KR20050044384A - Ｅ형 간염 바이러스 단클론 항체 또는 그의 결합 단편, 및이들의 용도 - Google Patents

Ｅ형 간염 바이러스 단클론 항체 또는 그의 결합 단편, 및이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 서열(서열식별번호 1)을 함유하는 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 또는 그의 보존 변체 또는 활성 단편, 또는 본 발명의 상기 단클론 항체와 교차 반응할 수 있는 ORF2에 대한 다른 단클론 항체, 및 그의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열; E형 간염 바이러스 ORF2에서 항원 결정기; E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기 1) 또는 3)과 동일한 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 선별 방법; 상기 방법에 의해 선별된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체, 및 그의 뉴클레오티드 서열 또는 변성 서열; E형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단 및/또는 예방용 약제의 제조에서 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 용도; E형 간염 바이러스 감염 진단용 키트 및 E형 간염 바이러스 감염 예방용 백신 조성물; E형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에서 상기 단클론 항체 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변체의 용도; E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물 및 E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법; 본 발명의 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되고 상기 단클론 항체, 그의 보존 변체 또는 활성 단편 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다.

Description

Ｅ형 간염 바이러스 단클론 항체 또는 그의 결합 단편, 및 이들의 용도{HEPATITIS E VIRUS MONOCLONAL ANTIBODIES OR THE BINDING FRAGMENTS OF IT AND THE USE THEREOF}
본 발명은 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 서열(서열식별번호 1)을 함유하는 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 또는 그의 보존 변체 또는 활성 단편, 또는 본 발명의 상기 단클론 항체와 교차 반응할 수 있는 ORF2에 대한 다른 단클론 항체, 및 그의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열; E형 간염 바이러스 ORF2에서 항원 결정기; E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기 1) 또는 3)과 동일한 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 선별 방법; 상기 방법에 의해 선별된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체, 및 그의 뉴클레오티드 서열 또는 변성 서열; E형 간염 바이러스의 감염에 대한 진단 및/또는 예방용 약제의 제조에서 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 용도; E형 간염 바이러스 감염 진단용 키트 및 E형 간염 바이러스 감염 예방용 백신 조성물; E형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에서 상기 단클론 항체 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변체의 용도; E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물 및 E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법; 본 발명의 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환되고 본 발명의 단클론 항체, 그의 보존 변체 또는 활성 단편 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 관한 것이다.
E형 간염 바이러스(HEV)는 1983년에 장에서 전염된 비-A형, 비-B형 간염의 병원체로서 처음으로 동정되었다(Balayan et al., 1983. Intervirology 20:23). E형 간염은 주로 아시아, 아프리카 및 중앙 아메리카에 있는 개발 도상국 특유의 풍토병이다. 선진국에서 E형 간염 사례는 대부분 이주자나 해외 여행객들에서 발견되었다. 산발적 및 유행성 사례 모두가 보고되었다. 1950년대에서 1990년대 사이의 기간 동안 수 차례의 E형 간염 격증이 오염된 식수로 인해 발생하였다(Visvanathan, 1957, Indian J. Med. Res.(Suppl.). 45:1-30; Wong et al., 1980 Lancet., 2:882-885; Myint et al., 1985, Am J Trop Med Hyg., 34:1183-1189; Belabbes et al., 1985 J Med Virol., 16:257-263; Hau et al., 1999, Am J Trop Med Hyg., 60:277-280). 대부분의 E형 간염 감염은 자기-제한적이며 좀처럼 만성 질병으로 발전하지 않았으나; 임신한 여성의 경우 그 추이는 사망률이 17% 이상에 달하게 심각하였다(Tsega et al., 1992, Clin. Infec Dis., 14:961-965; Dilawari et al., 1994, Indian J Gastroenterol., 13:44-48; Hussaini et al., 1997, J Viral Hepat., 4:51-54).
1991년에, 연구자들은 최초로 HEV에 대한 완전한 게놈 서열을 얻었으며, HEV가 단일 가닥의 외피가 없는 양성 RNA 바이러스임을 발견하였다(Tam et al., 1991, Virology 185:120-131). 서열 분석은 상기 게놈이 3 개의 개방 판독 프레임을 갖는 약 7.2 kb 길이임을 보였다. 5' 단부에 위치한 ORF1은 상기 바이러스의 비 구조 단백질을 암호화하고, 3' 단부에 위치한 ORF2는 상기 바이러스의 주요 구조 단백질을 암호화한다. ORF3의 5' 단부에 ORF1 3'과 겹치는 하나의 염기가 존재한다. OFR3의 3' 단부에는 OFR2와 겹치는 339 개 염기가 존재한다. ORF3은 기능이 알려지지 않은 또 다른 구조 단백질을 암호화하는 것으로 인정되었다(Tam et al., 1991, Virology, 185:120-131; Aye et al., 1992, Nucleic Acids Res., 20:3512; Aye et al., 1993, Virus Genes., 7:95-109; Huang et al., 1992, Virology, 191:550-558; Reyes et al., 1993, Arch Virol Suppl., 7:15-25).
5147번 염기에서 시작하는 HEV ORF2는 1980 뉴클레오티드를 가지며, 바이러스의 캡시드를 구성하는 주요 구조 단백질인 것으로 추정되는 660 개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다. ORF2 단백질의 N 말단에, 전형적인 신호 펩타이드 서열이 존재하며 이어서 아르기닌 풍부 영역이 존재하고, 이는 고도로 양으로 하전된 영역이며, 바이러스 회합 과정 동안 게놈 RNA 캡시드화에 관여하는 것으로 여겨진다. 번역 과정 동안, ORF2는 신호 펩타이드 인식 단백질(SRP)의 기전에 의해 소포체(ER)에 들어가서 글리코실화되며 ER에 축적되고, 이어서 추정 상 원 위치에서 캡시드의 캡소미어를 형성한다. ORF2 상의 3 개의 N-글리코실화된 부위인 Asn-137, Asn-310 및 Asn-562는 상이한 바이러스 균주들 중에서 매우 보존적이며, Asn-310이 주요 글리코실화된 부위이다. ORF2-형질감염된 포유동물 세포 COS 및 인간 간암 세포 Huh-7 및 HepG2는 이 때문에 세포질과 막 모두에서 발견될 수 있는 88kD 당단백질을 발현할 수 있다. 상기 글리코실화된 부위들에서의 돌연변이는 PORF2의 세포막으로의 배치에 영향을 미치지 않았다. 그러나 상기 신호 펩타이드 서열이 상기로부터 제거된 후에는 PORF2를 오직 세포질에서만 발견할 수 있다. 이는 세포 막으로의 단백질의 배치에 글리코실화 대신에 PORF2의 이동이 필요함을 함축하였다. HBV에서 MS 단백질과 마찬가지로, PORF2는 추정 상 골지체를 통해서가 아닌 ER을 통해서 직접 세포막으로 분비된다. 형질감염된 세포의 표면 상에서, gpORF2는 랜덤하게 분포되는 것이 아니라, 일부 대역에 집중되며 이는 단백질 서브유닛들의 능동 결합 과정을 의미하며, 상기 서브유닛들은 어느 정도 보다 정렬된 진보된 형태로 모일 수 있다. 상기 바이러스의 최종적인 회합/성숙은 게놈 RNA의 캡시드화를 필요로 하며, 따라서 ER의 세포질 외부 또는 세포막의 내벽에서 일어나야 한다. 세포막 상의 gpORF2의 축적은 바이러스의 회합을 의미할 수 있다. 동시에, 세포막 상의 캡시드 단백질의 국소화는 또한 발아를 통한 세포로부터의 성숙 바이러스의 분비 가능성을 의미하였다.
미국 특허 제 5,885,768 호에서 라이스(Reyes) 등은 4 마리의 키노몰구스 원숭이에게 0 일 및 30 일째에 HEV 미얀마 균주 ORF2 C 말단 2/3(aa225∼660)을 포함하는 이 콜라이에서 발현된 재조합 단백질 trpE-C2를 50 ㎍/용량의 양으로 주입하였으며, 이때 상기 단백질을 알룸 보강제와 배합함을 처음으로 보고하였다. 대조군으로서 2 마리의 원숭이에게는 오직 보강제만을 주입하였다. 4 주 후에 수거된 혈액에서 웨스턴 블럿팅에 의해 어떠한 항체도 검출되지 않았다. 이들 중 2 마리의 원숭이에게 동물 당 80 ㎍의 비 분해성 재조합 단백질을 보강제 없이 투여함으로써 3 차 면역시켰다. 4 주 후에, 상기 두 원숭이 모두 양성이었다(WB). 이어서 6 마리의 원숭이를 2 그룹으로 나누었으며, 이들 각 그룹은 3 마리의 원숭이, 즉 3 차 면역된 것, 2 차 면역된 것, 및 대조군을 포함하였다. 첫 번째 그룹을 미얀마 HEV로 공격하였으며, 두 번째 그룹은 멕시코 HEV로 공격하였다. 결과는 (1) ALT가 면역된 그룹에서는 항상 정상이었으나 대조군에서는 면역전보다 6 내지 10 배 더 높게 증가하였고; (2) 간 생검 샘플을 면역 형광법에 의해 검출 시, 3 회 용량으로 면역시키고 미얀마 균주로 공격한 것을 제외한 다른 모든 원숭이들에서 항원이 검출되었으며; (3) 배설물에서 바이러스 분비가, 3 회 용량으로 면역시키고 미얀마 균주로 공격한 것을 제외한 다른 모든 원숭이들에서 발견되었다. 상기 연구 샘플은 작았지만, 이는 ORF2의 재조합 단백질이 바이러스 간염의 생화학 지수의 발생을 차단할 수 있었으며 원숭이들을 야생형 HEV로 공격한 경우 일부 원숭이를 감염으로부터 완전히 보호할 수 있었음을 내포한다.
호주의 앤더슨 그룹(Anderson et al., 1999. J. Virol. Methods, 81:131-142; Li et al., 1994, J Clin Microbio. 32:2060-2066; Li et al., 1997 J. Med. Virol., 52:289-300; Li et al., 2000, J. Med. Virol., 60:379-386)은 이 콜라이에서 발현된 ORF2 aa394∼660(ORF2.1)을 사용하였다. 상기 발현 산물은 매우 형태-의존적인 회복 에피토프를 형성할 수 있는 GST 또는 폴리-His를 갖는 융합 단백질이었다. 상기 에피토프는 고 비율의 회복 혈청을 검출할 수 있으나, 상기 단편이 N-말단을 향해 연장되거나 절단된 경우 사라진다. 마우스를 재조합 ORF2.1 단백질로 면역시킨 후 30 주 째의 혈청을 사용하여 피막 항원으로서 바큘로바이러스에서 발현된 VLP를 갖는 회복기 환자의 혈청을 차단하였다. 상기 차단율은 81% 내지 86%에 달하였다. 다른 데이터는 ORF2.1이 VLP와 유사하기보다는 오히려 주요 에피토프 구조를 가짐을 보였다. 상기 에피토프에 대한 항체는 HEV 감염된 개인의 혈청에서 오랫동안 존재할 수 있다. 상기는 추정 상 중요한 보호 에피토프이며, ORF2.1에 대한 항체는 가치가 있을 것이다.
HEV 단클론 항체의 제조 및 적용 과정 중의 다수의 문제점들을 극복하기 위해서, E형 간염 바이러스 ORF2(중국 특허 제 CN00130634.0 호 참조) 내에 탁월한 항원성을 갖는 일련의 폴리펩타이드 단편들을 수득하는 것을 기본으로 본 발명자들은 하이브리도마 기술에 의해 항원으로서 NE2 단편을 갖는 단클론 항체를 제조하였으며 E형 간염 바이러스 ORF2에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 분비할 수 있는 세포주 및 상기 세포주에 의해 생산된 단클론 항체를 수득하였다.
발명의 요약
본 발명은 하나의 태양에서 E형 간염 바이러스(HEV) ORF2의 폴리펩타이드(들)(서열식별번호 1로 나타내는 아미노산 서열)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 또는 그의 보존 변체 또는 활성 단편에 관한 것으로, 이때 상기 보존된 아미노산 잔기들 중 하나 이상은 본 발명의 상기 단클론 항체의 아미노산 서열에 비해 상기 서열이 치환되거나, 첨가되거나 결실되었으며 HEV에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다. 본 발명은 또한 상기 단클론 항체와 교차 반응할 수 있는 ORF2에 대한 다른 단클론 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 태양에서 본 발명의 단클론 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기에 관한 것이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 본 발명의 E형 간염 바이러스 ORF2의 상기 항원 결정기 중 하나 이상 또는 이들의 임의의 조합을 포함하거나, 또는 본 발명의 상기 항원 결정기 중 하나 이상과 높은 서열 상동성을 갖는 단편들을 포함하는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드에 관한 것이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 상기 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 본 발명의 E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기 1) 또는 3)과 동등한 본 발명의 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 상기 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 선별 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 방법에 의해 선별된 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스의 감염을 진단 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스 감염의 진단, 특히 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG 또는 IgM 또는 전체 항체의 검출을 위한 진단 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 진단 유효량의 상기 E형 간염 바이러스의 항원결정기, 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 동족체 중 하나 이상, 및 상기 항원과 항체의 상호작용을 검출하는데 적합한 검출제를 포함한다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스 감염의 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 면역 유효량의 상기 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 동족체 중 하나 이상 또는 이들의 조합, 및 적합한 면역보강제를 포함한다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에서 상기 단클론 항체 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스 감염의 진단, 특히 샘플 중의 E 형 간염 바이러스 항원의 검출을 위한 진단 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 진단 유효량의 본 발명의 상기 단클론 항체 및 그의 활성 단편 및 보존 변체 중 하나 이상, 및 상기 항원과 항체의 상호작용을 검출하는데 적합한 검출제를 포함한다.
본 발명은 또한 E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 치료 유효량의 본 발명의 상기 단클론 항체 및 그의 활성 단편 및 보존 변체, 및 약학적으로 허용 가능한 비히클 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명은 또한 대상자에게 예방 및/또는 치료 유효량의 본 발명의 상기 단클론 항체 및 그의 활성 유도체 및 보존 변체 중 하나 이상을 투여함을 포함하는, E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 뉴클레오티드 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것으로, 상기 벡터는 본 발명의 상기 단클론 항체, 그의 보존 변체 또는 활성 단편, 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 발현할 수 있다.
본 발명은 또한 샘플에서 E형 간염 바이러스의 항원 및/또는 E형 간염 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
도 1은 HEV ORF2상의 항원 NE2의 정제된 재조합 산물의 SDS-PAGE 전기영동을 나타낸다. 레인 1은 분자량 마커이고; 레인 2는 세균 용해물이고; 레인 3은 2 밀리몰/L 우레아 세척물의 상등액이고; 레인 4는 4 밀리몰/L 우레아 세척물의 상등액이고; 레인 5는 8 밀리몰/L 우레아 세척물의 상등액이고; 레인 6은 PBS에 의해 투석된 4 밀리몰/L 우레아 세척물의 상등액이고; 레인 7은 HPLC에 의해 정제된 재조합 단백질(비등되지 않은)이고; 레인 8은 HPLC 정제된 단백질(비등된)이다.
도 2는 재조합 단백질 NE2의 MALDI-TOF 프로파일을 나타낸다.
도 3은 비등 및 비등되지 않은 재조합 단백질 NE2의 상이한 단클론 항체들에 의한 웨스턴 블럿팅을 나타낸다. 레인 1,2는 SDS-PAGE 결과이고; 레인 3 내지 20은 웨스턴 블럿팅 결과이며, 이때 홀수 레인은 비등되지 않은 NE2 단백질이고, 짝수 레인은 상응하는 비등된 NE2 단백질이다. 레인 3,4는 단클론 항체 1F6이고; 레인 5,6은 단클론 항체 2C9이고; 레인 7,8은 단클론 항체 7E8이고; 레인 9,10은 단클론 항체 8C11이고; 레인 11,12는 단클론 항체 8H3이고; 레인 13,14는 단클론 항체 13D8이고; 레인 15,16은 단클론 항체 15B2이고; 레인 17,18은 단클론 항체 16D7이고; 레인 19,20은 대조군으로서 단클론 항체이다.
도 4는 단클론 항체 또는 그의 Fab 단편의 NE2 칩과의 결합 및 분리 과정을 나타낸다.
도 5는 단클론 항체 8C11 및 그의 Fab 단편에 의한 8H3 또는 그의 Fab 단편의 강화된 효과를 나타낸다. A는 단클론 항체 8C11에 의한 8H3 또는 8H3 Fab 단편의 강화된 효과이고; B는 8C11 Fab 단편에 의한 8H3 또는 8H3 Fab 단편의 강화된 효과이다.
도 6은 배설물 중의 HEV의 단클론 항체에 의한 포획 RT-PCR 결과를 나타낸다. 레인 1은 분자량 마커이고; 레인 2는 단클론 항체가 없는 대조군이고; 레인 3은 단클론 항체 1F6이고; 레인 4는 단클론 항체 7E8이고; 레인 5는 단클론 항체 8C11이고; 레인 6은 단클론 항체 15B2이고; 레인 7은 단클론 항체 8H3이고; 레인 8은 단클론 항체 16D7이고; 레인 9는 단클론 항체 2C9이고; 레인 10은 단클론 항체 13D8이고; 레인 11은 대조군으로서 항-HBsAg 단클론 항체이고; 레인 12는 토끼 항-NE2 다클론 항체이다.
도 7은 단클론 항체 8C11에 의한 단클론 항체 8H3의 HEV에 대한 강화된 포획 활성을 나타낸다. A1 내지 A4는 8C11에 의해 피복되고; A6 내지 A12는 외피가 없으며; B1 내지 B12는 8H3에 의해 피복되고; C1 내지 C2는 8H3에 의해 피복되고; C4 내지 C7은 2C9에 의해 피복되고; C9는 RNA 추출의 음성 대조군이고; C11은 2 라운드 PCR의 음성 대조군이고; A1 내지 A2는 직접 첨가된 배설물 현탁액의 결과이다. A3 내지 A4는 1:100으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물 현탁액이고; A6은 직접 첨가된 배설물 현탁액이고; A7 내지 A11은 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 및 1:100000으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물 현탁액의 결과이고; A12는 1:100으로 단클론 항체 13D8과 함께 배양된 배설물 현탁액의 결과이고; B1 및 B2는 직접 첨가된 배설물이고; B3,B4는 1:10으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이고; B5,B6은 1:100으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이고; B7,B8은 1:1000으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이고; B9,B10은 1:10000으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이고; B11,B12는 1:100000으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이고; C1,C2는 1:100으로 단클론 항체 13D8과 함께 배양된 배설물이고; C4,C5는 직접 첨가된 배설물이고; C6,C7은 1:100으로 단클론 항체 8C11과 함께 배양된 배설물이다.
도 8은 급성 HEV 감염 환자의 혈청에 의한 8 종류의 항-NE2 단클론 항체의 차단 효과를 나타낸다.
도 9는 8C11, 8H3 및 이들의 Fab 단편에 의한 회복기의 3 개의 HEV 감염 혈청에 대한 차단 효과이다.
도 10은 20 개 아미노산의 성질을 나타낸다.
도 11은 상이한 단클론 항체에 의한 601 시리즈의 돌연변이 단백질에 대한 웨스턴 블럿팅을 나타낸다. A,B는 각각 단클론 항체 16D7, 13D8에 의한 결과이고: 레인 1은 재조합 단백질 600VE이고, 레인 2는 재조합 단백질 602LE이고, 레인 3은 재조합 단백질 599AE이고, 레인 4는 재조합 단백질 598VE이고, 레인 5는 재조합 단백질 597AE이고, 레인 6은 재조합 단백질 601LD이고, 레인 7은 재조합 단백질 601LK이고, 레인 8은 601LH이고, 레인 9는 재조합 단백질 601LD이다. C,D는 각각 단클론 항체 8C11, 8H3에 의한 결과이고: 레인 1은 재조합 단백질 NE2이고, 레인 2는 재조합 단백질 600VE이고, 레인 3은 재조합 단백질 602LE이고, 레인 4는 재조합 단백질 599AE이고, 레인 5는 재조합 단백질 598VE이고, 레인 6은 재조합 단백질 597AE이고, 레인 7은 재조합 단백질 601LQ이고, 레인 8은 재조합 단백질 601LK이고, 레인 9는 601LH이고, 레인 10은 재조합 단백질 601LD이다. E는 AA601 돌연변이 단백질의 SDS-PAGE 결과이고, 레인 1은 NE2, 레인 2는 601LP, 레인 3은 601LI, 레인 4는 601LG, 레인 5는 601LE, 레인 6은 601LD, 레인 7은 601LK, 레인 8은 601LN이고, 레인 9는 601LH이다.
도 12는 재조합 폴리펩타이드 239의 투과형 전자 현미경검사를 나타낸다.
도 13은 재조합 폴리펩타이드 239의 원자력 현미경검사를 나타낸다.
도 14는 재조합 폴리펩타이드 239의 동력학적 광산란 결과를 나타낸다.
도 15는 급성 HEV 감염 환자의 혈청에 의한 재조합 폴리펩타이드 239의 웨스턴 블럿팅을 나타낸다. 레인 1 내지 7은 비등되지 않은 폴리펩타이드 239를, 레인 8 내지 14는 비등된 폴리펩타이드 239를 나타낸다. 레인 1 및 8은 SDS-PAGE의 결과이고, 레인 2/9, 레인 3/10, 레인 4/11, 레인 5/12, 레인 6/13은 급성 HEV 감염 단계 환자로부터의 5 개의 혈청이며, 레인 7/14는 정상 혈청이다.
도 16은 원숭이 HEV 감염의 다양한 변수들에 대한 동력학적 과정이다.
도 17은 150 건의 임상적인 급성 간염 감염 사례 혈청에 대한 항원으로서 NE2에 대한 항-HEV-IgM 포획 시약의 OD 진동수 분포를 나타낸다.
도 18은 200 건의 임상적인 급성 간염 감염 사례 혈청에서 E2-IgM과 E2-IgG OD 값간의 관계를 나타낸다.
도 19는 119 건의 비-HAV, 비-HCV 급성 간염 감염 사례 혈청에 대한 E2-IgM과 GL-IgM의 OD 값 진동수 분포를 나타낸다.
도 20은 항-HEV IgG를 사용하여 간접 ELISA 키트에 의해 검출된 정상 및 급성 간염 혈청에 대한 OD 값 진동수 분포를 나타낸다.
도 21은 항-HEV 단클론 항체 8C11 및 8H3에 의한 E2-IgM 양성 혈청의 차단을 나타낸다.
도 22는 항-HEV 단클론 항체 8C11, 8H3 또는 그의 Fab 단편에 의한 E2-IgG의 차단을 나타낸다.
도 23은 400 명의 혈액 기증자의 혈청에 대한 2 개의 항체 샌드위치 및 간접 ELISA에서 검출된 s/co 결과의 일관성을 나타낸다.
본 발명을 하기 도면 및 실시예를 사용하여 상세히 추가로 예시한다. 하기의 실시예들은 본 발명을 단지 개시하고자 할 뿐이다. 벡터, 숙주 세포, 시약 농도, 온도 및 다른 변체들의 선택은 단지 예시적인 것이며 어떠한 식으로도 본 발명의 보호 범위에 대한 제한으로서 해석해서는 안 된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 용어 또는 명칭들은 당해 분야에 통상적으로 사용되는 것들과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 및 면역학 과정은 당해 분야에 통상적으로 사용되는 통상적인 기법들이다.
항체는 디설파이드 가교에 의해 결합된 폴리펩타이드 쇄들의 집단을 포함한다. 중쇄 및 경쇄라 지칭되는 2 개의 폴리펩타이드 쇄는 항체의 주요 구조 모두를 구성한다(동형). 중쇄 및 경쇄는 모두 가변적인 영역과 일정한 영역의 일부 하위 영역들로 추가 구분될 수 있다. 각각의 중쇄는 단일 가변 영역과 3 개의 일정한 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 상기 중쇄의 가변 영역과 상이한 단일 가변 영역 및 상기 중쇄의 일정한 영역과 상이한 단일 일정 영역을 갖는다. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항체의 결합 특이성에 기여한다.
본 발명의 하나의 태양은 서열식별번호 1로 나타내는 E형 간염 바이러스 OFR2에 의해 암호화되는 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 하이브리도마 세포주 CCTCC-C200116에 의해 생산되는 E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 8C11이며, HEV 바이러스를 직접 포획할 수 있고, 중화의 보호 효과를 가지며, HEV 감염의 급성 단계과 회복 단계 혈청 모두에서 현저한 혈청 차단 효과를 갖는다. HEV 감염된 혈청은 HEV 항원에 대한 8C11의 결합을 차단할 수 있다. HEV 또는 동족체에 대한 8C11의 결합으로 인해 HEV 또는 동족체의 공간 구조가 변하고 HEV 대 HEV 또는 동족체에 대한 또 다른 단클론 항체 8H3의 결합이 현저하게 향상될 수 있다. HEV 재조합 폴리펩타이드 NE2에 대한 8C11의 친화도 상수는 약 2 x 10-8이며, 그의 Fab 단편의 친화성 상수는 약 6 x 10-7이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 하이브리도마 세포주 CCTCC-C200114에 의해 생산된 E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 13D8이며, 이는 HEV 바이러스를 직접 포획할 수 있고 중화의 보호 효과를 가지며 HEV 감염의 급성 단계 및 회복 단계 혈청 모두에서 현저한 혈청 차단 효과를 갖는다. HEV 감염된 혈청은 HEV 항원에 대한 13D8의 결합을 차단할 수 있다. 13D8의 HEV 항원과의 결합은 단클론 항체 8C11에 의해 차단될 수 있으며 HEV 항원과 단클론 항체 8C11의 결합을 차단할 수 있다. HEV 또는 동족체와 13D8의 결합은 HEV 대 HEV 또는 동족체에 대한 또 다른 단클론 항체 8H3의 결합을 현저하게 향상시킬 수 없다. HEV 재조합 폴리펩타이드 NE2에 대한 13D8의 친화도 상수는 약 2 x 10-8이며, 그의 Fab 단편의 친화성 상수는 약 3 x 10-7이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 하이브리도마 세포주 CCTCC-C200117에 의해 생산된 E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 8H3이며, 이는 HEV 바이러스를 직접 포획할 수 있다. 8H3과 단클론 항체 8C11과의 상승 작용은 8C11의 보호성 중화 효과를 현저하게 향상시킬 수 있으며 단클론 항체 8C11 만으로보다는 HEV 감염의 급성 단계 및 회복 단계 혈청 모두에서 현저한 혈청 차단 효과를 갖는다. HEV 감염된 혈청은 HEV 항원에 대한 8H3의 결합을 차단할 수 있다. HEV 또는 동족체에 대한 8C11의 결합으로 인해 HEV 또는 동족체에 대한 단클론 항체 8H3의 결합이 현저하게 향상될 수 있다. HEV 재조합 폴리펩타이드 NE2에 대한 8H3의 친화도 상수는 약 2 x 10-6이며, 그의 Fab 단편의 친화성 상수는 약 6 x 10-11이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체는 하이브리도마 세포주 CCTCC-C200115에 의해 생산된 E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 16D7이다. HEV 감염된 혈청은 HEV 항원에 대한 16D7의 결합을 차단할 수 있다. HEV 재조합 폴리펩타이드 NE2에 대한 16D7의 친화도 상수는 약 2 x 10-8이다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 상기 단클론 항체에 관한 것이며, 여기에서
1) 상기 단클론 항체 8C11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 12에 나타내고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 10에 나타내거나;
2) 상기 단클론 항체 13D8의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 8에 나타내고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 6에 나타내거나;
3) 상기 단클론 항체 8H3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 16에 나타내고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 14에 나타내거나; 또는
4) 상기 단클론 항체 16D7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 20에 나타내고; 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열식별번호 18에 나타낸다.
