CN116507718A - 稳定的乳酸菌组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用选自低聚果糖、麦芽糊精、菊粉和豌豆纤维的稳定剂的协同混合物稳定的干乳酸菌组合物。已发现该混合物在干燥(例如冷冻干燥)工艺期间和储存期间稳定组合物。

Description

稳定的乳酸菌组合物
本发明涉及具有乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)及针对其的稳定剂的组合物。
产生乳酸并且通常被归类为乳酸菌(LAB)的各种细菌培养物在所有发酵乳制品、奶酪和黄油的制作中是必不可少的。这种细菌的培养物可称为发酵剂(starter culture)，且它们通过执行多种功能赋予各种乳制品特定的特征。
已知许多乳酸菌具有益生菌特性(即，当摄入时，它们对人类和一些其他动物具有有益的健康作用)。在大多数情况下，微生物在长期储存后必须保持活力，以使其在摄入时发挥有益作用。已经尝试将待干燥(例如冷冻干燥)的细菌与添加剂混合，这些添加剂可以发挥多种作用：在工业过程的特定步骤中(例如冷冻和/或干燥)保护细胞；创建在有效期/储存期间保护细胞的基质；在胃和胆汁的酸性环境中保护细胞；和/或在再水合期间保护细胞。在细胞冷冻期间起作用的保护剂称为冷冻保护剂(cryo-protectant)。在冻干(冷冻干燥)期间起作用的保护剂被称为冻干保护剂(lyo-protectant)。
例如，如果将LAB组合物与乳粉混合以制备合适的婴儿粉，通常需要储存极稳定的LAB组合物，尤其因为婴儿粉制品可能在其实际制作日期后很长时间才给予婴儿。因此，如果在实际制作日期后例如30周(或更晚)将婴儿粉给予婴儿，很明显，掺入婴儿粉中的LAB组合物应具有相当的储存稳定性，以维持LAB细胞的活力。
或者，细菌产品可以被配制成冷冻产品。例如，商品发酵剂可以作为冷冻培养物发放。高浓缩的冷冻培养物，特别是当制备成丸粒时，在商业上非常有用，因为这些培养物可以被直接接种到发酵培养基(例如乳品或肉)中而无需中间转移。换句话说，这种高浓缩的冷冻培养物包含一定量的细菌，使得终端用户的内部生产发酵剂变得多余。“生产用发酵剂(bulk starter)”在本文中被定义为在食品加工厂增殖的发酵剂，用于接种到发酵培养基中。高浓缩的培养物可以称为直投式(direct vat set,DVS)-培养物。为了包含足以用于终端用户的DVS培养物的细菌，浓缩冷冻培养物通常必须具有至少50g的重量和每克至少109菌落形成单位(CFU)的活菌含量。WO 2005/080548(Chr.Hansen)公开了丸粒冷冻的乳酸菌(LAB)培养物，其用诸如海藻糖和蔗糖的混合物稳定，并且在储存时不形成结块。
在现有技术工艺中，通过在生长培养基中培养细菌，然后例如通过离心将培养物浓缩，同时将细菌从生长培养基分离的已知方法来获得浓缩的细菌培养物。然后将浓缩的培养物与所需的防腐剂混合，且此后不久，将所得混合物进行：冷冻；干燥，例如冷冻干燥、喷雾干燥或流化床干燥；或者先冷冻再冷冻干燥。
Carvalho et al(2004)Biotechnol Prog.20,248-254讨论了添加到生长和干燥培养基中的各种糖对冻干德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiissp.Bulgaricus)在整个储存过程中的耐热性和存活率的影响，但未讨论使用保护性化合物的混合物。
然而，有时使用保护剂的混合物。例如，WO 2010/138522(Advanced BionutritionCorporation)描述了LAB细胞培养组合物，据说该组合物可用于掺入婴儿粉制品中。优选的组合物包括藻酸盐、菊粉、海藻糖和水解蛋白(见表1，段落[0094])。WO 2013/001089(Chr.Hansen)公开了包含海藻糖、菊粉和酪蛋白的干LAB组合物。
Gisela et al(2014)Food&Nutrition Sci.5,1746-1755公开了当用牛奶和蔗糖的混合物以及蔗糖和海藻糖的混合物制备植物乳杆菌组合物时可以实现协同的冷冻保护作用。
为了刺激双歧杆菌的生长，已经将菊粉和低聚果糖(菊粉的一个亚组)组合在一起(Niness(1999)J.Nutrition 129,1402S–1406S)，但没有披露与保存或乳酸菌相关的内容。
Su et al(2014)J Chinese Inst Food Sic Tech(11),56-63公开了菊粉、谷氨酸盐和山梨醇的混合物作为冻干植物乳杆菌CGMCC的保护剂，但没有公开任何协同作用。
Mensink et al(2015)Carbohydrate Polymers 130,405-419是一篇关于菊粉(包括其较短链形式，低聚果糖)的综述。它提到菊粉已被用于稳定基于蛋白质的药物，但没有提到稳定微生物。据说较高MW的菊粉对食品的储存稳定性有用。据说菊粉与其他胶凝剂(如明胶、藻酸盐、麦芽糊精和淀粉)在胶凝方面具有协同作用，但在其保存作用方面未提及协同作用。
在Jeong et al(2015)Korean Soc.Biotech.Bioeng.J.30，109-113中，针对植物乳杆菌和乳酸乳球菌测试了冷冻保护剂混合物，包括脱脂乳(或麦芽糊精)、海藻糖、甘油和氯化钠的混合物。没有公开协同作用。
在Shu et al(2017)Emirates J.Food&Ag.29,256-263中，用冷冻保护剂对冻干期间的嗜热链球菌进行了测试。据说几种保护剂的混合物，特别是蔗糖和可溶性淀粉的混合物加上抗坏血酸作为抗氧化剂，可以达到更好的效果。
最后，WO 2013/001089(Chr.Hansen；Yde&Svendsen)公开了菊粉、海藻糖和酪蛋白的组合物，用于在冷冻干燥期间保护LAB。没有提到或显示协同作用。
现已发现，特定剂的多种混合物令人惊讶地提供了协同性的稳定作用。
