KR102445404B1 - 생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물 - Google Patents

생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102445404B1
KR102445404B1 KR1020187018184A KR20187018184A KR102445404B1 KR 102445404 B1 KR102445404 B1 KR 102445404B1 KR 1020187018184 A KR1020187018184 A KR 1020187018184A KR 20187018184 A KR20187018184 A KR 20187018184A KR 102445404 B1 KR102445404 B1 KR 102445404B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mixture
lyophilisate
microbiota
ecosystem
feces
Prior art date
Application number
KR1020187018184A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180113981A (ko
Inventor
나탈리 카펠
안느-쥬디트 월리고라-뒤프리에
뮤리엘 토마스
크리스틴 샤뤼오
프란시스카 졸리
카미유 마이어
베로니크 로베르
조안느 데리누아
Original Assignee
엥스티튀 나쇼날 드 르쉐르슈 푸흐 라그리컬튀흐, 랄리망따씨옹 에 랑비허른망
위니베르시떼 파리 데카르트
유니베르시떼 빠리 디데롯- 빠리 7
아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엥스티튀 나쇼날 드 르쉐르슈 푸흐 라그리컬튀흐, 랄리망따씨옹 에 랑비허른망, 위니베르시떼 파리 데카르트, 유니베르시떼 빠리 디데롯- 빠리 7, 아시스땅스 퍼블리끄-오삐또 드 빠리 filed Critical 엥스티튀 나쇼날 드 르쉐르슈 푸흐 라그리컬튀흐, 랄리망따씨옹 에 랑비허른망
Publication of KR20180113981A publication Critical patent/KR20180113981A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102445404B1 publication Critical patent/KR102445404B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/10—Laxatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)

Abstract

생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결건조된 조성물
본 발명은 생태계 내, 특히 대변 내의 미생물상, 및 말토덱스트린 및 트레할로오스를 포함하는 동결보호제의 혼합물을 포함하는 동결건조된 조성물, 상기 동결건조된 조성물을 포함하는 캡슐, 이의 용도 및 이의 생산을 위한 방법에 관한 것이다.