"중쇄 가변 영역"이란 용어는 길이가 110 내지 125 아미노산 잔기인 폴리펩타이드를 의미하며, 이의 아미노산 서열은 N 말단의 아미노산으로부터 시작하는 본 발명의 단클론 항체의 중쇄의 것에 상응한다. "경쇄 가변 영역"이란 용어는 길이가 95 내지 115 아미노산 잔기이고 그의 아미노산 서열이 N 말단의 아미노산으로부터 시작하는 본 발명의 단클론 항체의 경쇄의 것에 상응하는 폴리펩타이드를 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단클론 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역들 중 하나 이상 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, E형 간염 바이러스 ORF2 단백질에 특이적으로 결합하는 결합 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 "결합 조성물"이란 용어는 2 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 조성물을 의미하며, (1) 이들 쇄가 함께 효과적으로 결합 시 E형 간염 바이러스 ORF2에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대해 높은 결합 친화성을 갖는 형태를 제공할 것이며; (2) 본 발명의 상기 단클론 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 영역의 폴리펩타이드 쇄를 발현하는 유전학적으로 형질전환된 숙주 세포로부터 또는 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 수득될 수 있다.
"효과적으로 결합하는"이란 용어는 함께 결합 시 2 개의 폴리펩타이드 쇄가 다양한 방식으로, 예를 들어 비 제한적으로 천연 항체 단편 Fab 또는 Fv에서와 같은 결합에 의해 또는 유전 공학의 단일 쇄 항체(scFv)를 사용한 결합에 의해 서로 상대적으로 배치될 수 있음을 의미한다. 상기 2 개의 폴리펩타이드 쇄는 일반적으로 상기 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 상응한다.
본 발명에 사용된 Fab, Fc, F(ab)2 및 Fv의 용어는 이들 각각의 면역학적 의미를 갖는다(Klein, Immunology, John Wiley, New York, 1982; Parham, Chapter 14, in Weir, ed. Immunochemistry, 4th Ed., Blackwell Scientific Publishers, Oxford, 1986).
본 발명에서, 상기 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 당해 분야에 통상적으로 사용되는 방법, 예를 들어 파파인에 의한 절단에 의해 제조할 수 있다. 본 원에 첨부된 실시예들은 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8의 Fab를 제조하는 방법을 개시한다.
본 발명의 또 다른 태양은 본 발명의 상기 단클론 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
본 발명의 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호 12에 나타낸 단클론 항체 8C11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 11의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 서열식별번호 10에 나타낸 단클론 항체 8C11의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명의 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호 8에 나타낸 단클론 항체 13D8의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 서열식별번호 6에 나타낸 단클론 항체 13D8의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호 16에 나타낸 단클론 항체 8H3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 15의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 서열식별번호 14에 나타낸 단클론 항체 8H3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 13의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호 20에 나타낸 단클론 항체 16D7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 19의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 또는 서열식별번호 18에 나타낸 단클론 항체 16D7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 암호화하고 바람직하게는 서열 식별번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 상기 단클론 항체의 보존 변체 또는 활성 단편에 관한 것으로, 여기에서 상기 보존된 아미노산 잔기들 중 하나 이상은 본 발명의 단클론 항체의 아미노산 서열이 치환, 첨가 또는 결실되었으며 여전히 E형 간염 바이러스에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다.
본 발명에 사용된 "보존 변체"란 용어는 상기 변체가 부모의 성질, 예를 들어 기본적인 면역학적 성질, 구조적 성질, 조절 성질 또는 생화학적 성질을 실질적으로 보유함을 의미한다. 일반적으로, 상기 폴리펩타이드의 보존 변체의 아미노산 서열은 상기 보존 변체와 부모 폴리펩타이드가 전체적으로 밀접하게 유사하고 많은 영역에서 동일하도록 부모 폴리펩타이드와 제한적으로 상이하다. 상기 보존 변체와 부모 폴리펩타이드간의 아미노산 서열의 차이는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 첨가 및 결실, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 치환 또는 첨가된 아미노산 잔기는 유전자 코드에 의해 암호화될 수도, 또는 되지 않을 수도 있다. 상기 폴리펩타이드의 보존 변체는 자발적으로 또는 비자발적으로 생산된 변체일 수 있다. 상기 비자발적으로 생산된 폴리펩타이드의 보존 변체를 유도된 돌연변이 기법 또는 직접적인 합성에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 개시된 내용에 따라, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 상기 단클론 항체의 단편을 E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 유도체의 특이적인 결합 성질을 실질적으로 보존하도록 변경시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 상기 단클론 항체와 교차 반응성을 갖는 ORF2에 대한 다른 단클론 항체들을 고려한다. 본 원에 개시된 항원 결정기에 대한 상세한 정보에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 하이브리도마를 제조할 수 있으며 본 발명의 상기 단클론 항체의 것과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단클론 항체를 수득할 수 있다. 그러나, 이들 단클론 항체와 상기 본 발명의 항체 모두 상기 E형 간염 바이러스의 동일한 항원 결정기를 목표로 한다, 즉 이들은 교차 반응성의 면역 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 또한 개시된 항원 결정기를 근거로 제조되고 본 발명의 상기 단클론 항체와 교차 반응성을 갖는 단클론 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, HEV ORF2에 의해 암호화되는 하기 폴리펩타이드의 항원 결정기 1) 내지 4) 중에서 선택된 항원 결정기를 또한 제공한다:
1) 단클론 항체 8C11 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면 상에서 노출되며; 형태 의존적이고, 그의 정확한 형성 및 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되며; 단클론 항체 13D8에 의해 특이적으로 인식되는 항원 결정기와 부분적으로 겹치거나 이에 인접하며; 대략적으로 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 배치된 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖거나; 또는
2) 단클론 항체 13D8 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면 상에서 노출되며; 형태 의존적이고, 그의 정확한 형성 및 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되며; 단클론 항체 13D8에 의해 특이적으로 인식되는 항원 결정기와 부분적으로 겹치거나 이에 인접하며; 대략적으로 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 배치된 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖거나; 또는
3) 단클론 항체 8H3 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면 상에서 노출되며; 형태 의존적이고, 그의 정확한 형성 및 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되며; 충분한 노출 및 공간 구조의 안정성을 가지며 이에 의해 단클론 항체 8C11이 HEV에 결합 시 MAb 8H3과 결합하는 그의 능력이 현저하게 향상되고; 대략적으로 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 배치된 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖거나; 또는
4) 단클론 항체 16D7 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; 선형의 항원 결정기이며; 대략적으로 E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 499 내지 515 사이에 배치된다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 본 발명의 E형 간염 바이러스 ORF2의 상기 항원 결정기들 중 하나 이상 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는, 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체, 또는 상기 항원 결정기들 중 하나 이상과 높은 서열 상동성을 갖는 단편을 또한 제공한다.
본 발명에 사용된 "서열 상동성"이란 용어는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열들간의 상동성을 판단하고자 하는 것이다. 대개, 서열들은 최대의 조화를 위해 함께 정렬된다. "상동성"이란 용어는 당해 분야에 널리 공지된 동일한 의미를 가지며 개시된 기술에 의해 평가될 수 있다(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, 1998; BIOCOMPUTING: INFORMATIOCS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W., ed., Academy press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. & Griffin, H.G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academy press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov, M.&Devereux, J. ed., M Stockton Press, New York, 1991). 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 2 개의 폴리펩타이드의 상동성을 평가하는데 이용할 수 있는 방법이 다수 존재하지만, "상동성"이란 용어는 모든 관련 전문가들에 의해 널리 공지되어 있다(SIAM J. Applied Math. Cartllo, H., & Lipton, D., (1988) 48:1073 참조). 2 개 서열의 상동성 또는 유사성을 판단하는데 통상적인 방법으로는 비 제한적으로 문헌[Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academy Press, San Diego, 1994 및 SIAM J. Applied Math. Cartllo, H., &Lipton, D., (1988)48:1073]에 공개된 것이 있다. 이들 방법은 모두 일부 특정한 규칙에 따라 컴퓨터 프로그램에 수집되어 있다. 이들 가운데, 바람직한 방법으로는 비 제한적으로 GCG 프로그램(Devereux, J., etc, Nucleic Acids Research(1984)12(1):387), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F., etc, J. Molec. Biol.(1990)215:403)이 있다.
예를 들어, 기준 서열과 95% 이상 "상동성"을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드의 매 100 개 뉴클레오티드마다 5 개의 뉴클레오티드를 제외하고 다른 뉴클레오티드 서열은 기준 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 기준 서열과 95% 이상 상동성인 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하기 위해서 상기 기준 서열의 모든 뉴클레오티드의 5%를 결실시키거나 또는 다른 종류의 뉴클레오티드로 치환하거나; 또는 기준 서열의 모든 뉴클레오티드의 5% 이하의 일부 뉴클레오티드를 상기 기준 서열에 삽입하거나; 또는 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 기준 서열의 모든 뉴클레오티드의 5%까지 일어나게 할 수 있다. 기준 서열에 대한 이러한 돌연변이를 상기 기준 서열의 5' 또는 3' 말단, 또는 상기 두 말단 사이의 임의의 위치에 배치시키거나, 또는 개별적으로 흩어놓거나 또는 기준 서열에 하나 이상의 인접한 그룹들을 형성시킬 수 있다.
유사하게, 기준 서열과 95% 이상의 "상동성"을 갖는 폴리펩타이드 서열은 폴리펩타이드의 매 100 개 아미노산 잔기 마다 5 개의 아미노산 잔기를 제외하고 다른 아미노산 서열은 기준 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 기준 서열과 95% 이상 상동성인 폴리펩타이드 서열을 수득하기 위해서는 상기 기준 서열의 모든 아미노산 잔기의 5%를 결실시키거나 또는 다른 종류의 아미노산 잔기로 치환하거나; 또는 기준 서열의 모든 아미노산 잔기의 5% 이하의 일부 아미노산 잔기를 상기 기준 서열에 삽입하거나; 또는 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 기준 서열의 모든 아미노산 잔기의 5%까지 일어나게 할 수 있다. 기준 서열에 대한 이러한 돌연변이를 상기 기준 서열의 5' 또는 3' 말단, 또는 상기 두 말단 사이의 임의의 위치에 배치시키거나, 또는 개별적으로 흩어놓거나 또는 기준 서열에 하나 이상의 인접한 그룹들을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에서, 본 발명의 상기 항원 결정기 1) 및 3)을 포함하는, 바이러스형 입자를 형성할 수 있는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드는 모두 바이러스형 입자를 형성할 수 있으며, 이는 1) 서열식별번호: 22에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 208; 또는 2) 서열식별번호: 21에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 239; 또는 3) 서열식별번호: 23에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 243; 또는 4) 서열식별번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 251; 또는 5) 서열식별번호: 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 262; 또는 6) 서열식별번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 292이다.
본 발명의 또 다른 태양에서 상기 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 또한 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 1) 서열식별번호: 22에 나타낸 아미노산 서열; 또는 2) 서열식별번호: 21에 나타낸 아미노산 서열; 또는 3) 서열식별번호: 23에 나타낸 아미노산 서열; 또는 4) 서열식별번호: 24에 나타낸 아미노산 서열; 또는 5) 서열식별번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 암호화한다.
당해 분야의 전문가들은 바이러스형 입자(즉 HEV NE2 폴리펩타이드의 중합체)를 형성할 수 있는 상기 폴리펩타이드가 하나 이상의 보존 아미노산 치환, 첨가 및/또는 결실을 포함할 수 있으며 여전히 바이러스형 입자를 형성하는 성질 및 면역원성을 유지함을 이해할 것이다. 일반적인 방식으로, 중합체를 형성하는 폴리펩타이드의 능력을 변화시키지 않으면서, 상기 폴리펩타이드 중의 극성 아미노산 잔기들을 다른 종류의 극성 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있으며 비극성 아미노산 잔기는 다른 종류의 비극성 아미노산 잔기로 치환시킬 수 있다. 아미노산에 대한 특정한 치환 및 변경은 이후에 언급되는 실시예에서 논의될 것이다.
본 발명은 여전히 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 선별하는 방법을 제공한다. 상기 폴리펩타이드 또는 그의 동족체는 본 발명의 E형 간염 바이러스 ORF2의 상기 항원 결정기 1) 또는 3)과 동일한 본 발명의 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 특이적으로 결합하는 성질을 갖는다. 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
1) 항원과 항체의 상호작용에 적합한 조건 하에서 면역반응의 발생에 충분한 기간 동안 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3을 분석물과 접촉시키는 단계;
2) 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 반응하는 분석물의 존재를 검출하는 단계; 및
3) 상기 단클론 항체와 반응할 수 있는 생성된 분석물을 회수하는 단계.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 7-펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 상기 언급한 방법에 의해 선별되는 일부 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 또한 제공한다. 여기에서, 상기 폴리펩타이드를 선행 방법들을 사용하여 합성된 펩타이드 라이브러리로부터 선택할 수 있으며, 상기 선택된 폴리펩타이드는 선행 폴리펩타이드와 유사한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 당해 연구 분야의 전문가들은 상기 폴리펩타이드 동족체를 화합물 라이브러리로부터 선택할 수 있음을 알 것이다. 따라서 상기 선택된 폴리펩타이드 동족체는 일종의 비 펩타이드 화합물에 속할 수 있으며, 상기 화합물은 상기 단클론 항체와 결합하는 HEV ORF2 항원 결정기와 유사한 성질 또는 모방 성질을 갖는다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양에서, 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 뉴클레오티드 분자를 또한 제공한다. 당해 분야의 전문가들은 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 본 발명의 언급된 방법들을 사용하여 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 수득할 때 상기 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 아미노산 서열로부터 추론할 수 있음을 알 것이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, E형 간염 바이러스 감염의 진단 및/또는 예방용 약제의 제조에서 상기 폴리펩타이드 또는 그의 동족체의 용도를 또한 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 생물학적 샘플 중에서 E형 간염 바이러스 감염을 진단하기 위한 진단 키트를 또한 제공하며, 상기 키트는 진단 유효량의 본 발명에 따른 결합 활성을 갖는 상기 HEV 항원 결정기, 폴리펩타이드 및 그의 단편, 및 본 발명의 방법에 의해 선별된 폴리펩타이드 및 그의 동족체들 중 하나 이상, 및 항원과 항체의 상기 상호작용을 검출하는데 적합한 검출 시약을 포함한다.
특히, 본 발명은 생물학적 샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG의 검출을 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 키트는 진단 유효량의 상기 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상; 및 채택된 검출 방법에 상응하는 검출제를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 생물학적 샘플의 항-HEV IgG 항체를 본 발명의 NE2를 포함하는 진단 키트를 사용하여 ELISA 방법에 의해 검출한다.
본 발명은 또한 HEV에 대한 IgM 항체의 검출을 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 키트는 진단 유효량의 본 발명의 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상; 및 관련 방법에 적합한 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, HEV에 대한 IgM 항체를 μ-쇄 포획 ELISA 방법(E2-IgM)에 의해 검출하며, 여기에서 본 발명의 양고추냉이 페록시다제-표지된 항원 결정기 NE2를 포함하는 진단 키트를 사용한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, HEV에 대한 전체 항체들의 검출을 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 키트는 진단 유효량의 본 발명에 따른 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상; 및 관련 방법에 적합한 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, HEV에 대한 전체 항체들을 이중-항원 샌드위치된 ELISA 방법(E2-IgM)에 의해 검출하며, 여기에서 본 발명의 항원 결정기 NE2 및 양고추냉이 페록시다제-표지된 항원 결정기 NE2를 포함하는 진단 키트를 사용한다.
본 발명의 "진단 유효량"이란 용어는 생물학적 샘플 중에서 HEV의 검출에 유효한 양의 본 발명의 항원 결정기 또는 단편, 및 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체를 의미하고자 한다. 공지된 면역화학적 방법에 따라, 당해 분야의 전문가들은 상기 언급한 물질의 양이 사용되고 있는 상이한 면역화학적 방법들에 따라 변할 것임을 안다. 공개된 참고문헌들의 교시 하에서, 이들은 생물학적 샘플 중의 HEV를 진단하기 위해서 본 발명의 항원 결정기 또는 단편, 및 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 적합한 양을 어떻게 선택하는지를 안다. 또한 이들은 경우에 따라 진단 키트가 적합한 흡수성 담체, 완충 시약/용액, 시험을 위한 가시적 신호를 발생시키는데 사용되는 시약 및 사용자 안내서를 추가로 포함해야 할 것이다. 최적의 진단 유효량은 용량 당 1 ng 내지 10,000 ng, 바람직하게는 10 ng 내지 1,000 ng, 보다 바람직하게는 100 ng 내지 1,000 ng이다.
당해 분야의 숙련가들은 항원과 항체의 특정한 상호작용, 통상적으로 사용되는 면역학적 시험 방법 및 본 발명의 설명에 따라 선행 진단 키트에 적합한 면역학적 방법, 관련 시약, 및 완충 시스템을 구상할 능력이 있을 것이다.
일반적인 방식으로, 선행 진단 키트에 적합한 면역화학적 방법으로는 비 제한적으로 하기의 것들이 있다:
생물학적 샘플 중에서 HEV에 대한 전체 항체를 검출하는 방법으로, 본 발명의 항원 결정기, 바람직하게는 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3에 의해 인식되는 항원 결정기 모두를 함유하는 폴리펩타이드들 중 하나 이상을 고상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 적합한 완충액에 분석물을 가하는 단계; 검출가능한 표지를 수반하고 상기 항원 결정기, 바람직하게는 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3에 의해 인식되는 항원 결정기 모두를 함유하는 폴리펩타이드를 첨가하는 단계; 및 상기 수반된 검출 가능한 표지를 검출하여, 항-HEV 항체의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다.
생물학적 샘플 중에서 HEV에 대한 항체 IgG를 검출하는 방법으로, 본 발명의 항원 결정기를 포함하는 폴리펩타이드들 중 하나 이상, 바람직하게는 단클론 항체 8C11에 의해 인식되는 항원 결정기 및/또는 단클론 항체 8H3에 의해 인식되는 항원 결정기를 포함하는 폴리펩타이드를 고상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 적합한 완충액 중에 검출하려는 샘플을 가하는 단계; 검출하려는 샘플이 유래된 종들의 IgG 항체에 대한 검출 가능한 표지를 수반하는 2 차 항체를 가하는 단계; 및 상기 2 차 항체에 의해 수반되는 검출 가능한 표지를 검출하여, 이에 의해 상기 샘플 중의 항-HEV IgG 항체의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 검출 가능한 표지는 양고추 냉이 페록시다제 또는 알칼리성 포스파타제이다.
생물학적 샘플 중에서 HEV에 대한 항체 IgM을 검출하는 방법으로, 본 발명의 항원 결정기를 포함하는 폴리펩타이드들 중 하나 이상, 바람직하게는 단클론 항체 8C11에 의해 인식되는 항원 결정기 및/또는 단클론 항체 8H3에 의해 인식되는 항원 결정기를 포함하는 폴리펩타이드를 고상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 적합한 완충액 중에 검출하려는 샘플을 가하는 단계; 검출하려는 샘플이 유래된 종들의 IgM 항체에 대한 검출 가능한 표지를 수반하는 2 차 항체를 가하는 단계; 및 상기 2 차 항체에 의해 수반되는 검출 가능한 표지를 검출하여, 이에 의해 상기 샘플 중의 항-HEV IgM 항체의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 검출 가능한 표지는 양고추 냉이 페록시다제 또는 알칼리성 포스파타제이다.
생물학적 샘플 중에서 HEV에 대한 항체 IgM을 검출하는 방법으로, 검출하려는 샘플이 유래된 종들의 IgM 항체에 대한 2 차 항체를 고상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 적합한 완충액 중에 검출하려는 샘플을 가하는 단계; 본 발명의 항원 결정기를 포함하는 폴리펩타이드들 중 하나 이상, 바람직하게는 단클론 항체 8C11에 의해 인식되는 항원 결정기 및/또는 단클론 항체 8H3에 의해 인식되는 항원 결정기를 포함하고 검출 가능한 표지를 수반하는 폴리펩타이드를 가하는 단계; 상기 검출 가능한 표지를 수반하고 상기 폴리펩타이드를 인식하는 2 차 항체를 첨가하는 단계; 및 상기 수반된 검출 가능한 표지를 검출하여, 이에 의해 상기 샘플 중의 항-HEV IgM 항체의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함한다. 바람직하게는 상기 검출 가능한 표지는 양고추 냉이 페록시다제 또는 알칼리성 포스파타제이다.
여기에서, 적합한 2 차 항체를 선택하는 방법은 당해 분야의 전문가들에게 공지되어 있으며; 양고추 냉이 페록시다제 및 알칼리성 포스파타제 이외에, 항원과 항체의 상호작용을 검출하기 위한 검출 가능한 표지는 방사성 동위원소, 플루오레세인, 비오틴, 스트랩트아비딘, β-갈락토시다제 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 포유둥물에서 E형 간염 바이러스 감염의 에방을 위한 백신 조성물을 또한 제공하며, 상기 조성물은 면역 유효량의 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 동족체들 중 하나 이상 또는 임의의 이들의 조합, 및 적합한 보강제를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 언급된 백신은 면역 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 동족체들 중 하나 이상을 포함하며, 이들은 단클론 항체 8C11 및 8H3에 의해 인식 가능한 항원 결정기를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 포유동물에서 E형 간염 바이러스 감염의 예방을 위한 백신 조성물은 면역 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하고 본 발명의 단클론 항체들 중 하나 이상에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 백신은 면역학적으로 허용 가능한 비히클 및/또는 보강제를 임의로 포함할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기 보강제를 사용할지의 여부와 면역학에서 통상적으로 사용되는 보강제를 선택하는 방법을 알 것이다.
이용할 수 있는 면역학적 보강제로는 비 제한적으로 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄, 완전 프로인트 보강제, 불완전 프로인트 보강제 등이 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 바이러스형 입자로 회합되는 성질을 갖는 상기 폴리펩타이드 239를 알루미늄 보강제와 함께 또는 어떠한 보강제도 없이 백신을 제조하는데 사용한다. 상기 백신에 의한 면역은 마우스를 HEV에 의한 감염으로부터 효과적으로 예방할 수 있다. 본 발명의 "면역 유효량"이란 용어는 백신화된 개체에서 유효한 보호성 면역 반응을 유도하기에 충분한 백신의 양을 지칭한다. 백신의 면역 유효량은 상이한 백신화 방식, 용량 유형 및 백신화된 개체에 따라 변할 수 있다. 당해 분야의 일반적인 지식에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 과도한 실험 없이 적합한 백신의 양을 결정하는 방법을 안다. 바람직하게는 상기 면역 유효량은 용량 당 0.0001 내지 0.1 ㎎, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.06 ㎎, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 0.04 ㎎이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, E형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에서 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변체의 용도를 또한 제공한다.
HEV 입자를 단클론 항체 8C11, 13D8 또는 8H3을 사용하여 검출할 수 있는데, 그 이유는 이들 단클론 항체가 HEV의 표면 상에 위치한 항원 결정기를 인식하기 때문이다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, HEV 입자를 검출하는 방법을 제공하며, 이때 상기 방법은 상기 언급한 단클론 항체들 중 하나 이상을 고체 상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 이를 HEV를 함유할 수도 있는 검출하려는 샘플과 접촉시키는 단계; 검출 가능한 표지를 수반하는 HEV에 대한 항체를 첨가하는 단계; 및 상기 지지체의 표면 상에 고정화된 단클론 항체/HEV의 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 항-HEV 항체를 고체 상 지지체의 표면 상에 고정화시키는 단계; 이를 HEV를 함유할 수도 있는 검출하려는 샘플과 접촉시키는 단계; 검출 가능한 표지를 수반하는 상기 단클론 항체를 첨가하는 단계; 및 상기 지지체의 표면 상에 고정화된 단클론 항체/HEV의 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, HEV 입자를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 단클론 항체를 항-HEV 다클론 항체를 수반하는 검출 가능한 표지(콜로이드성 금 입자, 유화액 입자 등), 또는 검출 가능한 표지를 수반하는 상기 단클론 항체와 혼합하는 단계; 이를 HEV를 함유할 수도 있는 검출하려는 샘플과 접촉시키는 단계; 및 면역 크로마토그래피 도중 면역크로마토그래피 수지 상에 고정화된 항-마우스 항체에 항체/HEV의 복합체를 결합시킴으로써 신호를 검출하는 단계를 포함하는, HEV 입자를 검출하는 방법을 제공한다.
유사하게, 상기 단클론 항체 8C11, 13D8 및 8H3은 HEV의 표면상에 배치된 항원 결정기를 인식하기 때문에, 이들의 항원 결합 영역(항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역)을 근거로 개발된 이들 단클론 항체 및 다양한 유도체 항체를 E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 수동적인 면역화 치료에 적용시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 태양에서, 특히 HEV의 감염을 진단하기 위한, 즉 HEV 항원을 검출하기 위한 진단 키트를 제공하며, 상기 키트는 진단 유효량의 본 발명의 단클론 항체, 그의 활성 단편 및 보존 변체들 중 하나 이상, 또는 임의의 이들의 조합, 및 항원과 항체의 상호작용에 적합한 검출 시약을 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, HEV 항원의 검출에 이중 항체 샌드위치된 ELISA를 사용하며, 여기에서 진단 키트는 본 발명의 단클론 항체를 포함하고, 양고추 냉이 페록시다제-표지된 단클론 항체 8C11이 사용된다.
본 발명의 "진단 유효량"이란 용어는 생물학적 샘플 중의 HEV의 존재를 효과적으로 검출하는데 충분한 본 발명의 단클론 항체의 양을 지칭한다. 공지된 면역화학적 방법에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 상기 언급한 물질의 양이 사용되는 상이한 면역화학적 방법들에 따라 변할 것임을 안다. 공개된 참고문헌들의 교시에 따라, 이들은 생물학적 샘플 중의 HEV를 진단하기 위해 본 발명의 단클론 항체의 적합한 양을 어떻게 선택할지를 안다. 또한 이들은 경우에 따라 진단 키트가 적합한 담체, 완충 시약/용액, 생성된 임의의 신호를 검출하는데 사용되는 시약 및 사용자 안내서를 포함할 수도 있음을 안다. 바람직하게는, 상기 진단 유효량은 용량 당 1 ng 내지 10,000 ng, 바람직하게는 10 ng 내지 1,000 ng, 보다 바람직하게는 100 ng 내지 1,000 ng이다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 생물학적 샘플에서 HEV 항원 및/또는 항-HEV 항체의 존재를 검출하기 위한 방법을 또한 제공하며, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) HEV 및 2 차 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 1 차 항체를 제공하는 단계(이때 상기 1 차 항체 및 2 차 항체 중 하나 이상은 청구항 제 1 항에 따른 단클론 항체 또는 그의 이용 가능한 단편이다);
b) 상기 2 차 항체에 결합할 수 있는 신호 발생자(이때 발생된 신호의 강도는 오직 2 차 항체의 양과 관련된다); 또는 바람직하게는 상기 2 차 항체에 직접 표지된 신호 발생자를 제공하는 단계;
c) 상기 1 차 항체를 지지체와 결합시켜 1 차 항체/지지체의 결합 복합체를 제조하는 단계;
d) 상기 결합 복합체를 검출하려는 생물학적 샘플과 접촉시켜 추정 상 상기 샘플 중에 존재하는 HEV가 상기 결합 복합체 항체/지지체에 결합되게 하는 단계;
e) 상기 신호 발생자와 유효하게 결합하는 2 차 항체를 HEV/1 차 항체/지지체의 복합체와 접촉시켜, 이에 의해 신호 발생자/2 차 항체/HEV/1 차 항체/지지체의 복합체를 제조하는 단계; 및
f) 상기 신호 발생자로부터 발생된 신호를 검출하는 단계.
