CN114002443A - 可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒包括试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液，其中所述试剂检测卡包括反应部和含有滤血膜和滤芯的滤血部，冻干小球为10～15μL包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被亲和素的供体浓缩微球试剂冻干形成的小球；本发明的试剂卡在孔抽负压下将样品经滤红细胞装置送至检测孔，与三种冻干小球复溶，一步法孵育，检测光信号，可对抗原或抗体进行定量检测，具有高精度、高稳定性以及好的滤红细胞效果。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测试剂盒技术领域，具体涉及一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术背景
光激发均相发光是将抗原、抗体或者基因探针分别与受体微球和供体微球连接，当发生特异性的分子结合时，两种微球连接在一起，此时如果有特定的光源照射反应体系，则包含在其中的一个供体微球中的光敏剂会将环境氧转化为激发态的单线态氧，单线态氧可以氧化另一个受体微球的发光剂而发光；若是两种微球没有结合，由于距离较远，寿命较短的单线态氧无法到达另一个受体微球并使其发光。因此，光激发均相发光技术显示出巨大的优势，其操作简单，测试速度快，精密度好，并且减少管路清洗系统，很大程度减少仪器的体积大小及维护、耗材费用。
目前，标记免疫分析技术仍以固相方式为主，即免疫复合物在固相载体上形成，并通过洗涤去除未结合的反应物和反应基质，而光激发均相发光技术的特点是无需分离免疫复合物，虽然固相免疫具有检测灵敏度高、线性范围宽的优点，但不足之处是反应时间长，操作步骤多，检测结果精密度不及均相反应。中国专利CN101750487B公开了一种干法光激化学发光免疫检测试剂盒，其微粒发光溶液中需要添加海藻糖，用于干燥过程中起支撑定型效果，防止试剂分子之间脱水，但因此增加成本，工艺复杂化，另一方面，该试剂盒在使用过程中需要经两步温育后进行光子信号检测，增加了人工加样过程中的误差。中国专利CN113092767A公开了一种鲎试剂冻干微球及其制备方法和应用，该微球的冻干过程需要控制温度进行预冻，增加了操作难度。目前，市面常规的光激发均相发光试剂均以液相产品为主，液态试剂的运输和储存稳定性受到很大限制，供体和受体微球采取逐步加液体试剂的形式会影响检测的精密度，若出产产品需人工完成试剂加样，则造成偏差更大。因此，如何提高光激发均相发光试剂的运输、储存稳定性，简化试剂的制备工艺，同时在操作过程中减小人为因素的影响，提高检测的精密度，对光激发均相发光技术的应用提供广阔的前景。
发明内容
针对上述现有的技术问题，本发明提供了一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒及其制备方法；
本发明的原理：在680nm左右激发光激发下，包被有亲和素的填充有酞菁衍生物的供体微球可以产生单线态氧，当供体微球连接生物素标记抗体或抗原，并且进一步连接检测对象及包被有抗体或抗原的受体微球时，单线态氧可传递至受体微球上，并与填充在受体微球上的二甲基噻吩发生化学反应，产生紫外光，紫外光进一步激发填充于受体微球上的铕螯合物产生光子；若是受体和供体微球未通过检测对象结合，则单线态氧由于传输距离太远而无法到达受体微球使其发光。
本发明所述试剂检测卡包括反应部和滤血部；
所述滤血部下端和反应部中间部位通过通道连接；
所述的滤血部有复合滤血装置，所述复合滤血装置包括滤血膜、滤芯；
所述的滤血装置包含滤血膜和滤芯，其中滤芯为下方孔径2-10μm左右，直径4.5-4.7mm，厚度2-3mm的聚乙烯烧结滤芯，在滤芯上方加装1-2μm孔径的滤血膜，所述滤血装置中滤芯和滤血膜位置可以互换，该装置可直接添加含有红细胞的样品上样检测，对样品中絮状等粒径较大且不参与反应的杂质和血细胞进行过滤。
所述可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒由试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液组成；