发明概述
本发明的第一方面提供了包含乳酸菌(LAB)和稳定剂的干燥组合物(例如冻干或喷雾干燥制剂),该稳定剂包含至少第一保护剂和不同的第二保护剂的协同混合物，所述第一和第二保护剂选自由低聚果糖、麦芽糊精、菊粉和豌豆纤维组成的组。
优选地，第一保护剂和第二保护剂以5∶95至95∶5、优选10∶90至90∶10、20∶80至80∶20、30∶70至70∶30、40∶60至60∶40、45∶55至55∶45或约50∶50的比例存在于混合物中。
稳定剂可以还包含果胶，优选果胶为第一保护剂和第二保护剂的组合量的2-4％的水平。
例如，稳定剂可以包括以下物质的混合物：
菊粉和麦芽糊精；
低聚果糖和麦芽糊精；
低聚果糖、麦芽糊精和果胶；
菊粉、麦芽糊精和果胶；或
菊粉、麦芽糊精和豌豆纤维。
在乳球菌属的种、链球菌属的种、肠球菌属的种、乳杆菌属的种(包括2020年之前归类为乳杆菌属的所有种)、明串珠菌属的种、双岐杆菌属的种、丙酸菌属的种和片球菌属的种中发现工业上最有用的乳酸菌。因此，在一个优选的实施方案中，乳酸菌选自由这些乳酸菌组成的组。
乳酸菌优选地属于选自由以下组成的组的属：乳杆菌属(Lactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、慢乳杆菌属(Lentilactobacillus)、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)和乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)。具体而言，它们可以是罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusrueteri)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillus paracasei subsp.Paracasei)、植物乳植杆菌植物亚种(Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum)、发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、动物联合乳杆菌(Ligilactobacillus animalis)、布氏慢乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、弯曲广布乳杆菌(Latilactobacilluscurvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus futsaii)、清酒广布乳杆菌清酒亚种(Latilactobacillus sakei subsp.sakei)和/或戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacilluspentosus)。其他包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)、乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostoc mesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种(Lactococcus lactissubsp.lactis biovar.diacetylactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、肠球菌属(Enterococcus)如屎肠球菌(Enterococcus faecium)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
该组合物可以包含一种或更多种乳酸菌菌株，其可以选自由以下组成的组：(动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)/>)、DSM 15954；ATCC 29682、ATCC 27536、DSM 13692、DSM 10140、LA-5(嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)/>)、DSM 13241、/>(鼠李糖乳杆菌/>)、ATCC53103、GR-1(鼠李糖乳杆菌/>)、ATCC 55826、/>(罗伊氏乳杆菌/>)、ATCC55845、L.casei />(副干酪乳杆菌副干酪亚种L.casei/>)、ATCC 55544、/>(副干酪乳杆菌/>)、LMG-17806、/>(嗜热链球菌/>)、DSM 15957、/>(发酵乳杆菌)、NM02/31074和/>(副干酪乳杆菌副干酪亚种/>)、CCTCC M204012。
LAB培养物可以是“混合的乳酸菌(LAB)培养物”或“纯乳酸菌(LAB)培养物”。术语“混合的乳酸菌(LAB)培养物”或“LAB”培养物表示包含两种或更多种不同LAB种的混合培养物。术语“纯乳酸菌(LAB)培养物”表示仅包含单一LAB物种的纯培养物。因此，在优选的实施方案中，LAB培养物是选自由这些培养物组成的组的LAB培养物。
在与保护剂混合前，可洗涤或不洗涤LAB培养物。
优选地，LAB细胞是益生菌细胞。
组合物优选还包含抗氧化剂，例如抗坏血酸或柠檬酸或其任一种的盐例如柠檬酸三钠，或维生素E。
最大含水量优选为5％(按重量计)，且更优选不超过3％或1％(按重量计)。
该组合物可以包含重量比约0.5∶1至1∶40的LAB与稳定剂混合物(加上抗氧化剂，如果存在)。然而优选地，组合物包含20％-50％的稳定剂(更优选30％-50％或40％-50％)、1％-25％的抗氧化剂(更优选5％-20％或8％-15％)和45％-55％的LAB(更优选49％-50％)，所有百分比以相对于稳定剂、抗氧化剂和LAB的总含量表示，加上也以相对于稳定剂、抗氧化剂和LAB的总含量表示的至多3％的水(优选不超过1％)。