경우에 따라, 상기 검출 방법에서 1 차 항체 또는 2 차 항체는 각각 청구항 제 1 항에 따른 단클론 항체 및 이에 속박되는 활성 단편 중 임의의 하나 또는 임의의 다수개의 조합일 수 있다.
본 발명의 더욱 또 다른 태양에서, 치료 유효량의 하나 이상의 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변이체, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는, HEV 감염의 치료를 위한 약학 조성물을 또한 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양에서, 대상자에게 예방학적 유효량 또는 치료 유효량의 하나 이상의 본 발명의 선행 단클론 항체들 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변이체를 투여함을 포함하는, E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법을 또한 제공한다.
"예방학적 유효량"이란 용어는 선행 용어 "면역학적 유효량"과 대체될 수 있으며, 백신화된 개체의 면역 예방을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 상기 "예방학적 유효량"은 백신화 방식, 기회, 백신화된 개체, 및 사용된 단클론 항체 또는 그의 활성 단편에 따라 변할 수 있다. 당해 분야에 공개된 참고문헌, 교시 및 상응하는 임상적 기준에 따라, "예방학적 유효량"을 제한된 시험으로 측정할 수 있다. 바람직한 예방학적/면역학적 유효량은 용량 당 0.0001 내지 0.1 ㎎, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.06 ㎎, 가장 바람직하게는 0.01 내지 0.04 ㎎이다.
유사하게, "치료 유효량"이란 용어는 대상자에게 유효한 보호를 유도하고 HEV를 중화시키기에 충분한 양을 의미한다. 상기 단클론 항체의 치료 유효량은 상이한 치료 계획, 병의 경과, 개체의 상황, 및 사용된 단클론 항체 또는 그의 활성 단편에 따라 변할 수 있다. 당해 분야에 공개된 참고문헌, 교시 및 상응하는 임상적 기준에 따라, 임상의는 그의 경험을 바탕으로 단클론 항체의 "치료 유효량"을 결정할 수 있다. 바람직한 치료 유효량은 용량 당 0.001 내지 20 ㎎, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎이다.
단클론 항체 및 그의 활성 단편(들), 항원 결정기(들) 및 그의 활성 단편(들), 상기 본 발명의 방법에 의해 선택된 폴리펩타이드 및 그의 동족체를 모두 유전공학 방법에 의해 적합한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 단클론 항체 또는 활성 단편, 항원 결정기 또는 그의 활성 단편, 상기 본 발명의 방법에 의해 선택된 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 다수의 발현 숙주 세포들, 예를 들어 원핵 세포, 예를 들어 비 제한적으로 에스케리키아 콜라이, 바실러스, 스트렙토마이세스; 진핵 세포, 예를 들어 비 제한적으로 아스퍼질러스, 사카로마이세테스 및 포유동물 세포, 식물 세포 등을 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 언급된 모든 관심 산물의 발현은 상기 단클론 항체, 그의 보존 변이체 또는 활성 단편, 또는 상기 항원 결정기 또는 그의 활성 단편, 및 본 발명의 방법에 의해 선택된 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 발현하는데 사용될 수 있는 한 임의의 특정한 발현 벡터 또는 숙주 세포로만 제한되지 않는다.
본 발명의 하이브리도마 세포를 당해 분야에 공지된 기법에 의해 생산할 수 있다. 구체적으로, 상기는 불멸 세포 주를 목적하는 항체를 생산할 수 있는 B 림프구와 융합시킴을 포함한다. 특정 항원에 의해 면역된 포유동물로부터 림프구를 수거하는 방법은 공지되어 있다. 일반적으로, 인간의 경우, 말초 혈액 림프구를 사용할 수 있으며; 다른 포유동물의 경우에는 비장세포 또는 림프구를 사용할 수 있다. 정제된 항원을 반복적으로 주입한 포유동물 숙주는 목적하는 항체 생성 세포를 생산할 것이다. 이러한 세포를 수거하고, 이어서 불멸 세포와 융합시킨다. 세포 융합 방법은 또한 당해 분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 상기는 상기 세포를 PEG와 같은 융합제와 혼합하는 단계; HAT 선택과 같은 표준 방법에 의해 하이브리도마 세포를 선택하는 단계; ELISA와 같은 표준 면역분석에 의해 상기 하이브리도마의 배양 배지를 분석하여 목적하는 단클론 항체들을 분비할 수 있는 하이브리도마 세포를 선택하는 단계; 및 단백질 정제를 위한 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 상기 단클론 항체를 정제하는 단계를 포함한다. 상기 언급한 임의의 방법에 대해서, 다수의 참고 문헌들이 존재한다(예를 들어 Kohler et al., Hybridoma Techniques, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985; 등).
항체 단편의 용도 및 생산이 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다, 예를 들어 Fab(Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, 1985) 및 Fv(Hochman et al, Biochemistry, 12:1130-1135, 1973; Sharon et al, Biochemistry, 15:1591-1594, 1976; Ehrlich et al., 미국 특허 4470925). 더욱 또한, 공지된 방법, 예를 들어 하이브리도마 세포의 추가 융합(콰드로마가 생성됨)(Reading, 미국 특허 제 4474493) 또는 반-분자의 화학적 재조합(Brennan et al, Science, 229:81-83, 1985)에 의해 본 발명의 화합물 및 조성물을 사용하여 2-특이 항체를 제작할 수 있다.
본 발명에서 하이브리도마 세포에 의해 특이적으로 분비되는 항체 및 단편들을 또한 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 본 발명에서 단클론 항체의 암호화 서열, 특히 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 암호화 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 쉽게 수득할 수 있다. 숙련가는 단클론 항체의 특이적 결합에 중요한 아미노산 영역, 예를 들어 항체 유전자의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에서 결정기 상보성 영역(CDR) CDR1, CDR2 및 CDR3, 상기 항체의 특정 결합 영역을 구성하는 그의 상응하는 아미노산 서열을 쉽게 결정할 수 있다. 이들 아미노산 서열을 기본으로, 단클론 항체에 대한 동일하거나 유사한 특이적 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드를 재조합 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA 서열의 재조합은 단일 쇄 Fv(ScFv)를 형성할 수 있으며; 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 CDR로 인간 항체의 상응하는 부분을 치환시키면 원래 단클론 항체의 특이적인 결합 활성은 유지하면서 인간 항체에 훨씬 더 가까운 인간화된 항체가 발생할 것이다; 등이다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, HEV ORF2로부터 면역 보호 항원인 재조합 단백질 NE2를 사용하여 마우스를 면역시켜 단클론 항체들을 제조하였으며, 이때 단클론 항체를 꾸준히 분비하고 각각 13D8, 16D7, 8C11 및 8H3이라 명명되는 4 개의 하이브리도마 세포주(서브유형 시험에 의해 측정 시 모두 IgG1 서브유형을 분비한다)가 수득되었다. 부다페스트 조약에 따라, 발명자들은 이들 4 개의 하이브리도마 세포주 모두를 CCTCC(Wuhan University, Wuhan province, China)에 기탁하였으며 수탁 번호는 각각 CCTCC-C200114, CCTCC-C200115, CCTCC-200116, CCTCC-C200117이다.
본 발명에서 제조된 단클론 항체 또는 그의 활성 단편에 따라, 당해 분야의 숙련가는 상기를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있으며 코돈 변성에 따른 이들의 변체를 얻을 수 있다. 본 발명에 개시된 내용에 따라, 당해 분야의 숙련가들은 상술한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 및 다수의 방법에 의해 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 얻을 수 있다. 숙주 세포 및 형질전환 기술의 선택은 이들을 본 발명의 상기 단클론 항체 또는 그의 활성 단편을 발현하는데 사용할 수 있는 한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
비등(boiled) 및 비등되지 않은 NE2 단백질의 웨스턴 블럿팅은 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8 모두가 일치하는 항원 결정기를 인식하는 반면, 16D7은 선형 항원 결정기를 인식함을 보였다. 차단 시험 및 결합 억제 시험은 단클론 항체 8C11 및 13D8이 동일한 항원 결정기를 인식하고 8H3 및 16D7이 각각 2 개의 다른 항원 결정기를 식별함을 보인다. 항체-포획 PCR 시험은 단클론 항체 8C11, 13D8 및 8H3이 천연 E형 간염 바이러스와 결합할 수 있음을 보이며, 이는 인식된 항원 결정기가 HEV의 표면 상에 있음을 입증한다. 이들 단클론 항체의 중화 보호 시험은 단클론 항체 8C11 및 13D8이 중화 활성을 가지며, 이들이 인식한 항원 결정기는 항원 결정기를 중화하였고, 따라서 상기 항원 결정기를 함유하는 폴리펩타이드 백신은 항체 중화를 유도할 수 있음을 보인다. 더욱이, 단클론 항체 8H3에 의해 인식된 항원 결정기가 또한 HEV의 표면상에 있었으며, 따라서 그의 항체는 또한 중화 활성을 갖거나, 또는 개체의 항-HEV 면역에 한 역할을 한다.
본 발명은 또한 본 발명에서 상기 단클론 항체 8C11, 8H3, 13D8 및 16D7 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 특징을 갖는 HEV ORF2의 폴리펩타이드에 의해 형성된 항원 결정기를 개시한다. 이들 결정기는 천연 HEV의 표면의 공간 구조에 따라 변한다.
따라서, 본 발명은 E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 단클론 항체 및 그의 결합 활성 단편들 중 하나 이상, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함한다. 치료하려는 대상자의 구체적인 조건에 따라, 당해 분야의 숙련가는 적합한 용량과 투여 경로를 어떻게 선택해야 할지를 안다. 바람직한 치료 유효량은 본 발명에서 0.001 내지 20 ㎎/㎏, 특히 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎, 더욱 더 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎이다.
웨스턴 블럿팅 시험은 단클론 항체 16D7이 웨스턴 블럿팅에서 미량의 HEV단백질을 검출할 수 있는 다양한 존재 조건 하에서 HEV ORF2의 재조합 단백질 NE2와 민감하게 반응할 수 있음을 보였다. 따라서 단클론 항체 16D7을 사용하여 순도를 검출할 수 있으며 재조합 단백질, 예를 들어 HEV 재조합 백신의 고 순도 제조에 특히 유리한 HEV 재조합 단백질의 제조 중의 존재 조건을 검출할 수 있다.
1. 본 발명의 단클론 항체의 제조
실시예 1
항원으로서 사용하기 위한 HEV ORF2 폴리펩타이드의 제조
주형으로서 사용하기 위한 HEV ORF2 단편의 제조
주형으로서 HEV-감염된 환자(Xin Jiang Province, China)로부터 클로닝된 완전한 길이의 HEV 유전자(Aye, T.T., Uchida et al., Nucleic Acids Research, 20(13), 3512(1992); GeneBank 수탁 번호 D11092), 2 개의 프라이머 ORF2FP: 5'-atgcgccctcggcca-3'(전방 프라이머) 및 ORF2RP: 5'-aaataaactataactcccga-3'(역 프라이머)을 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 94 ℃ 5 분; 이어서 94 ℃ 50 초, 57 ℃ 50 초 및 72 ℃ 2.5 분의 25 주기; 72 ℃ 10 분으로 종료하는 조건 하에서 PCR 열 사이클러(BIOMETRA T3)에서 수행하고, 약 2 kb의 HEV ORF2의 특정한 DNA 단편을 수득하고, 이를 본 발명의 폴리펩타이드의 제조를 위한 주형으로서 사용할 것이다. 상기 PCR 산물을 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pMD18-T(TAKARA CO.)와 추가로 연결시키고 이어서 ORF2 유전자가 삽입된 양성 클론을 BamHI/HindIII에 의한 절단에 의해 동정한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하기 위해서 주형으로서 사용하기 위해 상기 방법에 의해 수득된 HEV ORF2의 2 DNA 단편을 상하이 보 야 바이오엔지니어링 사(Shanghai Bo Ya Bioengineering Co.)에서 서열화하였다. M13(+)/(-) 프라이머를 사용하였다. 하나는 보존 서열(주형 1, 서열식별번호: 2)이고 다른 하나는 돌연변이 서열(주형 2, 서열식별번호: 3)이다.
개방 판독 프레임(ORF)에 대한 서열 정렬 및 분석에 의해서, 본 발명의 폴리펩타이드의 제조를 위해서 주형으로서 사용하기 위한 HEV ORF2의 상기 돌연변이 서열(서열식별번호: 3)은 상기 보존 서열(서열식별번호: 2)과 비교 시 염기 A가 부족하며 그 결과 이동 돌연변이가 발생하여 ORF2 중의 아미노산 잔기 604-605가 His-Ser-Val에서 Pro-Pro-Arg로 변이되고, 이에 의해 상기 폴리펩타이드의 번역이 상기 돌연변이에 의해 형성된 정지 코드 tag에 의해 정지되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 폴리펩타이드 NE2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터의 제조
주형으로서 상기 수득된 서열 서열식별번호:3, 전방 프라이머 HEFP: 5'-ggatccatatgcagctgttctactctc gtc-3'(5' 말단에 BamHI 부위, NdeI 부위(CAT ATG) 및 이 콜라이 시스템 중의 출발 코돈으로서 ATG가 도입됨), 및 역 프라이머 HERP: 5'-ctcgagaaataaacta taactcccga-3'(5' 말단에 EcoRI 부위가 도입됨)을 사용하는 PCR에 의해, 서열식별번호: 4로서 나타낸 아미노산에 상응하는, 본 발명의 폴리펩타이드 NE2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열인 810 bp 정도의 DNA 단편을 수득한다. 상기 PCR을 열 사이클러(Biometra T3)에서 94 ℃에서 5 분간 열 변성, 이어서 30 주기: 94 ℃ 50 초, 57 ℃ 40 초 및 72 ℃ 40 초 동안 증폭, 최종적으로 72 ℃에서 10 분간 수행한다.
본 발명의 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 발현 벡터 pTO-T7을 당해 분야에 공지된 방법(LUO Wen-Xin, et al., Chinese Journal of Biotechnology, 2000, 16:53-57)에 따라 제작하며, 상기 방법은 하기의 특별한 단계들을 포함한다: 상기 언급한 PCR 산물을 상업적으로 입수할 수 있는 pMD18-T 벡터(TAKARA 캄파니) 내로 클로닝하고 BamHI/HindIII에 의한 확인에 의해 폴리펩타이드 NE2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 함께 삽입된 양성 서브클론을 수득하는 단계; 상기 양성 서브클론을 NdeI 및 EcoRI으로 추가로 절단하여 폴리펩타이드 NE2를 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 수득하고, 이어서 이를 NedI/EcoRI-절단된 pTO-T7과 연결하는 단계. 폴리펩타이드 NE2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 양성 클론 pTO-T7-NE2를 NdeI/EcoRI에 의한 절단에 의해 확인한다.
폴리펩타이드 NE2의 발현
1 ㎕ 플라스미드 pTO-T7-NE2(0.15 ㎎/㎖)를 사용하여 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 이 콜라이 ER2566(New England BioLabs company로부터)의 적격 세포 40 ㎕를 형질전환시켰다. 이어서 상기 혼합물을 가나마이신(최종 농도 25 ㎍/㎖로, 이하 동일함) 함유 고체 LB 배지 상에 도말하고, 상기 플레이트를 개별적인 클론들이 보일 때까지 10 내지 12 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 상기 개별적인 클론들을 집어내어 배양액의 OD550㎚ 값이 약 1.5가 될 때까지 37 ℃에서 10 시간 동안 220 rpm 하에, 튜브 중의 4 ㎖ LB 배양 배지에 추가로 접종하였다. 이어서 배양 배지 1 ㎖을 4 ℃에서 나중의 사용을 위해 보관하고, 0.5 M IPTG 2 ㎕를 나머지 3 ㎖의 배양액에 가하였다(최종 농도 0.3 mM까지). 상기 IPTG를 함유하는 배양 배지를 관심 폴리펩타이드의 발현을 유도하기 위해서 220 rpm 하에 37 ℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 유도된 배양 배지 1.5 ㎖을 12000 g에서 30 초간 원심분리시켰다. 펠릿을 100 ㎕ 1 x 겔 부하 완충액(50 mM 트리스.Cl pH 6.8, 100 mM DTT, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 재 현탁시키고 10 분간 추가로 비등시키고, 이어서 12000 g에서 10 분간 원심분리시켰다. 상등액 10 ㎕를 폴리펩타이드 NE2의 발현을 분석하기 위해서 12% SDS-PAGE에 부하하였다. 최고의 발현 수율을 갖는 형질전환된 균주를 대규모 발현을 위해 선택하고 미래를 위한 시드로서 보관하였다.
보관된 세균 배양액 200 ㎕를 1 L 삼각 플라스크 중의 새로운 LB 배지 500 ㎖에 가하고 이어서 OD550㎚ 값이 2.0에 도달할 때까지 약 11 시간 동안 37 ℃에서 190 rpm 하에서 진탕시켰다. 0.5 M IPTG 300 ㎕를 최종 농도 0.3 mM로 가하였다. 이어서 상기 혼합물을 37 ℃에서 4 시간 동안 190 rpm에서 추가로 진탕시켰다. 마침내, 세균 펠릿을 원심분리 후에 상기 배양 배지로부터 수거하였다.
이 콜라이 봉입체에서 발현된 폴리펩타이드 NE2의 정제
재조합 폴리펩타이드 NE2를 함유하는 이 콜라이 배양액을 4000 rpm에서 15 분간 원심분리하고 배양액 500 ㎖로부터의 각각의 펠릿을 용해 완충액(50 mM 트리스.Cl, 10 mM EDTA 및 300 mM NaCl, pH 7.2) 15 ㎖에 재 현탁시켰다. 배양액 200 ㎖의 세포 상등액을 70% 동력 및 액체 중심에 배치된 거대 초음파 헤드를 사용하여 빙 욕 중의 250 ㎖ 플라스크에서 초음파처리하고(Uilbra-Cell VCX500, SONICS&MATERIALS company), 이때 초음파처리는 명백한 점성이 없을 때까지, 4 ℃에서 10 분간 12000 rpm에 의해 수득된 세포 펠릿에서 탄화에 의해 생성된 잡다한 검은 물질이 존재하는 정도로, 총 20 분간 40 초 켜고 1 분간 꺼서 수행하였다. 상기 펠릿을 현탁액 1/2 부피의 완충 I 용액(200 mM 트리스.Cl, pH 8.5; 5 mM EDTA; 100 mM NaCl)으로 재 현탁시키고, 이어서 같은 부피의 4% 트리톤-X100 함유 완충 I 용액을 보충하여 트리톤-X100의 최종 농도가 2%에 달하게 하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 200 rpm에서 진탕시키고, 이어서 4 ℃에서 10 분간 10000 rpm에서 원심분리시켰다. 상기 펠릿을 동부피의 완충액 I에 재 현탁시키고, 상기 혼합물을 상술한 조건(40 초 온, 1 분 오프; 총 3 분) 하에서 초음파처리하고, 이어서 4 ℃에서 10 분간 원심분리시켰다(10000 rpm). 상기 펠릿을 1/2 부피의 완충액 I에 재 현탁시키고, 이어서 4% 트리톤-X100을 함유하는 또 다른 동 부피의 완충액 I을 가하였다. 상기 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 진탕(200 rpm)시킨 후에, 4 ℃에서 10 분간 원심분리시켰다(10000 rpm). 상기 펠릿을 동 부피의 완충액 I에 재 현탁시키고, 37 ℃에서 30 분간 진탕(200 rpm)시켰다. 이어서 상기 혼합물을 4 ℃에서 10 분간 원심분리시켰다(10000 rpm). 상기 펠릿을 2M 우레아를 함유하는 동 부피의 완충액 I에 재 현탁시켰다. 37 ℃, 200 rpm에서 30 분간 진탕시킨 후에, 상기 혼합물을 4 ℃에서 10 분간 원심분리시켰다(10000 rpm). 이 상등액을 NE2 2M로 표시하였다. 상기 펠릿을 4 M 우레아를 함유하는 동 부피의 완충액 I에 재 현탁시켰다. 37 ℃에서 1 시간 동안 진탕(200 rpm)시킨 후에, 상기 혼합물을 밤새 4 ℃에서 고정시키고, 이어서 이를 4 ℃에서 10 분간 12000 rpm에서 원심분리시켰다. 이 상등액을 NE2 4M이라 표시하고 펠릿은 버렸다.
재조합 폴리펩타이드 NE2의 탈변성
샘플 NE2 4M 100 ㎖을 2 개의 투석 주머니(36 DM, 체류 MW: 8000 내지 10000 Da, United Carbon Compound, USA)에 넣고 1 x PBS(Na2HPO4·12H2O 73.344 g, KH2PO4 4 g, NaCl 163.632 g, KCl 4.024 g를 함유하는 20 x PBS(1L), pH 7.45) 900 ㎖과 함께 1L 비이커에서 교반 하에 25 ℃에서 밤새(10 시간) 투석시키고, 이어서 백색 침전물이 상기 투석 주머니에 나타났다. 상기 투석물을 보충하여 계속 투석하고, 이어서 투석물을 매 3 시간마다 4 회 보충하였다. 대체로, 상기 샘플 중의 우레아 농도는 투석이 끝나면 4 x 10-6 M이 될 것이다. 상기 투석된 샘플을 25 ℃, 12000 rpm에서 10 분간 원심분리하고; 상등액을 추가의 정제를 위해 0.22 ㎛ 필터 멤브레인으로 여과하였다.
겔 여과 HPLC에 의한 재조합 폴리펩타이드 NE2의 정제
탈변성된 NE2 샘플을 하기와 같이 HPLC에 의해 추가로 정제하였다:
장비: 벡크만 시스템 골드 누보(Beckman System Gold Nouveau) 125 NMP/166NMP HPLC,
컬럼: TSK GEL SW3000 21.5 ㎜ x 60 ㎝,
용출: 1 x PBS pH 7.45,
유속: 4 ㎖/분,
검출 파: UV, 280 ㎚,
샘플: 4M NE2(8 ㎎/㎖) 2 ㎖,
수거: 윈도우 모드의 자동 피크 수거,
수거 시간: 1 튜브/20 초,
수거 지체: 6 초.
결과는 끓는 물에서 10 분간 처리 후에, 12% 아크릴아미드를 사용한 SDS-PAGE에 의해 분석된 관심 단백질의 단독 피크의 순도는 90% 이하임을 보인다.
pTO-T7-E2 플라스미드로 형질전환된 이 콜라이 세포는 유도 후 SDS-PAGE 분석에서 29 kD의 위치에서 밴드를 발산하며, 이는 숙주 세포 중의 전체 단백질의 약 40%이며(도 1, 레인 2), 주로 봉입체로서 존재하였다. 2 몰/L, 4 몰/L 및 8 몰/L의 우레아로 차례로 처리된 NE2 봉입체는 상이한 형태로 존재한다, 즉 2 몰/L 우레아 상등액에서 단백질은 주로 40 kD이고(도 1, 레인 3); 4 몰/L 우레아 상등액에서는 29 kD 단백질이 풍부하게 나타나는 반면 가시적인 40 kD 밴드가 여전히 보이며(도 1, 레인 4); 8 몰/L 우레아 상등액 중에서 단백질은 주로 29 kD 밴드인 반면 40 kD 밴드는 거의 보이지 않고(도 1, 레인 5); PBS에 의해 투석 중인 4 몰/L 우레아의 단백질은 주로 40 kD 및 29 kD이 5:1의 비로 있으며(도 1, 레인 6); 탈변성된 단백질을 겔 여과 HPLC에 의해 추가로 정제하고(도 1, 레인 7) 10 분간 비등시킨 후에 밴드 29 kD는 현저하게 증가하는 반면 40 kD 밴드는 사라지며 다른 오염 밴드는 보이지 않는다(도 1, 레인 8).
NE2 폴리펩타이드의 MALDI-TOF-MS 분석
작용하는 기질 용액은 아세토니트릴-0.1% TFA(1:2, v/v) 중의 포화된 α-시아노-4-하이드록시-신남산(HCCA)이었으며, 이어서 HPLC에 의해 정제하고 순수한 물에 의해 탈염시킨 NE2 샘플과 동 부피로 혼합하였다. 이어서 상기 혼합물을 MS 분석을 위해 질량 분광계(Bruker Daltonics company, REFLEX III 유형) 상에 부하하였다. 상기 NE2 단백질은 9 개의 뚜렷한 피크를 보였으며 이때 가장 강한 피크의 질량/전하는 22899.18 m/z이었으며, 이는 하나의 전하에 대해서 NE2 단량체의 이론적인 분자량(23,097.02 Da)에 필적하였다. 다른 8 개의 피크는 23,097.02 Da의 배수였으며(도 2), 이는 NE2의 상이한 다량체들일 수 있다. 실험 조건 하에서, 단백질 분자는 대개 1 내지 2 개의 전하를 수반하였으며, 따라서 9 개의 피크가 단량체 내지 12 량체의 NE2 단백질인 것으로 추론되었다.
[표 1]
MALDI-TOF-MS에서 재조합 단백질 NE2의 주요 피크들
피크 번호 측정 m/z 추론된 전하 수 예상 m/z 추론된 올리고머 상태
1 11167.39 2 11548.51 단량체
2 22899.18 1/2 23097.02 단량체/이량체
3 34630.97 2 34645.53 삼량체
4 45887.14 1/2 46194.04 이량체/사량체
5 57597.06 2 57742.55 오량체
6 69350.73 1/2 69291.06 삼량체/육량체
7 92655.76 1/2 92388.08 사량체/팔량체
8 116512.86 1/2 115485.10 오량체/십량체
9 139705.91 1/2 138582.12 육량체/십이량체
실시예 2: 단클론 항체 8C11, 13D8, 8H3 및 16D7을 분비하는 하이브리도마 세포주의 제조
마우스의 면역 및 그의 비장 세포와 골수종 세포와의 융합
1 차 면역을 위해서, 각각의 Balb/C 암컷 마우스(6 내지 8 주된 것)에게 프로인트 완전 보강제(총 부피 50 ㎕)로 유화시킨 재조합 항원 NE2 5 ㎍을 접종하였다. 15 일 후에, 상기 마우스를 동일한 양의 프로인트 완전 보강제로 유화시킨 NE2를 사용하여 근육 내로 2 차 면역시켰다. 30 일 후에, 상기 마우스를 상기 보강제 없이 항원 5 ㎍을 사용하여 정맥 내로(꼬리 정맥을 통해) 두 번째 예방 접종하였다. 상기 마우스를 상기 두 번째 예방 접종 후 72 시간 째에 죽였다. 이어서 혈액을 수거하고 비장을 절제하여 비장세포의 현탁액(RPMI 1640 배지에 현탁)을 제조하였다. 상기 비장세포를 세포 계수기로 세었다. 이어서 상기 비장세포를 6:1의 비로 SP2/0 마우스 골수종 세포와 혼합하고 원심분리시켰다. 상기 혼합된 세포를 PEG(PEG 1500)에 의해 융합시키고 이어서 동 부피의 영양세포와 혼합하고 96-웰 플레이트로 옮겼다(200 ㎕/웰). 5% CO2의 분위기에서, 상기 플레이트를 배양기(ESPEC BNA-31)에서 37 ℃에서 배양하였다. 3 일 후에, 배양 배지의 반을 HT 배지(RPMI 1640 배지(GIBCO Int.)에 최종 부피 100 ㎖로 하이포크산틴 1.361 ㎎ 및 티미딘 0.388 ㎎을 약 45 내지 50 ℃에서 용해시키고 멸균을 위해 여과하였다)로 대체하였다. 7 일 후에, NE2로 피복된 96-웰 플레이트에서 ELISA 분석을 하기 개시한 바와 같이 하이브리도마 세포 배양액의 상등액 상에서 수행하였다. ELISA 분석에서 양인 세포를 제한된 희석 수단에 의해 클로닝하였다.