所述进样稀释液采用生理盐水添加防腐剂的形式；
所述可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法如下：
1)制备标记物试剂：分别将包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被有亲和素的供体微球与缓冲液混合得到；
2)冻干：采用滴珠机步骤1)中的三种标记物试剂经滴珠机呈小液滴滴落，滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状，将液氮冷冻小球直接转至液氮预冷过的铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，再进一步转移至冻干机进行冷冻干燥；
3)分拣：将三种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡中，分装结束对试剂卡进行封口，并将试剂卡放入装有干燥剂的密封袋密封。
所述步骤1)中的标记物分别为生物素标记抗体/抗原、包被有抗体/抗原的受体微球、包被有亲和素的供体微球，三种标记物的标记过程如下：
1)生物素标记抗体/抗原：取一定体积的0.05M pH9.5 CB缓冲液，以此投入一定摩尔比的生物氨基己酰基-6-氨基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和抗体/抗原，25℃反应2h后加入1％甘氨酸封闭30min，在0.01M pH7.4的PBS缓冲液透析至无残留生物素取出采用Thermo蛋白检测仪检测蛋白浓度；
2)包被有抗体/抗原的受体微球：取适量的200nm左右的羧基受体微球用0.05MpH5的MES清洗离心两遍后，按照一定的比例和顺序加入适量的抗体/抗原，m＝1/50m微球的EDC，加入10％Tween20至终浓度0.1％，30℃反应2h。偶联结束后，加入10％牛血清白蛋白浓度至终浓度0.1％，加入0.6％乙醇胺，30℃封闭30min，封闭结束后根据缓冲液稀释至20-50mg/mL；
3)包被有亲和素的供体微球：取适量的200nm左右的羧基供体微球用0.05M pH5的MES清洗离心两遍后，按照一定的比例和顺序加入适量的亲和素，m＝1/50m微球的EDC，30℃反应2h，偶联结束后，加入0.1％牛血清白蛋白，加入0.6％乙醇胺，30℃封闭30min，封闭结束后根据缓冲液稀释至20-50mg/mL。
所述步骤1)中的缓冲液为含有氯化钠、Tween20、牛血清白蛋白、Proclin-300和去离子水的PB、MES或TRIS体系中的一种或组合；
由于本发明的试剂盒在制备过程中，NaCl浓度通过影响冻干共晶点，影响升华干燥的温度和时间，进一步影响冻干小球的成型形态，最终对光激发化学发光检测结果产生影响，因此，本发明对NaCl含量进行优化；
所述步骤1)中缓冲液的NaCl添加量为0～0.9％；
所述步骤1)中的缓冲液还可添加保护剂为葡聚糖20000、抗坏血酸、酪蛋白、赖氨酸、山梨醇、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、Tween80、Tween20、Triton X-405、Triton X-100、酪蛋白钠盐、甘氨酸、PEG20000、PRG8000、PEG6000、PEG2000、PEG200、PVP29000、PVP40、PVP10中的一种或多种。
所述步骤2)中液氮冷冻小球放置于铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，进一步转移至冻干机中，在-40～-50℃直接抽真空冻干，最后通过共晶点判断最佳的工艺条件。
由于在不添加色素情况下，含有受体微球和生物素标记物的浓缩工作液小球颜色均为白色，肉眼难以区分，在生产分装上很难发现是否同时装载了同一种受体珠或者生物素珠，故本发明研究了不用色素对检测试剂盒的影响，挑选出不影响检测试剂盒的色素进行冻干小球色素添加，目的是为了区分三种组分，以便于分装、保存，本发明选取的色素为暖色调色系：红色、橙色、黄色，所述色素添加可为苯酚红、苯酚红钠盐、和日落黄或柠檬黄。
