KR20190129054A - 단위 동물용 분말 프로바이오틱 제제를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 캡슐화 과정을 통해 상이한 중합체의 조합을 사용하여 단위 동물(예를 들어 가금류 조류)용 프로바이오틱 박테리아의 건조 동결건조 분말 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 생성된 프로바이오틱 박테리아의 동결건조 분말은 동물 사료 가공, 저장 동안 및 단위 동물의 소화계로 전달 시 증가된 생존력을 갖는다.
Description
본 발명은 캡슐화 방법을 통해 상이한 중합체의 조합을 사용하여 단위 동물(monogastric animal)(예를 들어 가금류 조류)용 프로바이오틱 박테리아의 건조 동결건조된 분말 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 생성된 프로바이오틱 박테리아의 동결건조된 분말은 동물 사료 가공, 저장 동안 및 단위 동물의 소화계로 전달 시 증가된 생존력(viability)을 갖는다.
단위 동물은 식도(oesophagus), 위(stomach), 소장(small intestine), 대장(large intestine), 결장(colon) 및 직장(rectum)으로 구성된 단순한 위장관계를 가지고 있으며 일부의 경우에는 간 및 췌장으로 보조된다. 위의 pH는 약 1.5 내지 2.0이며, 이는 임의의 미생물의 생존이 어려운 강한 산성 환경을 유발한다. 위를 지나면 pH는 소장에서 2.0-7.0으로 점진적으로 변하며 결장에서는 알칼리성(8.5-9.0)이 된다. 일반적으로 단위 소화계의 경우, 프로바이오틱 박테리아의 효과적인 전달(delivery)에 대한 어려움은 하기와 같다:
1. 생존 세포의 생존력 및 적절한 수가 작용 부위인 소장에 도달하여 집락화(colonizing)하는데 영향을 미치는 산성 위 환경.
2. 사료 배합, 펠렛화(pelletization) 등 동안 특히 열 처리 방법의 어려움 및
3. 온도 및 습도가 상이한 조건 하의 저장과 관련한 프로바이오틱의 물류(logistics) 및 저장 기간(shelf life) 문제.
프로바이오틱 박테리아는 위의 산성 환경에 내성이 없으며 낮은 pH에서 즉시 사멸하기 때문에, 소화계의 다른 부분에 들어가서 효과를 나타내는데 필요한 프로바이오틱 미생물 농도를 감소시킨다. 이는 음식을 통해 제공되든지 또는 사료를 통해 제공되든지, 주로 열과 같은 가혹한(harsh) 가공 조건에 직면한다. 대부분의 미생물은 장시간 고열을 견딜 수 없으므로 내열성이 부여되어야 한다. 이러한 기술적 장애로 인해, 추가적인 상업적 기준은 제제 저장의 가혹하고 다양한 물리적 및 환경 조건에 노출되어도 생존할 것을 요구한다.
이러한 유해조건(adverse conditions)으로부터 프로바이오틱 미생물을 보호하는 방법은 캡슐화 형태로 보호하는 것이다. 캡슐화 기술의 개발을 위해, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 및 프로피오니박테리움 프레우덴레키이(Propionibacterium freudenrechii)가 프로바이오틱 균주로 선택되었고; 그러나, 본원에 개시된 기술은 다른 유기체에도 동일하게 적용될 수 있다.
캡슐화는 프로바이오틱 제제의 저장 기간을 증가시키는 공지된 방법 중 하나이다. 캡슐화는 작은 액적(droplets) 또는 입자를 보호 코팅으로 감싸서 박테리아가 봉입된 캡슐을 산출하는 방법이다. 이들 프로바이오틱 박테리아의 캡슐화는 일반적으로 위장관(GI tract)에서 작용 부위까지의 과정 동안 생존력을 유지시키기 위해 사용된다. 위장관에서 최소 필요 세포 수(minimum required cell count)를 표적 전달하는 것이 중요하다. 프로바이오틱스는 동물 사료, 의약품 및 건강 보조식품과 함께 사용된다. 이는 장 건강 유지에 큰 역할을 한다. 소화계에서 이들 박테리아의 생존이 의심스럽기 때문에 프로바이오틱 박테리아의 생존력을 보호하기 위해 알기네이트, 키토산, 젤라틴, 유청 단백질 분리물(whey protein isolate), 펙틴, 셀룰로오스 유도체와 같은 여러 유형의 바이오중합체가 캡슐화에 사용되었으며 분무 건조, 압출, 에멀젼과 같은 여러 캡슐화 방법이 보고되어 있다.