ELISA 분석
HPLC 정제된 NE2를 0.05 몰/L의 탄산 피복 완충액(ddH2O 중의 20.02 g Na2CO 3 및 2.52 g NaHCO3, 최종 1L, pH 9.5)에 최종 농도 0.3 ㎍/㎖로 용해시킨다. 96-웰 폴리비닐 미세 적정 플레이트를 상기 수득된 용액으로 37 ℃에서 2 시간 동안, 이어서 4 ℃에서 밤새 처리하였다. 상기 미세 적정 플레이트를 PBST(NaCl 8.0 g, KH2PO4 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.9 g, KCl 0.2 g 및 트윈-20 0.5 ㎖, ddH2O 중의 최종 1L로, pH 7.4)로 세척하여 결합되지 않은 항원을 제거하였다. 이어서 웰 당 200 ㎕의 차단 용액(1 x PBS 중의 2% 글루틴, 0.2% 카제인 및 2% 슈크로즈)을 차단을 위해 37 ℃에서 2 시간 동안 가하였다. 이어서 상기 용액을 붓고, 상기 웰을 건조시키고 상기 플레이트를 진공 하에서 밀폐시키고, 4 ℃에서 보관하였다.
분석을 위해서, 세포 배양액의 상등액 100 ㎕를 각 웰에 가하고, 각 플레이트에 대해서 하나의 양성 대조군(1:100으로 희석된 마우스 다중 항-NE2 혈청 100 ㎕를 가함) 및 하나의 음성 대조군(HT 배지 100 ㎕를 가함)을 정하였다. 37 ℃에서 30 분간 배양한 후에, 상기 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고 이어서 경사분리하였다. HRP-GAMIg(DAKO 캄파니)를 가하고 추가로 30 분간 37 ℃에서 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS-트윈-20으로 다시 5 회 세척하고 경사분리하였다. 기질 용액 A(Na2HPO4·12H2O 13.42 g, 시트르산·H2O 4.2 g 및 H2O2 0.3 g, ddH2O에 최종 700 ㎖로) 50 ㎕ 및 노출 용액 B(TMD 0.2 g 및 디메틸포름아미드 20 ㎖, ddH2O에 최종 700 ㎖로) 50 ㎕를 상기 플레이트에 가하고 37 ℃에서 10 분간 노출시켰다. 정지 용액 50 ㎕는 상기 반응을 종결시킨다. 각 웰의 OD450 값을 ELISA 판독기로 판독하였다. 일반적으로, 음성 대조군보다 2 배 이상 높은 OD450 값을 양성으로서 간주한다.
단클론 항체 함유 복수의 제조 및 정제
각각 10 주된 Balb/C 마우스에게 0.5 ㎖의 불완전 프로인트 보강제를 복강 내로 접종하였다. 2 내지 7 일 후에, 하이브리도마 세포를 수거하고 원심분리시켰다. 이어서 상등액을 버리고 혈청 비 함유 배지를 상기 세포에 2 x 105 내지 2 x 106 세포/㎖의 최종 농도로 가하고 0.5 ㎖을 사용하여 각 마우스를 접종하였다. 상기 마우스의 복부가 팽창된 지 7 내지 10 일 후에 복수를 수거하고 이어서 3,000 rpm에서 15 분간 원심분리시켰다. 튜브의 중간 부분에 있는 등명한 액체를 피펫팅하여 멸균을 위해 0.45 ㎛ 미세기공 멤브레인으로 여과하였다. 여액을 -20 ℃에서 보관하였다.
처리된 복수를 동 부피의 0.02 몰/L PBS(0.2 몰/L Na2HPO4 81 ㎖ 및 0.2 몰/L NaH2PO4 19 ㎖, 생리 염수에 최종 100 ㎖로)(pH 7.4)로 희석하였다. 이어서 (NH4)2SO4를 50% 포화될 때까지 서서히 교반하면서 적가하고 상기 복수를 4 ℃에서 밤새 유지시켰다. 상기 용액을 4 ℃에서 15 분간 원심분리시키고(12,000 rpm) 상등액은 버렸다. 펠릿을 2 부피의 PBS에 용해시켰다. (NH4)2SO4를 33% 포화될 때까지 교반하면서 상기 용액에 다시 적가하고, 상기 용액을 4 ℃에서 밤새 유지시켰다. 상기 용액을 4 ℃에서 15 분간 원심분리시키고(12,000 rpm) 상등액은 버렸다. 펠릿을 PBS(사용된 복수의 2 배 부피)에 용해시켰다. (NH4)2SO4 를 50% 포화될 때까지 서서히 교반하면서 적가하고, 4 ℃에서 밤새 유지시켰다. 상기 용액을 4 ℃에서 15 분간 원심분리시키고(12,000 rpm) 상등액은 버렸다. 이어서 펠릿을 투석 주머니에서 적합한 양의 PBS에 용해시키고 50 내지 100 배 부피의 120 밀리몰/L 트리스-HCl 완충액(20 밀리몰/L NaCl, pH 7.8)에 교반 하에 4 ℃에서 약 12 시간 동안 투석하였다. 상기 완충액을 3 회 더 대체시킨다. 관심 생성물을 -20 ℃에서 분액 패키지로 보관하였다.
상술한 방법에 따라, 항-HEV-ORF2 단클론 항체를 분비하는 8 개의 하이브리도마 세포주를 동정하였다(1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3, 13D8, 15B2 및 16D7).
하이브리도마 세포주의 배양 상등액의 적정
유도된 세포 배양 상등액 또는 복수를 희석하고 이어서 간접적인 ELISA에 의해 적정한다. 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
단클론 항체 분비 세포의 배양 상등액과 복수의 적정
2. 본 발명의 단클론 항체의 동정 및 특성화
실시예 3: 단클론 항체의 유형 및 서브유형의 동정
ELISA 미세적정 플레이트를 실시예 2에 따라 정제된 NE2로 피복한다. 각 단클론 항체 분비 세포 배양액의 상등액 100 ㎕를 상기 플레이트에 가하고, 이어서 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 TECAN 미세적정 플레이트 세척기를 사용하여 20 초의 간격으로 PBST로 5 회 세척하고, 이어서 경사분리시켰다. 효소로 표지된 HRP-GAM IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3(세로텍(Serotec) 캄파니)의 2 차 항체의 적합한 희석물들을 가하고 37 ℃에서 추가로 30 분간 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS-트윈-20으로 다시 5 회 세척하고 경사분리시켰다. 한 방울의 노출 기질 용액 A(H2O2) 및 B(TMD) 각각을 상기 플레이트에 가하고 37 ℃에서 10 분간 전개시켰다. 한 방울의 정지 용액(H2SO4)은 상기 반응을 정지시킨다. 각 웰의 OD450 값을 ELISA 판독기로 판독한다. 일반적으로, 한계는 음성 평균의 2 배이고 상기 한계 이상의 OD450 값은 양이다. 결과는 모든 단클론 항체의 경쇄는 κ이고; 단클론 항체 1F6은 IgG2b, 2C9는 IgG2a이며, 다른 8C11, 8H3, 12G8, 13D8, 15B2 및 16D7은 모두 IgG1이다(표 3).
[표 3]
단클론 항체의 서브유형
실시예 4: 단클론 항체에 의한 HEV 재조합 단백질의 웨스턴 블럿팅
HPLC 겔 여과에 의해 정제된 재조합 단백질 NE2를 10 분간 비등시키고, 비등시키지 않은 NE2와 함께 12% SDS-PAGE에 의해 분리시키고, 니트로셀룰로즈 멤브레인으로 옮겼다. 실온에서 1.5 시간 동안 5% 탈지 우유로 차단시킨 후에, 상기 멤브레인을 0.5 ㎝ 폭 홈으로 절단하였다. 단클론 항체들을 각각 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응시키고; 이어서 TNT를 사용하여 5 분 간격으로 3 회 세척하였다. AP-표지된 염소 항-마우스(H+L) IgG를 효소 표지된 2 차 항체(Protos Company, 5% 탈지 우유로 1:1000으로 희석됨)로서 가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. TNT에 의해 5 분 간격으로 3 회 세척하고, NBT/BCIP를 가하여 발색시켰다(도 3). 모든 단클론 항체들은 NE2와 잘 반응할 수 있다. NE2는 중합체를 형성하기 쉽고 이량체가 여전히 SDS-PAGE상에서 관찰되었기 때문에, 단클론 항체들과 NE2의 단량체 또는 이량체와의 반응 차이가 발견될 수 있다, 즉 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8은 NE2 이량체보다는 NE2 중합체와 더 잘 반응하며; 반대로, 단클론 항체 15B2 및 16D7은 NE2 중합체 및 단량체와 동등하게 반응한다. NE2 단백질은 비등 후 단량체로 분해되었으며, 단클론 항체 15B2 및 16D7과의 반응성은 영향을 받지 않은 반면, 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8과의 반응성은 감소하거나 없어졌다.
이러한 결과는 단클론 항체 15B2 및 16D7이 NE2의 선형 에피토프를 인식하고, 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8은 NE2 단백질의 단량체보다는 이량체 또는 중합체에 더 노출되는 NE2의 형태적 에피토프를 인식함을 가리킨다.
실시예 5: HEV-ORF2 재조합 폴리펩타이드에 대한 단클론 항체의 결합 동력학 상수의 측정
HEV-ORF2 재조합 폴리펩타이드의 바이오센서의 1# 큐벳 샘플에 대한 결합
재조합 폴리펩타이드 NE2를 사용자 안내서에 따라 IAsys 바이오센서(Affinity System company, Iasys Plus)의 CMD-처리된 큐벳에 결합시켰다: NHS(N-하이드록시숙신이미드) 200 ㎕ 및 EDC(1-에틸-3(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드) 200 ㎕를 혼합하고, 이어서 이를 사용하여 CMD(Caarbixtnetgtk Detran) 큐벳의 하이드록실 그룹을 활성화시키고, 상기 큐벳을 EDC/NHS 40 ㎕로 세척하고 이어서 상기 혼합물로 7 분간 충전시켰다. PBST(NaCl 8.0 g, KH2PO4 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.9 g, KCl 0.2 g 및 트윈-20 0.5 ㎖, ddH2 O에 1 ℓ로, pH 7.4) 50 ㎕로 3 회 세척하고, 약 1 분간 균등화시키고; 이어서 10 mM NaAc 완충액(pH 4.5) 40 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시키고, 이어서 상기 큐벳의 어느 한 웰에 NE2(0.675 ㎎/㎖, 순도 95%) 10 ㎕ 및 대조군으로서 BSA(10 ㎎/㎖) 10 ㎕를 각각 가하여 결합을 관찰한다. PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시키고, 이어서 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.5) 40 ㎕로 3 회 세척하고 추가로 1 분간 균등화시키고, 이어서 NE2(0.675 ㎎/㎖, 순도 95%) 10 ㎕를 7 분간 가하여 결합시킨다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시키고, 이어서 빈 카복실 그룹을 1M 에탄올아민(pH 8.5)으로 차단시킨다, 즉 40 ㎕로 3 회 세척하고 이어서 3 회 차단시킨다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시키고, 이어서 10 mM HCl 50 ㎕로 3 회 세척하여 유리 및 불특정하게 풍부한 단백질 분자를 제거하고, 2 분간 균등화시킨다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시킨다. 결합된 단백질의 양은 약 900 아크 초, 약 4.5 ng NE2/㎟이다.
HEV-ORF2 재조합 폴리펩타이드의 바이오센서의 2# 큐벳 샘플에 대한 결합
재조합 폴리펩타이드 NE2를 사용자 안내서에 따라 IAsys 바이오센서(Affinity System company, Iasys Plus)의 CMD-처리된 큐벳에 결합시켰다: NHS 200 ㎕ 및 EDC 200 ㎕를 사용하여 CMD 큐벳의 하이드록실 그룹을 활성화시키고, 상기 큐벳을 EDC/NHS 40 ㎕로 세척하고 이어서 상기 혼합물로 7 분간 충전시켰다. PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고, 약 1 분간 균등화시키고; 이어서 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.5) 45 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시키고, 이어서 상기 큐벳의 어느 한 웰에 NE2(0.675 ㎎/㎖, 순도 95%) 5 ㎕ 및 대조군으로서 BSA(10 ㎎/㎖) 5 ㎕를 각각 가하여 결합을 관찰한다. PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시키고, 이어서 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.5) 45 ㎕로 3 회 세척하고 추가로 1 분간 균등화시키고, 이어서 NE2(0.675 ㎎/㎖, 순도 95%) 5 ㎕를 가하여 결합 정도를 관찰하고 반응 시간을 NE2 단백질의 최초 첨가량에 따라 3000 아크 초를 넘지 않게 조절하였다. 상기 큐벳을 10 mM 아세트산 완충액(pH 4.5) 40 ㎕로 3 회 세척하고, 1 분간 균등화시키고, 이어서 추가의 NE2(0.675 ㎎/㎖, 순도 95%) 10 ㎕를 가하였다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시키고, 이어서 빈 카복실 그룹을 1M 에탄올아민(pH 8.5)으로 차단시킨다, 즉 40 ㎕로 3 회 세척하고 이어서 3 회 차단시킨다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시키고, 이어서 10 mM HCl 50 ㎕로 3 회 세척하여 유리 및 불특정하게 풍부한 단백질 분자를 제거하고, 2 분간 균등화시킨다. 상기 큐벳을 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시킨다. 결합된 단백질의 양은 최종적으로 약 180 아크 초, 약 0.9 ng NE2/㎟이다.
결합 동력학 상수의 측정
각 단클론 항체의 결합 동력학 상수를 IAsys 바이오센서에 의해 2# CMD 큐벳을 사용하여 측정하였다. 단클론 항체를 PBST로 5 배 이상 희석한다. 큐벳을 PBST 45 ㎕로 2 회 세척하고 약 1 분간 균등화시킨다. 희석된 단클론 항체 정제된 복수 샘플 5 ㎕를 약 3 내지 5 분간 결합 곡선을 위하여 가한다. 상기 큐벳을 PBST 45 ㎕로 2 회 세척하고 약 1 내지 3 분간 분해 곡선을 위해 균등화시켰다. 상기 큐벳을 50 mM HCl 50 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시키고; 이어서 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 약 1 분간 균등화시켰다. 0 내지 1 분 동안 CMD 큐벳 상에 커플링되는 NE2 단백질에 대한 단클론 항체 결합의 결합 곡선을 수집하고 FASTfit 소프트웨어로 동력학적 상수를 분석한다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
단클론 항체 8C11, 8H3, 13D8 및 16D7의 동력학적 상수
단클론 항체의 Fab 단편의 제조
정제된 단클론 항체 8C11(10 ㎎/㎖)을 밤새 0.1 몰/L 트리스-HCl(pH 8.0)로 투석한다. 파파인(Sigma Co.)을 2 밀리몰/L EDTA, 1 밀리몰/L DTT를 함유하는 동일한 완충액으로 2 ㎎/㎖로 희석하고 37 ℃에서 30 분간 배양시켜 활성화되게 하였다. 이어서 활성화된 파파인을 투석된 단클론 항체에 1:100의 중량비로 가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 상기 반응을 광선 혐기성 빙 욕에서 1 시간 동안 요오도아세트아미드(20 밀리몰/L의 최종 농도로)에 의해 종결시켰다. 이어서 절단된 단클론 항체들을 20 밀리몰/L PB(pH 7.4)로 밤새 투석한다. Fab 단편을, 20 밀리몰/L PB(pH 7.4)로 0 내지 10 분간 용출시키고, 20 밀리몰/L PBS(pH 7.4) 중의 0.5 몰/L NaCl로 10 내지 15 분간 교체하고, 이어서 20 밀리몰/L PB(pH 7.4)로 15 내지 20 분간 균등화시키는 용출 조건으로 DEAE-HPLC에 의해 정제시킨다. 10 내지 100 ㎎ 항체를 부하하며, 유속은 5 ㎖/분이고, 검출 파는 280 ㎚이다. 정제된 Fab 단편을 PEG와 축합시키고, 20 밀리몰/L PBS(pH 7.4)로 투석하고, 이어서 0.22 ㎛ 미세 기공 필터로 멸균시키고 이어서 분액하여 단클론 항체 8C11의 Fab 순수 단편을 수득한다.
8H3, 13D8의 Fab 단편을 동일한 수단에 의해 수득할 수 있다.
바이오센서(BIAcore 유형 X, BIAcore Co.)의 CMD-처리된 칩 CM5에 대한 HEV-ORF2 재조합 폴리펩타이드의 결합
CM5-NE2 칩과의 결합에 대한 동력학적 분석
NE2를 BIAcore 사용자 안내서에 따라 CMD-처리된 칩 CM5 상에 아민을 사용하여 결합시킨다. NHS 200 ㎕ 및 EDC 200 ㎕를 혼합하여 CM5 칩 상의 카복실 그룹을 활성화시킨다, 즉 반응 온도 22 ℃ 및 유속 10 ㎕/분을 고정시키고, 혼합물 70 ㎕를 부하하여 7 분의 접촉 시간 동안 표면을 활성화시킨다. 10 mM 아세테이트(pH 5.5)로 희석된 NE2 단백질(0.675 ㎎/㎖, 95% 순도)(1:5의 비)을 조절된 양으로 피복을 위해 부하한다. 기준선 날짜의 약 1 분을 모은다. 이어서 반응되지 않은 카복실 그룹을 에탄올아민(pH 8.5) 75 ㎕에 의해 차단시킨다. 결합된 단백질의 양은 약 84 RU, 즉 약 0.042 ng/㎟이다.
BIAcore 바이오센서에 의해 측정된 단클론 항체 8C11, 8H3 및 이들의 Fab 단편의 결합 동력학적 상수
단클론 항체 및 그의 Fab 단편 각각을 PBS로 5 배 이상 희석하고, 이어서 CM5 칩 상에 커플링된 NE2 단백질과의 결합에 대해 검출하고, BIA 평가 소프트웨어에 의해 동력학적 상수를 분석한다.
각 Fab 단편에 대한 KD 결과를 표 5에 나타낸다. 8C11, 13D8 Fab 단편의 해리 속도는 모두 비교적 빠르며, 결합과 유사하고; 8H3 Fab 단편의 결합속도는 현저하게 증가하며, 해리 속도는 감소하고, 친화율은 105 증가한다. 상기 칩 상에 커플링된 NE2에 대한 단클론 항체의 해리 과정을 도 4에 나타낸다.
[표 5]
NE2에 대한 단클론 항체 8C11, 8H3, 13D8, 16D7 및 그의 Fab 단편의 동력학적 상수
실시예 6: 바이오센서의 차단 시험
단클론 항체 각각을 그의 결합 동력학적 분석을 기준으로 적당한 포화 결합 농도로 희석하고 서로 짝을 지어 1# CMD 큐벳을 사용하여 8H3과 단클론 항체 8C11, 13D8, 16D7과의 상호작용, 및 2# CMD 큐벳을 사용하여 8C11, 13D8, 16D7 서로의 상호작용을 검출하였다. 상기 큐벳을 PBST 45 ㎕로 2 회 처음 세척하고 1 분간 균등화시킴으로써, 단클론 항체 Ab1의 희석된 정제된 복수 샘플 5 ㎕를 가하고 3 내지 5 분간 결합하게 하고; 상기 큐벳을 PBST 45 ㎕로 2 회 세척하고 1 내지 3 분간 균등화시키고(8H3과 같이 해리할 수 있는 단클론 항체의 경우, 결합 시간을 적합하게 연장시켜 가능한 한 반응의 균형을 유지시켰으며, PBST 세척에 의한 해리 과정을 제거하였다); 추가로 단클론 항체 Ab2의 희석된 정제된 복수 샘플 5 ㎕을 가하여 3 내지 5 분간 반응하게 하고, 이어서 결합 곡선을 관찰하였다. 큐벳을 PBST 45 ㎕로 2 회 세척하고 3 내지 5 분간 균등화시킨 후에, 해리 곡선을 관찰하였다. 상기 큐벳을 50 mM HCl 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시키고; 이어서 PBST 50 ㎕로 3 회 세척하고 1 분간 균등화시켰다. Ab1과 Ab2의 순서를 바꾸어 상기 과정을 반복한다. 단클론 항체(R)의 결합양은 상기 단클론 항체의 첨가로부터 처음 3 분째에 신호 값이 증가하였다. 1 차 항체(R1) 및 2 차 항체(R2)로서 각 단클론 항체의 결합양을 비교하였다. R2가 R1보다 큰 경우(증가율 = (R2-R1)/R1, 상기가 20% 이상이면 이는 상승이다), 이를 첨가된 또 다른 단클론 항체가 상기 단클론 항체의 결합 활성을 향상시키는 것으로서 간주할 수 있으며; 반대로, R2가 R1보다 작은 경우, 상기 단클론 항체가 첨가된 또 다른 단클론 항체에 의해 억제된다고 한다(억제율 = (R1-R2)/R1, 상기가 30% 이상이면 기존 억제로서 간주될 것이며; 억제율에 따라, 온화한 억제(30 내지 40%), 억제(40 내지 60%), 명백한 억제(60 내지 80%) 및 현저한 억제(80% 이상)가 존재하고, 2 개의 단클론 항체들이 서로 억제할 수 있는 경우 억제로 간주하였다).
13D8에 대한 8C11의 억제율은 82%이고, 8C11에 대한 13D8의 억제율은 53%이며, 이는 이들 2 개의 단클론 항체에 의해 인식된 에피토프들이 서로 중복됨을 시사하고; 반면에 8C11과 16D7, 13D8과 16D7은 서로 억제하지 않으며, 이는 16D7에 의해 인식된 에피토프와 8C11 및 13D8에 의해 인식된 에피토프간에 명백한 공간 간격이 존재함을 나타내고; 유사하게, 8H3과 13D8, 8H3과 16D7간에는 서로 억제가 존재하지 않으며, 이는 8H3에 의해 인식된 에피토프 영역이 13D8 및 16D7에 의한 것과 다름을 나타낸다(표 6). 8C11이 8H3을 명백하게 상승시킴(상승률이 50%에 가까움)은 뜻밖이며, 생성된 해리 곡선은 이전의 단클론 항체 8H3의 빠른 해리속도가 8C11의 영향으로 인해 보다 느려짐을 보이며, 이는 8C11이 항원과 결합한 결과 항원의 공간적 형태 변화가 일어나고 따라서 8H3에 의해 인식된 항원에 대한 에피토프의 보다 충분한 노출이 발생함을 가리킨다.
[표 6]
MAb 8C11, 8H3, 13D8 및 16D7간의 상호작용
처음 8C11 첨가 처음 13D8 첨가 처음 8H3 첨가 처음 16D7 첨가
이어서 8C11 첨가 - 억제 영향 없음 영향 없음
이어서 13D8 첨가 현저한 억제 - 온화한 억제 영향 없음
이어서 8H3 첨가 상승 영향 없음 - 영향 없음
이어서 16D7 첨가 영향 없음 영향 없음 영향 없음 -
실시예 7: MAb들 간의 교차 차단 효과에 대한 ELISA 시험
MAb 8C11의 정제: 8C11 복수 10 ㎖을 포화된 황산 암모늄으로 3 회 침전시키고, 10 mM 인산염 완충 염수(pH 7.2)에 대해 투석하고, 이어서 동일한 완충액으로 평형화시킨 DEAE-52 크로마토그래피 상에 부하하고 흐름 피크를 수집하였다.
양고추냉이 페록시다제(HRP)에 의한 MAb 8C11의 표지화
1 ㎎의 HRP 및 NaIO4 각각을 초 순수 물에 용해시키고; 이어서 NaIO4 용액을 HRP 용액에 교반하면서 적가하고, 완전히 혼합된 용액을 실온의 암실에 30 분간 두고; 초 순수 물 중의 에틸렌 글리콜 1 ㎕를 상기 혼합물 용액에 교반하면서 적가하고, 이어서 실온의 암실에 30 분간 정치시켰으며, 지금까지 효소 산화 과정이 성취되었다. HRP 산화 과정 동안, 정제된 8C11을 50 mM CB(pH ∼9.6)에 대해 투석하였다. HRP 산화를 마친 후에, HRP를 목적하는 비율로 투석된 8C11과 혼합하고 6 시간 이상 50 mM CB(pH 9.5)에 투석하고; 이어서 새로 제조된 NaBH4 용액을 0.2 ㎎의 양으로 가하여 정지시키고; 생성물을 완전히 진탕시키고 4 ℃에서 2 시간 동안 정치시킨 다음 10 mM PBS에 밤새 투석하였다.
MAb 8H3, 13D8 및 16D7을 정제하고 유사한 방식으로 HRP로 표지하였다.
ELISA 미세플레이트를 0.05 ㎍/㎖ 정제된 NE2 단백질로 피복하고 상기 실시예 2에 개시한 바와 유사한 방법에 따라 차단시켰다. 20 개 웰을 4 개의 그룹으로 나누고, 이어서 각각 4 개의 상이한 MAb(20% 갓난 송아지 혈청으로 1:105의 ELISA 역가로 희석됨)를 각각 매 그룹의 4 개의 웰에 웰 당 100 ㎕로 가하고 대조군으로서 나머지 웰에 PBS 중의 20% 갓난 송아지 혈청 100 ㎕를 가하였으며; 이어서 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 액체를 버리고 4 개의 상이한 HRP-표지된 MAb(PBS 중의 20% 갓난 송아지 혈청으로 1:103의 ELISA 역가로 희석됨) 100 ㎕를 가하고; 이어서 37 ℃에서 30 분간 배양하고; PBST로 5 회 세척하고 블럿팅을 건조시키고, 각각의 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B 50 ㎕를 가하고, 37 ℃에서 15 분간 배양하고, 상기 반응을 정지 용액 50 ㎕로 정지시키고, 흡광도 판독기에서 OD450/620㎚를 판독하고(PBST, 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B를 모두 Beijing Wantai Biomedical Company로부터 구입하였다), 최종적으로 차단율을 계산하였다(차단율 = 1 - 차단된 OD/대조용 OD). 50% 이상의 차단율을 차단 존재로서 간주하였다. 오직 서로 차단을 초래하는 경우에만 차단이 존재하는 것으로 간주하였다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, MAb 8C11 및 13D8은 서로 명백히 차단할 수 있으나, MAb 8H3과 MAb 16D7의 경우 서로 간에 차단 효과는 없으며; MAb 8H3 및 MAb 16D7은 각각 나머지 3 개의 MAb를 차단할 수 없다. 이는 MAb 8C11과 13D8이 동일한 항원 결정기 영역을 인식할 수 있는 반면, MAb 8H3과 16D7은 다른 2 개의 항원 결정기 영역을 인식함을 시사하였다.