Description

생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물
본 발명은 동결건조물(lyophilizate)의 형태로 생태계 내의 미생물상(microbiota in its ecosystem, MIIE)을 보존하는 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 인간 이식 목적으로, 대변 미생물상을 수개월 동안 보존할 수 있는 동결건조된 대변 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 조성물의 인간 또는 동물에서의 치료 용도, 특히 경구투여용 캡슐의 형태에 관한 것이다.
많은 연구들은 예를 들어, 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 감염 및 이의 재발과 같은 장내 불균형(dysbiosis)이라 불리우는 생태계 내의 대변 미생물상(microbiota)의 불균형을 포함하는 특정 병리의 치료적 관리를 위한 대변 미생물상 이식(faecal microbiota transplantation, FMT)의 중요성을 입증하였다(Van Nood E. 등, 2013). FMT는 이미 높은 수준의 임상 증거와 연관되어 있으며 이 목적을 위한 이 기법의 실행은 최근 유럽(Debast SB. 등, 2014)과 북미(Surawicz CM. 등, 2013) 의 권장 사항에 언급된다. 원인이 불확실하거나 알려지지 않은 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 대사 증후군(metabolic syndrome), 비만(obesity), 당뇨(diabetes), 다중 약물-내성 박테리아(multidrug-resistant bacteria), 또는 신경 발달 장애(neurological developmental disorder)와 같은 장내 불균형의 다른 병리학적 상황에서, 이 기술을 실행하는 것도 예상된다(Vrieze A. 등, 2013, Kelly CR. et al., 2015).
최근 의학계와 새로운 환자 수요에 의한 열의에도 불구하고, 현재 FMT를 수행하는 표준화된 절차가 없으며, 기증자를 선정하거나 대변을 준비하거나 투여 경로를 선택하는 방법도 없다.
일반적으로, 기증자는 임상 시험을 토대로 선정되고, 박테리아, 바이러스 또는 기생충과 같은 광범위한 병원체를 스크리닝한 후 선택된다; 이는 20% 미만의 잠재적 기증자의 확인율을 초래한다(Borody T. 등, 2015). 이것은 병원체 결과를 얻는데 지연이 있을 뿐만 아니라, 사용가능한 기증 횟수를 심각하게 제한한다.
FMT의 투여를 관리하는 양식(modalities)은 다양하다. 대변 미생물상은 비위(nasogastric) 또는 비십이지장(nasoduodenal) 프로브(probe), 대장내시경(colonoscopy) 검사, 또는 직장 관장(rectal enema)에 의해서 투여될 수 있으며(Kelly CR. 등, 2015), 각 방법마다 장점과 단점이 있다.
예를 들어, 비위 또는 비십이지장 경로는 치료받는 사람에게 안좋게 인식될 수 있고, 프로브를 삽입하는 동안 엑스레이(x-ray) 모니터링을 필요로 하는 구토 또는 섭취의 위험을 유발할 수 있다. 결장(colic) 프로브의 사용은 투여 중에 점막의 관찰이 가능하다는 점에서 흥미롭다; 그러나, 또한 이환율 인자가 중요하고 높고 비용이 많이 든다. 마지막으로, 직장 관장 방법은 실행하기 쉽고 비용이 적으나, 치료받은 개체에 투여받은 물질이 유지되도록 하는 것은 어렵다. 이러한 문제들은 제제의 관능적 특성과 관련하여 환자의 일부가 꺼려함으로 인해 복합적으로 나타난다.
클로스트리듐 디피실리 대장염(colitis)에 관한 "Groupe Francais de Transplantation Fecale"와 임상 시험에 대한 ANSM에 의한 현재 권장 사항은 대변이 배출된 후 6시간 이내에 발생하는 투여에 관한 것이다. 기증에 대한 접근을 용이하게 하기 위해서, -80℃에서 냉동되어 쉽게 이용가능한 보존된 대변 제제가 제안된다. 이들의 효능은 신선한 물질을 이용하는 이식에서 관찰된 것과 유사하다(Hamilton MJ 등, 2012; Youngster I 등, 2014a; Lee 등, 2016). 이러한 냉동 제제는 동결의 영향으로부터 미생물상을 보호하기 위하여 동결보호제(cryoprotectant)를 포함하는 용액에 희석해야 한다. 이식을 목적으로 대변을 냉동시키는 문헌에 기술된 유일한 동결보호제는 10% 농도의 글리세롤이다. 글리세롤을 포함한 냉동 제제로 수행한 이식의 효과는 제조 후 최대 5개월까지 유지된다(Younster I 등, 2014a).
이 물질로 충전되고 -80℃에서 저장된 캡슐의 경구투여는 만족스러운 결과로 보고되었다(Youngster I. 등, 2014b; Younster 등, 2016). 따라서 제제의 이러한 유형은 치료받는 사람, 특히 환자에게 투여를 용이하게 하는 생약 접근법(galenic approach)에 대한 새로운 전망을 제시한다. 그러나, 현재까지는 여전히 실험적 생산을 포함하고 -80℃에서 보존이 필요하며, 이는 저장 문제를 일으킨다.
따라서 저장 기간 동안 대변 미생물상의 본래 품질을 보존하면서 준비 및 저장을 용이하게 하는 대변 준비가 충족되지 않는다. 이러한 대변 제제는 편안하고 비침습적인 투여 경로를 통해, 작은 부피의 초기 투여를 가능하게 하는 생약 형태로 이용 가능할 것이다.
이러한 맥락에서, 치료를 받는 사람들의 수용성과 편안함을 향상시키면서 대변 제제의 생산, 이용가능성 및 장기간 보관을 용이하게 하기 위해, 본 발명자들은 최적화된 동결보호제의 혼합물에 희석된 동결건조된 대변 조성물을 개발하였다.
동결건조는 박테리아 균주 보존을 위해 제약 업계에서 사용되는 보존 과정이다. 특히, 일반적으로 MIIE와 특히 대변과 같은 복잡한 혼합물의 경우, 다른 박테리아 속의 생존력과 평형을 유지하기 위해, 동결건조는 최적의 조건에서 수행되어야 한다. 적합한 동결보호제의 사용은 동결될 때 박테리아의 전체 또는 적어도 부분적 생존을 보장한다.
생물체, 특히 박테리아를 위한 동결보호제 분자에는 세 가지 분류가 있다:
- 분자량이 크고 단백질 및 다당류와 같이 세포외 배지에서 유지되는 분자, 이는 동결 단계 동안 세포로부터 수분 유출(aqueous efflux)을 용이하게 하여, 세포내 얼음 결정의 형성을 제한한다. 세포외 배지의 점도를 증가시킴으로써, 이러한 분자들도 결정 성장을 감소시킨다;
- 아미노산과 올리고당과 같이 세포벽을 횡단할 수 있는 분자;
- DMSO와 글리세롤과 같이 세포벽과 세포질 막을 관통하는 분자(Carvalho A.S. et al., 2004).
두 번째 및 세 번째 분류의 침투제는 세포 탈수를 제한하고 세포 내부에 결빙 온도를 낮추어, 염 농도를 감소시키고 삼투압 충격을 감소시킨다(BeaI C. 등, 2015).
대변 미생물상의 살아있는 유기체의 보존을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 개별적으로 또는 조합하여 사용되는 몇 가지 동결보호제를 평가하였다. 냉동된 물질로 수행되는 FMT를 위해 일반적으로 사용되는 10% 글리세롤(Hamilton MJ. 등, 2012; Youngster I. et al., 2014a)은 동결건조물의 생산에 적합하지 않은 것으로 보인다. 테스트된 동결보호제 중에서, 2가지는 몇 가지 가능성을 보여주었다: 말토덱스트린(maltodextrin) 및 트레할로오스(trehalose). 트레할로오스가 좋은 결과를 가져오지만, 말토덱스트린 및 트레할로오스의 혼합물로 얻은 결과는 미생물상의 생존율(도 1 및 2)과 다양성 유지(도 5) 측면에서 더욱 향상된다. FMT의 목적이 수혜자(recipient)의 장 생태계에 있는 다른 개체군간의 균형을 정밀하게 복원하는 것이기 때문에 다양성을 유지하는 것은 특히 중요하다. 미생물상에 대한 말토덱스트린과 트레할로오스 혼합물의 보호 효과는 동결건조 후 최소 3개월, 심지어는 최대 7개월 후에 관찰된다(도 3, 6 및 7). 또한, 말토덱스트린과 트레할로오스의 혼합물은 클로스트리듐 디피실리 그룹의 박테리와 같이, 극심한 산소 민감성(extreme oxygen sensitivity, EOS)을 나타내는 박테리아의 생존력을 유지하는데 더 유리하다(도 4 및 8). 또한 대변 미생물상의 기능적 능력을 대표하는 단쇄 지방산과 같은 박테리아 대사물질의 농도는 본래의 대변에 비해 동결건조물에서 유지되고 심지어 증가된다(도 9). 마지막으로 동결건조물의 항-클로스트리듐 디피실리 활성은 시험관 내에서 클로스트리듐 디피실리 2개의 균주, 하나는 톡시노젠(toxinogen, 균주 630)이고 다른 하나는 비-톡시노젠(non-toxinogen, PCD1 균주)에 대한 박테리아 성장 억제로 입증되었다(도 10).
따라서, 본 발명은 동결건조된 형태의 생태계 내의 미생물상(microbiota in its ecosystem, IIE)을 보존하기 위한 동결보호제의 혼합물의 용도에 관한 것으로, 상기 동결보호제 혼합물은 말토덱스트린(M) 및 트레할로오스(T)를 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비로 포함하는 것을 특징으로 한다.
말토덱스트린은 세포벽을 관통하지 않는 다당류 동결보호제인 반면에, 트레할로오스는 세포벽을 관통하는 올리고당 동결보호제이다.
용어 "생태계 내의 미생물상" 또는 MIIE는 몸 속에 자연적으로 존재하는 미생물상과 비교하여 그 조성이 변하지 않는 미생물상을 말한다. 미생물상 및 그의 생태계는 박테리아, 곰팡이, 바이러스 및 박테리오파지로 주로 구성되는 복잡하고 풍부한 혼합물을 구성하나, 세포 파편; 장세포(enterocyte) 및 고유판세포(lamina propria cell)에 의해 분비된, 배설/분비물이 있는 많은 펩타이드 및 단백질, 예를 들어 분비형 IgA, 칼프로텍틴(calprotectin), 사이토카인(cytokines) 및 데펜신(defensin) 유형의 다른 항-염증성 또는 항균 펩타이드; 단쇄 지방산, 박테리오신(bacteriocin) 및 미생물상의 박테리아 또는 다른 미생물에 의해 생성된 임의의 다른 생물학적으로 활성인 분자와 같은 대사 산물을 포함하는 분비되거나 분비되지 않은 박테리아 생성물; 점액; 단당류 및 다당류-유형의 탄수화물 화합물; 및 미량원소로도 구성된다. 따라서 상기 MIIE는 살아있는 것으로 묘사될 수 있는 복잡한 매트릭스로, 그 안에서 많은 분자와 세포 상호작용이 일어난다.
상기 MIIE는 본 발명에 따른 말토덱스트린 및 트레할로오스의 혼합물을 사용함으로써 동결건조된 형태로 저장될 수 있다. 예를 들어, 이 방법으로 보존할 수 있는 MIIE는 이전에 장내 식물군(flora)으로 알려진 장내 미생물상, 대변에 포함 되는 대변 미생물상 및 이전에 질 식물군(vaginal flora)이라고 불렸던 질 미생물상이다. 미생물상의 이들 예의 각각은 당업자에게 공지된 우세한 박테리아 그룹에 의해 특징지어진다.
바람직한 실시 양태에서, 보존하고자 하는 상기 MIIE는 대변으로 구성된다.
본 발명에 따르면, 용어 "동결건조"는 생성물을 동결시킴으로써 생성물로부터 물을 제거한 다음, 승화라 불리는 현상인 액체 상태를 통과하지 않고 진공에서 얼음을 증발시키는 과정을 말한다. 이 기술은 당업자에게 잘 알려져있다. 동결건조 사이클에는 3개의 주요 단계가 있다:
- 생성물이 -20℃ 내지 -80℃의 온도에서 냉장되는 곳에서의, 동결; 물은 얼음으로 변한다;
- 틈새가 없는 얼음(interstitial free ice)이 승화를 거치는 단계인, 진공에서 1차 건조;
- 건조된 생성물의 표면에 포집된 물 분자가 탈착에 의해 추출되는, 최종 건조.
본 발명에서, 용어 "대변(stool)"은 음식의 흡수, 소화 및 장관 통과를 통하는 이동 후에 얻어지는 대변 물질을 기술하는데 사용된다. 대변은 일반적으로 체중의 75-85%의 물과 체중의 15-25%의 건조 물질로 구성된다 [배설/분비물이 있는 고유판으로부터 벗겨진 장세포(intestinal cell)와 면역 세포, 예를 들어 분비형 IgA, 칼프로텍틴, 사이토카인 및 다른 항-염증성 또는 항균 펩타이드..., 미생물상의 구성 요소(박테리아, 바이러스, 곰팡이, 박테리오파지) 및 단쇄 지방산, 박테리오신 및 미생물상의 박테리아 또는 다른 미생물에 의해 생성된 임의의 다른 생물학적으로 활성인 분자와 같은 대사물질을 포함하는 분비되거나 분비되지 않는 박테리아 생성물; 점액; 식물, 지질의 소화안되는 부분으로부터 나오는 섬유질(fibres) 및 셀롤로오스를 포함하는 세포 파편, 철, 미량 원소...]. 본 발명에 따르면, 용어 대변은 건강한 개체에 의해 최근-배출된 대변을 설명한다. 인간과 대변 준비자 중 기징자 선정은 "Groupe Francais de Transplantation Fecale"(Sokol 등, 2015)의 권고 사항, Kapel N. 등, 2014에 의한 "Practical implementation of faecal transplantation"이라는 제목의 문헌, 및 ANSM 권고 사항(2015)에서 정의된 프로토콜 및 조건에 따라 실시될 수 있다.