该组合物优选包含在108-1012CFU/g制剂、优选109-1012CFU/g制剂，更优选至少1011cfu/g制剂且还更优选至少5.0×1011cfu/g制剂范围内的活LAB含量。该组合物在37℃和aw≤0.15储存8周后可具有这些值。
本发明的第二方面提供了稳定剂在干燥制剂(例如，冻干或喷雾干燥制剂)中或在制备干燥制剂(例如，冻干或喷雾干燥制剂)的工艺中稳定乳酸菌的用途。稳定剂提供协同冷冻保护、协同冻干保护和/或协同储存稳定性。
本发明的第三方面提供了制备LAB组合物的方法，其包括以下步骤：(i)在含有如上所述稳定剂的培养基中配制乳酸菌以形成预干燥组合物，和(ii)干燥该预干燥组合物，例如通过喷雾干燥、真空干燥、空气干燥、冷冻干燥、托盘干燥或真空托盘干燥。
在37℃和aw≤0.15储存8周后，活LAB含量合适地在108-1012CFU/g制剂、优选109-1012CFU/g制剂、优选至少1011cfu/g制剂且更优选至少5.0E+11cfu/g制剂范围内。
LAB组合物可用于制造人类食品、饮品、益生菌、动物饲料、药物产品或植物保健产品。
附图说明
图1显示单个成分连同柠檬酸三钠(5％，w/w)对FD颗粒中动物联合乳杆菌(Ligilactobacillus animalis)(LA51)活力的影响。
图2显示与柠檬酸三钠(5％，w/w)组合的单个稳定剂和稳定剂组合对FD颗粒中动物联合乳杆菌(LA51)活力的影响。
图3显示在aw≤0.15，T＝37℃储存4周(4W)或8周(8W)后，本发明组合物中LA51的活力与基准组合物的比较。
图4显示与分别含有24％低聚果糖、24％麦芽糊精和0.3％果胶的组合物相比，本发明组合物(用11.85％低聚果糖、11.85％麦芽糊精和0.3％果胶的混合物稳定)在37℃和aw≤0.15的16周稳定性试验的结果。
图5是图表，其显示了单一稳定剂和稳定剂混合物对动物联合乳杆菌DSM 33570的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)的影响。
图6是图表，其显示了单一稳定剂和稳定剂混合物对动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.Lactis)DSM 15954的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)的影响。
图7是图表，其显示了单一稳定剂和稳定剂混合物对乳酸乳球菌动物亚种(Lactococcus lactis subsp.animalis)DSM 21404的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)的影响。
图8是图表，其显示了单一稳定剂和稳定剂混合物对嗜热链球菌DSM 15957的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)的影响。
优选实施方案的描述
定义
协同作用被定义为大于两种保护剂在相同浓度下使用相加效应的稳定性水平。例如，如果24％浓度的两种保护剂的混合物提供了比24％浓度的第一保护剂和24％浓度的第二保护剂提供的平均稳定性更高的稳定性(就冷冻保护、冻干保护和/或储存稳定性而言)，则观察到协同作用。这些值可以在图形上绘制成等效线图，其中X轴上仅为第一保护剂的效应(0％至100％的效应)，且Y轴上为第二保护剂的效应。如果保护剂组合的实验点在线以上，那么存在协同作用。
冷冻保护。可将细胞的冷冻生物质添加到稳定剂和抗氧化剂(柠檬酸三钠)中，并在10℃混合，直至使用试管旋转器(tube revolver/rotator)(ThermoFisher Scientific)将冷冻生物质在基质中液化并混合2h。将含有细胞的所得制剂填充在无菌移液管中，并逐滴添加到液氮中以形成丸粒(称为“PFD”，用于预冷冻干燥)，然后在冷冻干燥前于-80℃储存。检测这些PFD的cfu。对细菌的冷休克保护称为冷冻保护。
冻干保护。可使用冻干机(Martin Christ，GmbH)以安全模式(0.3mbar，32℃，运行26小时)干燥预冷冻干燥丸粒(PFD)。冷冻干燥后，检测冻干颗粒(称为“FD颗粒”)的菌落形成单位(CFU/g)。对冷冻干燥应力的活力保护称为冷冻保护。
储存稳定性可通过分析存活微生物细胞的数量如何随时间发展来确定。如本文所述，通过测定CFU/g来测量微生物培养物的活力。因此，微囊化微生物培养物的储存稳定性的测量可通过评估微囊化微生物培养物的干颗粒在时间点0(刚干燥后)和在加速储存条件下储存4周后的CFU/g来确定。简而言之，FD颗粒或FD研磨粉末的储存稳定性研究如下：将微生物培养物的FD颗粒样品(60目研磨粉末)混合在CaCO3中，以获得水分活度(aw)为0.15的样品。将样品放在铝袋中，且密封袋子，使其内没有空气。将袋子在37℃下储存4周，并测定样品的CFU/g。
菊粉是果糖聚合物的异质性收集物。它由终止链的葡糖基部分和通过β(2,1)键连接的重复的果糖基部分组成。标准菊粉的聚合度(DP)范围从2到60。在生产过程中除去DP低于10的部分后，剩余产品为高性能菊粉。DP低于10的部分在本文中被视为低聚果糖(见下文)，而非菊粉。在本发明的背景下，菊粉的平均聚合度可以是20-22或≥23。菊粉可以以各种形式用于本发明，例如市售的颗粒和粉末。