[표 7]
MAb 8C11, 8H3, 13D8 및 16D7의 차단 ELISA
8C11 13D8 8H3 16D7
HRP-8C11 차단 차단 차단 없음 차단 없음
HRP-13D8 차단 차단 차단 없음 차단 없음
HRP-8H3 차단 없음 차단 차단 차단
HRP-16D7 차단 없음 차단 없음 차단 안됨 차단 없음
실시예 8: BIAcore 바이오센서에 의해 검출된 MAb 8H3 및 그의 Fab 단편의 결합 활성에 대한 MAb 8C11 및 그의 Fab 단편의 향상
검출에 유용한 CM5-NE2 칩의 커플링
커플링을 제작 안내서에 따라 수행하였다, 즉 NHS 200 ㎕와 EDC 200 ㎕를 혼합하여 CM5 칩 상의 카복실 그룹을 활성화시키고; 10 mM 아세테이트 완충액(pH 5.5)(0.675 ㎎/㎖, 95% 순도)으로 1:5 희석된 NE2 단백질 100 ㎕를 부하하고 10 분간 반응시키고; 반응되지 않은 카복실 그룹을 1M 에탄올아민(pH 8.5) 75 ㎕로 차단시켰다. 커플링된 NE2 단백질의 최종 양은 3295RU이며, 1.65 ng/㎟에 상응한다.
MAb 8C11의 MAb 8H3 및 8H3 Fab 항체와의 상호작용
검출을 위해 CM5-NE2 센서 칩을 사용하였으며 반응 온도는 22 ℃이고, 유속은 10 ㎕/분이었으며, 반응 완충액은 PBS였다. 균형을 이룬 후에, 단클론 항체 8C11 10 ㎕를 부하하고, 결합 및 해리 곡선을 관찰하였으며 이어서 50 mM HCl 10 ㎕로 세척하였다. 단클론 항체 8H3 및 8H3 Fab 항체의 결합 및 해리 곡선을 동일한 방식으로 검출하였다. 이어서 단클론 항체 8C11 10 ㎕를 부하하고, 결합 및 해리 후에, 단클론 항체 8H3 10 ㎕를 부하하여 단클론 항체 8C11의 존재 하에서 단클론 항체 8H3의 결합 및 해리를 검출하였다. 이어서 50 mM HCl 10 ㎕로 세척하였다. 동일한 방식으로, 8H3 Fab 항체의 결합 및 해리를 단클론 항체 8C11의 존재 하에서 검출하였다. 단클론 항체 8H3 및 8H3 Fab의 보다 적은 결합과 보다 많은 해리가 별도의 결합 과정 동안 관찰되었다. 단클론 항체 8C11의 존재 하에서 상기 결합양은 도 5에 나타낸 바와 같이 보다 높고 안정해진다.
8C11 Fab 항체와 MAb 8H3 및 8H3 Fab 항체와의 상호작용
검출용 CM5-NE2 센서 칩을 사용하였으며, 반응 온도는 22 ℃이고, 유속은 10 ㎕/분이었으며, 반응 완충액은 PBS였다. 균형을 이룬 후에, 단클론 항체 8CH3 10 ㎕를 부하하고, 결합 및 해리 곡선을 관찰하였으며 이어서 50 mM HCl 10 ㎕로 세척하였다. 8H3 Fab 항체간의 결합 및 해리 곡선을 동일한 방식으로 검출하였다. 이어서 단클론 항체 8C11 Fab 항체 10 ㎕를 부하하고, 결합 및 해리 후에, 단클론 항체 8H3 10 ㎕를 부하하여 단클론 항체 8C11 Fab 항체의 존재 하에서 MAb 8H3의 결합 및 해리를 검출하였다. 이어서 50 mM HCl 10 ㎕로 세척하였다. 동일한 방식으로, 8H3 Fab 항체의 결합 및 해리를 8C11 Fab 항체의 존재 하에서 검출하였다. 단클론 항체 8H3 및 8H3 Fab 항체의 보다 적은 결합과 보다 많은 해리가 별도의 결합 과정 동안 관찰되었다. 8C11 Fab의 존재 하에서 상기 결합양은 도 5에 나타낸 바와 같이 보다 높고 안정해진다.
실시예 9: 항체-포획된 RT-PCR에 의한 mAb의 HEV 바이러스 입자에 대한 결합 시험
통상적인 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브를 30 분간 UV 조사하고, 이어서 카보네이트 피복 완충액(Na2CO3 20.02 g 및 NaHCO3 2.52 g, ddH2O를 1 L로 가한다, pH 9.5)으로 1:1000으로 희석된 상이한 MAb 500 ㎕를 가하고, 이어서 밤새 37 ℃에서 배양시키고; 상기 완충액을 버리고, 차단 완충액(2% 알부민이 보충된 1 x PBS, pH 7.4) 1.5 ㎖을 가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 차단시키고; 상기 차단 완충액을 버리고 멸균 염수로 희석된 10% HEV 양성 배설물 현탁액 500 ㎖을 가하여 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시키고, 이어서 PBST로 6 회 세척하고; 최종적으로 ddH2O 250 ㎕를 각각의 에펜도르프 튜브에 가하였다. 사용자 안내서에 따라 트리졸(Trizol) 시약(GIBCO)을 사용하여 추출한 RNA에 42 ℃에서 40 분간 RT 프라이머로서 특정한 프라이머 A3(4566-4568, 5'-ggctcaccggagtgtttcttc-3')과 함께 AMV 역 전사효소를 사용하여 20 ㎕ 반응 부피로 역전사를 가하였다. 이어서 처음 라운드의 RT-PCR을 하기 반응 조건 하에서 2 ㎕의 RT 주형 및 A3 및 A5 프라이머(4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3')를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 수행하였다: 예비 변성, 94 ℃ 5 분; 35 주기의 94 ℃, 40 초 변성, 68 ℃ 40 초의 어닐링 및 연장; 연장, 72 ℃ 5 분. 두 번째 라운드의 PCR은 하기 반응 조건 하에서 주형으로서 1 ㎕의 상기 처음 라운드 반응 산물 및 프라이머 B5(4372-4392, 5'-gccgcagcaaaggcatccatg-3') 및 B3(4554-4575, 5'-gtgtttcttccaaaaccctcgc-3')를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 수행하였다: 예비 변성, 94 ℃ 5 분; 35 주기의 94 ℃ 40 초 변성, 56 ℃ 40 초 어닐링 및 72 ℃ 1 분 20초 연장; 연장, 72 ℃ 5 분. 그 결과, 8C11, 8H3 및 13D8의 단클론 항체가 바이러스와 결합할 수 있었다(도 6).
실시예 10: 바이러스를 포획하는 MAb 8H3의 능력에 대한 MAb 8C11의 향상 효과
바이러스 역가가 낮은 HEV양성 배설물 현탁액을 면역 포획된 RT-PCR 분석에 사용하였다. HEV를 포획하는 MAb 8H3의 능력에 대한 MAb 8C11 또는 13D8(대조용으로서)의 효과를 검출하기 위해서 다양한 농도의 MAb 8C11 또는 13D8(대조용으로서)을 미리 상기 배설물 현탁액에 가하였다. 하기 도 7에 개시한 바와 같이, MAb 8C11은 바이러스와 현저하게 결합하는 MAb 8H3의 능력을 특이적으로 향상시키는 반면, MAb 8C11의 유사한 에피토프 영역을 인식하고 또한 상기 바이러스를 포획하는 MAb 13D8은 상기와 같은 효과가 없었다.
3. 본 발명에 개시된 MAb의 중화 보호 효과
실시예 11: 붉은털 원숭이에 대한 HEV XM 균주의 감염 용량
배설물로부터의 HEV RNA의 추출, 역 전사 및 PCR: HEV RNA를 조작 설명서에 따라 트리졸 시약(GIBCOL)을 사용하여 배설물 현탁액의 다양한 희석액 200 ㎕로부터 추출하고, 여기에 RT 프라이머로서 특정한 프라이머 A3(4566-4568, 5'-ggctcaccggagtgtttcttc-3')과 함께 42 ℃에서 40 분간 AMV 역 전사효소를 사용하여 20 ㎕ 반응 부피로 역전사를 수행하였다. RT-PCR을 하기 반응 조건 하에서 2 ㎕의 RT 주형 및 A3 및 A5 프라이머(4341-4362, 5'-ctttgatgacaccgtcttctcg-3')를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 수행하였다: 예비 변성, 94 ℃ 5 분; 35 주기의 94 ℃, 40 초 변성, 68 ℃ 40 초의 어닐링 및 연장; 연장, 72 ℃ 5 분. 두 번째 라운드의 PCR은 하기 반응 조건 하에서 주형으로서 1 ㎕의 상기 처음 라운드 반응 산물 및 프라이머 B5(4372-4392, 5'-gccgcagcaaaggcatccatg-3') 및 B3(4554-4575, 5'-gtgtttcttccaaaaccctcgc-3')를 사용하여 20 ㎕의 최종 부피로 수행하였다: 예비 변성, 94 ℃ 5 분; 35 주기의 94 ℃ 40 초 변성, 56 ℃ 40 초 어닐링 및 72 ℃ 1 분 20초 연장; 연장, 72 ℃ 5 분. 상기 배설물의 PCR 역가를 희석된 시편이 양성 밴드양성 밴드로 검출될 수 있는 최고의 희석으로서 정의하였다.
101 내지 105 PCR 역가의 HEV XM 균주의 희석 용액 0.5 ㎖로 정맥 내 시험 감염시킨 모든 붉은털 원숭이들은 바이러스를 배설하였으며, 이는 성공적인 감염을 나타내었다. 이러는 동안, 100 PCR 역가로 시험 감염된 2 마리의 붉은털 원숭이는 그의 배설물에서 검출 가능한 바이러스를 나타내지 않았으며 항체 및 비 정상적인 ALT의 양의 전환을 보이지 않았고, 이는 성공적이지 못한 감염을 나타내었다. 따라서, HEV XM 균주의 50% 원숭이 감염 용량(MID50)은 약 101 PCR 검출 가능한 양이었다. 더욱 또한, 감염 용량이 낮을수록 바이러스 배설물에서의 양의 전환의 개시 시점이 늦어지는 경향이 있었다(표 8).
[표 8]
상이한 용량 감염된 붉은털 원숭이에서 검출 가능한 HEV 마커들
*: 13 일째 H9, 27 일째 H10, 63 일째 H11이 각각 이질로 죽었다.
실시예 12: MAb 8C11 및 8H3의 중화 보호 효과
12 마리의 원숭이를 4 개의 그룹(그룹 당 원숭이 3 마리)으로 나누었다. 그룹 1(원숭이 KF25 내지 27)을 대조군으로서 사용하고, 그룹 2(원숭이 KF16 내지 18)를 MAb 8C11에 의해 중화시키고, 그룹 3(원숭이 KF19 내지 21)을 MAb 8H3에 의해 중화시키고, 그룹 4(원숭이 KF22 내지 24)를 MAb 8C11과 8H3의 조합에 의해 중화시켰다. 희석된 HEV XM 균주 양성 배설물(103 PCR 역가로 희석됨) 2 ㎖과 단클론 항체 8C11 복수(약 1:105 역가) 2 ㎖ 또는 8H3 복수(약 1:104 역가) 2 ㎖ 또는 8C11 복수 1 ㎖과 8H3 복수 1 ㎖의 혼합물을 4 ℃에서 밤새(약 14 시간) 정치시키고, 이어서 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 대조용 그룹은 상기 MAb들과 배양하지 않았다. 바이러스-MAb의 각 혼합물 1 ㎖을 3 마리의 붉은털 원숭이에게 각각 정맥 내 주입하였다. RT-PCR에 의해 배설물 중의 HEV-RNA를 검출하기 위해서, 배설물 시편을 시험 접종일로부터 시작하여 2 주간 매일, 매주 2 회 수거하였다. 혈청 샘플을 ALT 및 항-HEV 항체의 측정을 위해 매주 취하였다.
결과를 표 9에 나타내었다. 대조용 그룹의 3 마리 원숭이는 모두 비정상적인 ALT를 보였으며 그들의 바이러스 배설물이 보다 일찍 나타났다. 중화된 그룹의 모든 원숭이들은 8C11 + 8H3 그룹(KF22)의 오직 한 마리의 원숭이가 비정상적인 ALT를 나타낸 것을 제외하고 바이러스 배설 개시 시간이 현저하게 늦어졌다. 8C11+8H3 그룹 중 한 마리의 원숭이(KF24)는 상기 과정 전체를 통해 바이러스 배설 및 HEV에 대한 항체 없이 완전히 보호되었다. 상기 그룹의 또 다른 원숭이(KF23)에 대해서, 감염 후 40 일 째에 바이러스 배설이 일어났으며, 2 주 미만으로 지속되었고 이어서 음성으로 변하였으며; 항-HEV IgM 항체가 전체를 통해 검출되지 않았고 IgG 항체는 56 일까지 양성으로 변하였다. 이러한 결과는 MAb 8C11 및 MAb 8H3 모두가 특정한 중화 효과를 가지며 2 개의 MAb 조합의 중화가 보다 분명함을 입증하였다.
[표 9]
MAb의 중화 시험
4. 본 발명의 MAb 및 감염 혈청의 상호 차단 효과
실시예 13: MAb에 대한 HEV 환자의 혈청의 차단 효과
NE2 MAb에 대한 2 개의 급성 HEV 환자의 혈청과 2 개의 정상적인 인간 혈청의 차단 능력을 검출하였다. 7 개의 효소 표지된 MAb를 NE2 미세 플레이트와 반응하는 상기 MAb의 OD 값이 1.0 내지 2.0인 농도로 희석하였다. NE2로 미리 피복된 미세웰들을 2 개의 그룹, 즉 차단 그룹과 대조군으로 나누었다. 상기 차단 그룹의 웰에 검출하려는 일련의 3 배 희석 된 혈청 100 ㎕(1:10, 1:30, 1:90, 1:270 및 1:810)를 각각의 희석을 위해 중복하여 가하였다. 12 개의 대조용 웰에 희석액 100 ㎕를 가하고, 2 개의 대조용 웰은 각각의 MAb에 상응하였다. 30 분간 배양한 후에, 플레이트를 5 회 세척하고 희석된 효소 표지된 MAb 1F6, 2C9, 8C11, 13D8, 15B2 및 16D7을 가하였다. 추가로 30 분간 배양시킨 후에, 플레이트를 5 회 세척하고, 블럿팅 건조시키고, 크로마토젠을 가하고 37 ℃에서 10 분간 배양하였다. 반응을 정지 완충액 50 ㎕로 정지시키고 각 웰에 대한 흡광도 OD450/620 ㎚를 측정하였다. MAb 8H3에 의해 인식된 NE2 에피토프를 8C11에 의해 강화시킬 수 있었으며, 따라서 MAb 8H3에 대한 혈청 차단 시험에 사용된 NE2 예비 피복된 미세웰을 먼저 30 분간 8C11에 의해 포화시켜(1:1000) 8H3 에피토프를 NE2 상에서 완전히 노출시킨 다음 유사한 혈청 차단 시험을 수행하였다. MAb에 대한 혈청의 차단율은 (평균 대조용 OD - 평균 차단된 OD)/평균 대조용 OD * 100%이다. 상기 혈청의 차단 역가를 차단율이 50% 이상인 최고의 희석으로서 규정하였다.
표 10에 개시된 바와 같이, 급성 환자의 혈청은 형태적인 에피토프를 인식한 5 개의 MAb의 반응을 현저하게 차단하였으나, 선형 에피토프를 인식한 MAb 15B2는 차단하지 않았다. 하나의 급성 환자의 혈청은 선형 에피토프 MAb 16D7을 차단할 수 있었고 다른 혈청의 차단율은 항상 50% 이하였으며 이는 희석율이 증가함에 따라 감소하는 경향이 있다(도 8). 정상적인 인간 혈청은 어떠한 MAb에 대해서도 차단 효과를 갖지 않았다. 상이한 단클론 항체들에 대한 상이한 희석율의 하나의 급성 환자의 혈청의 차단 효과를 도 8에 예시하였다. 낮은 희석율에서, 5 개의 형태적인 MAb에 대한 차단율은 모두 90% 이상이었음을 알 수 있었으며, 이는 차단율이 희석율의 증가에 따라 감소하는 명백한 용량 효과를 가리켰다.
[표 10]
NE2 MAb에 대한 인간 혈청의 차단 효과
*: 혈청의 차단 역가는 차단율이 50% 이상인 최고의 희석으로서 정의하였다.
&: T1.0은 OD 값이 간접 ELISA에 의해 검출 시 1.0 이상인 대조용의 희석된 혈청의 최고 혈청 희석이었다.
실시예 14: HEV 감염된 혈청에 대한 항-NE2 MAb의 차단 효과
상이한 항-NE2 MAb에 의한 HEV 환자의 회복 혈청의 차단
NE 피복되고 차단된 미세 플레이트에서, 8 개의 희석된 항-NE2 MAb(1:1000) 100 ㎕, 동 분액의 MAb 8C11과 8H3의 혼합물 및 차단되지 않은 대조군으로서 희석액을 각각 가하고; 37 ℃에서 30 분간 배양하고 블럿팅 건조시키고; 이어서 HEV 환자로부터 대조용의 희석된 회복 혈청을 가하고 37 ℃에서 30 분간 배양시키고, PBST로 5 회 세척하고 블럿팅 건조시키고, 이어서 희석된 항-인간 IgG-HRP 100 ㎕를 가한 다음 37 ℃에서 30 분간 배양시키고; 다시 5 회 세척하고 블럿팅 건조시키고; 크로마토젠을 가하여 37 ℃에서 10 분간 배양시키고, 상기 반응을 정지 완충액(2 M H2SO4) 50 ㎕로 정지시키고, OD450/620㎚의 흡광도를 측정하였다. 대조용 OD 값이 1.0 내지 2.0인 희석율을 선택하여 하기 식에 의해 차단율을 계산하였다: 차단율 = (1 - 차단된 OD)/차단되지 않은 OD) * 100%. 하나 이상의 차단되지 않은 웰이 1.0 내지 2.0의 OD 값을 갖는 경우, 평균 차단율을 혈청에 대한 상기 MAb의 차단율로서 간주할 수 있다. 차단율이 50% 이상인 경우 양으로서 간주될 것이다. 도 11에 개시된 바와 같이, 8C11과 8H3의 혼합물(8C11+8H3)이 3 개의 환자 혈청을 현저하게 차단시킬 수 있는 반면, MAb 8C11 및 13D8은 또한 혈청 514 및 454를 차단시킬 수 있다.
[표 11]
HEV 환자의 회복 혈청에 대한 항-NE2 MAb의 차단 효과
-, 차단율이 50% 이하였다.
상이한 단계의 HEV 감염된 원숭이들의 혈청에 대한 다양한 MAb의 차단 효과
상이한 단계의 3 HEV 감염된 원숭이의 혈청에 대한 상이한 MAb 차단 효과의 차이를 밝혀내기 위해서, 차단 시험을 유사한 방식으로 수행하였다. 표 12에 나타낸 바와 같이, 결과는 인간 혈청의 것과 유사하였다, 즉 MAb 8C11 및 13D8은 임의의 단계에서 원숭이 혈청을 현저하게 차단할 수 있었으며, 이는 상기 2 개의 MAb에 의해 인식된 에피토프가 면역 우성임을 가리키며; 8C11+8H3의 합해진 차단율은 실질적으로 90% 이상이었고, 8C11 또는 13D8의 것보다 더 높았으며, 이는 8H3에 의해 인식된 에피토프가 또 다른 면역-우성의 것에 의해 인식됨을 입증한다. 이들 2 개의 에피토프에 대한 항체는 상이한 감염 단계의 항-NE2 항체들 중에서 중요하였다. 8H3 단독에 의해서는 유효 차단이 관찰되지 않았으며, 이는 바이오센서에 의해 측정된 MAb 8C11 또는 8H3과 NE2와의 결합 곡선에 의해 설명될 수 있다. 8C11과 동시에 NE2에 결합 시 8H3에 의해 인식된 에피토프는 8C11을 통해 유도된 형태의 변화에 의해 NE2에 완전히 노출되었으며, 이에 의해 상응하는 항체와 보다 빠르고 단단히 결합할 수 있었고, 따라서 8C11과 8H3의 결합된 차단은 상응하는 에피토프를 유효하게 차단할 수 있었다.
추정 상 8C11 및 8H3이 NE2와 동시에 결합한 경우, 따라서 항원과 상기 2 개의 에피토프에 인접한 다른 에피토프를 인식하는 항체가 결합한 경우 입체 장애 효과가 발생한다는 또 다른 이유가 존재하였다. MAb 8C11 및 8H3의 차단 효과에 대한 상기와 같은 입체 장애의 영향을 밝혀내기 위해서, 상기 2 MAb의 Fab 단편을 파파인 절단에 의해 절제하여 상기 입체 장애 효과를 현저하게 감소시키고, 이어서 유사한 차단 실험을 수행한다. 결과를 도 9에 나타내었다. 이들 Fab 단편의 차단 효과는 전체 항체의 것과 거의 동일하였으며, 이는 HEV-감염된 혈청에 대한 MAb 8C11 및 8H3의 차단 효과가 에피토프-특이적임을 가리킨다. HEV-감염된 혈청에 대한 8C11 및 8H3의 명백한 차단 효과는 이들 2 개의 에피토프가 HEV 감염 도중 NE2 도메인 내에서 가장 중요한 면역-우세 에피토프이며 이들의 상응하는 항체는 주요 항체로서 장시간 지속됨을 가리킨다.
[표 12]
감염된 원숭이의 상이한 단계의 혈청에 대한 항-NE2 MAb의 차단 효과
-, 차단율이 50% 이하였다.
5. 본 발명의 상기 단클론 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자들의 단리 및 발현
실시예 15: 단클론 항체 13D8의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자들의 단리
13D8 마우스 기원의 107 하이브리도마 세포를 반-융합성으로 배양하고, 현탁시키고 이어서 새로운 4 ㎖ 원심분리 튜브로 옮겼다. 상기 세포를 1500 rpm에서 3 분간 회전시킴으로써 수거하였다. 펠릿을 100 ㎕ 멸균 PBS(pH 7.45)에 재 현탁시키고 새로운 1.5 ㎖ 원심분리 튜브로 옮겼다. 800 ㎕ 트리졸(Roche, Germany)을 상기 튜브에 가하였다. 상기 용액을 서서히 전환시킴으로써 철저히 혼합하고 10 분간 정치시켰다. 상기 튜브를 클로로포름 0.2 ㎖을 가한 후에 15 초 간 격렬히 진탕시키고, 10 분간 정치시키고, 이어서 4 ℃, 12000 rpm에서 15 분간 원심분리시켰다. 상구 수성 상을 새로운 1.5 ㎖ 원심분리 튜브로 옮긴다음 동 부피의 이소프로판올을 가하였다. 상기 튜브를 수회 뒤집어 혼합하고 10 분간 정치시키고, 이어서 4 ℃, 12000 rpm에서 원심분리시켰다. 상등액을 버렸다. 펠릿을 75% 에탄올 600 ㎕를 가하여 세척하였다. 상기 튜브를 4 ℃, 12000 rpm에서 5 분간 원심분리시켰다. 상등액을 버렸다. 펠릿을 60 ℃에서 진공 하에 5 분간 건조시키고, 이어서 DEPC H2O 70 ㎕에 용해시켰다. 상기 용액에 1 ㎕ 역 전사 프라이머 올리고(dT)(12-18)(Progega), 1 ㎕ dNTP(Shenggong, Shanghai)를 가하고, 이어서 72 ℃에서 수 욕에서 10 분간 배양하였다. 상기 튜브를 즉시 얼음 상에 5 분간 두고, 20 ㎕ 5 x RT 완충액, 2 ㎕ AMV(10 u/㎕, Promega) 및 1 ㎕ Rnasin(40 u/㎕, Promega)을 가하고, 이어서 혼합하였다. cDNA를 42 ℃에서 역 전사에 의해 합성하였다.
항체 유전자를 Ig-프라임 키트(Novagen) 및 또 다른 구상된 하향 프라이머 MKCR1(Bioasia, Shanghai에 의해 합성됨)를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 단리시켰다. 상기 합성된 13D8 cDNA를 주형으로서 사용하였다.
경쇄 유전자를 Kappa 쇄에 대해 7 개 조의 MuIgkVL5'-A 내지 G의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MKCR(5'-TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCC TGT TGA A-3')을 사용하여 단리시켰다. 구배 PCR 증폭을 프라이머 MKCR1 및 7 개의 상향 프라이머 각각으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 47 내지 56 ℃에서 수행하였다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgKVL5'-G3(5'-ATG GT(C/T) CT(C/T) AT(A/C/G) TT(A/G) CTG CTG CTA TGG-3')/MKCR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 53 ℃ 1 분, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 13D8 경쇄 서열로서 동정하였다. 상기 가변 영역을 서열식별번호: 5로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 6이었다.
중쇄의 가변 영역 유전자를 6 개 조의 MuIgGVH5'-A 내지 F의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MVHR(5'-CCC AAG CTT CCA GGG (A/G)CC A(A/G)(G/T) GGA TA(A/G) AC(A/G/C/T) G(A/G)T GG-3')을 사용하여 단리시켰다. 구배 PCR 증폭을 프라이머 MVHR 및 6 개의 상향 프라이머 각각으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 47 내지 56 ℃에서 수행하였다. 그 결과, 약 400 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgGVH5'-C2(5'-CGA CAT GG(A/C/G) TTG G(C/G)T GTG GA(A/C) CTT GC(C/T) ATT CCT-3')의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 53 ℃ 1 분, 72 ℃ 40 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 13D8 중쇄(서열식별번호: 7) 서열로서 동정하고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 8이었다.