본 발명에 따른 동결건조된 형태의 대변을 보존하는데 사용되는 동결보호제의 혼합물에서, 말토덱스트린(M)는 트레할로오스(T)와 함께 35/65 내지 45/55 범위, 및 바람직하게는 40/60의 M/T 중량비로 사용된다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에 따르면, 상기 혼합물에 존재하는 동결보호제는 오직 말토덱스트린 및 트레할로오스이다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 혼합물에 존재하는 동결보호제는 말토덱스트린 및 트레할로오스를 혼합하고, 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 프럭토오스(fructose), 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 수크로오스(sucrose), 젤라틴(gelatine), 전분(starch), 소태아혈청(foetal bovine serum) 및 우유(milk) 중 선택되는 적어도 하나의 다른 동결보호제를 포함한다.
또한, 본 발명은 생태계 내의 미생물상(MIIE) 및 동결보호제의 혼합물을 포함하는 동결건조된 조성물에 관한 것으로, 상기 동결보호제의 혼합물은 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비, 및 바람직하게는 40/60의 M/T 중량비로 사용되는 말토덱스트린(M) 및 트레할로오스(T)를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 조성물에서, 말토덱스트린은 트레할로오스와 함께 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비, 및 바람직하게는 40/60의 중량비로 갖는 트레할로스와 함께 사용된다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에 따르면, 상기 동결건조된 조성물에 존재하는 동결보호제는 오직 말토덱스트린 및 트레할로오스이다.
본 발명의 다른 실시 양태에 따르면, 상기 동결건조된 조성물에 존재하는 동결보호제는 말토덱스트린 및 트레할로오스를 포함하고, 만니톨, 소르비톨, 프럭토오스, 글루코오스, 말토오스, 수크로오스, 젤라틴, 전분, 소태아혈청 및 우유 중 선택되는 적어도 하나의 다른 동결보호제를 포함한다.
본 발명에 따른 상기 동결건조된 조성물은 MIIE 및 동결보호제의 혼합물을 각각 상기 동결건조된 조성물의 15 내지 35% 및 85 내지 65%의 중량 함량으로, 및 바람직하게는 각각 18 내지 28% 및 82 내지 72%의 중량 함량으로 포함한다. 이러한 중량 함량은 MIIE 시료의 수화도 및 지질 함량, 섬유질 함량 및 세포 파편 함량을 포함한 다양한 매개 변수에 따라 달라질 수 있으며, 이는 특히 대변의 경우에 달라질 수 있다. 당업자는 동결건조를 거치는 조성물을 최적화하기 위해 중량 함량을 조정할 것이다.
따라서, 본 발명자들은 대변, 및 말토덱스트린 및 트레할로오스를 포함하는 동결보호제의 혼합물의 동결건조는 적어도 6개월의 장기간 동안 대변 미생물상의 생존력 및 생물 다양성 유지가 가능하게 함을 보여주었다. 그들은 또한 상기 동결건조물에서 박테리아 대사물질의 생산이 유지될 수 있음을 입증했다. 또한, 그들은 상기 동결건조물이 시험관 내에서 클로스트리듐 디피실리의 생장을 억제하는 능력을 보여주었다.
용어 "미생물상의 생존력"은 대변 미생물상의 살아있는 부분에 관한 것이다.
"상기 대변 미생물상의 생물 다양성"은 MIIE 내의 다른 미생물 집단에 의해 표현된다. 그것의 구성 집단의 보존은 미생물상 내에서 미생물의 대표 그룹의 안정성을 조사함으로써 평가할 수 있다.
바람직한 실시 양태에서, 본 발명은 대변 및 말토덱스트린(M) 및 트레할로오스(T)를 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비, 및 바람직하게 40/60의 중량비로 포함하는 동결보호제의 혼합물을 포함하는 동결건조된 조성물에 관한 것이다.
바람직한 실시 양태에서, 상기 MIIE는 대변으로 구성되고, 상기 대변 중량비는 상기 동결건조된 조성물의 15 내지 35%를 나타내고, 그리고 상기 동결보호제의 혼합물의 중량비는 상기 동결건조된 조성물의 85 내지 65%를 나타낸다.
더욱 더 바람직한 실시 양태에서, 상기 MIIE는 대변으로 구성되고, 상기 대변 중량비는 상기 동결건조된 조성물의 15 내지 35%를 나타내고, 상기 동결보호제의 혼합물의 중량비는 상기 동결건조된 조성물의 85 내지 65%를 나타내고, 그리고 상기 동결보호제의 혼합물은 말토덱스트린(M) 및 트레할로오스(T)를 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비, 및 바람직하게 40/60의 중량비로 포함한다.
박테리아 생존력과 생물 다양성 뿐만 아니라 박테리아 양(load)을 유지하는 것 이외에도, Firmicutes 및 Bacteroide phyla에 속하는 지배적인 박테리아 그룹 사이의 균형을 유지함으로써, 본 발명에 따른 상기 조성물은 박테리아 균주 혼합물보다 현저한 이점을 특징으로 한다(Allen -Vercoe E. 등, 2013). 사실, 본 발명에 따른 대변 조성물은 본래의 자연 생태계(대변 생태계) 내의 대변 미생물상을 유지하도록 한다. 따라서 이 복잡한 물질의 기능적 능력뿐만 아니라 다양한 구성요소 간의 상호작용은 보존되며 상기 FMT를 받은 개체는 신선한 대변의 이식 또는 박테리아 여액의 투여와 동일한 이점을 갖는다(Ott 등, 2016).
본 발명에 따르면, 용어 "대변 생태계"는 대변을 구성하는 모든 것을 의미한다. 즉 박테리아, 바이러스, 곰팡이 및 박테리오파지 뿐만 아니라, 단쇄 지방산, 박테리오신 및 미생물상의 박테리아 또는 다른 미생물에 의해 생성된 임의의 다른 생물학적으로 활성인 분자와 같은 대사물질을 포함하는 분비되거나 분비되지 않는 박테리아 생성물 및 벗겨지거나 세포 사멸의 상태인 장세포(장세포, 고유판의 면역 세포) 및 이들의 배설/분비물(분비형 IgA, 칼프로텍틴, 사이토카인 및 다른 항-염증성 또는 항균 펩타이드...), 식물, 단백질 및 지질 잔기의 소화되지 않은 부분 섬유질 및 셀룰로오스와 같은 탄수화물 단당류 및 다당류 성분, 미량 원소, 점액...
본 발명의 조성물은 경구투여에 특히 적합하다.
예를 들어, 치료받는 개체에 따라, 위-내성 캡슐(gastro-resistant capsule) 또는 정제, 또는 재수화나 스프레이 사용이 필요없는 과립제 형태일 수 있다.
본 발명의 특정 실시 양태에 따르면, 상기 동결건조된 조성물은 캡슐 또는 위-내성 정제의 형태이다. 이 제시는 특히 인간의 경구투여에 적합하다. 본 발명에 따른 용어 "위-내성 캡슐 또는 정제"는 위액에 저항성인 구강의 생약 및 장용성(enterosoluble) 형태를 말한다.
이러한 제형은 상기 동결건조된 조성물을 치료받는 대상에게 투여하기에 적합하게 하는 약학적으로 허용가능한 담체를 또한 포함할 수있다. 이 담체는 바람직하게는 비활성이며, 임의의 경우에 상기 생태계 내의 미생물상의 생존력 및 다양성을 유지하고 적절한 부위에서 상기 동결건조된 조성물을 방출할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 전술한 상기 동결건조된 조성물을 포함하는 위-내성 캡슐에 관한 것이다.
상기 캡슐의 충전은 수동적으로 또는 산업적으로 수행되든지, 용적 측정으로(volumetrically) 달성된다. 이를 위해, 상기 동결건조물은 분쇄되고 분배될 분말은 캡슐의 일정한 충전을 보장하는 우수한 유동성을 나타낼 필요가 있다((Le Hir 등, 2016).
분말의 유동 특성은 유럽 약전(European Pharmacopoeia, 2016)의 "2.9.16 Flow" 시험으로 평가될 수 있다. 이는 표준화된 치수를 가진 깔때기의 구멍을 통해 시료가 흐르는 데 필요한 시간을 측정한다. 10초/100 g의 분말 이하의 시간은 우수한 흐름으로 간주된다. 대조적으로, 유동하지 않는 분말의 유동 시간은 "무한"으로 등급화된다. 이것은 가공되지 않은 대변 동결건조물의 경우이므로 캡슐을 충전하기 위해서는 그 형태로 사용할 수 없다.
이러한 제한을 극복하기 위해, 본 발명자들은 상기 대변 동결건조물의 흐름을 향상시킬 수 있는 유동 희석제 및 윤활제와 같은 유동 부형제(flow excipient)가 보충된, 전술된 상기 동결건조된 조성물을 포함하는 캡슐을 개발하였다.
본 발명에 따른 상기 동결건조물을 포함하는 캡슐에 사용되는 유동 부형제는 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), 활석(talcum), 친수성 콜로이드성 실리카(hydrophilic colloidal silica) 및 소수성 콜로이드성 실리카(hydrophobic colloidal silica)와 같은 무기 부형제 중에서 선택된다.
따라서, 본 발명에 따르면 상기 위-내성 캡슐은 직접 타정법(direct compression)을 위한 유동 윤활제 및/또는 유동 희석제 중에서 선택된 적어도 하나의 유동 부형제와 혼합되는 상기 정의된 동결건조 조성물을 포함한다.
특정 실시 양태에 따라, 상기 유동 부형제는 이 목적을 위해 일반적으로 수행되는 양으로 사용되는 유동 윤활제이다; 바람직하게는 상기 동결건조물과 혼합 된 윤활제의 양은 상기 동결건조물 및 윤활제 혼합물의 중량의 0.1 내지 1%이고, 바람직하게는 상기 윤활제의 양은 상기 동결건조물 및 윤활제 혼합물의 중량의 0.5%이다.
상기 유동 윤활제는 활석, 소수성 콜로이드성 실리카 또는 친수성 콜로이드 성 실리카 중에서 선택될 수 있다; 바람직하게는, 소수성 콜로이드성 실리카가 사용된다.
특정 실시 양태에 따르면, 상기 유동 부형제는 이 목적을 위해 일반적으로 수행되는 양으로 사용되는 직접 타정법을 위한 희석제이다; 바람직하게 상기 동결건조물과 혼합된 희석제의 양은 상기 동결건조물 및 희석제의 혼합물의 중량의 10 내지 90%이고, 바람직하게는 상기 동결건조물 및 희석제 혼합물의 중량의 15 내지 75%, 또는 25 내지 50%이다.
상기 직접 타정법을 위한 희석제는 디칼슘 포스페이트 또는 분무된 말토덱스트린으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 특정 실시 양태에 따르면, 상기 유동 부형제는 상기 정의된 직접 타정법을 위한 유동 윤활제 및 희석제를 상기 언급된 비율로 포함한다.
예를 들어, 상기 MIIE 동결건조물 및 유동 부형제 혼합물은 하기로 구성된다:
- 소수성 콜로이드성 실리카의 비율은 상기 전체 혼합물의 중량의 0.1 내지 1%, 바람직하게는 0.5 %이다;
- 친수성 콜로이드성 실리카의 비율은 상기 전체 혼합물의 중량의 0.1 내지 1%, 바람직하게는 0.5%이고, 디칼슘 포스페이트의 비율은 상기 전체 혼합물의 중량의 10 내지 90%, 바람직하게는 15 내지 75%, 바람직하게는 25 내지 50%이다;
- 탈크의 비율은 상기 전체 혼합물의 중량의 0.1 내지 1%이고, 바람직하게는 0.5 %이고, 분무된 말토덱스트린의 비율은 상기 전체 혼합물의 중량의 10 내지 90%이고, 바람직하게는 15 내지 75%이다.
이러한 맥락에서, 동결건조된 조성물로부터 제조된 위-내성 캡슐의 개발은 제제의 관능적 특성, 이식 물질의 이용 가능성, 제제의 보존 및 치료 받는 사람의 편안함 측면에서 중요한 진보이다.
동결건조로 대변에 존재하는 물을 제거할 수 있다. 실제로, 정상 대변은 일반적으로 75 내지 85%의 물 비율을 포함한다. 동결건조 후, 50 g의 대변은 동결건조된 미생물상의 약 7.5 ~ 12.5 g에 상응하며, 여기에 상기 동결보호의 혼합물이 첨가된다.
신선한 변 또는 냉동된 변이든지 간에, 대변의 투여에 관한 통상적인 방법에 비하여 위-내성 캡슐에 포함될 수 있는 동결건조물 형태의 투여는 표준화된 제조 방법을 촉진시키고 치료받는 사람에 의한 수용 가능성을 향상시킨다. 따라서, 동결건조물 형태의 경구투여는 의학적인 관행에서 잘 확립되면, 이환율을 낮출수 있고 대변 이식 비용을 감소시킬 수 있다. 사실, 동결건조된 제제로 상기 FMT를 경구투여하는 것은 전문의가 필요하고 하루 입원을 필요로하는 기술적인 과정과 관련이 없으며, 현재는 신선하거나 냉동된 대변의 제제의 비십이지장, 대장 내시경 또는 직장으로의 투여의 경우와 마찬가지이다. 동결된 캡슐의 투여와 비교하여, 동결건조물 형태의 투여는 제조 및 저장 공정을 용이하게 하여, 제조 표준화를 향상시킬 것이다. 또한 동결건조된 제형의 사용은 예를 들어, 재발성 클로스트리듐 디피실리 감염과 관련하여 발생할 수 있는 응급 상황에 대처할 때, 중요한 포인트인 FMT 장비에 대한 접근성이 향상될 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같이 동결건조에 의해 대변을 보존하고 동결보호제의 혼합물의 사용을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 기재된 상기 미생물상의 지속적인 생존력과 다양성을 보장함으로써, 적어도 3개월 그리고 7개월까지 심지어는 그 이상의 기간 동안 동결건조된 대변의 보존을 허용한다.
본 발명에 따라 보존된 동결건조된 대변은 동종이계(allogeneic) 또는 자가인(autologous) FMT의 일부로서 투여될 수 있다. 사실, FMT는 같은 종의 두 개체 사이에서 대변의 이동, 또는 주어진 순간에 초기에는 건강한 기증자였고 나중에 치료를 받는 사람이 된 동일한 개체에 투여로 구성될 수 있다. 따라서, 건강한 개체는 그/그녀가 필요로하는 순간에 그/그녀의 기증으로부터 만들어진 대변 제제를 포함하는 동결건조된 조성물을 연속적으로 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제로서의 용도로 상기 기술된 동결건조된 조성물 또는 위-내성 캡슐에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 장내 미생물상의 불균형과 관련된 질환 또는 장애의 치료 용도를 위한 상기 기술된 상기 동결건조된 조성물 또는 상기 위-내성 캡슐에 관한 것이다.
