4个对数。
基于细菌群体乳酸杆菌属、肠球菌属和肠杆菌科的数量，分析来自不同样品的选择的需氧-厌氧群。证实了这些属和菌群在冻干后经过6个月保存期间的稳定性和活力。
这些结果显示，冻干方法主要保留不同的靶标菌群的活力，而不会引起主要菌群之间总体平衡的变化，并且在超过6个月的保存期间，保存保持稳定(图7)。
2.1.2.极氧敏感细菌的研究
排泄物微生物群的具体特征之一是存在可能受冻干方法影响的极氧敏感(EOS)的细菌。
在所有分析样品中，在天然粪便和排泄物冻干产物中，检测到这些EOS细菌(图8)。当这些EOS细菌以相对于厌氧细菌总量(UFC/ml)的百分比表示时，该水平在经过保存期间保持稳定(3至6个月，取决于样品)，并且严格厌氧细菌的量不受保存方法影响。这些结果显示冻干不影响显示出极氧敏感性的菌群。
2.2.在冻干产物中细菌生态系统功能的稳定性
2.2.1.检测冻干产物中的代谢物
与天然粪便相比，在72小时冻干产物中评估了细菌代谢物，即短链脂肪酸的产生。在3个分析样品中，冻干诱导发酵产物的保存，取决于粪便样品，对于乙酸盐和丙酸盐，短链脂肪酸的浓度增加2至4倍，以及对于丁酸盐为2至6倍。细菌代谢物尽管是挥发性的，但存在于冻干产物中。它们浓度的增加是冻干导致代谢物浓缩的结果(图9)。
2.2.2.检测冻干产物中的抗艰难梭菌作用
在存在两株艰难梭菌，包括一种产毒菌株(菌株630)和一种非产毒素菌株(菌株PCD1)，体外分析天然粪便和冻干产物中的抗艰难梭菌作用。当菌株的生长被抑制时，在接种区域周围出现一个白色的圆圈：这是接种圈。
已知抗艰难梭菌作用的不同对照已被系统地用作阳性对照。因此，已经使用不同浓度(300、400、500mM)的乙酸(AA)和乳酸(AL)。在每个皿中，在乙酸和/或乳酸存在下观察到抑制圈。
使用纯菌株作为对照，即乳杆菌菌株和双歧杆菌(CB)菌株，其不引起抑制圈出现。
在天然粪便(S或NS)存在时以及在-80℃下冷冻72小时(T1、T2和T3)的粪便存在时，不可见抑制圈，而冻干产物存在时可见抑制圈(图10)。
这些不同的实验的结果揭示了对于乙酸和乳酸以及对于所有分析的粪便的冻干产物，存在抑制区域。因此通过冻干增强粪便在体外对艰难梭菌发育的抑制能力。
实施例2中显示的所有结果证实了冻干产物中微生物群超过至少6个月期间的稳定性和活力，并且在冻干产物中，细菌的功能能力被维持，具体是保存感兴趣的细菌代谢物，以及在体外研究模型中的抗艰难梭菌作用。
实施例3
1.材料和方法
1.1.粪便冻干产物
采用实施例1中描述的方法处理来自健康供体的四份粪便，目的是获得四份排泄物冻干产物：S4、S5、S6和S7，其中S7表示与实施例2相比的额外的排泄物样品。
1.2.赋形剂的选择
稀释剂
稀释剂的选择基于它们的天然惰性，以及，具体地，不存在特异性肠作用。
所选择的稀释剂是无机物赋形剂，磷酸二钙(Anhydrous
Figure BDA0001695966250000181
JRSPharma,Rosenberg,德国)和雾化麦芽糖糊精(
Figure BDA0001695966250000182
JRS Pharma Rosenberg德国)，其中后者类型的赋形剂已经在冻干产物的组合物中。这两种纯赋形剂的密度和流动时间对于无水
Figure BDA0001695966250000183
分别为0.79g/mL和3秒18/100g，对于
Figure BDA0001695966250000184
分别为0.68g/mL和6秒03/100g。
润滑剂
选择三种流动润滑剂：滑石(Cooper，法国)、亲水胶体二氧化硅(
Figure BDA0001695966250000192
200Pharma,Kraemer&Martin GmbH,St-Augustin,德国)和疏水胶体二氧化硅(
Figure BDA0001695966250000193
R972,Degussa-Hüls,Courbevoie,法国)。
1.3.测量流动时间并将冻干产物与赋形剂混合
根据欧洲药典的专题论文2.9.16，该试验首先在单独的冻干产物上进行，然后在纳入0.5％的流动润滑剂，以及必要时75/25、50/50和25/75重量比的测试稀释剂之后进行。这些混合物是手工实现的。
对所有混合物测量具有良好流动性的最终混合物的密度，然后通过计算以1mL报告。
1.4.采用具有良好流动的混合物制造胶囊。
选择N°100胶囊，其具有0.95mL的大体积且与相对容易摄取兼容的尺寸(23.3mm长度)。将采用胶囊充填器，将它们手工填充，使混合物具有良好的流动。
2.结果
2.1.研究冻干产物的流动特征和密度
表1显示了对冻干产物进行测试的结果。表1.未加工的排泄物冻干产物的流动，以及含有流动润滑剂和/或稀释剂的混合物的流动，以及最终体积的密度。
Figure BDA0001695966250000191
Figure BDA0001695966250000201
*重量比为99.5/0.5
单独测试的测试的未加工的排泄物冻干产物均没有任何流动性质。因此不可能将它们放入胶囊中。
尽管它们具有流动润滑剂的作用，以0.5％使用的滑石粉和