실시예 16: 13D8 단일 쇄 항체의 클로닝, 발현, 정제 및 활성 측정
13D8 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 (GGGGS)3의 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결하여 단일 쇄 항체의 DNA 단편을 제조하였다. 13D8 중쇄의 가변 영역의 DNA 단편을 13D8HF1(5'-gAA TTC gAT GTA CAA CTT CAg g-3')13D8HR1(5'-gCT ACC ACC CCC TCC AgA TCC gCC ACC TCC TgA AgA TAC ggT gAC CgT ggT gCC-3')의 프라이머 쌍으로 증폭시키고 13D8 경쇄의 가변 영역의 DNA 단편은 13D8KF1(5'-A TCT ggA ggg ggT ggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAC ATC CAg ATg ACT CAg-3')/13D8KR1(5'-gTC gAC CCG TTT GAT TTC CAG C-3')의 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. 이들 2 개의 단편을 각각 회수하고 상기와 같은 2 개의 단편을 서로에 대한 프라이머 및 주형으로서 사용하여 새로운 PCR 시스템에서 단일 쇄 항체의 완전한 길이의 단편으로 조립하였다. 단일 쇄 항체의 새로 수득된 완전한 길이의 단편을 주형으로서 사용하여 프라이머 쌍 13D8HF1/13D8KR1과 함께 추가로 증폭시켰다. 회수된 단일 쇄 항체 단편을 pMD 18-T 벡터에 클로닝시켰다. 상기 단일 쇄 항체 단편을 생성된 플라스미드로부터 EcoRI/SalI으로 절단시켜 회수하고, 이어서 동일한 효소로 절단시킨 원핵 발현 벡터 pTO-T7에 클로닝시켰다. 이 콜라이 균주 ER256을 생성된 재조합 플라스미드 pTO-T7-13D8로 형질전환시키고, 개별적인 콜로니를 집어내어 500 ㎖ LB 배지(100 ㎍/㎖ Kan 함유)에서 증식시켰다. 배양을 37 ℃에서 밤새 진탕기에서 수행하였다. 세균 배양 배지의 OD600이 약 0.8에 도달했을 때, IPTG를 유도를 위해 0.2 밀리몰/L의 최종 농도로 가하고, 세균 수확 전에 배양을 30 ℃에서 6 시간 동안 지속하고 세균을 초음파 처리에 의해 붕괴시켰다. 15,000 rpm에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 침전물을 상등액과 동일한 부피의 20 밀리몰/L 트리스-HCl(pH 7.6)에 용해시켰다. 동 부피의 상등액 및 침전물 용액에 대해 SDS-PAGE를 수행하였다. 퇴적 겔과 분해 겔의 농도는 각각 5% 및 12%였다. 발현된 단백질은 주로 불용성 봉입체의 형태로 존재하는 것으로 관찰되었다. 초음파 처리로부터의 침전물을 2% 트리톤으로 2 회 세척한 다음 각각 2M, 4M 및 8M 우레아에 용해시키고 상기 용해된 용액 각각에 대해 12% SDS-PAGE를 수행하였다. 단일 쇄 항체는 주로 8M 우레아에 용해되는 것으로 밝혀졌다. 8M 우레아에 용해된 단일 쇄 항체를 1 x PBS에 점차적으로 투석시킴으로써 변성시켰다. 펠릿을 12000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고 버렸다. 수득된 단일 쇄 항체 용액의 활성을 분석하였다.
예비 정제시킨 13D8 단일 쇄 항체의 활성을 경쟁 ELISA에 의해 검출하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 1:40000으로 희석된 정제된 NE2로 피복하고 BSA로 차단시켰다. 상기 단일 쇄 항체 용액 50 ㎕ 및 HRP-표지된 13D8 단클론 항체 50 ㎕를 1:500으로 희석하여 검출하려는 샘플 웰에 가하였다. 1 x PBS 용액 50 ㎕ 및 HRP-표지된 13D8 단클론 항체 50 ㎕를 1:500으로 희석하여 음성 대조군 웰에 가하였다. 표지되지 않은 13D8 단클론 항체 50 ㎕ 및 HRP-표지된 13D8 단클론 항체 50 ㎕를 1:500으로 희석하여 양성 대조군 웰에 가하였다. 분석을 3 중으로 수행하였다. 혼합 후에 상기 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고, 이어서 크로마토젠 A 및 B를 가하였다. 색상을 37 ℃에서 15 분간 전개시켰다. 상기 반응을 정지시키고 흡광도를 미세플레이트 판독기에서 측정하였다. 그 결과, 음성 대조군의 평균 값은 2.955이고, 양성 대조군의 평균 값은 0.731이고, 검출하려는 샘플 웰의 평균 값은 0.624였다. 상기 결과는 예비 정제된 13D8 단일 쇄 항체가 높은 활성을 가짐을 보였다.
실시예 17: 단클론 항체 8C11의 경쇄의 가변 영역 유전자 및 중쇄의 Fd 단편의 단리
전체 RNA를 상기 언급한 동일한 방법에 의해 8C11의 1 x 107 반 융합성 마우스 기원 하이브리도마 세포로부터 추출하고, cDNA를 역 전사에 의해 합성하였다. 유사하게, 항체 가변 영역 유전자를 Ig-프라임 키트(Novagen) 및 2 개의 다른 구상된 하향 프라이머 MFdR1 및 MFdR2(Bioasia, Shanghai), 및 주형으로서 상기 합성된 8C11 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 단리시켰다.
경쇄 가변 영역 유전자를 Kappa 쇄에 대해 7 개 조의 MuIgkVL5'-A 내지 G의 상향 프라이머 및 3' 프라이머 MulgkVL3'-1(5'-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA-3')을 사용하여 단리시켰다. 구배 PCR 증폭을 하나의 하향 프라이머 및 7 개의 상향 프라이머 각각으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 47 내지 56 ℃에서 수행하였다. 그 결과, 약 400 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgKVL5'-G3/MulgkVL3'의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 35 초, 53 ℃ 1 분, 72 ℃ 40 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 8C11 경쇄 서열로서 동정하였다. 상기 가변 영역을 서열식별번호: 9로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 10이었다.
중쇄 유전자의 Fd 단편을 6 개 조의 IgG에 대한 MuIgGVH5'-A 내지 F의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MFdR1(5'-ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3') 및 MFdR2(5'-ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC-3')을 사용하여 단리시켰다. 구배 PCR 증폭을 하향 프라이머 MFdR1/MFdR2 및 6 개의 5' 프라이머 각각으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 47 내지 56 ℃에서 수행하였다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgGVH5'-C2(5'-CGA CAT GG(A/C/G) TTG G(C/G)T GTG GA(A/C) CTT GC(C/T) ATT CCT-3')/MFdR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 57 ℃ 50 초, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 8C11 중쇄의 Fd 단편으로서 동정하고 가변 영역 서열의 일부를 서열식별번호: 11로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 12였다.
실시예 18: 8C11 단일 쇄 항체의 클로닝, 발현, 정제 및 활성 측정
8C11 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들을 (GGGGS)3의 짧은 펩타이드 링커에 의해 연결하여 단일 쇄 항체의 DNA 단편을 제조하였다. 8C11 중쇄의 가변 영역의 DNA 단편을 8c11HF1(5'-ggA TCC CAT ATg CAg gTT ACT CTg AAA gAg-3')/8c11HR1(5'-gCT ACC CCC TCC AgA TCC gCC ACC TCC TgA ggA gAC ggC gAC TgA-3')의 프라이머 쌍으로 증폭시키고 8C11 경쇄의 가변 영역의 DNA 단편은 8c11KF1(5'-A TCT ggA ggg ggT ggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAC ATC CAg ATg ACT Cag-3')/8c11KR1(5'-gTC gAC CCg TTT gAT TTC CAg CTT gg-3')의 프라이머 쌍으로 증폭시켰다. 이들 2 개의 단편을 서로에 대한 프라이머 및 주형으로서 사용하여 새로운 PCR 시스템에서 단일 쇄 항체의 완전한 길이의 단편으로 조립하였다. 단일 쇄 항체의 새로 수득된 완전한 길이의 단편을 프라이머 쌍 8C11HF1/8C11KR1과 함께 추가로 증폭시켰다. 회수된 단일 쇄 항체 단편을 pMD 18-T 벡터에 클로닝시켰다. 상기 단일 쇄 항체 단편을 생성된 플라스미드로부터 BamHI/SalI으로 절단시켜 회수하고, 이어서 동일한 효소로 절단시킨 원핵 발현 벡터 pTO-T7에 클로닝시켰다. 이 콜라이 균주 ER2566을 사용하여 상기 언급한 유사한 방법에 의해 단일 쇄 항체를 발현시켰다. 발현된 단백질은 불용성 봉입체의 형태로 존재하는 것으로 관찰되었다. 초음파 침전물을 상술한 바와 동일한 방법을 통해 정제하였다. 단일 쇄 항체는 주로 8M 우레아에 용해되었다. 8M 우레아에 용해된 단일 쇄 항체를 1 x PBS에 점차적으로 투석시킴으로써 변성시켰다. 펠릿을 12000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고 버렸다. 수득된 단일 쇄 항체 용액의 활성을 검출하였다.
예비 정제시킨 8C11 단일 쇄 항체의 활성을 경쟁 ELISA에 의해 검출하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 1:160000으로 희석된 정제된 NE2로 피복하고 BSA로 차단시켰다. 상기 단일 쇄 항체 용액 50 ㎕ 및 HRP-표지된 8C11 단클론 항체 50 ㎕를 1:500으로 희석하여 검출하려는 샘플 웰에 가하였다. 1 x PBS 용액 50 ㎕ 및 HRP-표지된 8C11 단클론 항체 50 ㎕를 1:1000으로 희석하여 음성 대조군 웰에 가하였다. 표지되지 않은 8C11 단클론 항체 50 ㎕ 및 HRP-표지된 8C11 단클론 항체 50 ㎕를 1:1000으로 희석하여 양성 대조군 웰에 가하였다. 분석을 3 중으로 수행하였다. 혼합 후에 상기 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하고, 이어서 크로마토젠 A 및 B를 가하였다. 색상을 37 ℃에서 15 분간 전개시켰다. 상기 반응을 정지시키고 흡광도를 미세플레이트 판독기에서 측정하였다. 그 결과, 음성 대조군의 평균 값은 1.852이고, 양성 대조군의 평균 값은 0.541이고, 검출하려는 샘플 웰의 평균 값은 0.162였다. 상기 결과는 예비 정제된 8C11 단일 쇄 항체가 높은 활성을 가짐을 입증하였다.
실시예 19: 단클론 항체 8H3 Fab 유전자(경쇄 및 중쇄의 Fd 단편)의 단리
전체 RNA를 상기 언급한 동일한 방법에 의해 8H3의 1 x 107 반 융합성 마우스 기원 하이브리도마 세포로부터 추출하고, cDNA를 역 전사에 의해 합성하였다. 유사하게, 항체 유전자의 Fab 단편을 Ig-프라임 키트(Novagen) 및 MFdR1, MFdR2 및 MKCR1(Bioasia, Shanghai)의 3 개의 하향 프라이머, 및 주형으로서 상기 합성된 8H3 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 단리시켰다.
경쇄 유전자를 Kappa 쇄에 대해 7 개 조의 MuIgkVL5'-A 내지 G의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MKCR1을 사용하여 단리시켰다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgKVL5'-G2(5'-CGA CAT GGT (C/T)CT(C/T)AT (A/C/G)TC CTT GCT GTT CTG G-3')/MKCR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 56 ℃ 35 초, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 8H3 경쇄 서열로서 동정하였다. 상기 가변 영역을 서열식별번호: 13으로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 14였다.
중쇄 유전자의 Fd 단편을 6 개 조의 IgG에 대한 MuIgGVH5'-A 내지 F의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MFdR1 및 MFdR2를 사용하여 단리시켰다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgVH5'-C1(5'-CGA CAT GGC TGT C(C/T)T (A/G)G(C/G/T) GCT G(C/T)T C(C/T)T CTG-3')/MFdR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 50 ℃ 1 분, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 8H3 중쇄의 Fd 단편으로서 동정하고 가변 영역 서열의 일부를 서열식별번호: 15로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 16이었다.
실시예 20: 단클론 항체 16D7 Fab 유전자(경쇄 및 중쇄의 Fd 단편)의 단리
전체 RNA를 상기 언급한 동일한 방법에 의해 16D7의 1 x 107 반 융합성 마우스 기원 하이브리도마 세포로부터 추출하고, cDNA를 역 전사에 의해 합성하였다. 유사하게, 항체 유전자의 Fab 단편을 Ig-프라임 키트(Novagen), 및 MFdR1 및 MFdR2(Bioasia, Shanghai)의 2 개의 하향 프라이머, 및 주형으로서 상기 합성된 16D7 cDNA를 사용하여 PCR에 의해 단리시켰다.
경쇄 유전자를 Kappa 쇄에 대해 7 개 조의 MuIgkVL5'-A 내지 G의 상향 프라이머 및 하향 프라이머 MKCR1을 사용하여 단리시켰다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgkVL5'-F4(5'-CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT-3')/MKCR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 57 ℃ 35 초, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 16D7 경쇄 서열로서 동정하고 가변 영역 서열의 일부를 서열식별번호: 17로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 18이었다.
구배 PCR 증폭을 하향 프라이머 MFdR1/MFdR2 및 6 개의 상향 프라이머 각각으로 구성된 프라이머 쌍을 사용하여 47 내지 56 ℃에서 수행하였다. 그 결과, 약 700 bp의 단일 DNA 단편을 하기 PCR 조건 하에서 MuIgVH5'-E2(5'-CGA CAT GG(A/G) ATG GA(C/G) C(G/T)(G/T)(A/T/C/G)(A/G)T CTT T(A/C)T CT-3')/MFdR1의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켰다: 94 ℃ 5 분에 이어서 35 주기의 94 ℃ 40 초, 54 ℃ 1 분, 72 ℃ 50 초, 및 최종적으로 72 ℃ 15 분. 상기 단편을 회수하고 pMD 18-T 벡터로 클로닝시키고 이어서 서열화하였다(Bioasia, Shanghai). 상기 서열을 BLAST 정렬 후에 16D7 중쇄의 Fd 단편으로서 동정하고 가변 영역 서열의 일부를 서열식별번호: 19로 나타내고 그의 추론된 아미노산 서열은 서열식별번호: 20이었다.
실시예 21: CHO 세포에서 8C11 인간-마우스 키메릭 항체의 발현 및 활성 분석
8C11 마우스 항체 유전자의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역들을 각각 인간 항체 유전자의 경쇄 및 중쇄의 일정한 영역과 융합시켰다. CHO 세포에서 발현된 후에, 전체 인간-마우스 키메릭 항체는 조립되어 세포 배양액의 상등액에 분비될 수 있다. 여기에 사용된 발현 벡터는 2 가지 유형의 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1-Hyg(선택적 마커로서 하이그로마이신) 및 pcDNA3.1-Neo(선택적인 마커로서 네오마이신)의 플라스미드였다.
4 개의 프라이머를 합성하였다. 인간 카파 경쇄의 일정 영역 유전자를 프라이머 쌍으로서 hKCF(5'-CTC gAg ACT gTg gCT gCA CCA TC-3')/hKCR(5'-ggA TCC TCT AgA TTA ACA CTC TCC CCT gTT g-3') 및 주형으로서 플라스미드 pAG4622를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 pMD18-T 벡터 내로 클로닝하였다. 단편을 XhoI/XbaI으로 절단하여 생성된 플라스미드로부터 회수하고 동일한 효소에 의해 절단된 pcDNA3.1-Neo 벡터 내로 클로닝시켜 플라스미드 pcDNA3.1-Ak를 생성시켰다. 인간 감마 1 중쇄의 일정 영역 유전자를 프라이머 쌍으로서 hHCF(5'-CTC gAg gCA AgC TTC AAg ggC C-3')/hHCR(5'-ggA TCC TCT AgA TTA TTT ACC Cgg AgA CAg g-3') 및 주형으로서 플라스미드 pAH4604를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 pMD18-T 벡터 내로 클로닝하였다. 단편을 XhoI/XbaI으로 절단하여 생성된 플라스미드로부터 회수하고 동일한 효소에 의해 절단된 pcDNA3.1-Hyg 벡터 내로 클로닝시켜 플라스미드 pcDNA3.1-AH를 생성시켰다.
신호 펩타이드를 갖는 8C11 경쇄의 가변 영역을 프라이머 쌍으로서 8C11hVkF(5'-gAA TTC ATG AGT GTG CCC ACT CAG GTC CTG GGG TTG CTG CTG CTG TGG CTT CAC GAT GCC AGA TGT GAC ATC CAG ATG ACT CAG-3')/8C11hVkR(5'-CTC gAg CCg TTT gAT TTC CAg CTT gg-3') 및 주형으로서 실시예 17로부터 수득된 8C11 경쇄 유전자를 함유하는 pMD18-T 벡터를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 pMD18-T 벡터에 클로닝시키고 EcoRI/XhoI으로 생성된 플라스미드로부터 절단시키고, 이어서 플라스미드 pcDNA3.1-Ak의 동일한 부위 내로 클로닝시켜 인간-마우스 키메릭 경쇄를 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1-Ak8C를 생성시켰다.
신호 펩타이드를 갖는 8C11 중쇄의 가변 영역을 프라이머 쌍으로서 8C11hVhF(5'-gAA TTC AgA TCT ATG GGC AGG CTT ACT TCT TCA TTC CTG CTA CTG ATT GTC CCT GCA TAT GTC CTG TCC CAG GTT ACT CTG AAA GAG TC-3')/8C11hVhR(5'-CTC gAg TGA GGA GAC GGC GAC TG-3') 및 주형으로서 실시예 17로부터 수득된 8C11 중쇄 Fd 유전자를 함유하는 pMD18-T 벡터를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 pMD18-T 벡터에 클로닝시키고 BglII/XhoI으로 생성된 플라스미드로부터 절단시키고, 이어서 플라스미드 pcDNA3.1-AH의 동일한 부위 내로 클로닝시켜 인간-마우스 키메릭 중쇄를 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1-AH8C를 생성시켰다.
이들 2 개의 플라스미드 pcDNA3.1-Ak8C 및 pcDNA3.1-AH8C를 리포솜 매개된 형질감염에 의해 포유동물 CHO 세포 내로 동시 형질감염시켰다. 상기 리포솜은 인비트로젠(Invitrogen)의 리포펙타민 TM 시약이었다. 형질감염된 세포를 24웰 플레이트에서 2 일 동안 배양하고 이어서 웰 당 100 세포 미만으로 6 웰 플레이트로 옮겼다. 하이그로마이신과 네오마이신을 선택을 위해 동시에 배양 배지에 가하였다. 2 주 후에, 배양 상등액과 부분 세포를 수거하였다. 상기 세포를 동결과 해동을 4 회 반복하여 분열시키고 세포 상등액을 원심분리에 의해 수거하였다. 간접적인 ELISA를 사용하여 음성 대조군으로서 동일한 처리에 의해 형질감염되지 않은 CHO 세포에 대한 상등액의 활성을 검출하였다.
96-웰 ELISA 플레이트를 항원 NE2로 피복하고 BSA로 차단시켰다. 샘플 100 ㎕ 뿐만 아니라 음성 대조군을 3 중으로 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 각각의 웰에 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG 항체 100 ㎕를 1:5000으로 희석하여 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 반 시간 동안 배양시켰다. 세척 후에, 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B를 가하고 색상을 37 ℃에서 15 분간 발색시켰다. 반응을 멈추고 흡광도를 미세플레이트 판독기에 의해 측정하였다. 결과는 음성 대조군으로서 세포의 배양 상등액의 평균 값이 0.093인 반면, 8C11 인간-마우스 키메릭 항체를 발현하는 세포의 배양 상등액의 평균 값은 2.346임을 보였다. 음성 대조군으로서 분열된 세포의 배양 상등액의 평균 값이 0.132인 반면, 8C11 인간-마우스 키메릭 항체를 발현하는 분열된 세포의 배양 상등액의 평균 값은 3.534였다.
상기 결과는 CHO 세포에 의해 발현된 8C11 인간-마우스 키메릭 항체가 세포 내에서 정확하게 조립되어 높은 활성으로 세포로부터 분비됨을 입증한다.
6. 본 발명에 따른 단클론 항체에 의해 인식된 에피토프를 갖는 재조합 폴리펩타이드 HEV ORF2의 동정, 및 항원 결정 성질을 갖는(특히 바이러스형 입자로 조립되는 성질을 갖는) 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 동족체의 제조
실시예 22: NE2-형 재조합 폴리펩타이드 HEV ORF2와 단클론 항체의 상호작용
HEV ORF2 폴리펩타이드(표 13에 나타냄)를 실시예 1의 방법에 따라 pTO-T7 벡터 내로 클로닝하고, 발현시키고 정제하였다. 발현된 재조합 HEV ORF2 폴리펩타이드를 실시예 2의 방법에 따라 HRP-표지된 단클론 항체를 사용하여 ELISA에 의해 검출하였다.
각각의 정제된 폴리펩타이드 10 ㎕(1 ㎎/㎖)를 반복해서 서서히 니트로셀룰로즈 멤브레인 상에 점으로 찍고 공기 건조시켰다. 실온에서 1.5 시간 동안 5% 탈지 우유로 차단시킨 후에, 단클론 항체(5% 탈지 우유로 1:100으로 희석된 단클론 B 림프구에 의해 분비된 세포 상등액)를 가하고, 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이어서 상기 멤브레인을 TNF(10 mM 트리스.Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈 20)로 3 회(5 분 간격) 세척하였다. HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG(JINGMEI Biological Company에 의해 생산됨, 5% 탈지 우유에 의해 1:1000으로 희석됨)를 가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. TNT로 3 회(5 분 간격) 세척한 후에, NBT/BCIP(C40H30N10O6Cl2/C8 H6BrClNO4P.C7H9N)를 가하여 색을 전개시켰다. 전개된 점들을 UVI 겔 영상화 시스템으로 주사하고 회색도의 값들로 전환시켰으며, 이를 ++++, +++, ++, +, +/-의 5 개의 양의 등급과 -의 음의 등급으로 나눈다. 결과를 표 13에 나타내며, 이는 폴리펩타이드 148C(459-603PPR) 및 208N(394-601)이 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8과 반응성임을 보였다. 따라서, 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 의해 인식된 에피토프 영역은 상기 언급한 2 개의 폴리펩타이드의 중복 영역 459-601에 위치하는 것으로 추정되었다. 단클론 항체 16D7에 의해 인식된 에피토프 영역을 위치 측정하기 위해서, 다른 폴리펩타이드 97C(AA564-AA660), 161(AA499-AA660) 및 170P(AA345-AA515)를 단클론 항체 16D7과의 활성에 대해 시험하였다. 결과는 97C가 16D7과 반응성이 없는 반면, 161 및 170P는 16D7과 반응성임을 보였다. 이 결과는 16D7에 의해 인식된 에피토프 영역이 HEV ORF2의 AA499-515에 위치할 수도 있음을 가리켰다. 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대해 탁월한 항원성을 갖는 폴리펩타이드는 대개 SDS-PAGE 상에서 이량체로서 존재하며, 이는 이량체의 형성이 상기 3 개의 단클론 항체에 대한 에피토프의 적절한 폴딩 및/또는 완전한 노출에 유리함을 시사하였다.
[표 13]
NE2-형 재조합 폴리펩타이드 HEV ORF2와 단클론 항체들의 상호작용
기호 *는 -P-P-R이 폴리펩타이드 서열의 C-말단에 첨가되었음을 의미한다.
폴리펩타이드와 단클론 항체의 상호작용을 P/N 비, 즉 음성 대조용 웰의 OD 값에 대한 샘플 웰의 OD 값의 비(음성 대조용 웰의 OD 값이 0.05 미만인 경우, 0.05는 음성 OD 값을 가리킨다)를 계산함으로써 -에서 ++++까지 등급화할 수 있다. 따라서 상기 등급을 하기와 같이 정의한다: -(즉 음성), P/N<3; +/-, 3<P/N<6; +, 6<P/N<10; ++, 10<P/N<30; +++, 30<P/N<50; ++++, P/N>50.
실시예 23: NE2 폴리펩타이드의 이량체화 영역 상의 돌연변이로부터 유도된 변이체의 발현 및 단클론 항체에 대한 그의 항원성
NE2는 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 의해 단량체 형태보다는 이량체 형태로 보다 강하게 인식된다. 상기 이량체는 8 몰/L 우레아 처리에 의해 단량체로 완전히 분해될 수 있으며, 이때 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 항원성이 현저하게 감소되었다. 이러한 현상은 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 의해 인식된 NE2 상의 에피토프의 적절한 폴딩 및/또는 완전한 노출이 NE2 폴리펩타이드의 단독 이량체화와 밀접하게 상관이 있으며 상기와 같은 단독 이량체화는 단량체들의 소수성 상호작용에 따라 변할 수 있음을 제시하였다.
AA600의 C 말단의 끝을 절단함으로써 NE2로부터 유도된 변이체는 이량체화할 수 없었으며, 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 항원성이 크게 감소하였다. 이는 AA600 부근에 위치한 영역이 NE2 및 그의 동족체의 이량체화에 중요한 역할을 함을 가리킨다. 이러한 추론을 입증하기 위해서, 일련의 부위 지향된 돌연변이를 AA600 영역에 도입시켰다.
상기 NE2 폴리펩타이드를 PCR 및 클로닝 기법에 의해 부위-지향된 돌연변이를 가하고 이량체화에 대한 핵심 부위를 이량체화의 존재를 관찰함으로써 확인하였다. 먼저, AA601 상의 Leu를 Ile, Pro, Glu, Gly, Asp, His, Lys, Gln 및 Cys로 각각 치환하였다. 상기 방법을 하기와 같이 상세히 개시한다:
AA601-돌연변이된 C-말단을 얻기 위해서, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 주형으로서 NE2를, 상향 프라이머로서 601LIFP(Leu가 Ile로 변이된 프라이머)를, 하향 프라이머로서 HERP를 사용하여 수행하였다. 이어서 두 번째 PCR을 주형으로서 NE2를, 상향 프라이머로서 HEFP를, 하향 프라이머로서 회수된 변이된 C-말단 단편을 사용하여 수행하였다. 증폭된 완전한 길이의 NE2 변이체를 601LI로서 명명하였으며, 이어서 이를 벡터 pMD18-T에 연결시키고 이어서 BamHI/HindIII로 절단하여 양성 클론 pMD 18-T-601LI를 동정하였다. 이 클론을 NdeI 및 EcoRI으로 절단하여 관심 601LI 유전자를 수득하고, 이어서 이를 NdeI/EcoRI-절단된 pTO-T7에 클로닝시켰다. 정확하게 삽입된 것으로 동정된 클론은 pTO-T7-601LI이며, 발현된 단백질은 601LI였다.
유사하게, 다른 변이체 601LP, 601LE, 601LG, 601LD, 601LH, 601LK, 601LQ 및 601LC를 수득하였다. 변이된 단백질의 성질을 도 10에 나타내었다.
SDS-PAGE를 통하여, 폴리펩타이드 601LI, 601LP, 601LG 및 601LC가 이량체를 형성하는 것으로 밝혀졌으나, 폴리펩타이드 601LE, 601LD, 601LH, 601LK 및 601KQ는 단량체로서 존재하였다(표 14 및 도 11). 결과는 AA601이 비극성 아미노산인 폴리펩타이드가 이량체를 형성할 수 있으며 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대해 양호한 항원성을 갖고; AA601이 극성 아미노산인 폴리펩타이드는 이량체화에 실패하였으며 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 항원성이 감소하였음을 보였다. 7 개의 연속적인 비극성 아미노산은 AA597-AA603(AA601 포함)에 위치하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 NE2 폴리펩타이드의 이량체화에 핵심 역할을 하는 것으로 추론되었다. 이러한 추론을 입증하기 위해서, NE2의 AA596-AA603에 위치한 아미노산을 비극성 아미노산 E로 개별적으로 치환시켜 변이체 596SE, 597AE, 598VE, 599AE, 600VE, 602AE 및 603PE가 생성되었다. 이들 변이체 중에서, 596SE, 600VE 및 603PE는 이량체를 형성할 수 있는 반면, 597AE, 598VE, 599AE 및 602AE는 단량체로 존재하였다(표 14). 상기 이량체화된 변이체는 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 강한 항원성을 유지한 반면, 단량체로 존재하는 변이체는 명백히 감소된 항원성을 가진다. AA600에서 V가 A로 치환된 것을 제외하고, AA597-AA602 영역에서 극성 아미노산에 의한 비극성 아미노산의 치환은 모두 이량체화를 억제하였으며 따라서 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 항원성이 감소되었다. 또한, AA596(S)(AA597-AA602 영역 밖)에 대한 변이는 이량체화 및 항원성에 대한 영향이 없었다.