所述步骤3)的分拣环境为：温度为25℃以下，湿度为30％以下，分拣时间在0～8h不受影响。
本发明的可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒在使用过程中，其反应模式为：10-50μL样品+150μL进样稀释液，经抽滤后复溶3种冻干小球；
进一步地，所述冻干小球复溶后的试剂反应模式为：10-50μL样品+50μL生物素标记抗体/抗原工作液+50μL包被有抗体/抗原的受体微球工作液+50μL包被有亲和素的供体微球工作液；
所述的受体微球和生物素标记中提到包被的蛋白可为抗体或抗原，其主要根据项目选取的方法进行区分：①若检测的蛋白为大分子抗原，则采用双抗体夹心法(见附图2)，此时受体微球包被抗体，生物素标记抗体，反应模式是10-50μL样品+50μL生物素标记抗体工作液+50μL包被有抗体的受体微球工作液+50μL包被有亲和素的供体微球工作液；②若检测的蛋白为小分子抗原，则采用竞争法(见附图3)，此时受体微球包被抗原，则生物素标记抗体，反应模式是10-50μL样品+50μL生物素标记抗体工作液+50μL包被有抗原的受体微球工作液+50μL包被有亲和素的供体微球工作液。受体微球包被抗体，则生物素标记抗原，反应模式是10-50μL样品+50μL生物素标记抗原工作液+50μL包被有抗体的受体微球工作液+50μL包被有亲和素的供体微球工作液。
本发明的试剂盒在上述反应模式基础上，将50μL的三种含有微球和生物素标记的不同工作液采用冻干或者烘干形式做成干法试剂，经验证表明，冻干的形式优于烘干的形式，表现为复溶较简单且蛋白的结构不易破坏；另一方面，若是50μL的工作液直接冻干成小球，体积太大，导致冻干小球表面形态较差，因此，本发明对50μL的试剂成分进行1.6-5倍的浓缩，浓缩后的工作液冻成小球后，每颗小球再加入50μL的进样稀释液稀释至1X工作浓度，进一步进行测试，同时，为了配合检测孔可同时放置三种小球的体积大小，故本发明所要求冻干小球的体积大小为10-30μL，优选为10～15μL。
本发明所述试剂盒的使用方法为：
所述的试剂检测卡设有手柄，方便操作人员手持操作，在试剂卡的一侧设置有条码，方便仪器识别及自动化；将冻干小球装载至试剂检测卡的反应检测孔中，样品测试时，去掉试剂卡上方的医用易撕膜，将样品加入至试剂检测卡的过滤孔，后加入适量进样稀释液，将试剂检测卡放入仪器，仪器对反应检测孔抽负压，所述抽负压过程中的检测压力和时间应保证滤血膜在抽滤过程中不会破碎，样品及进样稀释液随压力经过滤血材料从通道进入至反应检测孔，进入检测孔的液体复溶3种冻干小球，仪器对试剂卡进行震动数秒，进行一步法孵育，孵育结束后，读取光子信号，根据标准曲线计算待测样品浓度，直接得到样品的定量检测结果，该检测过程见附图1。
本发明的试剂盒在使用过程中，样品和进样稀释液经过滤装置抽滤至检测孔，检测孔的三颗浓缩小球被稀释成工作浓度液体并与样品反应，由于进样稀释液是为了稀释3颗浓缩的冻干小球，因此进样稀释液的组分不同对冻干小球的复溶情况以及样品的检出性能均有有很大程度的影响，其具体影响过程如下：
①由于过滤装置选取的滤芯和滤血膜的孔径较小，若是进样稀释液含有表面活性剂或者是蛋白，则容易引起泡沫的产生，妨碍检测孔的检测；
②另一方面，由于进样稀释液是与样品一同加入，若是加入的样品中含有细胞，则稀释液的环境应当满足与细胞渗透压接近，则容易引起细胞破碎；
综上所述，本发明对进样稀释液成分和含量进行了优化。
本发明所述含有微球和生物素标记的三种缓冲液体系的冻干工艺如下：
(1)PB体系冻干工艺如下：
a：PB体系缓冲液-保护剂组成为PB浓缩液+0-0.5％葡聚糖20000、0-5％蔗糖、0-0.5％Triton X-405、0-0.5％Triton X-100、0-0.5％PEG20000、0-0.5％PEG8000、0-0.5％PEG6000、0-0.5％PEG2000、0-5％海藻糖、0-4％甘氨酸、0-5％甘露醇或0-5％葡萄糖；
b：1.6-5倍浓缩液经液氮冷冻后形成液氮小球，转至经液氮预冷过的铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，再根据表1中的冻干程序进行抽真空冷冻干燥；
表1：PB体系冻干程序
| -40℃ | 2h |
| -30℃ | 2h |
