CN110810399B

CN110810399B - 细胞运输保护液及制备方法和应用

Info

Publication number: CN110810399B
Application number: CN201911161689.5A
Authority: CN
Inventors: 焦晓敏; 杜宏武
Original assignee: Kangyanbao Beijing Stem Cell Technology Co ltd
Current assignee: Kangyanbao Beijing Stem Cell Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110810399A

Abstract

本发明提供了一种细胞运输保护液及制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的细胞运输保护液包括保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水。其中，保护剂包括纤维素醚、环糊精、聚合醇或泊洛沙姆188，以上述各物质作为保护剂，成本低，且能够减缓细胞生长速度，避免细胞生长过密，影响细胞活性。并且，上述保护剂还能够增加细胞运输保护液的粘稠度，有效避免运输过程中因震动摇晃引起的细胞物理损伤。同时，基础培养基中富含细胞代谢必需成分，白蛋白也可为细胞提供营养，从而有效保持细胞的活性。此外，抗生素能够起到良好的抑菌杀菌作用，维持细胞无菌生长环境。

Description

细胞运输保护液及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种细胞运输保护液及制备方法和应用。

背景技术

随着医学的发展，在临床应用及科研实践过程中，人们对保存离体器官、组织及细胞等的需求不断提高，标准不断提升，在对一些待移植器官或组织的保存、运输等过程中，也对细胞生存的介质提出了更高的要求。既要确保器官、组织或细胞的生存能力，又要最大限度的保留其原有的生物学活性，同时还要防止其被细菌等污染，防止其死亡。各种器官、组织或细胞的属性不同，在保存运输等过程中其保存介质也有不同要求。

干细胞(Stem Cell)是一种未高度分化，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞具有分化潜能，经适当条件下对其定向诱导增殖、分化成相应组织器官，在临床治疗上具有非凡意义，如用于修复损伤组织细胞、替代损伤细胞的功能，或刺激机体自身细胞的再生功能。因此，干细胞的研究应用得以在医疗领域大放异彩。其中尤以间充质干细胞近年来的发展态势迅猛。

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells)来源于中胚层，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。间充质干细胞的特征在于免疫源性弱，不易与宿主产生免疫排斥反应，因此，在多学科多领域均成为理想的干细胞种子来源。在组织工程技术领域，已有搭载干细胞的组织工程材料修复病变组织，在小儿脑瘫、心肌梗死治疗临床应用中，也有通过注射间充质干细胞对坏死组织进行功能重建并取得成功。因此间充质干细胞蕴藏了巨大的应用前景。

目前，为保证间充质干细胞在运输过程中的活性，通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行转运、运输条件非常苛刻，必须保证运输全程处于低温状态，成本高昂。且运输过程中若细胞反复冻融，会影响细胞存活率。另外所收到的细胞无法直接观察其状态，对于后续研究实验没有保障。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种细胞运输保护液，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供上述细胞运输保护液的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述细胞运输保护液在细胞运输中的应用。

本发明提供了一种细胞运输保护液，所述细胞运输保护液包括：

保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水；

所述保护剂包括纤维素醚、环糊精、聚合醇或泊洛沙姆188。

进一步的，所述纤维素醚包括羟丙基纤维素或羧甲基纤维素钠盐；

优选地，所述羧甲基纤维素钠盐包括低粘羧甲基纤维素钠盐或中粘羧甲基纤维素钠盐。

进一步的，所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、2-羟丙基-β-1环糊精、2-羟丙基-γ-环糊精或甲基-β环糊精。

进一步的，所述聚合醇包括聚乙烯醇或多元醇，优选多元醇为聚乙二醇。

进一步的，所述基础培养基包括MEM或DMEM；

优选地，所述白蛋白来自人或动物源，所述白蛋白优选为胎牛血清。

进一步的，所述抗生素包括青霉素和链霉素；

优选地，所述青霉素和链霉素的质量比为1-2.5:1，更优选为1:1；

优选地，所述水为无菌去离子水。

进一步的，每1L所述细胞运输保护液包括：

保护剂2-15g、基础培养基0.1-0.3L、白蛋白0.01-0.03L、抗生素0.2-1.5g和余量的水；

优选地，每1L所述细胞运输保护液包括：

保护剂3-12g、基础培养基0.12-0.25L、白蛋白0.012-0.028L、抗生素0.3-1.2g和余量的水；

优选地，每1L所述细胞运输保护液包括：

保护剂5-10g、基础培养基0.15-0.2L、白蛋白0.015-0.025L、抗生素0.4-1g和余量的水。

进一步的，所述细胞包括贴壁细胞；

优选地，所述细胞包括间充质干细胞。

本发明还提供了上述的细胞运输保护液的制备方法，取保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水并混合均匀，得到细胞运输保护液。

另外，本发明还提供了上述的细胞运输保护液在细胞运输中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的细胞运输保护液包括保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水。其中，保护剂包括纤维素醚、环糊精、聚合醇或泊洛沙姆188，以上述各物质作为保护剂，成本低，且能够减缓细胞生长速度，避免细胞生长过密，影响细胞活性。并且，上述保护剂还能够增加细胞运输保护液的粘稠度，有效避免运输过程中因震动或摇晃引起的液体对细胞的损伤。同时，基础培养基中富含细胞代谢必需的成分，可以有效的保持细胞的活性。白蛋白也可以为细胞提供营养。此外，抗生素能够起到良好的抑菌杀菌作用，维持细胞无菌生长环境。

本发明提供的细胞运输保护液的制备方法，工艺简单、操作方便，只要取保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水溶解并混合均匀，即可得到细胞运输保护液。该制备方法无需借助昂贵的仪器，能够有效节约成本，适合大规模生产应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他结果。

图1为应用本发明实施例1提供的细胞运输保护液传代后的细胞成活率的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在常温或37℃环境中，细胞生长活跃，细胞内生化反应活跃、代谢旺盛、耗氧高、能耗大。细胞生长过密后，会发生抑制生长现象，刺激细胞分泌不良因子，还会引起环境pH和渗透压的变化，造成细胞溶胀和死亡。在细胞运输中，这一问题更为突出，因此通常将细胞冷冻后用液氮或干冰进行转运。在液氮或干冰低温下进行非细胞培养状态运输，需要将贴壁细胞解离下来，进行冻存操作后，放置到液氮或干冰中低温运输。在冷冻状态下，细胞停止生命活动和新陈代谢，进入“休眠”。但冷冻运输对于运输条件要求非常苛刻，成本高、细胞活率低，因此在实际应用过程中难以广泛采用。

基于此，本发明提供了一种细胞运输保护液，包括：

保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水；

所述保护剂包括纤维素醚、环糊精、聚合醇或泊洛沙姆188。

其中，以纤维素醚、环糊精、聚合醇或泊洛沙姆188作为保护剂，成本低，且能够有效减缓细胞生长速度，避免细胞生长过密，影响细胞活性。并且，上述保护剂还能够增加细胞运输保护液的粘稠度，避免运输过程中因震动或摇晃引起的细胞损伤。

需要说明的是，纤维素醚指的是通过纤维素聚合物中一个或多个脱水葡萄糖重复单元上存在的一个或多个羟基的转变以在纤维素聚合物上提供一种或多种醚连接的基团，从而形成纤维素醚。为了在保证保护效果的基础上进一步节约成本，在一些优选的实施方式中，纤维素醚可以选自羟丙基纤维素(HPC)或不同级别的羧甲基纤维素钠盐。优选地，不同级别的羧甲基纤维素钠盐可以选自低粘羧甲基纤维素钠盐(CMC-LV)或中粘羧甲基纤维素钠盐(CMC-MV)。

环糊精是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。在一些优选的实施方式中，所述环糊精可以选自α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)、γ-环糊精(γ-CD)、2-羟丙基-β-1环糊精(HBC)、2-羟丙基-γ-环糊精(HGC)或甲基-β环糊精(MBC)。上述各类环糊精均能够有效增加细胞运输保护液的粘稠度，在保证细胞存活率的基础上，增加细胞运输保护液的稳定性。

典型的聚合醇可以选自聚乙烯醇(PVA)或多元醇，聚乙烯醇和多元醇，其中，多元醇优选为聚乙二醇。

此外，本发明也可以选用泊洛沙姆188(Polox188)作为细胞运输保护液中的保护剂，泊洛沙姆188除减缓细胞生长速度和增加细胞运输保护液粘稠度外，还有利于细胞贮存后各类生长因子的保持。

在本发明提供的细胞运输保护液中，基础培养基中富含细胞代谢必需的成分，可以有效的保持细胞的活性。对基础培养基的种类不做限定，凡是能够在培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，均可作为本发明细胞运输保护液中的基础培养基。

在一些优选的实施方式中，所述基础培养基包括MEM或DMEM。MEM中的磷酸盐及碳酸盐缓冲体系可以有效的保持细胞环境的稳定，且MEM中富含细胞代谢必需的无机盐离子、氨基酸、糖分、维生素等重要成分，可以有效的保持细胞的活性。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，其是以MEM培养基为基础进行改进的培养基，同样可以有效的保持细胞活性。

在本发明提供的细胞运输保护液中加入白蛋白，可以为细胞提供营养。

在一些优选的实施方式中，可以选择胎牛血清或人血白蛋白作为白蛋白。由于胎牛还未接触外界，因此胎牛血清具有较高的品质，其中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分少。

此外，在本发明提供的细胞运输保护液中，抗生素能够起到良好的抑菌杀菌作用，维持细胞无污染的生长环境。

在一些优选的实施方式中，所述抗生素包括青霉素和链霉素。青霉素可以有效的抑制及杀灭革兰氏阳性菌，链霉素可以有效的抑制及杀灭革兰氏阴性菌，二者配合使用，对污染的预防及细菌的杀灭作用更佳。

优选地，所述青霉素和链霉素的质量比为1-2.5:1，例如可以为，但不限于1:1、1.2:1、1.5:1、1.8:1或2:1，更优选为1:1。当亲霉素和链霉素的质量比在上述范围内时，配合抑菌杀菌的效果更佳。

为了进一步提高本发明提供的细胞运输保护液中各组分的配合效果，对各组分的配比进行如下限定：

每1L所述细胞运输保护液包括：

保护剂2-15g、基础培养基0.1-0.3L、白蛋白0.01-0.03L、抗生素0.2-1.5g和余量的水。

其中，每1L所述细胞运输保护液中保护剂的含量例如可以为，但不限于2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、11g、12g、13g、14g或15g；每1L所述细胞运输保护液中基础培养基的含量例如可以为，但不限于0.1L、0.2L或0.3L；每1L所述细胞运输保护液中白蛋白的含量例如可以为，但不限于0.01L、0.02L或0.03L；每1L所述细胞运输保护液中抗生素的含量例如可以为，但不限于0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g或1.5g。余量的水指的是每1L所述细胞运输保护液除包含的保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和任选的其他助剂或添加剂外，其余的组分为水。优选地，所述水为无菌去离子水。

优选地，每1L所述细胞运输保护液包括：

通过对配比进行进一步的调整和优化，能够使得本发明提供的细胞运输保护液更加有效地保持细胞的活性。

由于传统的细胞运输通常需要将贴壁细胞先消化下来，进行冻存操作后再进行低温运输，消化重悬的步骤多少都会对细胞的状态及活率产生影响。本发明提供的细胞运输保护液能够直接应用于贴壁细胞，将贴壁状态下的细胞进行运输，保证细胞成活率及状态，且细胞在本发明的贴壁运输保护液中生长速度减慢，不会出现细胞生长过密的情况。运输在生长状态的细胞，收到后可直接观察其状态，对于后续研究实验有保障。

优选地，所述细胞包括间充质干细胞，典型的间充质干细胞可以为牙髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或骨髓间充质干细胞。

本发明还提供了上述细胞运输保护液的制备方法，包括取保护剂、基础培养基、白蛋白、抗生素和水溶解并混合均匀，得到细胞运输保护液。

在一些具体的实施方式中，以配置1L细胞运输保护液为例，在无菌条件下，取0.1-0.3L基础培养基加0.01-0.03L白蛋白，再加入保护剂2-15g和抗生素0.2-1.5g，搅拌溶解后，加入无菌去离子水至1L定容，搅拌均匀，得到细胞运输保护液。

此外，本发明还提供了上述的细胞运输保护液在细胞运输中的应用。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：羟丙基纤维素5g、MEM 0.2L、胎牛血清0.015L、青霉素0.2g、链霉素0.2g和余量的水。

实施例2

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：低粘羧甲基纤维素钠盐10g、MEM 0.15L、胎牛血清0.025L、青霉素0.5g、链霉素0.5g和余量的水。

实施例3

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：中粘羧甲基纤维素钠盐3g、MEM 0.25L、胎牛血清0.012L、青霉素0.15g、链霉素0.6g和余量的水。

实施例4

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：α-环糊精12g、MEM 0.12L、胎牛血清0.028L、青霉素0.6g、链霉素0.15g和余量的水。

实施例5

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：聚乙烯醇2g、MEM 0.3L、胎牛血清0.01L、青霉素0.75g、链霉素0.1g和余量的水。

实施例6

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：2-羟丙基-β-1环糊精15g、MEM 0.1L、胎牛血清0.03L、青霉素0.1g、链霉素0.75g和余量的水。

实施例7

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：聚乙二醇1.5g、MEM 0.4L、胎牛血清0.035L、青霉素0.05g、链霉素0.05g和余量的水。

实施例8

本实施例提供了一种细胞运输保护液，与实施例1的区别在于，保护剂为β-环糊精。

实施例9

本实施例提供了一种细胞运输保护液，与实施例1的区别在于，保护剂为γ-环糊精。

实施例10

本实施例提供了一种细胞运输保护液，与实施例1的区别在于，保护剂为2-羟丙基-γ-环糊精。

实施例11

本实施例提供了一种细胞运输保护液，与实施例1的区别在于，保护剂为甲基-β环糊精。

实施例12

本实施例提供了一种细胞运输保护液，与实施例1的区别在于，保护剂为泊洛沙姆188。

对比例1

本对比例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：MEM 0.2L、胎牛血清0.015L、青霉素0.2g、链霉素0.2g和余量的水。

对比例2

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：羟丙基纤维素5g、胎牛血清0.015L、青霉素0.2g、链霉素0.2g和余量的水。

对比例3

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：羟丙基纤维素5g、MEM 0.2L、青霉素0.2g、链霉素0.2g和余量的水。

对比例4

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：羟丙基纤维素5g、MEM 0.2L、胎牛血清0.015L和余量的水。

对比例5

本实施例提供了一种细胞运输保护液，每1L所述细胞运输保护液包括：0.9％W/W的氯化钠溶液。

将上述实施例1-12及对比例1-5提供的细胞运输保护液按照如下方法制备：

在无菌条件下，取配方量的基础培养基加配方量的白蛋白，再加入配方量的保护剂和抗生素，搅拌溶解后，加入无菌去离子水至1L定容，搅拌均匀，得到细胞运输保护液。

实验例

将分别加入实施例1-12及对比例1-5提供的细胞运输保护液的乳牙牙髓干细胞(SHED)，放置于2-8℃的摇床上模拟运输环境，24小时后，无菌操作下换成常规完全培养基，待细胞生长至80％密度后传代，统计传代后细胞成活率，结果如下表所示：

从上述结果中可以看出，应用本发明实施例1-12提供的细胞运输保护液传代后的细胞成活率在95％以上，生长速度与细胞形态均正常，明显优于对比例。其中应用实施例1提供的细胞运输保护液的细胞传代后增殖特性曲线如图1所示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种乳牙牙髓干细胞运输保护液，其特征在于，每1L所述细胞运输保护液包括：γ-环糊精5g、MEM 0.2L、胎牛血清0.015L、青霉素0.2g、链霉素0.2g和余量的水。

2.权利要求1所述的乳牙牙髓干细胞运输保护液在乳牙牙髓干细胞运输中的应用。