상기 결과는 NE2 및 그의 동족체의 비 극성 영역 AA597-AA603이 이량체화에서뿐만 아니라 단클론 항체 8C11, 8H3 및 13D8에 의해 인식된 그의 에피토프의 적절한 폴딩 및/또는 노출에서도 중요한 역할을 함을 강하게 시사하였다.
[표 14]
NE2 이량체화 영역 상의 부위 지향된 돌연변이로부터 생성된 폴리펩타이드의 단클론 항체에 대한 항원성 및 이량체화
실시예 24: 폴리펩타이드 239의 클론 제작
실시예 1에 개시된 폴리펩타이드 NE2의 MALDI-TOF-MS 분석에 EK라, 상기 폴리펩타이드는 여러 종류의 단독중합체를 용액 중에서 자발적으로 형성할 수 있다. 어느 정도까지, 폴리펩타이드 NE2의 중합 과정은 HEV 캡시드의 자가 조립을 모방할 수 있으며, 이량체들은 HEV 입자의 기본적인 구조 단위를 제공할 수 있다.
이 콜라이에서 HEV의 VLP를 발현시키기 위해서, pTO-T7-NE2의 NE2의 N-말단을 프라이머 연장 합성에 의해 AA368로 연장시켜 클론 pTO-T7-239를 생성시켰다. pTO-T7-239는 서열식별번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 재조합 폴리펩타이드를 발현할 수 있다.
PCR을 수행하여 주형으로서 pTO-T7-NE2를 사용하여 폴리펩타이드 239(AA368-AA603PPR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 얻었다. 프라이머들을 하기와 같다:
390FP: 5'-CAT ATG TCG GCG GGT GGT CAG CTG TTC TAC TCT CGC-3'
380FP: 5'-CAT ATG CTA GGC GGT CTA CCC ACA GAA TTG ATT TCG TCG GCG GGT GGT C-3'
368FP: 5'-CAT ATG ATA GCG CTT ACC CTG TTT AAC CTT GCT GAC ACC CTG CTA GGC GGT CTA CCC A-3'
EHERP: 5'-GAA TTC ACC ACC ATG ATA GCG CTT ACC CTG TTT-3'
첫 번째 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 주형으로서 pTO-T7-NE2를 하기 2 개의 프라이머와 함께 사용하여 수행하였다: 전방 프라이머 390F(NdeI 제한 부위가 5'에 도입됨); 및 역 프라이머 EHERP(EcoRI 부위가 5'에 도입됨). 반응 조건은 하기와 같다: 94 ℃ 5 분; 이어서 30 주기의 94 ℃ 50 초, 57 ℃ 50 초 및 72 ℃ 1 분; 72 ℃에서 10 분간 연장. 약 810 pb의 특정한 DNA 단편, 즉 AA390-AA603PPR 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 수득하였다. 상기 PCR 산물을 벡터 pMD18-T에 추가로 연결시키고 이어서 관심 유전자가 삽입된 양성 클론 pMD 18-T-390F를 BamHI/HindIII에 의한 절단에 의해 동정하였다. 2 차 PCR을 주형으로서 pMD 18-T-390F를 전방 프라이머 380FP(NdeI 제한 부위가 5'에 도입됨); 및 역 프라이머 EHERP와 함께 사용하여 수행하였다. 생성된 단편은 길이가 약 840 pb이며, 이는 HEV ORF2의 AA380-AA660 상에 위치한 폴리펩타이드를 암호화하였다. 유사하게 상기 PCR 산물을 벡터 pMD18-T에 연결시키고 양성 클론 pMD 18-T-390F를 BamHI/HindIII에 의한 절단에 의해 동정하였다. 유사한 과정을 반복하였다. 이에 의해 유전자 239(AA368-603PPR)을 전방 프라이머 368FP 및 역 프라이머 EHERP를 사용하여 PCR에 의해 수득하였다. 증폭된 유전자 239를 벡터 pMD18-T에 연결시키고 이어서 양성 클론 pMD 18-T-239를 BamHI/HindIII에 의한 절단에 의해 동정하였다. 상기 pMD 18-T-239를 NdeI 및 EcoRI으로 절단하여 관심 유전자 239를 수득하고, 이어서 이를 NdeI/EcoRI-절단된 pTO-T7에 클로닝하였다. 정확하게 삽입된 양성 클론 pTO-T7-239를 동정하였다.
실시예 25: 폴리펩타이드 239의 발현 및 정제
이 콜라이 ER2566을 pTO-T7-239로 형질전환시키고 배양액의 OD가 약 1.0에 달할 때까지 튜브에서 배양하였다. 이어서 상기 세균을 차후의 발효를 위해 시드로서 사용하였다. 상기 세균 100 ㎕를 500 ㎕ LB 배양 배지에 가하였다. 37 ℃에서 약 9 시간 동안 배양한 후에, 0.5M IPTG 300 ㎕를 가하여 239의 발효를 유도하였다. 상기 혼합물을 추가로 4 시간 동안 배양하였다. 발현된 폴리펩타이드 239는 봉입체로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이어서 상기 봉입체를 하기와 같이 세척하였다:
이 콜라이의 배양 배지를 8,500 rpm에서 10 분간 원심분리시키고 펠릿을 수거하였다. 1,000 ㎖ 배양액으로부터 수득된 펠릿을 50 ㎖ 용해 완충액에 재 현탁시키고 세포를 초음파 장치에서 초음파처리하였다. 상기 초음파 처리된 혼합물을 원심분리시키고, 이어서 펠릿을 2% 트리톤 50 ㎖에 재 현탁시키고, 이어서 이를 1 시간 동안 진탕시켰다. 상기 혼합물을 다시 원심분리시키고, 펠릿을 50 ㎖ 완충액 I에 재 현탁시키고, 이어서 이를 5 분간 초음파 처리하였다. 상기 혼합물을 원심분리시켰다. 이어서 상기 펠릿을 2% 트리톤 50 ㎖에 재 현탁시키고 1 시간 동안 진탕시켰다. 그 후에, 상기 혼합물을 원심분리시키고 펠릿을 완충액 I 50 ㎖에 재 현탁시켰다. 그 후에 상기 혼합물을 원심분리시켰다. 상기 펠릿을 2M 우레아를 함유하는 완충액 I 30 ㎖에 재 현탁시키고, 1 분간 초음파 처리하고 30 분간 교반하였다. 상기 혼합물을 원심분리시키고 상등액을 수거하였다. 상기 펠릿을 4M 우레아를 함유하는 완충액 I 30 ㎖에 재 현탁시키고, 1 분간 초음파 처리하고 30 분간 교반하였다. 상기 혼합물을 원심분리시키고 상등액을 수거하였다. 상기 펠릿을 8M 우레아를 함유하는 완충액 I 20 ㎖에 재 현탁시키고, 1 분간 초음파 처리하고 30 분간 교반하였다. 상기 혼합물을 원심분리시키고 상등액을 수거하였다. 드디어, 폴리펩타이드 239가 4M 우레아를 함유하는 완충액 I에 주로 용해되는 것으로 밝혀졌으며, 이를 등전-초점 기법에 의해 추가로 정제하였다.
상기 방법에 사용된 시스템은 하기와 같다: pI8 IsoPrime 멀티 챔버형 일렉트로포커싱 유니트(Amersham Pharmacia company); 고정화된 pH 멤브레인: pH 5.10(T%:10%, C%:8%), pH 5.20(T%:5%, C%:8%), pH 5.25(T%:5%, C%:8%), pH 5.30(T%:5%, C%:8%), pH 5.35(T%:5%, C%:8%), pH 5.40(T%:10%, C%:8%); 수용조 용액: 초 정제 H2O 중의 4 몰/L 우레아; 샘플: 4 몰/㎖ 우레아에 용해된 재조합 폴리펩타이드를 함유하는 변성 용액(300 ㎖, 3.0 ㎎/㎖); 견본 챔버는 pH 5.25 내지 pH 5.30이었고; 일렉트로포커싱 변수: 200 V 2 시간, 500 V 2 시간, 800 V 2 시간, 3000 V 60 시간. 정제된 폴리펩타이드는 pH 5.25 내지 pH 5.30에 위치하였으며, 부피는 300 ㎖이었고 농도는 2.5 ㎎/㎖이었다. 순도는 은-염색된 SDS-PAGE에서 95%로 나타났다. 이렇게 하여 수득된 폴리펩타이드 293을 하기 개시된 바와 같이 HPLC HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 추가 정제하였다:
장치: 벡크만 시스템 골드 누보 125NMP/166NMP HPLC; 컬럼: TSK 페닐-5PW 21.5 ㎜ x 15 ㎝; 완충액: 0.5 몰/㎖ 암모늄 설페이트, 4 몰/L 우레아 및 20 밀리몰/L 인산염 완충액(pH 7.2); 용출 완충액: 4 몰/㎖ 우레아, 20 밀리몰/㎖ 인산염 완충액(pH 7.2); 유속: 4 ㎖/분; 용출 방식: 120 분간 연속 등급으로 0.5 내지 0 몰/㎖ 암모늄 설페이트; 검출 파장: 280 ㎚; 샘플: 2 ㎎/㎖ 농도에서 등전 초점에 의해 정제된 폴리펩타이드 239 360 ㎖; 수거: 크로마토그래피 상에서 105 내지 120 분 후, 고도로 정제된 폴리펩타이드 239 60 ㎖을 4 ㎎/㎖의 농도로 수득하고, 순도는 은-염색된 SDS-PAGE 상에서 나타난 바와 같이 98% 이상이었다.
접선 흐름 장치를 사용하는 재조합 폴리펩타이드 239의 탈변성
장치: 접선 흐름 장치 시스템(PALL company); 멤브레인의 컷오프 MW: 30 kD; 작동 압력: 5 psi; 유속: 500 ㎖/분; 접선 유속: 15 ㎖/분; 샘플: 4 ㎎/㎖ 농도의 폴리펩타이드 239 60 ㎖, HPLC HIC에 의해 고도로 정제됨; 탈변성 완충액: 1200 ㎖ PBS(pH 7.45); 탈변성된 샘플의 후 처리: 4 ℃에서 10 분간 12,000 rpm 원심분리에 의해 3.9 ㎎/㎖ 농도의 탈변성된 폴리펩타이드 60 ㎖이 생성된다.
실시예 26: 폴리펩타이드 239로부터 자가 조립된 바이러스형 입자의 특성화
크기 배제 HPLC: 4M 우레아/완충액 I 중의 샘플 239를 PBS에 대해 투석시키고, 이어서 벡크만 시스템 골드 누보 125NMP/166NMP HPLC 장치 상의 TSK GEL SW3000(21.5 ㎜ x 60 ㎝) 컬럼에 부하하였다. 결과는 폴리펩타이드 239의 체류 시간은 22.3 분(체류 부피: 89.0 ㎖)이었으며, 이는 TSK GSW300의 상한과 같음을 보였다. 이는 폴리펩타이드 239의 분자량이 500 kD 이상임을 가리켰다. NE2의 체류 시간은 35.6 분(체류 부피: 148.3 ㎖)이었으며, 이는 폴리펩타이드 239가 용액 중에서 입자를 형성함을 가리켰다(도 12A).
투과 전자 현미경 검사(TEM)를 사용한 VLP의 관찰
탈변성된 폴리펩타이드 239를 탄소 피복된 그리드에 흡착시키고, 2% 포스포 텅스텐산(pH 7.0)으로 염색하고, 약 x100,000 확대로 JEM-100CX II 전자 현미경검사에 의해 검사하였다. 도 12B의 사진은 다수의 가시적인 바이러스형 입자들을 나타내었다.
원자력 현미경 검사(AFM)를 사용한 VLP의 관찰
분석을 1 ㎚ 해상력을 갖는 탐침을 사용하여 나노 IIIA 원자력 현미경(DI Company, USA) 상에서 수행하였다. 탈변성된 폴리펩타이드 239를 PBS(pH 7.45)로 1:10으로 희석하고, 폴리스티렌의 표면 상에서 피복하고, 이어서 1 ㎟의 주사 면적으로 AFM에 의해 분석하였다. 도 13의 사진은 다수의 가시적인 바이러스형 입자들을 나타내었다.
동적인 광 산란을 사용한 VLP의 분석
분석을 DynaPro MS/X 동적인 광 산란 장치(온도 조절기 함유) 상에서 수행하였으며 사용된 연산방식은 정규 연산이었다. 폴리펩타이드 239를 4 ℃에서 15 분간 원심분리시키고(20,000g) 이어서 분석하였다. 결과는 폴리펩타이드 239의 수화된 분자 역학적 반경이 24.16 ㎚임을 보였다(도 14).
실시예 27: 재조합 폴리펩타이드 239의 항원성
항-HEV 단클론 항체에 대한 재조합 폴리펩타이드 239의 항원성
실시예 4의 방법에 따라, 정제된 폴리펩타이드 239를 단클론 항체로 웨스턴 블럿팅시켰다. 결과는 폴리펩타이드 NE2의 것과 유사하였다, 즉 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8이 NE2의 단량체보다는 239의 다량체와 더 강하게 상호작용하였으며; 반대로, 단클론 항체 15B2 및 16D7은 239의 다량체 및 NE2의 단량체와 동등하게 상호작용하였다. 비등시킨 후, NE2는 모두 단량체로 분해되었으며, 여전히 단클론 항체 15B2 및 16D7에 대해서 변하지 않은 항원성을 가졌지만, 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8에 대한 항원성은 크게 감소하였다. 이러한 결과는 단클론 항체 15B2 및 16D7에 의해 인식된 239의 에피토프는 선형 에피토프이고; 반면에 단클론 항체 1F6, 2C9, 7E8, 8C11, 8H3 및 13D8에 의해 인식된 에피토프는 형태 의존성 에피토프임을 시사하였다. 이들 형태 의존성 에피토프는 이량체 형태로 잘 노출되지만 단량체는 아니었다.
HEV 환자의 급성 단계 혈청 및 회복기 혈청에 대한 폴리펩타이드 239의 항원성
실시예 4의 방법에 따라, 정제된 폴리펩타이드 239를 HEV 환자의 급성 단계 혈청 샘플 5 개, 회복기 혈청 샘플 5 개 및 정상적인 인간 혈청 샘플 2 개로 웨스턴 블럿팅하였다. 결과(도 15)는 폴리펩타이드 239가 급성 단계 혈청에 대해 명백한 활성을 가지며, 더욱 또한 이량체 형태의 활성은 단량체 형태의 것보다 강함을 보였으며; 상기 이량체는 또한 HEV 환자의 회복기 혈청 샘플 3 개에 대해 높은 활성을 보였으나; 폴리펩타이드 239의 상기 두 형태는 모두 정상적인 인간 혈청에 대해서 반응하지 않았다.
실시예 28: HEV ORF2의 이 콜라이 발현된 미립자 폴리펩타이드
NE2의 일련의 N-말단 연장 변이체를 프라이머-연장 합성에 의해 pTO-T7 벡터에 클로닝시켰다. 이들 중에서, 단량체 대 이량체의 비, 뿐만 아니라 중합을 SDS-PAGE 상에서 비교하였다. 또한, 실시예 25의 방법에 따라, 입자 형성을 그의 체류 시간의 항으로 크기 배제 HPLC에 의해 측정하였다.
결과(표 15)는 NE2의 AA368로의 N-말단 연장으로부터 생성된 폴리펩타이드 239(AA368-603)가 입자로 자가 조립할 수 있는 반면, 다른 N-말단 연장 변이체, 즉 217(AA390-603), 227(AA380-603)뿐만 아니라 NE2 모두 자가 조립에 실패했음을 가리켰다. 따라서 영역 AA368-380은 입자의 자가 조립과 관련이 있다. 추가의 연장을 수행하여 폴리펩타이드 369, 370, 371, 372, 378 및 379를 제조하였다. 이들 중에서 오직 237C(AA370-603)만이 입자로 자가 조립하는 것으로 밝혀졌다. AA345로의 추가적인 연장에 대해서 상기 변이체는 여전히 입자로 자가 조립할 수 있다.
[표 15]
NE2의 N-말단 연장 변이체의 중합
AA368, AA370, AA372, AA375 및 AA395의 Leu에 대한 부위 지향된 돌연변이는 모두 입자의 안정성에 부정적인 효과를 가지며(표 16), 이는 AA368 부근의 구조가 안정한 입자의 형성에 중요함을 지시한다.
[표 16]
AA368-395 영역에 위치한 Leu 상의 부위 지향된 돌연변이로부터 생성된 HEV ORF2 폴리펩타이드의 입자 회합
폴리펩타이드 HEV ORF2 상의 위치 입자 비고
370LI 370-603PPR 불안정함 Ile로 변이된 370Leu
370LA 370-603PPR 대단히 불안정함 Ala로 변이된 370Leu
370LE 370-603PPR 없음 Glu로 변이된 370Leu
370LQ 370-603PPR 대단히 불안정함 Gln으로 변이된 370Leu
370LF 370-603PPR 불안정함 Phe로 변이된 370Leu
368LA 368-603PPR 불안정함 Ala로 변이된 368Leu
372LE 368-603PPR 없음 Glu로 변이된 372Leu
375LE 368-603PPR 없음 Glu로 변이된 375Leu
395LE 368-603PPR 없음 Glu로 변이된 395Leu
미립자 폴리펩타이드의 또 다른 일련의 C-말단 변이체, 즉 292, 208, 209, 242P, 202P, 172P 및 170P(표 17)는 입자로 자가 조립하고; C-말단이 AA603의 상부에 위치한 폴리펩타이드는 이량체를 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 결과는 이량체의 형성이 입자의 조립과 관련이 없을 수도 있으며, 상기 2 가지 기전은 상이한 도메인들에 의해 조절될 수도 있음을 나타내었다.
[표 17]
미립자 폴리펩타이드의 C-말단 변이체의 중합
실시예 29: 바이러스형 입자로 자가 조립될 수 있는 이 콜라이 발현된 HEV ORF2 폴리펩타이드의 단클론 항체에 대한 항원성
[표 18]
단클론 항체에 대한 미립자 폴리펩타이드의 항원성(ELISA)
7. 단클론 항체에 의해 동정된 에피토프를 모방하는 펩타이드의 선택
실시예 30: 단클론 항체에 의해 동정된 에피토프를 모방하는 펩타이드의 선택
7-펩타이드 파지 디스플레이 라이브러리(New England BioLabs company)를 사용하여 단클론 항체 8C11, 8H3, 13D8 또는 16D7에 의해 인식될 수 있는 7-펩타이드를 선별한다. 상기 선별 과정을 파지 디스플레이 라이브러리 사용자 안내서에 개시된 바와 같이 수행하였다. 간단히, mAb(100 ㎍/㎖, 20 mM PB 중에서, pH 7.5)를 96-웰 미세적정 플레이트(150 ㎕/웰) 상에 피복하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 피복 용액을 부었다. 상기 플레이트를 PBST로 1 회 세척하고, 건조시키고 이어서 37 ℃에서 2 시간 동안 차단 완충액(0.1M NaHCO3, pH 8.6, 5 ㎎/㎖ BSA)과 함께 배양하였다. 차단 용액을 부었다. 상기 플레이트를 PBST로 6 회 세척하고, 건조시켰다. 별도로, 2 x 1011 파지를 PBST(0.1% 트윈-20)로 최종 부피 100 ㎕로 희석하였다. 이어서 상기 희석된 파지 용액을 피복된 96-웰 미세적정 플레이트(100 ㎕/웰)로 옮기고, 실온에서 1 시간 동안 정치시켰다. 파지 용액을 붓고 단단히 쳐서 잔류 용액을 제거하였다. 상기 웰을 PBST(0.1% 트윈-20)로 10 회 세척하고, 쳐서 잔류 용액을 제거하였다. 결합된 파지를 실온에서 10 분간 0.2M 글리신-HCl(pH 2.2, 1 ㎎/㎖ BSA 함유) 100 ㎕와 함께 배양하여 용출시켰다. 이어서 상기 용액을 미세원심분리 튜브로 옮기고 1 몰/L 트리스-HCl(pH 9.1)로 중화시켰다. 용액 1 ㎕를 취하여 파지를 적정하였다. 나머지 용액을 ER2738 배양액 20 ㎖에 초기 성장기 단계에서 가하고 4.5 시간 동안 진탕시키면서 37 ℃에서 배양하였다. 상기 배양액을 50 ㎖ 원심분리 튜브로 옮기고 10,000 g에서 10 분간 회전시켰다. 상부 상등액의 80%를 모으고 1/6 부피의 PEG/NaCl(20% PEG-8000, 2.5M NaCl)을 가하고, 4 ℃에서 밤새 정치시켰다. 이어서 상기 혼합물을 4 ℃에서 15 분간 회전시켰다(10,000 g). 펠릿을 PBS 1 ㎖에 재 현탁시키고 4 ℃에서 5 분간 회전시켰다. 상등액을 꺼내어 1/6 부피의 PEG/NaCl 용액을 가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서 상기 혼합물을 4 ℃에서 15 분간 회전시켰다(10000 rpm). 상등액을 붓고, 펠릿을 PBS 200 ㎕에 현탁시키고, 4 ℃에서 보관하였다. 상기 과정을 또 다른 주기의 선별을 위해 반복한다.
밤새 배양시킨 ER2738 숙주를 LB 배양 배지로 1:100으로 희석하였다. 상기 희석된 배양액을 튜브들(1 ㎖/튜브)에 분배한다. 3 라운드의 선별 후에 LB/IPTG/Xgal 배양 플레이트 상에서 청색 플라크인 10 개 클론을 선택하여 상기 희석된 배양액을 함유하는 튜브로 옮기고 37 ℃에서 4.5 시간 동안 배양하였다. 상기 배양액을 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 단일 가닥 DNA를 M13 미니 키트(Shanghai Huashun Biotech Ltd)용 안내서 지시에 따라 추출하고, 이어서 상하이 보야 리미티드(Shanghai Boya Ltd)에 의해 서열화하고, 삽입된 7-펩타이드의 서열 결과를 표 19에 나타내었다.
[표 19]
단클론 항체와 결합하는 7-펩타이드의 서열
실시예 31: 8H3 및 8C11에 의해 인식된 에피토프를 모방하는 펩타이드의 발현
HBc 유전자의 분리 및 클로닝
특정 프라이머 BvCF 및 BvCR을 구상하였다(표 20). 주형으로서 우리 팀에 의해 제작된 플라스미드 pT-HBc(GenBank No. AF233235)를 사용하여 PCR을 사용하여 HBc의 완전한 길이의 유전자를 증폭시켰다. 약 550 pb의 증폭된 단편을 플라스미드 pMD 18-T에 클로닝시켜 재조합 플라스미드 pT-C183을 수득하였다. 플라스미드 pT-C183에 삽입된 단편의 서열화 결과는 상기가 완전한 길이의 HBV 코어 유전자이며, 길이가 549 pb이고 183 아미노산을 암호화함을 보였다.
[표 20]
HBV 유전자 클로닝용 프라이머들
플라스미드 pC149-mut의 제작
HBc MIR 섹션의 아미노산 잔기 79 및 80을 HBc 발현을 위한 변이체 플라스미드 pC149-mut를 제작하기 위해서 부위 지향된 돌연변이 방법에 의해 링커와 치환시켰다.
주형으로서 pT-C183 및 프라이머 쌍으로서 Bv80F/Bv149R 및 Bv78R/BvCF(표 20)를 사용하여, HBc의 3' 말단과 5' 말단 서열을 증폭시키고, 생성물 C80-149 및 C1-78을 회수하였다. 상기 2 개의 단편을 새로운 PCR 반응(프라이머로서 Bv149R 및 BvCF)에서 혼합하여 완전 길이 HBc 유전자(C149-mut라 칭함) 변이체를 증폭시켰다. 상기 산물을 T 벡터에 클로닝시켜 재조합 플라스미드 pT-C149-mut를 수득하였다. pC143 및 pC-149에 대해 개시한 바와 같이, C149-mut 단편을 발현 벡터 pTO-T7으로 서브클로닝시켜 HBc 발현을 위한 변이체 플라스미드 pC149-mut를 수득하였다. 양쪽에 링커가 있는 BamHI 제한 부위를 pC149-mut의 서열에 가하였다. C149-mut의 아미노산 서열은 C1-78+G4SG4T+GS+G4SG4+C81-149이다.
변이체 HBc 플라스미드를 기본으로 하는 펩타이드 발현 플라스미드 모방물의 제작
7-펩타이드의 서열화 결과에 따라, 2 개의 긴 프라이머(표 20의 8C11AFP 및 8H3AFP)를 링커와 BamHI 부위 사이에 7-펩타이드 유전자가 삽입되도록 구상하였다. 3' 프라이머를 pC149-mut 상의 EcoRI 부위 부근의 서열에 따라 구상하였다(표 20에서 149MutRP). 7-펩타이드 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시키고 pMD-18T 벡터에 클로닝시켜 플라스미드 pT-8C11 및 pT-8H3을 수득하였다. 이들 2 개의 플라미스미드 및 pC149-mut 벡터를 BamHI 및 EcoRI에 의해 절단하였다. 벡터 및 표적 단편을 회수하고, 상기 벡터와 단편을 함께 연결시켜 2 개의 재조합 발현 플라스미드 pC149-mut-8C11 및 pC149-mut-8H3을 수득하였다. 발현된 단백질의 아미노산 서열을 서열식별번호: 30(C149-mut-8C11) 및 서열식별번호: 31(C149-mut-8H3)로 나타내었다.
모방 펩타이드를 함유하는 플라스미드의 발현
재조합 플라스미드 pC149-mut-8C11 또는 pC149-mut-8H3으로 형질전환된 이 콜라이 균주 ER2566을 LB 액체 배지 2 ㎖에서 배양시켰다. 37 ℃에서 진탕기에서 배양을 수행하였다. 배양 배지의 OD가 약 0.6에 도달했을 때, IPTG를 0.5 밀리몰/L의 최종 농도로 가하고, 배양을 37 ℃에서 4 시간 동안 계속하였다. 세포 배양액 1 ㎖을 1.5 ㎖ 튜브로 옮기고 12000 rpm에서 30 초간 회전시키고 뒤집어 건조시켰다. 세포를 H2O 60 ㎕에 재 현탁시키고, 이어서 30 ㎕의 SDS-PAGE 부하 완충액(3 x)을 가하였다. 상기 혼합물을 비등 수 욕에 10 분간 넣고 12000 rpm에서 10 분간 회전시켰다. 상등액 10 ㎕을 SDS-PAGE 분석을 위해 사용하였다.
모방 펩타이드의 면역학적 활성 시험
상기 발현된 폴리펩타이드의 용해 상등액 3 ㎕를 니트로셀룰로즈 멤브레인 상에 점으로 찍었다. 탈지 우유를 함유하는 0.5% 차단 용액을 0.1 ㎖/㎠로 가하고 실온에서 2 시간 동안 진탕시켰다. 이어서 5% 탈지 우유로 1:100으로 희석된 단클론 항체 8C11 또는 8H3을 0.1 ㎖/㎠로 가하였다. 상기 반응물을 실온에서 1 시간 동안 진탕시켰다. 이어서 상기 멤브레인을 TNF로 3 회 세척하였다(각각에 대해 10 분). AP-부하된 염소 항-마우스 IgG(0.5% 탈지 우유로 1:10000으로 희석됨)를 0.1 ㎖/㎠로 가하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. TNF로 2 회 세척한 후에(각각에 대해 10 분), NBT/BCIP를 가하여 색을 전개시켰다. 최종적으로, PBS를 가하여 반응을 정지시켰다. 결과는 C149-mut-8C11 및 C149-mut-8H3이 상응하는 단클론 항체와 명백하게 반응하였음을 보였다.