사실, 상기 장내 미생물상은 지속적으로 스스로를 조절하는 균형있는 생태계이다. 다양한 공격이 이 균형을 깨뜨릴 위험이 있다. 장내 불균형은 유해한 미생물의 과량 및/또는 숙주에게 유익한 미생물의 상대적 부족으로 인한 미생물상의 다양성의 상실 또는 불균형이다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 동결건조된 조성물의 지시된 용도는 장내 불균형과 관련된 것과 동일하다. 이와 같이, 용어 "장내 미생물상의 불균형과 관련된 질환 또는 장애"는 클로스트리듐 디피실리 대장염 및 이의 재발, 크론병과 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 같은 만성 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 다중 약물-내성 박테리아의 존재, 변비(constipation), 여행자 설사(traveller’s diarrhoea), 위장 감염(gastrointestinal infections), 자가면역질환(autoimmune diseases), 게실증(diverticulosis), 1형 및 2형 당뇨, 대사 증후군, 비만, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis) 및 천장관절염(sacroiliitis), 만성 피로 증후군, 구취(halitosis), 알러지(allergy), 여드름(acne), 불면증(insomnia), 우울증(depression) 및 예를 들어, 파킨슨 병 및 자폐증 스펙트럼과 같은 신경정신학적 질환(neuropsychiatric diseases)을 포함하는 것으로 간주된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 동결건조된 조성물은 클로스트리 듐 디피실리 대장염의 치료에 사용된다. 이러한 맥락에서, 동결건조된 제품으로 보존된 박테리아 대사물질의 존재는 클로스트리듐 디피실리에 대한 싸움에서 중요한 유익한 효과를 가질 수 있다.
상기 동결건조된 조성물은 또한 염증성 장 질환, 다중 약물-내성 박테리아, 1형 및 2형 당뇨, 대사 증후군, 비만 및 자폐증 스펙트럼 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 미생물상과 관련된 환경의 보존은 상기 FMT의 치료적 효과에 크게 기여할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 동결건조된 조성물 또는 위-내성 캡슐은 또한 메트로니다졸(metronidazole) 또는 반코마이신(vancomycin) (클로스트리듐 디피실리 감염을 치료하기 위해 사용되는 1차 치료)과 같은 경구 항생제 치료, 특히 대상이 반복된 항생제 치료에 둔감해지는 대상이 가지는 재발성 클로스트리듐 디피실리 대장염의 치료를 위한 중계물(relay)로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 동결건조된 MIIE의 조성물은 인간 또는 동물에게 투여되도록 설계된다.
다중 약물-내성 박테리아의 발생 위험을 제한하기 위한 항생제 치료와 관련된 실행 계획이 증가하는 상황에서, 그러한 동결건조된 조성물의 사용은 수의학, 및 특히 유기농법에서 대안을 제공한다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 동결건조된 조성물은 인간뿐만 아니라 돼지, 소, 양, 설치류, 토끼류, 육식 동물, 말, 새, 파충류, 그리고 특히 돼지, 소, 닭, 랫트, 토끼, 개, 고양이 및 말에서 사용될 수 있다. FMT는 수년 동안 경험적으로 사용되어 왔으며 수의학에서 상당한 발전을 거친 방법이며 동결건조된 대변 형태의 투여는 분명히 시행을 용이하게 할 것이다.
동물로의 투여를 용이하게 하기 위해, MIIE의 동결건조된 조성물은 재수화 또는 스프레이를 필요로하지 않는 과립 형태로 제조될 수 있다. 당업자는 치료받는 동물에 따라 가능한 한 적합한 것으로 만들기 위해 생약 형태로 조정할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 MIIE의 동결건조된 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 상기 MIIE의 수집, 및 특히 대변;
- 상기 MIIE를 상기 기재된 동결보호제의 혼합물로 35/65 내지 45/55 범위의 M/T 중량비로, 및 바람직한 40/50의 M/T 중량비로 희석;
- 이전 단계에서 달성된 상기 혼합물의 동결건조 및 상기 동결건조된 조성물의 수득.
특정 실시 양태에 따라, 동결건조는 -20℃ 내지 -80℃ 범위의 동결 온도를 수십분 내지 수시간 동안 적용함으로써 수행될 수 있다. 바람직한 실시 양태에서, 상기 동결 단계는 -80℃에서 30분 동안 수행된다. 당업자는 이러한 조건을 조정할 것이다.
전술한 바와 같이, 상기 MIIE 및 동결보호제의 혼합물은 MIIE의 15-35%의 중량비, 및 상기 동결건조된 조성물의 전체 중량 중 동결보호제의 85-65%의 중량비, 및 18 내지 28% 및 82 내지 72% 범위의 바람직한 중량 함량을 포함하는 정도이다. 이러한 중량 함량은 MIIE 시료의 수화도 및 지질 함량, 섬유질 함량 및 세포 파편 함량을 포함하는 다양한 매개 변수에 따라 달라질 수 있으며, 특히 대변의 경우 다를 수 있다. 당업자는 동결건조를 거치는 조성물을 최적화하기 위해 중량 함량을 조정할 것이다.
특정 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 동결건조된 조성물을 포함하는 위-내성 캡슐의 제조방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 동결건조된 조성물의 제조;
- 동결건조물을 분말 형태로 스프레이;
- 선택적으로 상기 동결건조물의 유동성을 개선시키는 하나 이상의 부형제의 첨가;
- 상기 동결건조된 혼합물로 위-내성 캡슐의 외피(envelope)를 충전;
- 상기 캡슐을 밀봉.
특정 실시 양태를 하기 실시예에 기재한다. 이의 유일한 목적은 본 발명을 설명하고 이해하기 쉽게 하기 위한 것이며, 어떠한 방법으로도 발명에 제한되지 않는다.
도 1: 본래의 대변에서 성장 후 회수되고 NaCl 9 ‰, 또는 6.7 % 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스를 포함하는 말토덱스트린 동결보호제 혼합물(MT) 내에서 희석된 주요 박테리아 그룹 및 효모를 나타낸 것. 도 1에 나타낸 결과는 대변 3에서 얻은 것에 해당한다.
도 2: 동결보호제의 성질에 따라 동결건조물을 재구성한 후, 살아있는 박테리아 양(load)의 본래 대변을 나타낸 것: 5% 말토덱스트린(M), 5% 트레할로오스(T5) 10% 트레할로오스(T10), 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스(MT)의 혼합물, 또는 우유(L).
도 3: 동결보호제의 성질에 따라 시간 경과에 따른 박테리아 양의 진화를 나타낸 것: 5% 트레할로오스(T5), 10% 트레할로오스(T10), 및 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레로오스의 혼합물(MT). J0은 동결건조 이전(pre-lyophilization)을 나타내고, M0은 동결건조 후(post-lyophilization)이고; M4는 동결건조 후 4개월이고 M7은 동결건조 후 7개월이다.
도 4 : 동결보호제의 성질에 따라 M0에서 EOS 박테리아의 비율을 나타낸 것: 말토덱스트린 5% (M), 트레할로오스 5% (T5), 트레할로오스 10% (T10), 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 혼합물(MT). J0는 동결건조 이전을 나타내고; M0는 동결건조 후이다.
도 5: 동결보호제의 성질에 따라 본래의 대변 및 동결건조물에서 제조 후 바로 발견된 주요 박테리아 그룹을 나타낸 것: 5% 트레할로오스 (T5), 10% 트레할로오스 (T10), 및 6.7 % 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 혼합물 (MT). 도 5에 나타낸 결과는 대변 3에서 얻은 결과를 보여준다.
도 6: 동결보호제의 성질에 따라 본래의 대변 및 동결건조물(M0)에서 제조 후 발견된 주요 박테리아 그룹을 나타낸 것: 5% 트레할로오스 (T5), 10% 트레할로오스 (T10), 및 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 혼합물 (MT). 결과는 동결건조 직후 및 4℃에서 3개월(+3) 및 8개월(+8) 동안 보관한 후에 나타난다. 도 6에 제시된 결과는 대변 3에서 얻은 결과를 보여준다.
도 7: 본래의 대변(NS)과 비교하여 3가지 대변 시료(S4, S5, S6)의 주요 박테리아 그룹의 생존율에 대한 동결건조의 영향(L72h) 및 3개월(L3M) 및 6 개월(L6M) 동안 동결건조물의 보존을 나타낸 것. (A) 다른 완전히 혐기성인 박테리아 집단의 영향. (B) 다른 선택적으로 호기성/혐기성인 박테리아 군에 미치는 영향.
도 8: 본래의 대변(NS)과 비교하여 다양한 대변 시료(S4, S5, S6)에서 극심한 산소 민감성인(EOS) 박테리아의 생존력에 대한 동결건조의 영향(L72h) 및 3개월(L3M) 및 6 개월(L6M) 동안 동결건조물의 보존을 나타낸 것.
도 9: 본래의 대변(NS) 및 동결건조된 대변(L72H)에서 수행된 기체 크로마토그래피에 의한 박테리아 대사물질의 진화 평가.
도 10: 본래(S 또는 NS) 및 동결건조된 대변(L72h)의 항-클로스트리듐 디피실 효과의 평가.
실시예 1
1. 재료 및 방법
1.1. 대변 샘플링
동결건조 조건의 선택은 건강한 독립적인 지원자가 제공한 3가지 대변에 대한 연구를 기반으로 하며 배양을 위한 시료 포트에 설치된 GENbagAnaer®시스템이 있는 상태에서 배출 즉시 이루어졌다. 시료는 배출 후 1시간 이내에 바로 실험실로 보내졌다. 각 대변의 일부는 즉각적인 분석을 위한 대조군으로서 GENbagAnaer®로 보존된다.
1.2. 동결보호제의 선택
이 연구에 사용된 동결보호제는 다음과 같다.
- 10%의 글리세롤 (G)
- 10%의 재구성된 탈지 및 저온 살균된 우유 (L).
- 5% 농도의 말토덱스트린 (M).
- 5% (T5) 및 10% (T10) 농도의 트레할로오스.
- 6.7% 농도의 말토덱스트린 및 10% 농도의 트레할로오스, 또는 40/60의 M/T 중량비의 혼합물 (MT).
- 신선한 대변을 희석하기 위해 일반적으로 사용되는 대조군으로 9‰ 농도의 NaCl 용액.
각 용액을 멸균 포트에 포장하고 사용할 때까지 +4℃에서 저장했다.
1.3. 대변 동결건조물의 제조
대변을 동결보호제 용액에서 10배 희석하고 일회용 스템(stem)이 장착된 Ultraturrax®형 균질화기(homogenizer)를 사용하여 균질화시켰다. 본래의 대변 시료 300 mg에 대해 3 ml에 상응하는 부피를 가진 동결건조 바이알에 현탁된 용액을 넣었다.
테스트한 각 조건과 3개의 분석된 대변 각각에 대해, GENbagAnaer®시스템의 존재하에 현탁액 바이알을 즉시 배치하여, 각각 희석되고 비-동결건조된 대변의 미생물상 내 박테리아의 생존력에 대한 다른 동결보호제의 영향을 평가하였다.
나머지 바이알은 즉시 -80℃에 놓는다. 30분 동안 동결시킨 후, 바이알을 트랩(trap)이 자동 사이클 하에서 24시간 동안 이미 냉각된 동결건조기(FreeZone®6 리터, Freeze Dry System, Model 77530, Labcono Corporation, 캔자스시티, 미주리 주, 미국)에 놓는다.
동결건조 기간이 끝날 때, 바이알을 진공 상태로 밀봉하고 알루미늄 뚜껑으로 고정시킨다.
각 대변 및 각 동결-보존 조건에 따라, 1개의 시리즈(series) 바이알은 미생물상 분석을 위해 실험실로 보내지고 2개의 시리즈는 4℃에서 3-4개월 및 7-8개월동안 안정성 연구를 위해 저장된다.
1.4. 동결건조 조건에 따른 미생물상의 생존 능력에 대한 시험관 내 연구
미생물 연구의 첫 번째 단계는 미생물상의 다양성과 그의 생존력을 유지하는 데 있어 다른 동결보호제 하에서 희석 효과를 시험하기 위한 비-동결건조되고 희석된 대변의 분석이었다. 이 목적을 위해, 10% 우유 (L), 10% 글리세롤 (G), 5% 말토덱스트린 (M), 5% 트레할로오스 (T), 10% 트레할로오스 (T10), 및 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 혼합물, 즉 40/60의 M/T 중량비로 만들어진 희석액의 특정 양을 즉시 놓았고, 대변 동결건조물을 제조한 후, 혐기성 생활(anaerobiosis) 및 미생물 배양 하에 즉시 제조되었다.
과정 중 두 번째 단계는 동결건조물 연구와 관련이 있다. 분석은 제조 후 4℃에서 3-4개월 및 7-8개월의 저장 후에 수행되었다. 각각의 동결건조물은 3 ml의 멸균 펩톤 물(water)로 재구성되며, 이는 각 바이알에 초기에 존재하는 희석된 대변의 부피와 일치한다.
완전 호기성 및 혐기성 미생물의 분석을 위해, 비-동결건조된 대변 및 재구성된 동결건조물을 10에서 10으로 희석하고 선택성 및 비선택성 배지에 분주했다(Rouge 등, 2010). 37℃에서 호기성 및 혐기성 유닛(N2/CO2/H2 : 80/10/10)에서 배양된 배지를 표 1에 나타내었다.
각 배양을 위해 미생물상의 분석에 사용된 배지
미생물상의 탐색된 요소