低聚果糖(oligofructan)(也称为果糖低聚糖(FOS)或寡聚果糖(oligofructose)，且有时在本文中缩写为OF)是寡糖果聚糖的混合物。FOS可以通过菊粉或多聚果糖的降解产生，多聚果糖是通过β(2→1)键连接的D-果糖残基与末端α(1→2)连接的D-葡萄糖的聚合物。菊粉的聚合度范围从10到60。菊粉可以通过酶法或化学法降解为具有一般结构Glu–Frun(缩写为GFn)和Frum(Fm)的低聚糖混合物，n和m的范围为1至7。该过程在一定程度上也发生在自然界中，且这些寡糖可以在大量植物中发现，特别是在菊芋(Jerusalem artichoke)、菊苣和蓝色龙舌兰植物中。商业产品的主要成分是蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(nystose)(GF3)、果糖基蔗果四糖(fructosylnystose)(GF4)、黑麦双叉寡糖(GF3)、菊粉二糖(F2)、菊粉三糖(F3)和菊粉四糖(F4)。第二类FOS是通过黑曲霉(Aspergillus niger)或曲霉属(Aspergillus)的β-果糖苷酶对蔗糖的转果糖基化作用制备的。所得混合物具有通式GFn，其中n的范围为1至5。与菊粉衍生的FOS以及β(1→2)结合相反，确实存在其他连接，但数量有限。在本专利申请中，“FOS”和相关术语用于描述第二类FOS。
麦芽糊精是多糖，其由连接成不同长度的链的D-葡萄糖单位组成。葡萄糖单位主要通过α(1→4)糖苷键连接。麦芽糊精通常由长3个至17个葡萄糖单位的链混合物组成。麦芽糊精通过DE(葡萄糖当量)分类，且具有3至20、优选10至20的DE。DE值越高，葡萄糖链越短，甜度越高，溶解度越高，且耐热性越低。
抗氧化剂。术语“抗氧化剂”是指抑制氧化的化合物。抗氧化剂可以是工业化学品或天然化合物。如本文所用，抗氧化剂包括但不限于柠檬酸、维生素C、维生素E和谷胱甘肽及其衍生物，尤其是盐如柠檬酸钠和抗坏血酸钠。术语“维生素E”应理解为包括生育酚和生育三烯酚(α，β，γ，δ)的任一个和所有变体，无论是单独使用还是一起使用。
CFU/g。在实例中，样品的稳定性通常通过使用以下测定计数每克的菌落形成单位(CFU)来评估。在稳定性研究期间，测定在冷冻干燥后立即取样和在选定的时间点取样的冷冻干燥颗粒中的活细胞计数。使用标准的浇注平板法。将冻干的物质混悬在无菌蛋白胨盐水稀释剂中，并通过拍打(stomaching)均匀化。复苏30分钟后，重复进行拍打，并将细胞悬液在蛋白胨盐水稀释剂中连续稀释。将稀释液一式两份铺在MRS琼脂(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂，Fisher Scientific)上。将琼脂平板在37℃厌氧孵育三天。选择具有30-300个菌落的平板进行菌落形成单位(CFU)计数。结果以根据重复样品计算的平均CFU/g冻干样品报告。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)La-5的总体计数方法如下所述。
水分活度(aw)是公知参数，且是物质中水蒸气分压除以标准状态水蒸气分压。在本文，标准状态被定义为纯水在相同温度的蒸气分压。使用该定义，纯蒸馏水具有精确为1的水分活度。FDA网站在2014年8月27日发布的“食品中的水分活度(aw)”标题下列出了测量aw的合适方法。
可培养性：如果细胞在通常支持所讨论菌种生长的营养培养基上形成菌落，则细胞是可培养的。
术语益生菌细胞指的是被定义为微生物食品或饲料补充剂的一类细胞，其通过改善其胃肠道微生物平衡而有益地影响宿主人类或动物。已知的有益效果包括由于益生菌的耗氧和产酸而提高对有害微生物群落的定植抗性。
在本上下文中，表述“乳酸菌”(LAB)是指一组革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无运动性、微需氧或厌氧的细菌，它们发酵糖并产生酸，酸包括乳酸(作为主要产生的酸)、乙酸、甲酸和丙酸的。在乳球菌属的种(spp.)、链球菌属的种、乳杆菌属的种(包括在2020年分类学修订之前被分类为乳杆菌属的种–见下文)、明串珠菌属的种、片球菌属的种、短杆菌属的种、肠球菌属的种和丙酸属的种中发现工业上最有用的乳酸菌。另外，属于严格厌氧菌组的产乳酸细菌，双歧杆菌属，即双歧杆菌属的种(其经常单独或与乳酸菌组合用作食物发酵剂)通常包括在乳酸菌组中。甚至葡萄球菌属(Staphylococcus)种的某些细菌(例如，肉葡萄球菌(S.carnosus)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、松鼠葡萄球菌(S.sciuri)、小牛葡萄球菌(S.vitulinus)和木糖葡萄球菌(S.xylosus))也被称为LAB(Mogensen et al.(2002)Bulletin of the IDF No.377,10-19)。
乳酸菌(LAB)的命名最近发生了变化；见Zheng et al.,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.DOI 10.1099/ijsem.0.004107。该变化可归纳如下：
新名称将在本说明书中使用。LAB可以是这些种中的任何一种。
通常使用的LAB发酵剂乳酸菌株通常分为具有约30℃的最佳生长温度的嗜温生物和具有约40℃至约45℃范围内的最佳生长温度的嗜热生物。
本文所述的组合物可包含在合适的包装中-例如瓶、盒、小瓶、胶囊等。如本领域技术人员在本上下文中所理解的，当我们提及组合物的重量(例如，称为“组合物的g”)时，那么我们指的是组合物本身的重量，即不包括合适包装的可能重量。
与本发明相关的一般性公开内容
典型的冷冻干燥过程如下进行。
(a)发酵LAB细胞并收获细胞以获得包含LAB细胞和水的LAB细胞浓缩物；该浓缩物可以包含108至1014cfu/g乳酸菌(LAB)细胞浓缩物的干物质；
(b)将适量的稳定剂混合物与LAB细胞浓缩物混合以形成浆料；
(c)冷冻浆料以形成固体冷冻颗粒/丸粒；
(d)向托盘装载例如2kg/m2至50kg/m2的冷冻颗粒/丸粒；