| -25℃ | 6h |
| -10℃ | 2h |
| 0℃ | 2h |
| 10℃ | 2h |
| 20℃ | 2h |
| 30℃ | 3h |
(2)MES体系冻干工艺如下：
a：MES体系缓冲液-保护剂组成为MES浓缩液+0-0.5％葡聚糖20000、0-5％蔗糖、0-0.5％Triton X-405、0-0.5％Triton X-100、0-0.5％PEG20000、0-0.5％PEG8000、0-0.5％PEG6000、0-0.5％PEG2000、0-5％海藻糖、0-4％甘氨酸、0-5％甘露醇、0-5％山梨醇或0-5％葡萄糖；
b：1.6-5倍浓缩液经液氮冷冻后形成液氮小球，转至经液氮预冷过的铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，再根据表2中的冻干程序进行抽真空冷冻干燥；
表2：MES体系冻干程序
| -40℃ | 2h |
| -30℃ | 6h |
| -20℃ | 2h |
| -10℃ | 2h |
| 0℃ | 2h |
| 10℃ | 4h |
| 20℃ | 4h |
| 30℃ | 3h |
(3)TRIS体系冻干工艺如下：
a：TRIS体系缓冲液-保护剂组成为TRIS浓缩液+0-5％蔗糖、0-0.5％TX100；
b：1.6-5倍浓缩液经液氮冷冻后形成液氮小球，转至经液氮预冷过的铝制盘、不锈钢盘或西林瓶中，再根据表3中的冻干程序进行抽真空冷冻干燥；
表3：TRIS体系冻干程序
| -50℃ | 2h |
| -45℃ | 1.5h |
| -40℃ | 0.5h |
| -35℃ | 10h |
| -30℃ | 6h |
| -20℃ | 2h |
| -10℃ | 2h |
| 0℃ | 2h |
| 10℃ | 2h |
| 20℃ | 2h |
| 30℃ | 3h |
对上述冻干工艺制备得到的冻干小球进行分拣，对其分拣环境进行测定：
三种不同组分的冻干小球制备后，需要各取1颗分装至试剂检测卡的检测孔中，分拣的过程中，放置于环境中的小球会受环境的影响，经研究发现，冻干小球放置于温度≤25℃、湿度≤30％环境8h，对小球的性能不产生影响，而放置于湿度>30％、温度>25℃下的冻干小球溶易潮解，从而影响小球的存储稳定性。
相应的与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)本发明提供的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒包含三种成分的冻干小球，将含有三种成分的工作液进行浓缩1.6～5倍，体积大小控制在10-30μL，得到的冻干小球的CV仍可达到6％以下；
(2)本发明的冻干小球在制备过程中无需将经液氮冷冻后的小球置于冻干机中进行预冻，液氮小球可直接转移至冻干机中抽真空冻干，优化了工艺步骤，降低了实际过程中的操作难度，减少误差，有利于放大生产；
(3)本发明的冻干小球对不同材质的冻干箱进行筛选，相比不锈钢冻干盘和西林瓶，铝制品冻干箱制备的冻干小球形态更好；
(4)本发明在分拣封装过程中为了避免吸湿变形等问题，采用的分拣环境湿度≤30％以下，温度≤25℃，在此环境下，分拣时间可延长至8h；
(5)本发明冻干过程中的缓冲液中可添加5％蔗糖的蔗糖作为保护剂或者甚至无需添加保护剂制备的冻干小球性能形态光滑，不易产生碎屑，高温稳定性良好，同时可节约成本；
(6)本发明对缓冲液体系中的NaCl浓度进行了优化，其中NaCl以0～0.9％质量浓度的缓冲液产生的冻干共晶点较高，提高了抽真空过程中升华干燥的温度，缩短了冻干时间，冻干的小球形态稳定良好，同时节约了成本；
(7)本发明采用了不用色素区分三种组分的冻干小球，以便于分装、保存；
(8)本发明制备的试剂盒采用的测试方式为试剂卡左侧进样，右侧泵抽过滤后直接进入右侧检测杯复溶三个小球，一步温育检测，缩短了时间，也减少了液态试剂的添加步骤，仪器无需管路清洗，降低对仪器设备的要求。
附图说明
图1中(A)左边的滤芯和滤血膜位置可以互换，右边检测孔上方黑色部分为泵抽的吸头，检测孔中的三颗球分别为生物素标记物小球、受体微球标记小球、供体微球标记小球；(B)为通过负压抽滤后，样本+稀释液通过过滤装置过滤至右边的检测孔中，迅速复溶三颗小球，随后孵育结束后检测。