(Searched elements of the microbiota)		 한천 베이스
(agar base)		 배양/판독
(Incubation/reading)
전체 혐기성 군
(Total anaerobic population)		 콜롬비아(Colombia) + 시스테인(cysteine, Cc) + 혈액 + 네오마이신(neomycine, 100 mg/ml) 37℃
48시간 및 5일에서의
혐기성 단위(Anaerobic unit) 판독 및 계산
박테로이데스 종 (Bacteroides sp.),
프레보텔라 종
( Prevotella sp.)		 Cc + 혈액 + 카나마이신 (Kanamycine, 100 mg/ml) + 반코마이신 (vancomycine, 7 mg/ml)
클로스트리듐 디피실리
(Clostridium difficile ) 		CC + 혈액 + 클로스트리듐 디피실리 배지(CLO-M Biomerieux)
기타 클로스트리듐
(Other Clostridium) 		CC + 무피로신 (mupirocine, 100 mg/ml) + 전유(full milk, 5ml) + 뉴트럴 레드 (40 mg/ml)
비피도박테륨 종
( Bifidobacterium sp.)		 WCB (비피도박테리아를 위한 Wilking-Chalgren) + 무피로신 (mupirocine, 100 mg/ml)
락토바실러스 종 (Lactobacillus sp.) MRS (Nan, Rogosa, Sharpe agar)
전체 호기성 군
(Total aerobic population)		 트립티케이스 소이 (Trypticase soy) 37℃
24시간에서의
호기성 생활(Aerobiosis) 판독
엔테로박테리아
(Enterobacteria)		 드리갈스키 (Drigalski)
엔테로코커스 종 (Enterococcus sp.) 엔테로코코셀 (Enterococcosel)
스태필로코커스 종 (Staphylococcus sp.) 채프먼 110 (Chapman 110)
효모 사보우라우드 클로암페니콜
(Sabouraud Chloramphenicol)
클로스트리듐 렙텀(Clostridium leptum) 그룹의 박테리아와 같은 극심한 극심한 산소 민감성(EOS) 박테리아의 정량은 산소의 존재 또는 부재 하에서의 차별적인 배양에 의해 수행되었다. 이 목적을 위해, 신선한 대변 시료(TO) 및 펩톤 물에서 재수화된 다양한 동결건조된 시료들을 매우 풍부한 선택성 배양 배지(셀로비오스, 말토오스 및 시스테인으로 보충된 효모 추출물로 풍부한 뇌-심장(brain-heart) 배지에 상응하는 YBHI)에서 연속 희석시켰다. 이 배지는 페칼리박테리움 프라우스니치이(Faecalibacterium prausnitzii)와 같은 박테리아를 배양하기에 극도로 어려운 박테리아의 배양을 가능하도록 개발되었다. 완전 혐기성 조건에서의 즉석(ad hoc) 희석이 완료되면, 2개의 디쉬에서 병행 배양(parallel cultures)에 의해 산소의 존재에 저항하는지 아닌지 여부에 대한 능력을 평가하였고, 그 중 하나는 호기성 분위기에 60분 동안 노출되었고 반면에 다른 하나는 그렇지 않았다. 동결건조 후 다른 시간에 다른 시료에서 살아있는 완전 혐기성 박테리아의 비율을 이 방법으로 평가할 수 있다.
2. 결과
2.1. 동결건조 전에 미생물상의 다양성과 생존력에 대한 다양한 동결보호제의 영향
다양한 평가된 동결보호제, 특히 MT 혼합물에서의 대변 희석액은 본래의 대변 또는 9% NaCl에 희석된 대변과 비교하여(이는 신선한 대변으로 FMT에 사용된 제제에 상응함), 박테리아 양(load)에 유의한 영향을 미치지 않았고, 배양 가능한 미생물상의 다른 주요 속(genera)의 평형에 영향을 미치지 않았다(도 1). 미생물상의 군의 주요 그룹은 여전히 살아있다.
2.2. 사용된 동결보호제를 기초로 한 미생물상의 생존력에 대한 동결건조의 영향
전체 박테리아 양(load)을 동결건조 후 1주 또는 MO에서 평가하였다. 결과는 도 2에 제시되어 있다. 테스트된 3개의 동결보호제, 즉 5% 트레할로오스 용액 (T5), 10% 트레할로오스 용액 (T10), 및 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 혼합물 (TM)은 동결건조하는 동안 배양 가능한 박테리아의 총 박테리아 양의 90% 이상 안정성을 제공한다; 이 결과는 본래의 대변, 또는 동결건조 전에 9% NaCl에 희석된 대변에 존재하는 양과 비교하여 약 1 로그의 손실에 해당한다.
동결건조 후 최대 7개월까지 측정된 총 박테리아 양은 크게 변하지 않았다(도 3).
또한, 이 3가지 동결보호제는 동결건조 동안 EOS 박테리아의 효율적인 보존을 가능하게 한다(도 4).
2.3. 사용된 다른 동결보호제에 따른 미생물상의 다양성에 대한 동결건조의 영향
상기 테스트된 3가지의 동결보호제 중, 6.7%의 말토덱스트린 및 10%의 트레할로오스의 동결보호제 혼합물(또는 40/60의 중량비로)은 대변 3에 대해 약 1 내지 2 로그 (및 다른 대변에 대해 4 로그까지-도시하지 않음)의 특정한 완전 혐기성 속의 감소에도 불구하고(도 5), 살아있는 대변 미생물상을 구성하고 있는 주요 속(genera)을 유지하는 최상의 결과를 제공한다. 반대로, 10% 글리세롤 용액은 호기성 및 혐기성 속 모두에 대해 보호하지 않는다(결과 미도시).
연구가 동결건조 후 일주일 이내에 수행될 때 완전 혐기성 속(클로스트리듐 종 및 박테로이데스 종)은 여전히 지배적이다(도 6). 4℃에서의 동결건조물의 보존은 거의 영향을 미치지 않았으며 4℃에서 3개월 저장 후 박테로이데스 종에 대해 약 1.5 로그의 추가적인 손실, 클로스트리듐 종에 대해 8개월에 1로그의 손실을 보인다(도 6). 임의의 경우에, 미생물상의 우세한 속은 보존하는 동안에 우세하게 남아있다.
비피도박테리움 종(Bifidobacterium sp.)이 풍부한 대변 2에서 얻어진 결과는 MT 혼합물에서 동결건조 후 최대 6개월 동안 그 그룹의 안정성을 나타내었다(결과는 미도시).
종합적으로 말하자면, 이러한 결과는 MT 혼합물이 동결건조 후 6개월의 기간 동안, 생존력과 다양성 면 모두에서 동결건조된 대변 미생물상의 최상의 보존을 허용한다.
실시예 2
1. 재료 및 방법
실시예 1에서 기술된 방법에 따라, S4, S5 및 S6으로 식별되는 3개의 추가적인 대변 시료를 6.7% 말토덱스트린 및 10% 트레할로오스의 동결보호제 혼합물(또는 40/50의 M/T 중량비)에서 희석시킨 다음 동결건조시켰다.
2. 결과
2.1. 6개월 저장 후 동결건조물 내 박테리아 생태계의 안정성
2.1.1. 6개월 저장 후 동결건조물 내 박테리아 생존력 및 다양성 분석
완전 혐기성 집단은 대표적인 박테리아 그룹의 수에 기초하여 분석되었다: 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.) 및 박테로이데스(Bacteroides spp.)
비피도박테리움 spp. 속에 관해서는, 우세한 미생물상의 불가분의 일부로 남아 있으며 6개월 보존 기간 동안 유의한 변화가 없다.
박테로이데스 spp. 속에 대해서, 6개월 동안 약 1.5 내지 4 로그의 손실을 초래하는 개체간 변이가 있었다.
박테리아 그룹 락토바실러스 spp., 엔테로코커스 spp. 및 엔테로박테리아(Enterobacteriaceae)의 수에 기초하여, 다른 시료로부터 최적의 호기성-혐기성 집단을 분석하였다. 6개월 보존 기간 동안 동결건조 후 속(genera) 및 박테리아 그룹의 안정성과 생존력이 확인되었다.
이러한 결과는 동결건조 공정이 주요 박테리아 그룹간에 전반적인 균형의 변화를 유도하지 않으면서 다양한 표적 박테리아 집단의 생존력을 대개 유지함을 보여주며, 보존은 6개월 보존기간에 걸쳐 안정함을 나타낸다(도 7).
2.1.2. 극심한 산소 민감성 박테리아의 연구
대변 미생물상의 특이적인 특징 중 하나는 동결건조 과정에 의해 영향을 받을 수 있는 극심한 산소 민감성(EOS) 박테리아의 존재이다.
이러한 EOS 박테리아는 모든 분석되는 시료에서 본래의 대변 및 대변 동결건조물에서 모두 검출된다(도 8). 이 EOS 박테리아가 혐기성 박테리아의 총량(CFU/ml)에 대한 백분율로 표시될 때, 보존 기간 (시료에 따라 3 내지 6개월) 동안 수준이 안정적으로 유지되며 완전 혐기성 박테리아의 양은 보존 과정에 의해 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는 동결건조가 극심한 산소 민감성을 나타내는 박테리아 집단에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여준다.
2.2. 동결건조물 내 박테리아 생태계의 기능 안정성
2.2.1. 동결건조물 내 대사물질의 검출
박테리아 대사물질, 즉 단쇄 지방산의 생산은 72시간 동결건조물에서 본래 대변과 비교하여 평가되었다. 3가지 분석 시료 중에서, 동결건조는 발효 생성물의 보존을 유도하고, 단쇄 지방산의 농도는 대변 시료에 따라 아세테이트와 프로피오네이트의 경우 2 내지 4배, 부티레이트의 경우 2 내지 6배 증가한다. 박테리아 대사물질은 휘발성이지만 동결건조물에 존재한다. 그 농도의 증가는 대사물질의 농도를 증가시키는 동결건조의 결과이다(도 9).
2.2.2. 동결건조물 내 항-클로스트리듐 디피실리 효과의 검출
본래 대변 및 동결건조물에서의 항-클로스트리듐 디피실리 효과를 시험관 내에서 1종의 톡시노젠 균주(균주 630) 및 1종의 비-톡시노젠 균주(균주 PCD1)를 포함하는 2개의 클로스트리듐 디피실리 균주의 존재 하에 분석하였다. 균주의 성장이 억제되면, 접종 영역 주위에 옅은 원(circle)이 나타난다: 이것은 접종 원이다.
항-클로스트리듐 디피실리 효과로 알려진 다양한 대조군을 체계적으로 양성 대조군으로 사용했다. 따라서 젖산(AL) 뿐만 아니라 아세트산(AA)은 다른 농도 (300, 400, 500 mM)로 사용되었다. 각 디쉬에서 아세트산 및/또는 젖산의 존재 하에서 억제 원이 관찰되었다.
대조 균주, 즉, 억제 원이 나타나지 않는 락토바실러스(Lactobacillus) 균주 및 비피도박테리움(Bifidobacterium, CB)로 순수 균주를 사용하였다.
본래의 대변(S 또는 NS) 및 72시간 동안 -80℃에서 동결된 대변(T1, T2 및 T3))의 존재 하에서, 억제 원이 보이지 않지만 동결건조물의 존재 하에서는 억제 원이 보인다(도 10).
이러한 다양한 실험의 결과는 아세트산 및 젖산, 및 분석된 대변의 모든 동결건조물에 대한 억제 영역의 존재를 나타낸다. 따라서 클로스트리듐 디피실리의 시험관 내 저해 능력은 동결건조에 의해 강화된다.
실시예 2에 나타낸 모든 결과는 적어도 6개월의 기간 동안 동결건조물 내 미생물상의 안정성 및 생존력을 확인하고 동결건조물 내에서 박테리아의 기능적 능력, 특히 시험관 내 연구 모델에서 관심있는 박테리아 대사물질의 보존과 항-클로스트리듐 디피실리 효과가 유지된다는 것을 확인하였다.
실시예 3
1. 재료 및 방법
1.1. 대변 동결건조물
4개의 대변 동결건조물을 얻기 위해 건강한 기증자로의 4개의 대변을 실시예 1에 기재된 방법으로 처리하였다: S4, S5, S6 및 S7, 여기서 S7은 실시예 2와 비교하여 추가적인 대변 시료를 나타냄.
1.2. 부형제의 선택
희석제
희석제의 선택은 불활성, 및 특히 특이적인 장 효과의 부재에 기초한다.
선택된 희석제는 무기물 부형제, 디칼슘 포스페이트(dicalcic phosphate, Anhydrous Encompress®JRS Pharma, 로젠버그, 독일) 및 분무된 말토덱스트린 (Emdex®JRS Pharma 로젠버그, 독일)이며, 후자 유형의 부형제는 이미 동결건조물의 조성에 존재한다. 이들 두 순수한 부형제의 밀도 및 유동 시간은 각각 무수 Encompress®의 경우 각각 0.79 g/mL 및 3초 18/100 g 이고, Emdex®의 경우 0.68 g/mL 및 6 초 03/100 g 이다.
윤활제
3개의 유동 윤활제가 선택되었다: 활석(Cooper, 프랑스), 친수성 콜로이드성 실리카(Aerosil®200 Pharma, Kraemer & Martin GmbH, St-Augustin, 독일), 소수성 콜로이드성 실리카 (Aerosil®R972, Degussa-Huls, Courbevoie, 프랑스).
1.3. 유동 시간을 측정하고 동결건조물을 부형제와 혼합
이 시험은 유럽 약전(European Pharmacopoeia)의 모노그래프(monograph) 2.9.16에 따라, 먼저 동결건조물 단독에 대해 수행되었고, 그 다음 0.5%로 사용되는 유동 윤활제의 첨가 후, 필요 시 75/25, 50/50 및 25/75 중량비로 시험된 희석제의 첨가 후 수행되었다. 이 혼합물은 수동으로 얻어졌다.
계산에 의해 1 mL로 보고되기 전에, 우수한 유동성을 특징으로 하는 최종 혼합물의 밀도를 모든 혼합물에 대해 측정하였다.
1.4. 우수한 유동성을 특징으로 하는 혼합물로 캡슐 제조
0.95 mL의 유의한 부피 및 비교적 쉬운 소화와 양립가능한 크기(23.3 mm)와 관련된 N°100캡슐이 선택되었다. 그들은 캡슐 충전제와 우수한 유동성이 특징인 혼합물로 수동으로 충전되었다.
2. 결과
2.1. 동결건조물의 유동 특성 및 밀도 연구
표 2는 동결건조물에 대해 수행된 시험 결과를 나타낸다.
표 2. 유동성 윤활제 및/또는 희석제를 포함하는 혼합물을 포함하는 가공되지 않은 대변 동결건조물의 유동성(flow), 및 최종 부피의 밀도.
테스트된 혼합물 중량비 유동성
(XG의 3번 측정 중 평균)		 밀도
S4 가공되지 않은 동결건조물 무한 확인되지 않음
대변 동결건조물/활석 99.5/0.5 무한
대변 동결건조물-활석*/Emdex® 75/25 무한