본원에 제시된 발명은 2 가지 상이한 중합체의 조합을 사용하여 대규모로 프로바이오틱 박테리아의 분말 제제를 제조하는 방법을 개시하고 다공성이 낮고 단위 동물 위장관의 바람직하지 않은 환경 조건에 대한 노출을 낮추는데 도움을 주는 물질 매트릭스를 생성한다. 상기 제제는 취급 및 운반이 용이하고 주변 조건에서 더욱 안정적이다.
본 발명의 일 구체예에서, 캡슐화 기술의 개발을 위해, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 프로피오니박테리움 프레우덴레키이가 이들의 알려진 프로바이오틱 특성에 근거하여 선택되었다.
본 발명의 다른 구체예에서, 달리 언급되지 않는 한, 약 20 시간 동안 성장시키거나 또는 갓 성장한 프로바이오틱 세포 바이오매스가 사용되었다. 마이크로캡슐화 방법에서 상이한 매트릭스 중합체를 개별적으로 또는 조합하여 평가하였다. 비-캡슐화 세포는 비교 사례를 위한 대조군으로 제공된다. MRS 배지에서 프로피오니박테리움 프레우덴레키이의 총 생존 수는 정적 인큐베이션에서 약 2.98x109 CFU/ml이었고, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스에 대해서는 1000 ml 부피의 원추형 플라스크를 사용하여 37 ℃에서 약 24 시간 동안 진탕 인큐베이션하는 조건에서 7.80x109 CFU/ml이었다. 상기 배지는 발효 및 프로바이오틱 제제 개발을 위해 추가로 선택되었다. 또한, 상기 접종물(inoculum)은 MRS 브로스에 접종되고 약 37 ℃에서 약 24 시간 동안 정적 조건에서 인큐베이션된다. 또한, 상기 브로스를 약 500 ml/분의 공급 속도로 원심분리하여 습윤 케이크(wet cake)를 분리시켰다. 이어서, 상기 습윤 케이크를 LAF 유닛(층류 기류)에서 무균적으로 즉시 제거하였다. 추가로 약 0.5 % 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 약 1 %의 말토덱스트린을 캡슐화제로 사용하였다. 상기 캡슐화 용액을 약 121 ℃로 약 20 분 동안 멸균시켰다. 또한 상기 습윤 케이크 및 캡슐화 화학물질(1 % 말토덱스트린 + 0.5 % CMC)을 볼텍스 믹서(vortex mixer)를 사용하여 적절히 혼합하여 분산슬러리(lyoslurry)를 제조하였다. 이어서 상기 제조된 분산슬러리를 트레이에 붓고 약 -80 ℃로 약 2 시간 동안 동결시켰다. 동결 후, 동결된 분산슬러리를 약 -50 ℃로 약 28 내지 약 36 시간 동안 동결건조시켜 분산분말(lyopowder)을 제조하였다. 상기 수득된 분산분말을 TVC 및 고체 함량에 대해 분석하였다. 상기 브로스, 습윤 케이크, 분산슬러리 및 분산분말을 멸균된 탈기 식염수 트윈 80 용액을 사용하여 연속 희석하고 멸균된 MRS 아가 플레이트 상에 도말하였다. 상기 플레이트를 약 37 ℃로 약 48 내지 약 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 브로스, 습윤 케이크, 분산분말 및 분산슬러리에 대한 총 고체 및 TVC 값을 하기 표 A 및 B에 열거하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 분산분말 제제는 기밀(air-tight) 용기에 포장(packed)되고 실온에서 약 50 % 상대 습도로 저장된다. 분산분말 제제의 수분 함량은 5 중량% 이하이다. 저장 동안 특정 기간 후에 제제에서 박테리아의 생존력을 확인하기 위해 TVC 분석을 수행하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 프로바이오틱 건조 분말의 생산 전에, 위의 높은 담즙 염 농도 (위액) 및 고온에 대한 노출과 같은 모의(simulated) 가혹 환경 조건에 대한 생존 효율에 근거하여 상기 프로바이오틱 배양물을 선택하였다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 박테리아 배양물은 바실러스에 대해서는 영양분 브로스 및 프로피오니박테리움에 대해서는 MRS 브로스를 사용하여 글리세롤 스톡으로부터 재생되었다. 이를 위해, 글리세롤 스톡으로부터의 상기 250 μ1의 배양물을 250 ml 플라스크에서 100 ml 영양분/MRS 브로스에 접종하였다. 상기 배양물을 진탕/정적 조건 하에 약 18 ± 2 시간 동안 37 ℃로 인큐베이션하였다. 