Figure BDA0001695966250000203
200不能改善冻干产物的流动性(S5和S5)。
Figure BDA0001695966250000204
和无水
Figure BDA0001695966250000205
稀释剂可有效改善流动。对于冻干产物S4-滑石/
Figure BDA0001695966250000206
混合物，比为50/50，对于冻干产物S5-
Figure BDA0001695966250000207
200/无水
Figure BDA0001695966250000208
混合物，比为75/25，发生改善。在冻干产物与稀释剂之间的比例为25/75时，混合物变成流体，其流动时间对于13.70g(S4)为0s69，以及对于10.86g(S5)为0s57。
最后，以0.5％单独使用的
Figure BDA0001695966250000209
R972流动润滑剂导致冻干产物S6(对于1.466g为0s30)和S7(对于3.296g为0s26)的流动性显著改善。
对于“冻干产物/流动润滑剂/稀释剂”混合物，混合物的密度为0.53g/mL至0.64g/mL，对于“冻干产物/流动润滑剂”混合物为0.33g/mL至0.47g/mL。
2.2.制造混合物的胶囊
表2显示了每个样品制备的胶囊的数量，以及每个胶囊中整合的冻干产物的质量。最后一栏报告了起初实施的新鲜物质的理论质量。
表2.采用冻干样品制备的胶囊的特征
Figure BDA0001695966250000202
样品S6和S7的情况是最有利的，因为仅添加了0.5％的流动润滑剂，因此冻干产物的稀释不显著。然而，两个样品之间观察到相当重要的变异性，在相同体积下，可以表示293mg(S6)或471mg(S7)干物质。这源于两个样品之间的密度差异。
关于样品S4和S5，除了0.5％的流动润滑剂之外，由于添加了75％的稀释剂，冻干产物的稀释是更重要的。在相同体积下，相对于每个样品的密度，冻干产物的质量从125mg(S4)至151mg(S5)的干物质变化。
这项研究显示，粉末状排泄物微生物群冻干产物没有流动性，因此不能单独放入胶囊。
然而，可以通过与75％稀释剂(
Figure BDA0001695966250000211
麦芽糖糊精、无水磷酸二钙、无水
Figure BDA0001695966250000212
)或0.5％流动润滑剂(疏水胶体二氧化硅
Figure BDA0001695966250000213
R972)混合来改善冻干产物的流动性质。
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Claims (9)

1.冷冻保护剂混合物用于保存冻干形式的在生态系统中的微生物群的用途，其特征在于，所述冷冻保护剂混合物包含麦芽糖糊精和海藻糖，其中麦芽糖糊精/海藻糖的重量比为35/65至45/55；其中在生态系统中的微生物群由粪便组成。
2.一种冻干组合物，其包含：
在生态系统中的微生物群、和
冷冻保护剂混合物，
其特征在于，所述冷冻保护剂混合物包含以35/65至45/55的麦芽糖糊精/海藻糖的重量比使用的麦芽糖糊精和海藻糖；
所述在生态系统中的微生物群由粪便组成。
3.根据权利要求2所述的冻干组合物，其中：
(i)在生态系统中的微生物群由粪便组成，
(ii)粪便的重量配比为冻干组合物的15至35％，以及冷冻保护剂混合物的重量配比为冻干组合物的85至65％，和
(iii)麦芽糖糊精和海藻糖以40/60的重量比使用。
4.一种胃耐受性胶囊，其包含权利要求2或3所述的冻干组合物。
5.根据权利要求4所述的胃耐受性胶囊，其特征在于，所述冻干组合物与至少一种流动赋形剂混合。
6.权利要求2或3所述的冻干组合物或权利要求4或5所述的胃耐受性胶囊在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗与肠微生物群失衡相关的疾病或病症。
7.根据权利要求6所述的用途，其中所述药物在复发性艰难梭菌Clostridiumdifficile感染的情况中用于替代口服抗生素治疗。
8.制备权利要求4或5所述的胃耐受性胶囊的方法，其包括以下步骤：
a.收集在生态系统中的微生物群；
b.采用冷冻保护剂混合物来稀释所述在生态系统中的微生物群，所述冷冻保护剂混合物包含麦芽糖糊精和海藻糖，其中麦芽糖糊精/海藻糖的重量比为35/65至45/65；
c.冻干在步骤b中得到的混合物；
d.将步骤c中获得的冻干产物喷雾形成粉末形式；
e.任选地添加一种或多种改善冻干产物流动的赋形剂；
f.采用所述冻干混合物填充胃耐受性胶囊的包膜；
g.密封所述胶囊。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述在生态系统中的微生物群由粪便组成，并且所述冷冻保护剂混合物由麦芽糖糊精和海藻糖的混合物组成，其中麦芽糖糊精/海藻糖的重量比为40/60。
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