(e)在例如0.7毫巴至2毫巴(mbar)的真空压力、在材料的温度不会高到超过使75％的LAB细胞失活的温度，对托盘上的材料进行初次干燥并持续一段时间，直到步骤(b)浆料的至少90％的水已经被去除；且
(f)在例如0.01毫巴至0.6毫巴(mbar)的真空压力，在其中所述材料的温度不会高到使超过75％的LAB细胞失活的温度，对步骤(e)的材料进行二次干燥，干燥时间足以将水分活度(aw)降低到小于0.30，并从而获得本发明的干组合物。
其他储存稳定剂和/或冻干保护剂和/或冷冻保护剂以及协同混合物可以包括在本发明的组合物中。例如，可以包括改性淀粉。然而，优选依赖于本发明定义的混合物。
本领域技术人员理解在本上下文中什么是干组合物。为了对此进行定量描述，本文所述干粉组合物的水分活度(aw)小于0.30。更优选地，本文所述干粉组合物的水分活度(aw)小于0.25，甚至更优选小于0.20，且最优选本文所述干粉组合物的水分活度(aw)小于0.15。
本文所述干组合物的制造通常包括将细胞培养物与保护剂混合。第二步包括干燥所述混合物。干燥可以通过冷冻干燥、喷雾干燥、改良喷雾干燥和/或真空干燥进行。其他干燥方式也是可能的。
在冷冻干燥或真空干燥的情况下，混合物通过本领域已知的方法优选形成丸粒。一种方法是让混合物液滴落入液氮中。另一种形成丸粒的方法是通过挤压。随后可以使用上述干燥方法干燥丸粒。优选地，使用本文所述的制备干粉组合物的方法干燥该组合物。
干组合物可以是粉末形式。
干组合物的重量(例如称为“组合物的g”)通常取决于不同的因素，例如组合物的用途(例如制备如下讨论的婴儿粉制品)。本文所述的干组合物的重量可以是例如1g至1000kg。例如，如果将干组合物用作婴儿产品，那么通常将干组合物与乳粉和其它补充剂混合以获得包含乳酸菌细胞的婴儿粉制品。
婴儿粉制品的生产可以在相当大的规模上进行，例如通过将1kg至10kg如本文所述的干组合物与适量的乳粉和其它补充剂混合。
因此，优选本文所述的干组合物的重量为50g至10000kg，例如100g至1000kg或1kg至5000kg或100kg至1000kg。
为了获得重量为例如100kg的干粉组合物，需要使用相应的相对大量的LAB细胞浓缩物和保护剂。
术语“婴儿”是指从出生到12个月大的人。术语“婴儿配方粉”是指通过替代人乳来满足婴儿营养需求的液体或粉末形式的组合物。这些配方受EU和US法规的监管，这些法规定义了大量营养素、维生素、矿物质和其他成分的水平，旨在模拟人类母乳的营养和其他特性。显然，配方粉不应该含有任何潜在致敏物质。因此，当使用水解酪蛋白时，其应优选被水解，使得超过90％的肽具有小于1,000道尔顿的分子量，超过97％的肽具有小于2,000道尔顿的分子量。
如本文所用，“儿童”被定义为年龄约12个月至约12周岁的人。本发明的婴儿粉末组合物可用于婴儿配方粉、后续配方粉、生长奶和特殊配方粉，以及用于婴儿和儿童的营养产品，以改善其肠道微生物群，同时向婴儿或儿童提供营养。
本发明的干粉组合物可被包封在例如明胶胶囊中，或配制成片剂或小袋。如果组合物用在膳食补充剂中，这一方面尤其重要。
如果组合物包含海藻酸盐如海藻酸钠，则通常需要在加入保护剂之前用软化水洗涤细胞，以避免形成藻酸钙。
本文所述的干组合物可包含其它感兴趣的化合物。例如，这可以是维生素(例如生育酚)或人们可能感兴趣的存在于最终组合物中的其他化合物。这类化合物的实例可以是水分清除剂，例如马铃薯淀粉。
根据所使用的干燥方法，可能需要添加粘度调节剂。例如，如果真空带式干燥是期望的，可能需要增加粘度。相反，如果喷雾干燥是期望的，可能需要降低粘度。粘度调节剂的合适实例例如水(用于降低粘度)、果胶、预胶化淀粉、树胶(例如阿拉伯胶、黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶)、甘油醇(例如甘油)；二醇(例如聚乙二醇、丙二醇)；植物来源的蜡(例如巴西棕榈蜡、米糠蜡、小烛树蜡(candelilla))、非植物蜡(蜂蜡)；卵磷脂；植物纤维；脂质；和硅酸盐(例如二氧化硅)。
本发明的干组合物可以配制成或不配制成为了促进健康的目的而给予人、哺乳动物、鸟或鱼的制成品而使用。当LAB是益生菌LAB时，这通常是最相关的。
本发明的优选制剂是婴儿粉的形式，其中组合物与乳粉混合。如本领域所知，乳粉还可以包含其他补充剂。另一种用途涉及将本文所述的组合物用于谷物，如牛奶什锦早餐，或其它干食品。
因此，在又一方面，本发明涉及掺入根据本发明的组合物的食品，例如谷物、燕麦坚果能量棒、糖棒或巧克力棒。它也可以用在粉末(例如所谓的运动粉末)中，该粉末拟混合在饮品，例如运动饮料或能量饮料中。
另一方面，本发明涉及包含本文所述干组合物的膳食补充剂。
本领域技术人员的常规工作是发酵感兴趣的LAB细胞，以便例如大规模生产/培养它。如本领域所知，发酵细胞的收获通常涉及离心步骤，以除去发酵培养基的相关部分，从而得到LAB细胞浓缩物。为了生产LAB细胞，人们在此阶段可能具备含有约10％细胞干物质的LAB细胞浓缩物-即所谓的10％浓缩物。然后浓缩物剩下的成分通常主要是水，即大约有90％的水。当然，LAB细胞浓缩物有时也可能含有较少的水，例如约50％的水。通常，LAB细胞包含至少10％(如至少20％或至少50％)的水。在一些实施方案中，浓缩物可以包含甚至少于10％的干物质，例如在5％-10％的范围内，例如约5％。
通过本文所述的干燥方法除去的基本上是LAB细胞浓缩物的这种水，从而获得本文所述的干粉LAB组合物。
在收获细胞后，可以优选包括额外的洗涤步骤，以去除尽可能多的发酵培养基成分/化合物，从而获得基本上仅包含LAB细胞的更“纯”的LAB细胞浓缩物。
实施例1–单一稳定剂