50/50 4s16 (taps)
25/75 13.70 g의 경우 0s69 (0s69/0s68/0s71) 13.70g/26mL
(0.53g/mL
S5 가공되지 않은 동결건조물 - 무한 확인되지 않음
대변 동결건조물/Aerosil®200 99.5/0.5 무한
대변 동결건조물/Aerosil®200*/무수 Emcompress® 75/25 0s84/0s37/무한 (taps)
50/50 0s53/0s31/무한
25/75 10.86의 경우 0s57 (0s56/0s48/0s68) 10.86g/17mL (0.64g/mL)
S6 가공되지 않은 동결건조물 - 무한 확인되지 않음
대변 동결건조물/Aerosil®R927 99.5/0.5 1.466g 의 경우 0s30 (0s35/0s25/0s31) 1.466g/4.5mL (0.33g/mL)
S7 가공되지 않은 동결건조물 - 무한 확인되지 않음
동결건조물/Aerosil®R927 99.5/0.5 3.296g 의 경우 0s26 (0s25/0s25/0s27) 3.296g/7mL (0.47g/mL)
* 99.5/0.5의 중량비
단독으로 검사된 가공되지 않은 대변 동결건조물 중 어느 것도 유동 특성을 나타내지 않는다. 따라서 그들을 있는 그대로 캡슐에 넣어두는 것은 불가능하다.
유동 윤활제의 역할에도 불구하고, 0.5%에서 사용된 활석 및 Aerosil®200은 동결건조물(S5 및 S5)의 유동성을 향상시키지 못했다.
Emdex®와 무수 Emcompress®희석제는 유동성을 개선하는 데 효율적이다. 개선은 동결건조물 S4-활석/Emdex®혼합물의 경우 50/50 비율로, 동결건조물 S5-Aerosil®200/무수 Emcompress®혼합물의 경우 75/25의 비율로 발생한다. 동결건조물과 희석제 사이의 비율이 25/75인 경우, 혼합물은 유동 시간이 13.70 g인 경우 0s69이고(S4), 10.86 g인 경우 0s57(S5)인 유체가 된다.
마지막으로, 0.5%에서 단독으로 사용되는 AroSil®R972 유동 윤활제는 동결건조물 S6(1.466g의 경우 0s30) 및 S7(3.296g의 경우 0s26)의 유동성을 크게 향상시켰다.
혼합물의 밀도는 "동결건조물/유동 윤활제/희석제" 혼합물의 경우 0.53 내지 0.64 g/mL이고, "동결건조물/유동 윤활제" 혼합물의 경우 0.33 내지 0.47 g/mL 이다.
2.2. 혼합물의 캡슐 제조
표 3은 각 시료에 대해 제조된 캡슐의 수 및 각 캡슐에 통합된 동결건조물의 질량을 나타낸다. 처음에 실행된 신선한 물질의 이론적인 질량은 마지막 열에 보고된다.
표 3. 동결건조된 시료로 제조된 캡슐의 특성
제조된 캡슐의 수 혼합물 질량/캡슐 동결건조물 질량/캡슐 n 캡슐에 있는 신선한 물질의 이론적 질량
S4 - 활석/Emdex® 20 500 mg 125 mg 1754 mg
S5 - Aerosil® 200/무수 Emcompress® 18 603 mg 151 mg 3000 mg
S6 - Aerosil®R972 5 293 mg 293 mg 1792 mg
S7 - Aerosil®R972 7 471 mg 471 mg 5000 mg
시료 S6 및 S7의 경우는 0.5% 유동 윤활제만 첨가되었기 때문에, 동결건조물의 희석이 중요하지 않아 가장 유리하다. 그러나 건조 물질 293 mg(S6) 또는 471 mg(S7)을 나타낼 수 있는 동일한 양의, 두 시료 간에 관찰되는 다소 중요한 변동성이 있다. 이것은 두 시료 간의 밀도 차이에 기인한다.
시료 S4 및 S5와 관련하여, 동결건조물의 희석은 0.5%의 유동 윤활제 이외에, 75% 희석제의 첨가 때문에 더욱 중요하다. 동일한 부피에서, 동결건조물의 질량은 각 시료의 밀도와 관련하여 건조 물질 125 mg(S4)에서 151 mg(S5)까지 다양하다.
이 연구는 분말의 대변 미생물상 동결건조물은 유동성이 없으므로 캡슐에 단독으로 넣을 수 없음을 보여준다.
그러나 75% 희석제(Emdex®maltodextrins, 무수 디칼슘 포스페이트, 무수 Emcompress®또는 0.5% 유동 윤활제(소수성 콜로이드성 실리카, Aerosil®R972)와 혼합하여 동결건조물의 유동 특성을 개선할 수 있다.
참고문헌
Allen-Vercoe E, Petrof EO. Artificial stool transplantation: progress towards a safer, more effective and acceptable alternative. Expert Rev Gastroenterol Hepatol 2013;7:291-3.
ANSM. Rapport. La transplantation de microbiote fecal et son encadrement dans les essais cliniques, Mars 2014, mise a jour juin 2015.
Beal C and Fonseca F. Freezing of probiotic bacteria. P. 179-212. Advances in probiotic technology. Eds Foerst P. and Sativarangkna C. 2015, CRC Press, Boca Raton, USA.
Borody T, Fischer M, Mitchell S, Campbell J. Fecal microbiota transplantation in gastrointestinal disease: 2015 update and the road ahead. Expert Rev Gastroenterol Hepatol.2015;9:1379-91. Carvalho A.S., Silva J., Ho P., Texeira P., Malcata F.X. and Gibbs P. Relevant factors for the preparation of freeze-dried lactic acid bacteria. Int. Dairy J 2004, 14: 835-47.
Debast SB, Bauer MP, Kuijper ED. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: update of the treatment guidance document for Clostridium difficile infection. Clin Microbiol Infect 2014;20Suppl 2:1-26.
Hamilton MJ, Weingarden AR, Sadowsky MJ, KhorutsA. Standardized frozen preparation for transplantation of fecal microbiota for recurrent Clostridium difficile infection. Am J Gastroenterol2012; 107:761-7.
Kapel N, Thomas M, Corcos O, Mayeur C, Barbot-Trystram L, Bouhnik Y, Joly F. Practical implementation of faecal transplantation. Clinical Microbiology and lnfection2014;20:1098-105.
Kelly CR, Kahn S, Kashyap P, Laine L, Rubin D, Atreja A, Moore T, Wu G. Gastroenterology.2015 Jul;149(l): 223-37.
Le Hir A, Chaumeil JC, Brossard 0, Charrueau C, Crauste-Mander S. Pharmacie galenique, bonnes pratiques de fabrication des medicaments. Elsevier Masson SAS, Issy-les-Moulineaux, France, 104mi edition,2016.
Lee CH, SteinerT, Petrof EO, Smleja M, Roscoe D, Nematallah A, Weese JS, Collins S, Moayyedi P, Crowther M, Ropeleski MJ, Jayaratne P, Higgins D, Ll Y, Rau NV, Kim PT. Frozen vs Fresh Fecal Microbiota Transplantation and Clinical Resolution of Diarrhea in Patients With Recurrent Clostridium difficile infection: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2016;315:142-149
Ott SJ, Waetzig 6H, Rehman A, Moltzau-Anderson J, Bharti R, Grasis JA, Cassidy L, Tholey A, Fickenscher H, Seegert D, Rosenstiel P, Schreiber S. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 2016 Nov 17. pii: S0016- 5085(16)35354-9. doi: 10.1053/j.gastro.2016.11.010.
Pharmacopee europeenne 8inw edition,2016.Monographie 2.9.16. Ecoulement. EDQM Europeen Directory for the Quality of Medicines and Healthcare. https://www.edqm.eu/fr/Pharmacopee- europeenne-8eme-Edition-1563.html
Rouge C, Goldenberg O, Ferraris L, Berger B, Rochat F, Legrand A, Gobel UB, Vodovar M, Voyer M, Roze JC, Darmaun D, Piloquet H, Butel Ml, De La Cochetiere MF. Investigation of the intetinal microbiota in preterm infants using different methods. Anaerobe 2010;16:362-370.
Sokol H, Galpertne T, Kapel N, Bourlioux P, Seksik P, Barbut F, Scanzi J, Chast F, Batista R, Joly F, Joly AC, Collignon A, Guery B, Beaugerie L, pour le GroupeFrancais de Transplantation Fecale (GFTF). Transplantation de microbiote fecal dans le cadre des infections a Clostridium difficile recidivantes : recommandations pour la pratique clinique courante. Hepato Castro 201 ; 22:278- 90.
Surawicz CM, Brandt U, Binion DG, et ai. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention of Clostridium difficile infections. Am J Gastroenterol 2013;108:478-98.
Van Nood E, Vrieze A, Nieuwdorp M, Fuentes S, Zoetendal EG, de Vos WM, Visser CE, Kuijper El, Bartelsman JF, Tijssen JG, Speelman P, Dijkgraaf MG, Keller J. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. N Engl J Med 2013;368:407-15.
Vrieze A, de Groot PF, Kootte RS, Knaapen M, van Nood E, Nieuwdorp M. Fecal transplant: a safe and sustainable clinical therapy for restoring intestinal microbial balance in human disease. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2013;27:127-37.
Youngster I, Sauk J, Pindar C, Wilson RG, Kaplan JL, Smith MB, Alm EJ, Gevers D, Russell GH, Hohmann EL. Fecal microbiota transplant for relapsing Clostridium difficile infection using a frozen inoculum from unrelated donors: a randomized, open-label, controlled pilot study. Clin Infect Ois 2014a;58:1515-22
Youngster I, Russell GH, Ziv-Baran T, SaukJi, Hohmann EL. Oral, capsulized, frozen fecal microbiota transplantation for relapsing Clostridium difficile infection JAMA. 2014b;312:1772-8.
Youngster I, Mahabamunuge J, Systrom HK, Sauk J, Khalili H, Levin J, Kaplan JL, Hohmann EL. Oral, frozen fecal microbiota transplant (FMT) capsules for recurrent Clostridium difficile infection. BMC Med. 2016 Sep 9; 14(1): 134. dol: 10.1186/sl2916 016-0680-9.