图2为双抗体夹心发检测模式，A、B、C、D、F分别为包被有亲和素的供体微球、生物素标记抗体、待测抗原、包被有抗体的受体微球、免疫复合物。
图3为竞争法检测模式，a、b、c、d、f1、f2分别为包被有亲和素的供体微球、生物素标记的抗体、待测抗原、包被有抗原的受体微球、抗原竞争结合免疫复合物、待测抗原结合免疫复合物。
图4为滤血装置。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1NT-proBNP(氨基末端脑钠肽前体)冻干小球诊断试剂的制备
(1)抗NT-proBNP抗体包被的受体微球制备及工作液的配制：
受体微球的制备：(a)将100μL，浓度为10mg/mL受体微球混悬液放入试管内，于14000rpm的转速下离心15min，去除上清液，加入两倍体积的MES溶液(pH＝5)清洗两遍，同样于14000rpm的转速下离心15min，去除上清，加入200μL的MES溶液(pH＝5)，超声分散，制成初级微球混悬液I；(b)向步骤(a)制得的初级微球混悬液I中分别加入50μg抗NT-proBNP抗体、2μL 10mg/mL的EDC-MES溶液、2μL 10％的Tween20-去离子水，混匀，在30℃摇床下震荡2h，反应结束后加入1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺，混匀，置于30℃摇床上封闭30min，于14000rpm转速下离心15min，去除上清液，加入两倍体积的缓冲液清洗两遍，加入50μL的缓冲液贮存；
按质量百分数计，所述缓冲液组成为：0.25M MES、0.9％氯化钠、7.5％牛血清白蛋白、0.5％Tween20、0.5％Proclin-300，余量为去离子水，pH＝6.0。
工作液的配制：将包被有NT-proBNP抗体的受体微球贮存液用缓冲液+0.01％苯酚红钠盐稀释至工作浓度为1.0mg/mL；
(2)生物素标记抗NT-proBNP抗体制备及工作液的配制：
抗体的制备：50μg的NT-proBNP抗体和1.89μg的sigma长链生物素加入到50μL，0.01M的PBS缓冲液(pH＝7.4)中，于25℃下震荡2h，反应后加入1mg甘氨酸，于25℃下震荡封闭30min，生物素标记抗NT-proBNP抗体溶液在0.01M的PBS缓冲液(pH＝7.4)中透析24h。
工作液的配制：生物素标记抗NT-proBNP抗体标记液用缓冲液+0.01％日落黄稀释至工作浓度为6.25μg/mL；按质量百分数计，所述缓冲液组成为：0.25M MES、0.9％氯化钠、7.5％牛血清白蛋白、0.5％Tween20、0.5％Proclin-300，余量为去离子水，pH＝6.0。
(3)亲和素包被的供体微球制备及工作液的配制
供体微球的制备：(a)将100μL，浓度为10mg/mL供体微球混悬液放入试管内，于14000rpm的转速下离心15min，去除上清液，加入两倍体积的MES溶液(pH＝5)清洗两遍，同样于14000rpm的转速下离心15min，去除上清，加入200μL的MES溶液(pH＝5)，超声分散，制成初级微球混悬液I；(b)向步骤(a)制得的初级微球混悬液I中分别加入50μg亲和素、2μL10mg/mL的EDC-MES溶液，混匀，在30℃摇床下震荡2h，反应结束后1mg牛血清白蛋白和1.2μL乙醇胺，混匀，置于30℃摇床上封闭30min，于14000rpm转速下离心15min，去除上清液，加入两倍体积的缓冲液清洗两遍，加入50μL的缓冲液贮存；
按质量百分数计，所述缓冲液组成为：0.25M MES、0.9％氯化钠、7.5％牛血清白蛋白、0.5％Tween20、0.5％Proclin-300，余量为去离子水，pH＝6。
工作液的配制：包被有亲和素的供体微球贮存液用缓冲液稀释至工作浓度为0.25mg/mL。
(4)液氮冷冻小球制备
将滴珠机出液体积大小调整至10μL，包被有抗NT-proBNP抗体的受体微球工作液、生物素标记的NT-proBNP抗体工作液、包被有亲和素的供体微球工作液经滴珠机呈小液滴滴落，滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状。
(5)干燥、分拣