이로부터 20 ml를 2 개의 150 ml 플라스크에서 각각 취하였다. 대조군 플라스크로 표지된 하나의 플라스크를, 총 생존 수(TVC) 분석을 위해 영양분/MRS 아가 플레이트 상에 희석하고 도말하였다. 두 번째 플라스크를 수조(water bath)에서 90 ℃로 1 분 동안 처리하였다. 두 플라스크로부터의 샘플의 희석 도말(dilution plating)을 TVC 측정을 위해 영양분/MRS 아가 배지에서 수행하였다. 희석 도말을 위해, 0.9 ml의 트윈-식염수 (0.05 % 트윈 80 + 0.5 % 소듐 클로리드)를 2 ml 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 부가하고, 여기에 0.1 ml의 상기 배양물을 첨가하여 101 배 희석물을 만들고 이어서 1012 배까지 연속 희석하였다. 각 희석물로부터 0.1 ml를 영양분 아가 및 MRS 아가 플레이트 상에 멸균 L-스프레더(L-spreader)의 도움으로 각각 스프레드하였다. 플레이트를 37 ℃로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 도말된 모든 희석물에 대해 콜로니(colony) 수로 성장을 측정하고 TVC를 하기 식을 사용하여 계산하였다:
TVC = (콜로니 수 X 희석 계수) / 도말된 알리코트(aliquot)
열 처리 후 배양물에 대한 생존 퍼센트를 하기 식을 사용하여 계산하였다.
% 생존 = (열 처리 후 TVC) / (열처리 전 TVC) X 10.
본 발명의 다음 구체예에서, 테스트되는 프로바이오틱 배양물을 담즙 염에 대한 내성에 대해 확인하였다. 분석을 위해 선정된 담즙 염 농도는 0.5, 1.0, 1.5, 2 및 3 %였다. 필요한 양의 담즙 염을 영양분 브로스(바실러스를 위한 것)/MRS 브로스(프로피오니박테리움을 위한 것)와 혼합하고 121 ℃에서 20 분 동안 멸균하였다. 멸균된 브로스를 테스트할 박테리아의 갓 성장하고 원심분리된 배지 유리 세포(free cell) 현탁액 1 ml를 사용하여 접종하였다. 이를 진탕/정적 조건 하에 37 ℃로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 성장을 육안으로 모니터링하고 아가 배지에 희석 도말하여 TVC의 수를 측정하였다. 내성을 검증하기 위해, 상기 배양물의 성장을 또한 표면 스프레딩에 의해 필요한 양의 담즙 염을 함유하는 영양분/MRS 아가 플레이트 상에서 테스트하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 1 % 카복시 메틸 셀룰로오스 소듐 염(CMC-Na), 카복시 메틸 셀룰로오스 소듐 염 + 말토덱스트린(0.5 % CMC + 1 % MD), 1 % 알기네이트, 1 % 카파 카라기난(kappa carrageenan), 1 % 젤라틴 및 1 % 펙틴과 같은 다른 중합체를 또한 건조 분말의 제조를 위한 프로바이오틱 박테리아의 캡슐화제로서 단독으로 또는 조합하여 테스트하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 또는 바실러스 리체니포르미스 (Bacillus licheniformis ) 또는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis ) 또는 바실러스 코아굴란스 (Bacillus coagulans) 또는 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이 ( Propionibacterium freudenreichii) 또는 페디오코쿠스 아시딜락티시 ( Pediococcus acidilactici ) 이의 조합 중 하나이다.
상기 제공된 구체예는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 변형(variations)에 대해 어떠한 제한없이 본 발명의 더 넓은 유용성을 제공한다. 다양한 구체예들의 비-제한적인 요약이 상기 제공되며, 이는 본원에 개시된 방법의 이점 및 신규한 양상을 입증한다.
이점(ADVANTAGES):
1. 독특한 캡슐화 방법은 보다 나은 보호를 위한 중합체의 조합을 사용하여 단위 소화계의 소장에서 프로바이오틱 미생물의 방출을 한정하도록 돕는다.
2. 캡슐화를 위해 테스트된 상기 프로바이오틱 배양물은 이미 담즙 염, 열 처리 및 모의 위액 및 장액에서의 생존에 대한 내성이 테스트되었다.
3. 사용된 상기 캡슐화제는 다공성이 낮아서 프로바이오틱 미생물이 환경에 적게 노출되도록 한다.
4. 상기 캡슐화된 건조 제제는 가공 및 단위 소화계에서의 적용 동안 박테리아 생존력을 증가시켰다.
5. 상기 프로바이오틱 건조 제품은 보다 안정적이고 취급 및 운반이 더 용이하다.
하기 제공된 실시예는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 변형에 대해 어떠한 제한없이 본 발명의 더 넓은 유용성을 제공한다. 다양한 실험 결과의 비-제한적인 요약이 하기 실시예에 제공되며, 이는 독특한 마이크로캡슐화 기술에서 중합체의 조합을 사용하여 건조 프로바이오틱 미생물 제제를 제조하는 방법의 이점 및 신규한 양상을 입증한다.
실시예 1
건조 분말 제제의 제조를 위해 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이 균주 (MTCC 1371)를 사용하였다. 상기 박테리아를 원추형 플라스크에서 약 37 ℃로 약 24 시간 동안 정적 인큐베이션 조건 하에 데만 로고사 샤프(deMan Rogosa Sharpe: MRS) 브로스 배지에서 성장시켰다. 상기 배양물을 통상적으로 전달하였고 전달 사이에 약 20 부피% 글리세롤 중에서 약 -80 ℃로 저장하였다. MRS 배지에서 총 생존 수는 약 2.98 x 109 CFU/ml였다.
건조 분말 제제의 제조를 위해 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 균주 (MTCC 10456)를 사용하였다. 상기 박테리아를 원추형 플라스크에서 약 37 ℃로 약 24 시간 동안 진탕 인큐베이션 조건 하에 영양분 브로스 또는 MRS 브로스 배지에서 성장시켰다. 상기 배양물을 통상적으로 전달하였고 전달 사이에 약 20 부피% 글리세롤 중에서 약 -80 ℃로 저장하였다. MRS 배지에서 총 생존 수는 약 5.7 x 108 CFU/ml인 영양분 브로스와 비교하여 약 7.8 x 109 CFU/ml이었다
실시예 2 : 제제화된 박테리아의 내열성 및 담즙 내성
상기 박테리아 배양물은 바실러스에 대해서는 영양분 브로스 및 프로피오니박테리움에 대해서는 MRS 브로스를 사용하여 글리세롤 스톡에서 재생되었다. 이를 위해 글리세롤 스톡으로부터 250 μ1의 배양물을 250 ml 플라스크에서 100 ml 영양분/MRS 브로스에 접종하였다. 상기 배양물을 진탕/정적 조건 하에서, 약 18 시간 동안, 37 ℃로 인큐베이션하였다. 이로부터 20 ml를 2 개의 150 ml 플라스크에서 각각 취하였다. 대조군 플라스크로 표지된 하나의 플라스크를, 총 생존 수 (TVC) 분석을 위해 영양분/MRS 아가 플레이트 상에 희석하고 도말하였다. 두 번째 플라스크를 수조에서 90 ℃로 1 분 동안 처리하였다. 두 플라스크로부터의 샘플의 희석 도말을 TVC 측정을 위해 영양분/MRS 아가 배지에서 수행하였다. 희석 도말을 위해, 0.9 ml의 트윈-식염수(0.05 % 트윈 80 + 0.5 % 소듐 클로리드)를 2 ml 에펜도르프 튜브에 부가하고, 여기에 0.1 ml의 상기 배양물을 첨가하여 101 배 희석물을 만들고 이어서 1012 배까지 연속 희석하였다. 각 희석물로부터 0.1 ml를 영양분 아가 또는 MRS 아가 플레이트 상에 멸균 L-스프레더의 도움으로 각각 스프레딩하였다. 플레이트를 37 ℃로 약 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 모든 희석물에 대해 콜로니(colony) 수로 성장을 측정하고 TVC를 계산하였다. 하기 표 2은 일반 배양물(plain culture)과 비교하여 제제 중 박테리아의 내열성을 나타낸다.
실시예 3
여기에서 프로바이오틱 박테리아는 담즙 염에 대한 내성을 확인하였다. 분석을 위해 선정된 담즙 염 농도는 0.5, 1.0, 1.5, 2 및 3 %이었다. 필요한 양의 담즙 염을 영양분(바실러스를 위한 것) 브로스/MRS 브로스(프로피오니박테리움을 위한 것)와 혼합하고 121 ℃에서 20 분 동안 멸균하였다. 멸균된 브로스에 테스트할 박테리아의 갓 성장하고 원심분리된 배지 유리 세포 현탁액 1 ml를 사용하여 접종하였다. 이를 진탕/정적 조건 하에 37 ℃로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 성장을 육안으로 모니터링하고 아가 배지 상에 희석 도말하여 TVC의 수를 측정하였다. 내성을 검증하기 위해, 상기 배양물의 성장을 또한 표면 스프레딩에 의해 필요한 양의 담즙 염을 함유하는 영양분/MRS 아가 플레이트 상에서 테스트하였다. 하기 표 3A 및 표 3B는 캡슐화 시 박테리아의 내성에 관한 데이터를 나타낸다.
실시예 4
바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 프로피오니박테리움 프레우덴레키이 배양물 모두를 MRS 브로스 플라스크에 접종하고 약 37 ℃로 약 24 시간 동안 정적 조건에서 인큐베이션하여 출발 배양물을 형성하였다. 다음으로 상기 출발 배양물을 1.5 L MRS 브로스에 접종하고 약 37 ℃에서 약 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 두 브로스를 원심분리하여 바이오매스를 분리시켰다. 1 % 카복시메틸셀룰로오스 소듐 염(CMC-Na), 카복시메틸셀룰로오스 소듐 염 + 말토덱스트린(0.5 % CMC + 1 % MD), 1 % 알기네이트, 1 % 카파 카라기난, 1 % 젤라틴 및 1 % 펙틴과 같은 중합체를 건조 분말의 제조를 위한 프로바이오틱 박테리아에 대한 캡슐화제로 테스트하였다. 1 % 농도의 캡슐화제를 함유하는 스톡 용액을 약 121 ℃에서 약 20 분 동안 멸균시켰다. 원심분리 후 수득된 두 미생물의 바이오매스를 1:1 비율로 캡슐화제의 멸균 용액과 혼합하였다. 상기 혼합물을 볼텍스 믹서를 사용하여 잘 혼합하였다. 이어서 수득된 분산슬러리를 약 -80 ℃로 2 시간 동안 동결시켰다. 동결 후, 동결된 분산슬러리를 약 -50 ℃로 약 28 내지 36 시간 동안 동결건조하여 분산분말[분말 프로바이오틱 제제]을 제조하였다. 상기 분산분말 및 분산슬러리를 멸균 식염수 트윈 80 용액을 사용하여 연속 희석하고 멸균 MRS 아가 플레이트 상에 도말하였다. 상기 플레이트를 배양에 따라 약 37 ℃로 약 24 내지 약 72 시간 동안 인큐베이션하였다. 중합체의 캡슐화 가능성 및 동결건조 후 프로바이오틱 세포의 생존력의 손실을 확인하기 위해 상기 분산분말 및 분산슬러리의 총 생존 수 분석을 수행하였다. 동결건조 후 비 캡슐화 및 캡슐화된 프로바이오틱 박테리아(분산분말)의 총 생존 수를 하기 표 4에 제공하였다.
두 배양물에 대한 대조군(비-캡슐화) TVC는
1. 프로피오니박테리움 프레우덴레키이: 1.16x 1014 CFU/ml
2. 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스: 1.10 X 1013 CFU/ml이다.
실시예 5: 모의 위액 및 장액에서 캡슐화된 세포의 방출에 대한 분석
바람직한 pH에서 캡슐화 물질로부터 박테리아 세포의 방출 효율을 확인하기 위해, 0.5 % CMC + 1 % MD로 캡슐화된 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 피. 프레우덴레키이(P. freudenrechii)의 세포의 내성 및 방출을 SIF[모의 장액]에서의 방출과 함께 SGF[모의 위액]에서 연구하였다. 상기 캡슐화된 박테리아는 SGF의 낮은 pH에 대한 내성이 있었으며 최대 6 시간 까지 생존하였다. 유사하게 캡슐화된 박테리아는 높은 pH에서 SIF로 용이하게 방출되었다. 수득된 데이터를 하기 표 5A 및 표 5B에 나타내었다.
실시예 6: 주사 전자 현미경에 의한 캡슐화된 세포의 분석.
바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이의 건조 동결건조 분말[제제]의 입자의 형태(morphology)를 확립하기 위해 캡슐화제 [0.5 % CMC + 1 % 말토덱스트린]을 그대로 및 이에 봉입된 박테리아 세포와 함께 사용하여 주사 전자 현미경으로 분석하였다. 상기 분석의 세부사항은 하기에 포함된다.
도 1 A 및 B는 분말 물질로서 그대로 캡슐화제를 나타낸다. 도 1 C 및 D는 각각, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이의 박테리아 세포를 봉입하여 뚜렷한(definite) 크기 및 모양의 입자를 형성하는 캡슐화제를 나타낸다.
실시예 7 : 캡슐화된 제제의 적외선 스펙트럼 분석.
박테리아가 있는 또는 없는 캡슐화제와 함께 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 및 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이의 건조 동결건조 분말의 입자의 스펙트럼 특성을 확립하기 위해, 샘플을 FT-IR 분광분석법으로 분석하였다.
IR 분광법: 브로스에 접종된 상기 배양물을 37 ℃로 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 브로스를 원심분리(8000 rpm, 10 분, 4 ℃하여 세포를 수집하였다. 상기 세포를 식염수(0.85 % 소듐 클로리드)로 3 회 세척하였다. 상기 세포를 다시 식염수에 재-현탁시키고 원심분리하였다. 수득된 세포 펠렛을 -80 ℃로 2 시간 동안 예비-동결하고 동결건조기를 사용하여 분말 형태를 수득하기 위해 동결건조하였다. 모든 스펙트럼은 Spectrum100FT-IR 분광기(PerkinElmer)를 사용하여 기록되었다. 4 cm-1의 스펙트럼 분해능(resolution)으로 파수 영역 4000 cm-1 내지 500 cm-1 사이에서, 평균을 추정(estimation)하기 위해 8 회 이상의 스캔을 취하였다.
도 2A는 카복시메틸 셀룰로오스 소듐 염 그대로의 스펙트럼이다. 도 2B는 말토덱스트린 그대로의 스펙트럼이다. 도 2C는 박테리아 세포가 없는 0.5 % CMC + 1 % 말토덱스트린 혼합물의 스펙트럼이다. 도 2D는 박테리아 세포를 갖는 0.5 % CMC + 1 % 말토덱스트린 혼합물의 스펙트럼이다. MD 및 CMC 모두를 혼합한 후, 주요 주파수에서 흡수는 변하지 않았다. 그러나, 세포 캡슐화 후, 약 1150 cm-1 및 1453 cm-1에서 새로운 흡수를 나타내었으며 이는 본원에 개시된 박테리아의 캡슐화된 제제에 대해 현저하였다.
상기 제공된 구체예는 당해 기술분야의 통상의 기술자가 이해할 수 있는 변형에 대해 어떠한 제한없이 본 발명의 더 넓은 유용성을 제공한다. 다양한 구체예의 비-제한적인 요약이 실시예 및 표에 제공되며, 이는 본원에 개시된 방법의 이점 및 신규한 양상을 입증한다.
Claims (10)
- 하기 단계를 포함하는 프로바이오틱 박테리아의 건조 동결건조 제제를 제조하는 방법:
(a) 프로바이오틱 박테리아의 담즙, 열-내성 배양물을 제공하는 단계;
(b) 상기 배양물을 원심분리하여 박테리아를 습윤 케이크(wet cake)로 분리하는 단계;
(c) 상기 습윤 케이크를 캡슐화제와 혼합하여 분산슬러리(lyoslurry)를 형성하는 단계;
(d) 상기 분산슬러리를 분산산제(lyopowder)를 형성하도록 바람직한 조건 하에 동결건조시키는 단계; 및
(e) 상기 분산산제를 기밀(air-tight) 용기에 포장(packaging)하는 단계. - 청구항 1에 있어서, 상기 프로바이오틱 박테리아는 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 또는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 또는 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 또는 프로피오니박테리움 프레우덴레이키이(Propionibacterium freudenreichii ) 또는 페디오코쿠스 아시딜락티시 (Pediococcus acidilactici ) 이의 조합 중 하나인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 캡슐화제는 카복시메틸 셀룰로오스 소듐 염 및 말토덱스트린의 혼합물인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 캡슐화제는 약 0.5 중량%의 카복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 캡슐화제는 약 1 중량%의 말토덱스트린을 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 동결건조(lyophilisation)는 약 -50 ℃로 약 30 내지 약 36 시간 동안 수행되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 단위 동물(monograstic animal) 사료 보충제(feed supplement)의 구성성분으로 사용되는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 SGF에서 최대 6 시간 동안 안정한 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 SIF에서 1 시간 이내로 박테리아를 방출하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 단위 동물 위의 산성 조건에 내성이 있는 것인 방법.
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