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 생태계 내의 미생물상 및 동결보호제의 혼합물의 동결건조물(lyophilizate)을 유효성분으로 포함하는 장내 불균형(dysbiosis)을 포함하는 질환 또는 장애(disorder) 치료용 조성물로서,
    상기 생태계 내의 미생물상은 장내 미상물상(intestinal microbial), 대변(stool) 미생물상, 및 질 미생물상(vaginal microbial) 중에서 선택되고,
    상기 동결보호제의 혼합물은, 혼합물 전체 중량에 대하여, 35-45중량%의 말토덱스트린 및 55-65 중량%의 트레할로오스를 포함하고, 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    (i) 상기 생태계 내의 미생물상(microbiota in its ecosystem, MIIE)은 대변으로 구성되고,
    (ii) 상기 대변 중량 비율은 상기 동결건조물의 15 내지 35%이고, 상기 동결보호제의 혼합물은 상기 동결건조물의 85 내지 65%이며,
    (iii) 혼합물 전체 중량에 대하여, 말토덱스트린은 동결보호제의 혼합물의 40 중량%이고 트레할로오스는 동결보호제의 혼합물의 60 중량%인,
    장내 불균형(dysbiosis)을 포함하는 질환 또는 장애 치료용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제3항에 있어서,
    상기 조성물은 적어도 하나의 유동성 부형제(flow excipient)와 혼합되고, 위-내성 캡슐에 충전되는 조성물(gastro-resistant)이되,
    상기 유동성 부형제는 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), 활석(talcum), 친수성 콜로이드성 실리카(hydrophilic colloidal silica) 및 소수성 콜로이드성 실리카(hydrophobic colloidal silica)을 포함하는 무기 부형제 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 장내 불균형(dysbiosis)을 포함하는 질환 또는 장애(disorder)는 클로스트리듐 디피실리 대장염 , 크론병과 궤양성 대장염(ulcerative colitis)과 같은 만성 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 다중 약물-내성 박테리아의 존재, 변비 (constipation), 여행자 설사(traveller's diarrhoea), 위장 감염 (gastrointestinal infections), 자가면역질환(autoimmune diseases), 게실증 (diverticulosis), 1형 및 2형 당뇨, 대사 증후군, 비만, 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis) 및 천장관절염 (sacroiliitis), 만성 피로 증후군, 구취(halitosis), 알러지(allergy), 여드름 (acne), 불면증(insomnia), 우울증(depression) 및 파킨슨 병 및 자폐증 스펙트럼과 같은 신경정신학적 질환(neuropsychiatric diseases)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 장내 미생물상(intestinal microbiota)의 불균형과 관련된 질환 또는 장애가 재발성 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile) 감염인 경우, 경구용 항생제 치료를 위한 중계물(relay)로서 사용하기 위한, 조성물.
  9. a. 생태계 내의 미생물상의 수집;
    b. 제3항의 동결보호제의 혼합물로 상기 생태계 내의 미생물상을 희석한 생태계 내의 미생물상의 희석액을 얻는 단계;
    c. 단계 b에서 얻은 희석액을 동결건조하여 동결건조물을 얻는 단계;
    d. 단계 c에서 얻은 동결건조물을 스프레이하여 분말 형태의 동결건조물을 얻는 단계;
    e. 상기 동결건조물의 유동성을 개선시키는 하나 이상의 유동성 부형제를 첨가하여 동결건조물과 부형제의 혼합물을 얻는 단계;
    f. 상기 단계 e에서 얻은 혼합물로 위-내성 캡슐의 외피(envelope)를 충전하여, 위-내성 캡슐을 얻는 단계;로 구성되는 것을 특징으로 하는 제3항의 조성물이 충전된 위-내성 캡슐의 제조방법이되,
    상기 단계 a에서 생태계 내의 미생물상은 장내 미상물상(intestinal microbial), 대변(stool), 및 질 미생물상(vaginal microbial) 중에서 선택되고,
    상기 단계 e에서 유동성 부형제는 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate), 말토덱스트린(maltodextrin), 활석(talcum), 친수성 콜로이드성 실리카(hydrophilic colloidal silica) 및 소수성 콜로이드성 실리카(hydrophobic colloidal silica)을 포함하는 무기 부형제 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 위-내성 캡슐의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 생태계 내의 미생물상은 대변이고, 상기 동결보호제의 혼합물은, 혼합물 전체 중량에 대하여, 동결보호제의 혼합물의 40 중량%인 말토덱스트린 및 동결보호제의 혼합물의 60 중량%인 트레할로오스로 구성되는 것을 특징으로 하는, 위-내성 캡슐의 제조방법.
KR1020187018184A 2015-12-18 2016-12-16 생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물 KR102445404B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1562836 2015-12-18
FR1562836A FR3045384B1 (fr) 2015-12-18 2015-12-18 Composition lyophilisee pour la conservation de microbiote dans son ecosysteme
PCT/EP2016/081603 WO2017103225A1 (fr) 2015-12-18 2016-12-16 Composition lyophilisee pour la conservation de microbiote dans son ecosysteme