将步骤4)得到的液氮冷冻小球转移至已预冻至-40℃的冻干机后进行冷冻干燥，干燥结束后，于湿度30％以下，温度25℃以下环境进行小球分拣，3种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡的反应检测孔中，分装结束对试剂卡进行封口，并将试剂卡放入装有干燥剂的密封袋密封。
(6)检测结果
(a)精密度：将已知浓度的NT-proBNP抗原定标品5个，分别取10μL加入试剂检测卡的过滤孔中，每个样品20孔，各添加150μL的进样稀释液，37℃孵育10min后，采用Reader读数，结过见表1；
表1：精密度测定结果
由表1结果显示，色素冻干小球试剂的发光值与NT-proBNP抗原浓度具有明显的相关性，随着NT-proBNP抗原浓度的升高，发光值逐渐升高，批内精密度小于10％，可用于NT-proBNP抗原的检测。
(b)试剂检测卡稳定性：对37℃下储存28天的冻干小球稳定性进行测定，将浓度分别为20000pg/mL、5000pg/mL、300pg/mL的NT-proBNP抗原定标品，分别取10μL加入试剂检测卡的过滤孔中，每个样品3孔，各添加150μL的稀释液，37℃孵育10min后，采用Reader读数，得到的发光均值如表2所示；
表2：稳定性测定结果
由稳定性数据可知，冻干小球试剂37℃高温28天内稳定性良好，表明试剂检测卡也具有良好的稳定性。
实施例2滤血装置的优化
(1)滤血装置装的优化
对试剂盒中的试剂检测卡滤血装置进行优化，其中滤血装置采用不同的填充形式，三种不同的填充形式对滤过红细胞效果以及装在难以程度进行对比，结果如表3所示；
表3：不同滤血装置填充形式的优化结果
由表3结果可知，单独使用滤芯填充的滤血装置虽然装载容易，但红细胞大多数可通过滤芯，滤芯是聚乙烯烧结的较硬有一定孔径的材料，可以起到支撑的结构，由于孔径较大和不均一的问题并不能起到良好的滤血作用，滤血效果较差；滤血的孔径原理可以截留红细胞，单独采用滤血膜的装置需要采用合适的抽滤压力才能得到较好的滤过效果，但滤血膜本身是属于软和薄的材质，在试剂卡孔较难平整填充，单独采用滤血膜的装载难度较大，且填塞后，抽滤的压力太大可能会导致滤血膜破裂或者向内坍塌；因此，由表3结果看出，以滤芯+滤血膜的复合形式得到的滤过红细胞效果好，且滤液不见红，本发明设计将滤血膜与其滤芯复合在一起的滤血装置见附图4，底座可装载滤芯，在滤芯上覆盖的一层偏透明色的滤血膜，滤芯和滤血膜之间有流动性较好的浓缩胶水，滤芯和滤血膜胶贴后通过钢刀配件裁剪至一个个的复合滤血装置，发现复合后能良好的过滤红细胞并且容易填装至试剂卡的滤血孔中，该设计解决了生产上费时费力填装单层较软滤血膜的问题，并且可以通过合理的工装直接便于生产自动化。
(2)滤血效果检测
取不含红细胞的CRP样品，向其添加红细胞，混合成含有40％红细胞压积比的混合液，将不含红细胞样品和含有红细胞均通过上述滤芯+滤血膜的复合滤血装置，对比不含红细胞样品和含有红细胞样品的测试结果，见表4；
表4：过滤装置的滤过红细胞效果
含有红细胞样品采用当前试剂卡过滤装置过滤后的光值相比不含红细胞样品平均偏低15％左右，并且对检测样品的梯度影响不大，因此，本发明采用该种方式进行红细胞过滤。
实施例3冻干小球体积对试剂盒检测结果的影响
本实施例将分别含有微球和生物素标记的工作液浓缩成10μL、12.5μL、15μL、15μL、30μL的工作液，进一步冷冻干燥形成冻干小球，分别对不同体积的冻干小球样品进行性能测定，测定结果见表5；
表5：冻干小球体积对检测结果的影响
冻干小球的体积根据浓缩的程度决定，原工作液为50μL/份，若要做成10μL的小球则需要将原来50μL/份的试剂成分浓缩5倍进行制备，相应的25μL需要浓缩2倍，浓缩的倍数越大，制备成小球后稀释回原来的工作浓度的误差就越大，而本发明的冻干工艺制备出的10-30μL的冻干小球均可满足与样品和进样稀释液最终的检测光值偏差在±10％以内，并且CV保持在6％以内。
实施例4保护剂对冻干小球的影响
本实施例制备10μL的含有不同保护剂的工作液，进一步制备成冻干小球，小球的检测结果如表6所示；
表6：保护剂对冻干小球形态的影响
由表6结果所示，针对目前研究的工艺，发现并不需要加多余的保护剂即可做成形态较优不掉碎屑的小球，且发现45℃7天可保持小球良好的稳定性，另外，添加5％蔗糖也可得到较好的冻干小球。
实施例5缓冲液中NaCl质量浓度对冻干共晶点的影响
本实施例对缓冲液中的NaCl质量浓度进行考察，其中NaCl质量浓度分别为0％、0.9％、4.5％时，测得的共晶点见表7；
表7：NaCl质量浓度对共晶点的影响
由表7结果看出缓冲液中NaCl质量浓度对共晶点的影响是很大的，当缓冲液中NaCl质量浓度较低时，共晶点较高，冻干时间缩短。
实施例6分拣环境对冻干小球的影响
本实施例对分拣环境参数进行考察，分别在湿度>30％、温度>25℃下分拣30min，湿度≤30％、温度≤25℃下分拣8h，得到的冻干小球形态以及复溶难以程度见表8；
表8：分拣环境对冻干小球的影响
由表8结果看出分拣环境对小球的影响较大，在湿度>30％、温度>25℃下30min小球已经吸水，复溶困难，应严格控制分拣小球的环境，否则将导致检测样本的结果差异太大。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种试剂检测卡，其特征在于，所述试剂检测卡包括反应部和滤血部；所述滤血部下端和反应部的中间部位通过通道连接；所述滤血部有复合滤血装置，所述复合滤血装置包括滤血膜、滤芯。
2.根据权利要求1所述的试剂检测卡，其特征在于，所述滤血膜孔径为1-2μm，滤芯为孔径2-10μm，直径4.5-4.7mm，厚度2-3mm的聚乙烯烧结滤芯；所述复合滤血装置中滤芯和滤血膜的位置可以互换。
3.一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由权利要求1所述的试剂检测卡、冻干小球以及进样稀释液组成，所述进样稀释液由生理盐水和防腐剂组成。
4.根据权利要求3所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备标记物试剂：分别将包被有抗体或抗原的受体微球、生物素标记抗体或抗原、包被有亲和素的供体微球与缓冲液混合制备工作浓度；
2)冻干：采用滴珠机将步骤1)中的三种标记物试剂经滴珠机呈小液滴滴落，滴落的液滴经液氮冷冻后呈小球状，将液氮冷冻小球直接转至含有液氮的铝制盘中并进一步转移至冻干机进行冷冻干燥；
3)分拣：将三种冻干小球分别取1颗分装至试剂检测卡中，分装结束对试剂检测卡进行封口，并将试剂检测卡放入装有干燥剂的密封袋密封。
5.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的缓冲液为含有氯化钠、Tween20、牛血清白蛋白、色素、Proclin-300和去离子水的PB、MES或TRIS体系中的一种或其组合，所述体系中氯化钠质量浓度为0-0.9wt％。
6.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述的步骤2)中的小球体积为10-30μL，优选为10-15μL。
7.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中预冷过的铝制盘温度为-40～-50℃。
8.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述冻干小球的颜色为红色、橙色、黄色，所述色素添加分别为苯酚红、苯酚红钠盐、日落黄或柠檬黄。
9.根据权利要求4所述的一种可滤血色素冻干球均相发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述分拣环境为：温度在25℃以下，湿度在30％以下，时间为0～8h。
10.根据权利要求4所述方法制备的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
将冻干小球装载至试剂检测卡的反应检测孔中，样品测试时，去掉试剂卡上方的医用易撕膜，加入适量进样稀释液至试剂检测卡的滤血部中，然后加入样品，将试剂检测卡放入仪器，仪器对反应检测孔抽负压，样品及进样稀释液随压力经过复合滤血装置从通道进入至反应检测孔，进入检测孔的液体复溶3种冻干小球，仪器对试剂卡进行震动数秒，进行一步法孵育，孵育结束后，读取光子信号，根据标准曲线计算待测样品浓度，直接得到样品的定量检测结果。
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