为了研究和开发新的改进的冷冻制剂，使用动物联合乳杆菌(称为LA51)对单一成分连同制剂中作为抗氧化剂的柠檬酸三钠进行了测试。将LA51的冷冻生物质添加到冷冻添加剂中，并在10℃使用试管旋转器(ThermoFisher Scientific)混合2小时，以模拟生产工厂的生产条件。所得组合物的包封指数(EI；稳定剂与细菌的比例，w/w)为1(以干基计)。
将含有LA51的制剂在液氮中制丸，然后在冷冻干燥前在-80℃储存。将冷冻干燥前的冷冻丸粒称为PFD(预冷冻干燥)。使用冻干机(Martin Christ GmbH)按照优化后的性能(0.3mbar和32℃)干燥PFD。冷冻干燥后，检测冷冻干燥颗粒(FD颗粒)的水分活度(aw)和菌落形成单位(cfu/g)，并对总细胞数/g、活细胞数/g、活细胞数/总细胞数(％)和cfu/活性可培养性(％)进行流式细胞术(FlowCyto)分析。对包装在铝袋中的具有最大cfu/g和活细胞数/总细胞数(％)的FD颗粒进行储存稳定性测试(温度＝37℃；aw≤0.15)。基于最大cfu/g和活细胞数/总细胞数(％)，将这些成分与细菌(以干基计)组合配制，包封指数为1。
图1显示单一成分连同柠檬酸三钠的FD颗粒的cfu结果和流式细胞术分析(活细胞数/总细胞数，％)。结果清楚地显示，对于对照，在不添加冷冻添加剂的情况下(仅柠檬酸三钠，5％w/w)，冷冻干燥后LA51的活力急剧下降(活细胞数/总细胞数为14.22％和3.25E+10cfu/g)。这表明需要向LA51细胞中添加冷冻和冻干保护成分，以保护它们免受恶劣生产条件的影响。菊粉和低聚果糖的添加表现出分别具有84.17％和44.48％活性细胞以及6.14E+11cfu/g和4.08E+11cfu/g的冷冻和冻干保护活性，这显著高于对照，从而表明冷冻和冻干保护活性。然而，与对照相比，单独使用海藻糖并未对LA51细胞给予任何冷冻和冻干保护。
实施例2–稳定剂混合物
基于实施例1中单一成分连同抗氧化剂(柠檬酸三钠)的初步cfu和流式细胞术结果，菊粉和低聚果糖显示出冻干/冷冻活性，但在冷冻干燥期间保护细菌的能力有限。因此，进行了一种以上成分连同抗氧化剂的组合以测定协同活性，并且也在冷冻干燥期间实现对LA51活力的最大保护。作为基准，使用海藻糖和麦芽糊精(共占组合物的28％)的混合物(还包括作为抗氧化剂的柠檬酸三钠)稳定动物联合乳杆菌(称为LA51)。结果见表1和图2。
表1.冷冻和冷冻干燥后，即以FD颗粒的形式LA51的活力。
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菊粉HSI和菊粉GR获自BENEO GmbH，Mannheim，德国。麦芽糊精获自Roquette Frères。
图2和表1中展示的数据清楚地表明，当低聚果糖和麦芽糊精以1:1的比例(干基)与抗氧化剂混合并添加到LA51细胞(EI＝1)中时，活力(7.86E+11cfu/g和94.17％活细胞数/总细胞数)显著高于单一成分。本研究的结果表明，两种或更多稳定剂的组合可有助于在冷冻和冷冻干燥(表2)后达到最大活力(～95％)。
实施例3–加速条件下的储存稳定性
为了使用本发明的协同稳定剂评价细菌的储存稳定性，在冻干后，将根据实施例2制备的冻干(FD)颗粒包装在铝袋中并在37℃储存。然后在0、4和8周检测其CFU。与实施例2一样，在本实施例中使用海藻糖和麦芽糊精的混合物作为基准。
表2 LA51 FD颗粒在37℃、水分活度(aw)≤0.15的储存稳定性结果(CFU/g)。
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OF＝低聚果糖
图3和表2中所示数据显示，在37℃储存4周后以及8周后，与海藻糖和麦芽糊精的基准混合物相比，根据本发明的协同制剂具有更好的活力保护。在含有低聚果糖、麦芽糊精和果胶的冷冻制剂中，LA51减少0.85Log cfu/g，而在对照情况下，其减少1.35Log cfu/g。此外，与基准(减少2.35Log cfu/g)相比，该制剂在8周后显示出更高的活力保护(减少1.42Log cfu/g)。
实施例4–协同作用的体现
为了评价稳定剂在储存稳定性测试期间的协同作用，如实施例1所述制备单一稳定剂(低聚果糖、麦芽糊精、果胶)，和如实施例2所述制备多稳定剂(低聚果糖、麦芽糊精、果胶一起)。如实施例3所述评估了储存稳定性。图4显示在37℃和aw≤0.15储存期间，动物联合乳杆菌LA51的Log10 cfu/g。数据清楚地表明，与混合的多稳定剂相比，单一稳定剂的活力保护作用较弱。协同稳定剂的活力保护是明显的，因为在37℃和aw≤0.15储存16W后，多稳定剂比单一稳定剂表现出超过1Log10 cfu/g的保护作用。
实施例5–协同作用的进一步体现
将动物乳双歧杆菌BB12 CHCC 5445接种到补充有0.5g/L L-半胱氨酸盐酸盐(Sigma-Aldrich,Inc.)的De Man,Rogosa and Sharpe(MRS)液体培养基(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂，Fisher Scientific)中，并在37℃厌氧培养24小时。生长24小时后，使用离心法将培养基中的细胞浓缩25倍。根据表3，将浓缩细胞与冷冻保护剂混合。与此类似，动物联合乳杆菌LA51 CHCC 10506、嗜热链球菌TH4 CHCC 2336和乳酸乳球菌R607CHCC 1915在DeMan,Rogosa and Sharpe(MRS)液体培养基中于37℃厌氧生长24小时。根据表3，还将这些浓缩细胞与冷冻保护剂混合。
表3.冷冻保护剂的组成(％w/w)。
使用以下测定，通过计数菌落形成单位(CFU)/克来评估样品的稳定性。在稳定性研究期间，测定在冷冻干燥后立即取样以及在选定时间点取样的冷冻干燥颗粒中的活细胞计数。使用标准的浇注平板法。将冻干材料混悬在无菌蛋白胨盐水稀释液(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂,Fisher Scientific)中，并使用匀浆器(stomacher)(bioMérieux,Inc.Durham,NC)拍打均匀化。复苏30分钟后，重复进行拍打，并将细胞悬液在蛋白胨盐水稀释剂中连续稀释。对于动物双歧杆菌乳酸亚种BB12 CHCC 5445的cfu，将稀释液一式两份涂布于补充有0.5g/L L-半胱氨酸盐酸盐(Sigma-Aldrich,Inc.)的MRS琼脂(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂,Fisher Scientific)上。将琼脂平板在37℃厌氧孵育3天。对于动物联合乳杆菌La51 CHCC 10506的cfu，将稀释液一式两份涂布于MRS琼脂(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂,Fisher Scientific)上。将琼脂平板在37℃厌氧孵育3天。对于嗜热链球菌TH4 CHCC2336的cfu，将稀释液一式两份涂布于补充有0.5g/L磷酸二氢钠(Sigma-Aldrich,Inc.)和0.5g/L磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich,Inc.)的M17琼脂(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂,Fisher Scientific)上。将琼脂平板在37℃下有氧孵育3天。对于乳酸乳球菌R607 CHCC1915的cfu，将稀释液一式两份涂布于补充有0.5g/L磷酸二氢钠(Sigma-Aldrich,Inc.)和0.5g/L磷酸氢二钠(Sigma-Aldrich,Inc.)的M17琼脂(BD DifcoTM乳酸杆菌MRS琼脂,Fisher Scientific)上。将琼脂平板在37℃下有氧孵育3天。选择具有30–300个菌落的平板用于计数菌落形成单位(CFU)。结果以根据重复样品计算的平均CFU/g冻干样品报告。
结果见表4-7。表4显示了动物联合乳杆菌(DSM 33570)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。表5显示了动物双歧杆菌乳酸亚种(DSM 15954)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。表6显示了乳酸乳球菌乳酸亚种(DSM21404)在加速条件(37C和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。表7显示了嗜热链球菌(DSM 15957)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。
表4.动物联合乳杆菌(DSM 33570)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。
表5.动物双歧杆菌乳酸亚种(DSM 15954)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。
表6.乳酸乳球菌乳酸亚种(DSM 21404)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。
表7.嗜热链球菌(DSM 15957)在加速条件(37℃和aw≤0.15)下的储存稳定性结果(CFU/g)。
表8总结了表3中列出的根据本发明实施方案的各种组合物，用于图5-8中的进一步比较。
表8.用于证明冷冻保护剂协同作用的具有单一稳定剂和稳定剂混合物的组合物。
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图5显示了单一稳定剂和稳定剂混合物的作用，获得了不同冷冻保护剂对包含动物联合乳杆菌DSM 33570的制剂的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)。图6显示了单一稳定剂和稳定剂混合物的作用，获得了不同冷冻保护剂对包含动物双歧杆菌乳酸亚种DSM15954的制剂的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)。图7显示了单一稳定剂和稳定剂混合物的作用，获得了不同冷冻保护剂对包含乳酸乳球菌动物亚种DSM 21404的制剂的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)。图8显示了单一稳定剂和稳定剂混合物的作用，获得了不同冷冻保护剂对包含嗜热链球菌DSM 15957的制剂的加速储存稳定性(37℃，aw≤0.15，12周)。
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Claims (18)

1.一种干燥组合物(例如冻干制剂或喷雾干燥制剂)，其包含乳酸菌(LAB)和稳定剂，所述稳定剂包含至少第一保护剂和不同的第二保护剂的协同混合物，所述第一保护剂和第二保护剂选自由低聚果糖、麦芽糊精、菊粉和豌豆纤维组成的组。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一保护剂和第二保护剂以5∶95至95∶5、优选10∶90至90∶10、20∶80至80∶20、30∶70至70∶30、40∶60至60∶40、45∶55至55∶45或约50∶50的比例存在于所述混合物中。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述稳定剂还包括果胶，优选所述果胶为所述第一保护剂和第二保护剂的组合量的2-4％的水平。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的组合物，其中所述稳定剂包括以下物质的混合物：
(i)菊粉和麦芽糊精；
(ii)低聚果糖和麦芽糊精；
(iii)低聚果糖、麦芽糊精和果胶；
(iv)菊粉、麦芽糊精和果胶；或
(v)菊粉、麦芽糊精和豌豆纤维。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述乳酸菌属于选自由以下组成的组的属：链球菌属(Streptococcus)(例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus))、乳球菌属(Lactococcus)(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))、酒球菌属(Oenococcus)(例如酒酒球菌(Oenococcus oeni))、明串珠菌属(Leuconostoc)(例如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides))、乳杆菌属(Lactobacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、粘液乳杆菌属(Limosilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、慢乳杆菌属(Lentilactobacillus)、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)和乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述细菌是选自由以下组成的组的种：罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillus salivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus casei)、副干酪乳酪杆菌副干酪亚种(Lacticaseibacillusparacasei subsp.Paracasei)、植物乳植杆菌植物亚种(Lactiplantibacillus plantarumsubsp.plantarum)、发酵黏液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)、动物联合乳杆菌(Ligilactobacillus animalis)、布氏慢乳杆菌(Lentilactobacillus buchneri)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus futsaii)、清酒广布乳杆菌清酒亚种(Latilactobacillus sakei subsp.sakei)、戊糖乳植杆菌(Lactiplantibacillus pentosus)、短乳杆菌(Levilactobacillus brevis)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的组合物，其另外包含抗氧化剂，例如抗坏血酸或柠檬酸或其任一种的盐例如柠檬酸三钠，或维生素E。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中最大水含量为按重量计5％，优选不超过按重量计3％或1％。
9.根据权利要求7或8所述的组合物，其包含20％-50％的稳定剂(优选30％-50％或40％-50％)、1％-25％的抗氧化剂(优选5％-20％或8％-15％)和45％-55％的LAB(优选49％-50％)，所有百分比以相对于稳定剂、抗氧化剂和LAB的总含量表示，加上也以相对于稳定剂、抗氧化剂和LAB的总含量表示的至多3％的水(优选不超过1％)。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的组合物，其包含在108到1012CFU/g制剂、优选至少1011cfu/g制剂且更优选至少5.0×1011cfu/g制剂范围内的活LAB含量。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述组合物已经在37℃和aw≤0.15储存了8周。
12.如权利要求1至4中任一项所述的稳定剂在干燥制剂(例如，冻干制剂或喷雾干燥制剂)中或在制备干燥制剂(例如，冻干制剂或喷雾干燥制剂)的工艺中稳定乳酸菌的用途。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述稳定剂用于提供协同冷冻保护、协同冻干保护和/或协同储存稳定性。
14.一种制备根据权利要求1到11中任一项的组合物的方法，其包括以下步骤：(i)在含有权利要求1到4中任一项所述稳定剂的培养基中配制乳酸菌以形成预干燥组合物和(ii)干燥所述预干燥组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述干燥步骤包括喷雾干燥、真空干燥、空气干燥、冷冻干燥、托盘干燥或真空托盘干燥。
16.根据权利要求14到15的方法，其中活LAB含量在108到1012CFU/g制剂、优选至少1011cfu/g制剂且更优选至少5.0E+11cfu/g制剂范围内。
17.根据权利要求14所述的方法，还包括步骤(iii)：在37℃和aw≤0.15储存所述组合物8周，其中储存后活LAB含量在108到1012CFU/g制剂、优选至少1011cfu/g制剂且更优选至少5.0E+11cfu/g制剂范围内。
18.一种人类食品、饮品、益生菌、动物饲料、药物产品或植物健康产品，其包含根据权利要求1到11中任一项的组合物。
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