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180113981A KR20180113981A (ko) 2018-10-17
KR102445404B1 true KR102445404B1 (ko) 2022-09-19

Family

ID=55346090

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187018184A KR102445404B1 (ko) 2015-12-18 2016-12-16 생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물

Country Status (14)

Country Link
US (1) US11110133B2 (ko)
EP (1) EP3389681B1 (ko)
JP (1) JP6946299B6 (ko)
KR (1) KR102445404B1 (ko)
CN (1) CN108472321B (ko)
AU (1) AU2016374580B2 (ko)
CA (1) CA3008315C (ko)
DK (1) DK3389681T3 (ko)
ES (1) ES2788646T3 (ko)
FR (1) FR3045384B1 (ko)
HU (1) HUE052404T2 (ko)
IL (1) IL260017B2 (ko)
PT (1) PT3389681T (ko)
WO (1) WO2017103225A1 (ko)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3045383B1 (fr) * 2015-12-18 2019-06-14 Maat Pharma Procede de lyophilisation d'un echantillon de microbiote fecal
FR3067928B1 (fr) * 2017-06-23 2020-02-28 Fondation Mediterranee Infection Procede de conservation d'un echantillon de bacteries
CN110540941A (zh) * 2019-07-16 2019-12-06 上海交通大学 一种从粪便中提取保存菌液的方法
EP4045069A1 (en) * 2019-10-18 2022-08-24 Thaena Inc. Fecal-derived sterile postbiotic composition and method therefor
EP3858363A1 (en) 2020-01-28 2021-08-04 Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement Composition for treating intestinal or pulmonary diseases
US11098377B1 (en) * 2020-09-15 2021-08-24 Nubiyota Llc Systems and methods for characterizing compositions comprising bacterial populations
CN113209039A (zh) * 2021-04-22 2021-08-06 重庆晶云生物科技有限公司 一种肠菌胶囊及其制备方法
CN114181913A (zh) * 2021-12-14 2022-03-15 厦门昶科生物工程有限公司 一种噬菌体冻干粉制剂及其生产方法
CN114404384A (zh) * 2022-02-25 2022-04-29 北京富玛特生物科技有限公司 一种用于肠道菌群移植的口服胶囊及其制备方法
CN115404167A (zh) * 2022-09-21 2022-11-29 上海承葛医药科技有限公司 一种适用于人体肠道菌群的冻存保护液

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013142792A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1962873E (pt) * 2005-12-14 2013-08-29 Oxthera Inc Composições farmacêuticas compreendendo bactérias redutoras de oxalato
US20100189767A1 (en) * 2006-09-19 2010-07-29 Eyal Shimoni Probiotic compositions and methods of making same
EP2600877A4 (en) * 2010-08-04 2014-05-07 Borody Thomas J COMPOSITIONS FOR FLORAL TRANSPLANTATION OF FECAL MATERIALS AND METHODS OF MAKING AND USING SAME, AND DEVICES FOR THEIR ADMINISTRATION
WO2014152484A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Regents Of The University Of Minnesota Freeze dried fecal microbiota for use in fecal microbial transplantation
FR3035328B1 (fr) 2015-04-24 2019-08-23 Maat Pharma Procede de preparation d'un echantillon de microbiote fecal

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013142792A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Advanced Bionutrition Corporation Stabilizing composition for biological materials

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
David et al., "Microencapsulation of Lactobacillus paracasei by spray freeze drying", Food Research International 43 (2010) 193-202

Also Published As

Publication number Publication date
CA3008315C (fr) 2022-09-13
US11110133B2 (en) 2021-09-07
JP6946299B2 (ja) 2021-10-06
CA3008315A1 (fr) 2017-06-22
FR3045384B1 (fr) 2020-02-07
HUE052404T2 (hu) 2021-04-28
IL260017A (en) 2018-07-31
CN108472321B (zh) 2022-04-15
DK3389681T3 (da) 2020-05-04
JP2018537504A (ja) 2018-12-20
AU2016374580B2 (en) 2023-06-08
WO2017103225A1 (fr) 2017-06-22
EP3389681B1 (fr) 2020-02-05
EP3389681A1 (fr) 2018-10-24
KR20180113981A (ko) 2018-10-17
CN108472321A (zh) 2018-08-31
AU2016374580A1 (en) 2018-07-19
ES2788646T3 (es) 2020-10-22
FR3045384A1 (fr) 2017-06-23
PT3389681T (pt) 2020-05-08
US20190134110A1 (en) 2019-05-09
IL260017B2 (en) 2023-06-01
JP6946299B6 (ja) 2021-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102445404B1 (ko) 생태계 내의 미생물상을 보존하기 위한 동결보존된 조성물
US20220000939A1 (en) Compositions for Fecal Floral Transplantation and Methods for Making and Using Them and Device for Delivering Them
EP3630190B1 (en) Lyophilized compositions comprising fecal microbe-based therapeutic agents and methods for making and using same
Tomás et al. Encapsulation and subsequent freeze-drying of Lactobacillus reuteri CRL 1324 for its potential inclusion in vaginal probiotic formulations
ES2863398T3 (es) Uso de probióticos en el tratamiento y/o la prevención de la dermatitis atópica
BRPI0314060B1 (pt) composição compreendendo variante ou componente de variante de lactobacillus fermentum e usos da variante ou componente de variante de lactobacillus fermentum e da composição
Torp et al. Optimizing oral delivery of next generation probiotics
CN105008924B (zh) 用于治疗和/或预防腹泻的益生菌菌株
KR20060109452A (ko) 건조 바이오치료 조성물, 용도, 그 투여 장치 및 투여 방법
US20180099011A1 (en) Compositions and Methods for Treating Irritable Bowel Syndrome and Related Disorders
US20200197449A1 (en) Compositions and Methods for Treating Alopecia and Related Disorders
Sorokina et al. Optimization of Conditions for Human Bacterial Preparation for Biological Correction of Intestinal Microflora

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant