CN109609449B

CN109609449B - 一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法

Info

Publication number: CN109609449B
Application number: CN201811609796.5A
Authority: CN
Inventors: 葛啸虎; 陈海佳; 黄幸; 王小燕; 李学家
Original assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109609449A

Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。该牙周膜干细胞增殖培养基包括氨甲环酸、海藻糖、EGF和基础培养基；牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；海藻糖：500～2000mg/L；EGF：5～15ng/mL；基础培养基：补足。本发明将氨甲环酸、海藻糖、EGF加入基础培养基后，可促进牙周膜干细胞的快速增殖，效果好于现有培养基，也好于加有单一因子的培养基。同时，本发明培养基可有效维持牙周膜干细胞的干细胞，增殖培养后的细胞具有较强的成骨诱导能力。

Description

一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，特别涉及一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。

背景技术

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持组织的慢性炎症。发病年龄以35岁以后较为多见，如龈炎未能及时治疗，炎症可由牙龈向深层扩散到牙周膜、牙槽骨和牙骨质而发展为牙周炎。由于早期多无明显自觉症状而易被忽视，待有症状时已较严重，甚至已不能保留牙齿。牙周膜干细胞是来源于牙周膜的成体干细胞，具有自我复制的能力，能产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞，能够维持牙周膜的功能的稳定，发挥生理细胞更新和组织修复组织损伤的作用，在维持正常的牙周组织更新和牙周炎组织损伤修复中起到重要的作用。

细胞培养现在已成为应用于生命科学的主要技术之一，它是从动物或植物移取的细胞、组织或器官并将它们在有利于生长的人工环境中培养的统称。细胞最适生长的基本环境要求是：控制的温度，良好的细胞附着基质和适当的培养液和培养箱，能够保持正确的pH值和渗透压。在动物细胞培养中最重要和最关键的一步是选择适当的培养液用于体外培养。生长培养基或培养基是液体或凝胶状态的，设计用于支持微生物、细胞或小的植株生长。培养基是控制最佳的细胞生长最重要和最复杂的因素。细胞培养基通常包括适当的细胞能量来源和调节细胞周期的化合物。一个典型的培养基还需要补充氨基酸，维生素，无机盐，葡萄糖，和血清，以提供生长因子，激素，和附着因子。除了营养外，培养基也有助于保持培养体系中的pH值和渗透压平衡。

目前常用牙周膜干细胞培养基都是用成分确定的基础培养基如DMEM添加一些营养物质(有机的和无机的)，制备成人工或合成的培养基。其中，胎牛血清是动物细胞培养中最常见的补充成分。它提供动物细胞培养较为完整的营养物质，这些补充剂能够为不稳定或不溶于水的营养物质提供载体或螯合剂，提供激素和生长因子，蛋白酶抑制剂，并结合并中和有毒部分。但现有的培养基对牙周膜干细胞的增殖作用有限。因此，需要提供一种增殖速度更快的牙周膜干细胞增殖培养基。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。该牙周膜干细胞增殖培养基可促进牙周膜干细胞的快速增殖，效果好于现有培养基。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牙周膜干细胞增殖培养基，包括氨甲环酸、海藻糖、EGF和基础培养基；牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：500～15000mg/L；

海藻糖：500～2000mg/L；

EGF：5～15ng/mL；

基础培养基：补足。

作为优选，牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：500～10000mg/L；

海藻糖：1000～2000mg/L；

EGF：10ng/mL；

基础培养基：补足。

优选地，牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：10000mg/L；

海藻糖：1000mg/L；

EGF：10ng/mL；

基础培养基：补足。

优选地，牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：10000mg/L；

海藻糖：2000mg/L；

EGF：10ng/mL；

基础培养基：补足。

作为优选，基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明还提供了一种牙周膜干细胞的增殖培养方法，包括：将牙周膜干细胞接种于上述牙周膜干细胞增殖培养基，进行增殖培养。

作为优选，牙周膜干细胞的接种密度为5000～20000cell/mL。

优选地，牙周膜干细胞的接种密度为10000cell/mL。

作为优选，增殖培养的条件为37℃、5％CO₂。

作为优选，增殖培养的时间为5～8天。

作为优选，增殖培养过程中每三天换液一次。

作为优选，接种前还包括将复苏的步骤。

本发明提供了一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法。该牙周膜干细胞增殖培养基包括氨甲环酸、海藻糖、EGF和基础培养基；牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：氨甲环酸：500～15000mg/L；海藻糖：500～2000mg/L；EGF：5～15ng/mL；基础培养基：补足。本发明具有的技术效果为：

本发明将氨甲环酸、海藻糖、EGF加入基础培养基后，可促进牙周膜干细胞的快速增殖，效果好于现有培养基，也好于加有单一因子的培养基。

同时，本发明培养基可有效维持牙周膜干细胞的干细胞，增殖培养后的细胞具有较强的成骨诱导能力。

附图说明

图1示牙周膜干细胞增殖情况；

图2示牙周膜干细胞的成骨效果；

图3示牙周膜干细胞表面标志物的表达情况。

具体实施方式

本发明公开了一种牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语解释：

海藻糖(Trehalose)，又名覃糖，是由两个吡喃环葡萄糖分子以α,α-1,1键连接而成的双糖，化学名为α-D-吡喃葡糖基α-D-吡喃葡糖苷，分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，分子量378.133。海藻糖理论上存在有三种不同的正位异构体(Anomers)，即α,α-型、α,β-型和β,β型。但在自然界中广泛存在的只有α,α-型异构体，也就是通常所说的海藻糖(Trehalose)，也被称作蘑菇糖(Mycose,Mushroom sugar)，其余两种很少见，仅在蜂蜜和王浆中发现了少量的α,β-型海藻糖(新海藻糖,Neotrehatose)；另一种β,β型也被称作异海藻糖(Isotrehalose)。

氨甲环酸，英文名称：Tranexamic Acid，化学名称：对氨甲基环己烷甲酸、反式－4－氨甲基－环己烷甲酸。可抑制这种纤溶酶的作用，而显示止血、抗变态反应、消炎效果。主要用于急性或慢性、局限性或全身性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。

表皮细胞生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。

本发明提供的牙周膜干细胞增殖培养基及其增殖培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1、混合物配比

混合物各组分浓度：

(1)氨甲环酸工作浓度为500mg/L、10000mg/L；

(2)海藻糖工作浓度为1000mg/L、20000mg/L；

(3)EGF工作浓度为10ng/ml。

实验组：命名为A组，为DMEM/F12+混合物；

对照组：命名为B组，为DMEM/F12+10％FBS。

表1 A组中各组分浓度配比

实施例2、采用实施例2的梯度浓度培养基进行增殖实验

取12孔培养板，每孔以10000cell/孔的密度将复苏后的牙周膜干细胞各接种于孔中，每孔加入含相关培养液(实施例1中培养基)1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每三天换液一次。从第2天开始(刚刚复苏的细胞需要约24h适应环境)，每隔24h取出板，随机选择3孔，吸弃旧培养液并用PBS清洗，加胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取10μL细胞悬液与10μL0.4％台盼蓝混匀后加样到血细胞计数板上，10倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。试验结果见表2、图1。

表2牙周膜干细胞增殖情况

由图1可以看出，加了混合物培养基在相同时间下明显生长速度快于常规培养基，而最终细胞数量也多于常规培养基。而最优的比例是A3。

实施例3、成骨能力鉴定

取A3配比培养得到的P5细胞(细胞编号P16QD00198)，以5×10⁴个/孔密度接种于6孔板，分为成骨诱导组和对照组，完全培养基培养。成骨诱导组贴壁细胞生长融合后更换成骨诱导培养基(含500ng/mL BMP-2、10％FBS、100nmol/L地塞米松、20mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10mg/L维生素C的L-DMEM)，对照组继续以完全培养基培养和常规诱导培养基(10％FBS、100nmol/L地塞米松、20mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10mg/L维生素C的L-DMEM)。每3天更换培养基，至4周时行茜素红染色鉴定。成骨效果见图2。

实施例4、表面标记物鉴定

取第3代采用A3配比培养的生长良好的牙周膜干细胞，消化后清洗3次，制成细胞悬液，加入抗体，流式细胞仪检测分析CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况。试验结果见表3、图3。

表3牙周膜干细胞表面标志物的表达情况

上述检测结果表明该细胞是牙周膜干细胞。

实施例5、效果对比试验

实验组：A3组；

对照组：命名为C组，为DMEM/F12+单一因子。

表4试验组和对照组中各组分浓度配比

试验方法：取12孔培养板，每孔以10000cell/孔的密度将复苏后的牙周膜干细胞各接种于孔中，每孔加入含相关培养液(表4培养基)1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每三天换液一次。从第2天开始(刚刚复苏的细胞需要约24h适应环境)，每隔24h取出板，随机选择3孔，吸弃旧培养液并用PBS清洗，加胰酶消化细胞，终止消化后，制备单细胞悬液，吹匀，取10μL细胞悬液与10μL0.4％台盼蓝混匀后加样到血细胞计数板上，10倍镜下计数计数板四角大方格内细胞的数量，以时间为横轴，细胞数为纵轴绘制细胞生长曲线。试验结果见表5。

表5牙周膜干细胞增殖情况

由上述结果可以看出，加了混合物培养基在相同时间下明显生长速度快于加了单一因子的常规培养基，而最终细胞数量也显著多于加了单一因子的常规培养基。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种牙周膜干细胞增殖培养基，其特征在于，包括氨甲环酸、海藻糖、EGF和DMEM/F12培养基；所述牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：500~10000mg/L；

海藻糖：1000~2000mg/L；

EGF：10 ng/mL；

DMEM/F12培养基：补足。

2.根据权利要求1所述的牙周膜干细胞增殖培养基，其特征在于，所述牙周膜干细胞增殖培养基中各组分的浓度为：

氨甲环酸：10000mg/L；

海藻糖：1000mg/L；

EGF：10 ng/mL；

DMEM/F12培养基：补足。

3.一种牙周膜干细胞的增殖培养方法，其特征在于，包括：将牙周膜干细胞接种于权利要求1或2所述牙周膜干细胞增殖培养基，进行增殖培养。

4.根据权利要求3所述的增殖培养方法，其特征在于，所述牙周膜干细胞的接种密度为5000~20000cell/mL。

5.根据权利要求3所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养的条件为37℃、5%CO₂。

6.根据权利要求3所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养的时间为5~8天。

7.根据权利要求3所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养过程中每三天换液一次。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的增殖培养方法，其特征在于，所述接种前还包括复苏的步骤。