8. MAb에 의해 인식된 본 발명의 에피토프를 함유하는 폴리펩타이드를 기본으로 하는 진단 키트 및 상기 폴리펩타이드의 예방학적 적용
실시예 32: 양고추냉이 페록시다제(HRP)를 사용한 폴리펩타이드 NE2의 표지 방법
하기 과정은 NE2 20 ㎎을 기본으로 하였다: 아세테이트 완충액(0.2 M, pH 5.6) 2 ㎖에 HRP(Biozyme R/Z>3) 40 ㎎을 용해시키고; 0.06 M NaIO4 용액 2 ㎖을 가하고; 생성된 용액을 실온에서 20 분간 유지시키고; 0.16M 에틸렌 글리콜-10% NaCl 용액 2 ㎖을 가하고, 실온에서 20 분간 정치시키고; 상기 용액을 0.001M 아세테이트 완충액(pH 4.0)에 대해 밤새 투석시키고; 2M 카보네이트 완충액(pH 9.6) 0.8 ㎖ 및 NE2 항원 20 ㎎을 가하고, 4 ℃에서 교반하면서 2 시간 동안 반응시키고; 새로 제조된 NaBH4 용액(5 ㎎/㎖) 0.4 ㎖을 가하고; 4 ℃에서 2 시간 동안 교반하면서 정치시키고; 포화된 (NH4)2SO4 용액 9.2 ㎖을 적가하고; 4 ℃에서 30 분간 교반하고, 이어서 3500 rpm에서 20 분간 4 ℃에서 원심분리시키고; 상등액을 버리고 펠릿을 0.02M 포스페이트 완충액(pH 7.4) 2 ㎖에 용해시키고, 이어서 상기 용액을 0.02M 포스페이트 완충액(pH 7.4)에 대해 24 시간 동안 투석시키고; 글리세롤 2 ㎖을 가하고, 이어서 혼합하고 -20 ℃에서 보관하였다.
실시예 33: 항-HEV IgG 항체의 검출을 위한 진단 키트 및 그의 제조 및 조작
본 발명의 재조합 폴리펩타이드 NE2를 함유하는 진단 키트의 제조 과정은 하기와 같다: 실시예 1에 개시된 바와 같은 재조합 폴리펩타이드 NE2 1 ㎎/㎖을 제조 및 정제시키고; 이를 20 mM PBS 완충액(pH 7.4)으로 1:500으로 희석하고 96-웰 미세적정 플레이트를 100 ㎕/웰로 37 ℃에서 2 시간 동안 피복하고 이어서 4 ℃에서 밤새 배양하고; 이어서 상기 플레이트를 PBS-트윈 세척 완충액(NaCl 8.0 g, KH2PO4.12H2O 0.2 g, KCl 0.2 g 및 트윈-20 0.5 ㎖, 탈이온수를 1 L로 가하고, pH를 7.4로 조절함)으로 1 회 세척하고 뒤집어 건조시키고; 웰 당 차단 용액(PBS 중의 2% 슈크로즈, 카제인 0.2%, 젤라틴 2%) 200 ㎕를 가하고, 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고; 상기 웰을 블럿팅 건조시키고, 진공 하에서 밀폐시키고 이를 4 ℃에서 보관하였다.
상기 키트의 분석 과정은 하기와 같다: 샘플 희석액(20 mM pH 7.2 PBS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고, 이어서 혈청 10 ㎕를 가하고, 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 미세플레이트를 TECAN 세척기 상에서 PBS-트윈 세척 용액으로 5 회(20 초 간격) 세척하고; 블럿팅 건조시키고; 적합한 희석율의 HRP-표지된 2 차 항체(염소 항-인간 IgG)를 가하고, 이어서 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이를 다시 5 회 세척(20 초 간격)하고 블럿팅 건조시키고; 한 방울의 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B(크로마토젠 A: 13.42 g의 Na2HPO4.12H2O, 4.2 g의 시트르산 및 0.3 g의 H 2O2, 탈이온수를 70 ㎖로 가하고; 크로마토젠 B: 0.2 g의 TMB, 20 ㎖의 DMF, 탈이온수를 700 ㎖로 가함)를 가하고 37 ℃에서 배양시키고; 반응을 한 방울의 정지 용액(2M H2SO4)으로 종료시키고 각 웰의 흡광도를 TECAN 판독기(Sunrise Remote/Touch Screen) 상에서 450 ㎚(기준 파장 620 ㎚)에서 측정하였다. 컷 오프 값을 음성 대조군에 대한 OD 값 + 0.16으로서 간주한다. 상기 OD 값이 컷 오프 값 이상인 경우, 결과를 양으로서 간주하는 반면, OD 값이 컷 오프 값 미만인 경우 결과는 음이다.
실시예 34: 항-HEV IgM 항체의 검출을 위한 μ-쇄 포획 ELISA 키트(E2-IgM) 및 그의 제조 및 조작
상기 키트의 제조 과정은 하기와 같다: NE2-HRP를 실시예 32에 개시된 바와 같이 1:1000으로 희석하고; 염소 항-인간 μ-쇄(DAKO)(0.05 M CB 중의 1:1000) 100 ㎕를 각 웰에 가하고; 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 이어서 4 ℃에서 밤새 배양하고; 상기 미세 플레이트를 PBST 세척 완충액(pH 7.4)으로 1 회 세척하고; 각 웰을 37 ℃에서 2 시간 동안 배양함으로써 차단 완충액 200 ㎕로 차단시키고; 상기 차단된 웰을 블럿팅 건조시키고 이를 진공 하에서 밀폐시키고 4 ℃에서 보관하였다.
상기 키트의 분석 과정은 하기와 같다: 샘플 희석액(20 mM pH 7.2 PBS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 시험하려는 혈청 10 ㎕를 가하고, 이어서 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 상기 미세 플레이트를 PBST 세척 용액으로 5 회 세척하고; 블럿팅 건조시키고 작용 NE2-HRP(1:1000, 실시예 32에서와 같이 제조) 100 ㎕를 가하고 이어서 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이를 다시 PBST로 5 회 세척하고 블럿팅 건조시키고; 크로마토젠을 가하고 37 ℃에서 10 분간 배양하고; 반응을 한 방울의 정지 용액으로 정지시키고, OD450/620 ㎚ 값을 판독하였다. 컷 오프 값을 음성 대조군에 대한 OD 값 + 0.26으로서 간주한다. 상기 OD 값이 컷 오프 값 이상인 경우, 시편을 비 반응성인 것으로, 그렇지 않다면 반응성인 것으로 간주한다.
실시예 35: HEV 항원의 검출을 위한 샌드위치 ELISA 키트 및 그의 제조 및 조작
상기 키트의 제조 과정은 하기와 같다: 본 발명의 정제된 MAb 8C11를 20 mM PBS(pH 7.2)로 50 ng/㎖로 희석하고, 상기 희석액 100 ㎕를 각 웰에 가하고; 37 ℃에서 밤새 배양하고; 이어서 상기 미세 플레이트를 PBST로 1 회 세척하고; 각 웰을 20% 송아지 태아 혈청(FBS) 200 ㎕로 37 ℃에서 2 시간 동안 배양함으로써 차단시켰다.
상기 키트의 분석 과정은 하기와 같다: 혈청 또는 FBS를 사용하여 제조된 대변 시편의 20% 현탁액을 가하고, 이어서 20% FBS로 희석된 8C11-HRP 50 ㎕를 가하고 이를 서서히 혼합하고 37 ℃에서 60 분간 배양하고; 미세 플레이트를 PBST로 5 회 세척하고 블럿팅 건조시키고; 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B 각각 50 ㎕를 가하고 37 ℃에서 15 분간 배양하고; 반응을 정지 용액 50 ㎕로 종료시키고, 각 웰에 대해 OD450/620㎚를 측정하였다(PBST, 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B를 Beijing Wantai biological pharmacy enterprise Co., Ltd로부터 구입한다). 컷 오프 값을 음성 대조군에 대한 OD 값 + 0.12로서 간주한다. 상기 OD 값이 컷 오프 값 미만인 경우 상기 시편은 반응성이 아닌 것으로 간주하고, 그렇지 않으면 반응인 것으로 간주한다.
실시예 36: 본 발명의 E2-IgG ELISA 키트 및 E2-IgM ELISA 키트를 사용하여 혈청을 진단하는 실시예
5 개의 E형 간염 환자 혈청 및 40 개의 음성 혈청에서 E2-IgM 및 E2-IgG
5 개의 E형 간염 환자 혈청 및 40 개의 음성 혈청을 E2-IgM 및 E2-IgG에 대해 시험하였다. 5 개의 HE 환자 혈청의 OD 값은 모두 1.0 이상이고 음성 OD 값은 모두 0.1 이하였다.
HEV에 의한 감염에 따른 붉은털 원숭이 혈청에서 상이한 항-HEV 항체들의 역학적 변화
표 20에 개시한 바와 같이, 86 마리의 붉은털 원숭이에게 HEV-양성 배설물의 현탁액을 시험 접종하고, 배설물 바이러스 분비가 감염된 붉은털 원숭이의 98.4%에서 검출되었다. GL-IgG(IgG 항체를 GENELABS DIAGNOSTICS HEV IgG ELISA에 의해 검출할 수 있다)에 대한 반응율은 70.9%였다. GL-IgG 혈청전환이 감염 후3 내지 14 주(평균 5 주)에서 일어났으며 반 이상의 동물에서 간염 발병보다 0.5 내지 5 주(평균 약 3 주) 늦었다. GL-IgG가 상이한 원숭이들에서 1 주에서 69 주 이상 지속되었다(75% 원숭이에서 17 주 미만). GL-IgG가 25 마리 원숭이에서 실험을 통해 검출되지 않았으며, 이 중 11 마리 원숭이는 명백하게 비정상적인 ALT와 급성 간염 증상이 있었다. E2-IgM 혈청 전환이 감염 후 1 내지 8 주(평균 4 주)에 85 마리 원숭이(반응율은 98.8%였다)에서 일어났고 시험 접종 후 5 주 내에 75% 원숭이에서 일어났다. 지속 시간은 일반적으로 약 8 주였다. 혈청 ALT 수준이 정상으로 된 지 3 내지 4 주 후에 E2-IgM이 음성으로 변하였다. 한 마리 원숭이가 E2-IgM에 대해서 항상 음이었으며, 배설물 바이러스 분비가 검출되지 않았으나, 단 ALT는 4 주째에 비정상으로 검출되었다. 그러나 그의 E2-IgG는 감염 후 3 주째에 양으로 변하였고 20 주 이상 지속된 반면, GL-IgG는 실험 전체를 통해 검출되지 않았다. E2-IgG의 반응율은 100%였다. E2-IgG 혈청전환이 감염 후 4.5 주 내에 일어났고 그의 혈청전환은 84 주 내에 어떠한 원숭이에서도 일어나지 않았다.
[표 20]
HEV 감염에 대한 원숭이의 반응 비율, 평균 발병 시간 및 평균 지속 시간
도 16에서와 같이 전형적으로, 바이러스 분비가 감염 후 0.5 주 째에 시작되었으며, 이어서 바이러스 감염이 일어났다. E2-IgM 및 E2-IgG가 3 주째에 거의 동시에 처음 검출된 후에, 혈청 ALT 수준이 일어났으며, 이어서 GL-IgG의 혈청전환이 일어났다. 이어서 바이러스 감염이 급속히 사라졌고, 혈청 LAT 수준이 연속적으로 정상으로 변하였으며, 바이러스 분비는 음성이었다. 약 3 내지 4 주 후에, E2-IgM이 음성으로 변하였다. GL-IgG의 수준이 그의 각 피크 값에 도달한 후에 서서히 감소한 반면, E2-IgG는 상기 실험 과정 동안 높은 수준으로 지속되었다, 즉 70 주 후에 반응율은 100%를 유지하였다.
본 발명의 E2-IgM ELISA 키트를 사용한 급성 간염 환자의 임상 시편에서 HEV에 대한 IgM 항체의 검출
E2-IgM ELISA 키트로 시험하여 오직 2 개의 시편이 0.2 미만의 OD 값을 가짐을 제외하고(하나는 0.203이고, 다른 하나는 0.333이다), 928 개의 정상 혈청 시편들 중 대부분이 0.15 이하의 OD 값을 가졌으며 이때 평균은 0.012였다. 임상적인 급성 간염 환자의 510 개 혈청 시편에 대한 OD 값은 0.001에서 4로 변하였고, 이는 각각 미세 플레이트 판독기의 상한과 하한에 상응한다. 지수 곡선에 가깝게 분포된 OD 값들에 대해서, 이들의 대수 분포를 1000 배 한후에 분석하였다(도 17). 0.398 내지 0.631의 OD 값의 양쪽에 2 개의 피크가 존재하였다. 왼쪽 피크는 대수 평균 0.077의 대략적인 정규 형태를 가졌으며, 이는 추정 상 IgM-음성 간염 환자를 나타내고; 오른쪽 피크(OD>0.398)는 131 개의 시편을 함유하였으며, 이중 109 개는 1.0 이상의 OD 값을 가졌고, 이는 추정 상 IgM-양성 HEV 환자를 나타낸다. E2-IgM에 대한 컷오프가 0.4로 고정된 경우, 200 개의 임상적인 감염 혈청 시편 중에서 E2-IgM의 양성 시편은 E2-IgG의 보다 높은 OD 값을 가진 반면, 대부분의 음성 시편들은 E2-IgG 음성이었으며 다른 시편에서 E2-IgG의 OD 값은 낮은 값에서 높은 값으로 변하였다(도 18).
OD 값들의 분포를 비교하기 위해서, E2-IgM 키트 및 GL-IgM 키트(GENELABS DIAGNOSTCS HEV IgM ELISA)를 사용하여 비-A 내지 C 형 간염 환자들의 119 개 혈청 시편들을 시험하였다. E2-IgM에 대한 OD 값들의 분포는 상술한 바와 같이 0.4의 OD 값의 양쪽에서 2 개의 분명한 피크를 형성한 반면, GL-IgM의 OD 값들의 분포는 불규칙적이었다(도 19). 컷오프 값이 0.4로 고정된 경우, E2-IgM의 반응율은 47.9%(57/119)인 반면, GL-IgM에 대한 반응율은 24.4%(29/119)였다.
29 GL-IgM 양성 시편에서, E2-IgM은 모두 반응성이었다. 그러나, 양의 HAV-IgM, 양의 HBc-IgM 또는 양의 HCV-IgG를 나타내는 30 개 혈청 시편들의 E2-IgM OD 값들 중 어느 것도 0.2를 초과하지 않았다.
본 발명의 E2-IgG ELISA 키트를 사용한 급성 간염 환자의 임상 시편 및 정상 혈청 시편에서 HEV에 대한 IgG 항체의 검출
실시예 33에 개시한 바와 같이, 5060 개의 정상 혈청 시편 및 급성 간염 환자로부터 200 개의 임상 혈청 시편을 E2-IgG ELISA 키트로 시험하였으며, OD 값들을 대수적 진동수 분포에 의해 분석하였다(도 20). 정상 혈청 시편은 개시된 바와 같이, 0.025의 OD 값 부근에 정규 형태에 유사한 피크가 존재하였다. 그러나, OD 값이 0.2를 초과하면, 상기 라인은 4.0의 OD 값에 경사지게 연장되었다. 대수적 진동수 분포 분석을 사용하는 경우, OD 값이 0.251 미만인 시편들 중에서 log(OD)의 평균은 1.333(OD는 0.022였다)이고 SD는 0.362였다. 95% 특이성을 갖는 컷오프 OD는 0.111(x=2.042)인 반면, 99% 특이성의 컷오프 OD는 0.185(x=2.266)였다. 컷오프 OD 미만의 OD 값들은 대략 정규 형태로서 분포되었으며, 이때 나타난 대부분의 시편들은 E2-IgG에 대해 음성일 수도 있으며; OD 값이 컷오프 OD보다 높은 시편들은 상이한 역가로 E2-IgG에 대해 양성일 수도 있다. 이러한 컷오프 OD의 경우 상기 시편들의 반응율은 22.2%였다.
200 개의 급성 간염 환자의 임상적 혈청 시편은 개시된 바와 같이, 컷오프 OD의 어느 한 쪽에 2 개의 분명한 피크가 존재하였다. 왼쪽 피크는 정상 혈청 시편의 것과 유사하였고, 오른쪽 피크는 1.6 내지 4.0(OD 2.5에서의 피크)의 OD 값을 형성하였다. 이는 급성 간염 환자에서 2 개의 그룹이 존재함을 암시하였다. 하나는 정상인과 유사하였고(그의 OD 값은 0.2 미만이었다) 다른 것은 E2-IgG의 보다 높은 OD 값을 가졌으며, 이들 중 대부분은 E2-IgM 양성이었다(도 21). 상기 후자는 추정 상 급성 HEV환자를 나타낸다.
실시예 37: 본 발명의 항-HEV MAb를 포함하는 치료제, 그의 제법 및 E2-IgM 양성 혈청 및/또는 E2-IgG 양성 혈청의 차단
상술한 예비 피복된 NE2 미세 플레이트에서, MAb 8C11과 MAb 8H3의 혼합물(각각 1:1000의 비로 희석됨) 100 ㎕를 하나의 웰에 가하고 동시에 대조용으로서 희석액 100 ㎕를 또 다른 웰에 가하고; 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 이어서 웰을 뒤집어 건조시키고; 일련의 이중으로 희석된 혈청 100 ㎕를 가하고 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 상기 플레이트를 PEST로 5 회 세척하고, 이어서 예비 희석된 항-인간 IgM-HRP 작용 희석액 또는 항-인간 IgG-HRP 작용 희석액(Beijing Wantai Biotech company에 의해 제공됨) 100 ㎕를 가한 다음 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이를 다시 5 회 세척하고 뒤집어 건조시키고 크로마토젠을 가하고 37 ℃에서 10 분간 배양하고; 이어서 2M H2SO4 50 ㎕로 반응을 정지시키고 각 웰에 대한 흡광도 OD450/620㎚를 측정하였다. 대조용 OD 값이 1.0 내지 2.0인 희석율을 선택하여 차단율을 하기 식에 의해 계산하고:
차단율 = (대조용 OD - 차단된 OD)/대조용 OD * 100%
상기 차단율이 50% 이상인 경우 MAb는 상기 혈청을 성공적으로 차단할 수 있다.
상술한 예비 피복된 NE2 미세 플레이트에서, MAb 8C11과 MAb 8H3의 혼합물(각각 1:1000의 비로 희석됨) 100 ㎕를 하나의 웰에 가하고, MAb 8C11의 Fab 단편과 MAb 8H3의 Fab 단편의 혼합물(1:1000의 비로 희석됨) 100 ㎕를 또 다른 웰에 가하고 동시에 대조용으로서 희석액 100 ㎕를 세 번째 웰에 가하고; 37 ℃에서 2 시간 동안 배양하고, 이어서 웰을 뒤집어 건조시키고; 일련의 1:2의 비로 희석된 혈청 100 ㎕를 가하고 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 상기 플레이트를 PEST로 5 회 세척하고 뒤집어 건조시키고, 이어서 작용 농도로 희석된 항-인간 IgM-HRP 또는 항-인간 IgG-HRP 100 ㎕를 가한 다음 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이를 5 회 세척하고 뒤집어 건조시키고 크로마토젠을 가하고 37 ℃에서 10 분간 배양하고; 2M H2SO4 50 ㎕로 반응을 정지시키고 각 웰에 대한 흡광도 OD450/620㎚를 측정하였다.
E2-IgM ELISA의 특이성을 입증하기 위해서, HEV를 직접 포획하는 2 개의 MAb인 8C11과 8H3을 사용하여 10 E2-IgM 양성 혈청 시편에서 E2-IgM을 차단하였다. 상기 결과는 MAb가 66.4 내지 94.8%(평균 차단율은 86.6%(86.6%±7.9%)이다) 범위의 차단율로 혈청과 E2 항원간의 반응을 현저하게 차단할 수 있음을 나타내었다(도 21 참조). 10 E2-IgG 양성 혈청 시편에 대해서, 혈청과 E2 항원간의 반응은 55 내지 96%의 차단율로 모두 차단되었으며 평균 차단은 75.7%이다.
차단 시험에 대한 단클론 항체의 입체 장애 효과의 영향을 평가하기 위해서, 상기 두 MAb의 Fab 단편을 사용하여 2 개의 혈청 시편을 동시에 차단시켰다. 도 22에 예시된 바와 같이, Fab 단편의 차단 효과는 그의 전체 항체와 일치하며, 이는 양성 혈청에 대한 MAb의 차단 효과가 에피토프 특이성임을 가리킨다.
실시예 38: 이중 항원 샌드위치 ELISA(DS-ELISA)
NE2 미세 플레이트를 실시예 33에 상술한 바와 같이 제조하였다. 분석 과정은 하기와 같다: 혈청 시편 50 ㎕를 첨가한 후에 웰 당 희석된 NE2-HRP 50 ㎕를 가하고; 상기 플레이트를 가볍게 두드려 시약들을 균질화시키고 37 ℃에서 30 분간 배양하고; 이를 6 회 세척하고 뒤집어 건조시키고; 이어서 크로마토젠(TMB 기질, Beijing Wantai biological pharmacy enterprise Co., Ltd에 의해 공급)을 가하였다. 37 ℃에서 10 분간 배양한 후에, 반응을 2M H2SO4 50 ㎕로 정지시키고; 이어서 각 웰에 대해 450 ㎚에서 기준 파장 620 ㎚로 하여 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군의 평균 흡광도에 0.12를 더하여 컷오프 값을 계산하였다. 흡광도 값이 컷오프 값보다 작으면, 시편은 반응성이 아닌 것으로 간주되고, 그렇지 않으면 반응성이다.
400 명의 혈액 공급 지원자의 혈청 시편을 DS-ELISA 및 E2-IgG ELISA에 의해 시험하였으며 결과는 2 개의 ELISA가 서로에 대해 완전히 일치함을 나타내었다. 양성 시편의 샘플/컷오프 비를 언급한 바와 같이, DS-ELISA는 E2-IgG ELISA보다 더 높았다(도 23 참조).
항-HEV 항체를 XinJiang로부터 수집한 소, 양, 염소 및 돼지의 혈청, 및 ShangHai로부터 얻은 암탉의 혈청에서 DS-ELISA에 의해 선별하였다. 표 21에 개시한 바와 같이, 항-HEV 항체를 예외 없이 상기 동물들의 종으로부터 검출할 수 있었으며, 돼지에서 양성 비율은 79.9%였다.
[표 21]
DS-ELISA에 의해 선별된 상이한 동물들에서 항-HEV 항체의 양성 비율
동물 검출된 수 반응 수 반응율(%)
소 202 13 6.4
양 24 3 12.5
염소 30 2 6.7
돼지 443 353 79.7
암탉 173 3 1.7
실시예 39: 펩타이드 239의 항원 결정기를 포함하는 백신, 그의 제조 및 면역원성
백신화된 동물: 6 BAL B/c 마우스 및 6 마리 쿤밍(Kunming) 백색 마우스, 4 내지 6 주 된 것
백신의 제조: 목적하는 양의 원래 알루미늄 보강제(Lanzhou Biological Product Institute of China)를 침전물이 발생할 때까지 1N NaOH로 조절하였다. 완전히 혼합한 후에, 1 x PBS를 가하여 부피를 2 배로 하였다. 이어서 원심분리를 10,000 rpm에서 1 분간 수행하고 상등액을 버렸다. 침전물을 1 x PBS에서 재 현탁시켜 부피를 2 배로 하고, 10,000 rpm에서 1 분간 원심분리시키고 상등액을 버렸다. 상기와 같은 과정을 pH가 7 내지 7.4에 도달할 때까지 여러 번 반복하였다. 최종적으로, 침전물을 같은 부피의 1 x PBS에 재 현탁시키고 상기 용액을 멸균시키고 4 ℃에서 보관하고, 9 x 저장 용액으로서 사용하였다. 정제된 폴리펩타이드 239를 선행 알루미늄 보강제와 4 ℃에서 밤새 5 ㎍/100 ㎕의 최종 농도로 혼합하였다. 보강제가 없는 백신을 5 ㎍/100 ㎕ 농도로 오직 폴리펩타이드 239만을 사용하여 제조하였다. 용량을 5 ㎍/마우스로서 구상하였다.
백신화 프로그램: 동물들을 보강제 백신과 비 보강제 백신 그룹으로 나누었다. 각 그룹에는 3 BALB/c 마우스(코드 B1 내지 B3, B4 내지 B6)와 쿤밍 백색 마우스(코드 K1 내지 K3, K4 내지 K6)가 있으며 0, 10 일의 면역 스케줄에 따라 근육 내로 백신화하였다. 매주 수거된 혈청 중의 항-HEV 항체의 존재를 HEV-NE2 폴리펩타이드 피복된 플레이트에 의해 ELISA 키트로 검출하였다.
결과(표 22 참조): 비-보강제 및 알루미늄 보강제 239 백신은 모두 탁월한 면역원성을 가졌다. 특히, 비-보강제 백신의 오직 하나의 백신화만이 3 마리 마우스 중 하나에서 항-HEV 항체를 유도하게 만들 것이다. 2 회 백신화 후에, 다수 마우스의 항-HEV 항체 역가는 1:105 이상에 달할 수 있다.
[표 22]
폴리펩타이드 239 백신이 접종된 마우스의 면역원성
실시예 40: 폴리펩타이드 239의 면역 보호성
알루미늄 보강제와 함께 폴리펩타이드 239를 함유하는 백신의 제조
목적하는 양의 원래 알루미늄 보강제(Lanzhou Biological Product Institute of China)를 침전물이 발생할 때까지 1N NaOH로 조절하였다. 완전히 혼합한 후에, 1 x PBS를 가하여 부피를 2 배로 하였다. 이어서 원심분리를 10,000 rpm에서 1 분간 수행하고 상등액을 버렸다. 침전물을 1 x PBS에서 재 현탁시켜 부피를 2 배로 하고, 10,000 rpm에서 1 분간 원심분리시키고 상등액을 버렸다. 상기와 같은 과정을 pH가 7 내지 7.4에 도달할 때까지 여러 번 반복하였다. 최종적으로, 침전물을 같은 부피의 1 x PBS에 재 현탁시키고 상기 용액을 멸균시키고 4 ℃에서 보관하고, 9 x 저장 용액으로서 사용하였다. 상기 언급한 바와 같이 생성되고 HPLC(단백질의 농도는 1.0 ㎎/㎖이다)에 의해 정제된 폴리펩타이드 239를 PBS로 희석하고, 알루미늄 보강제의 1/9 부피를 가하여 폴리펩타이드 239의 목적하는 최종 농도에 도달시키고(10 ㎍/㎖), 밤새 4 ℃에서 혼합하였다. 상기 혼합물을 앰풀 당 1.2 ㎖로 나누고, 상기 앰풀들을 4 ℃, 암실에서 보관하였다. 사용 전에 상기 앰풀을 혼합해야 한다.
면역화 계획
정상적인 ALT 및 음성 HEV를 갖는 6 마리의 건강한 붉은털 원숭이를 선택하고 그룹 당 원숭이 3 마리씩, 2 개의 그룹으로 나누었다. 면역화 그룹의 원숭이들에게 알루미늄 보강제 함유 폴리펩타이드 239 백신 10 ㎍을 각각 0 일, 10 일 및 58 일째에 어깨 세모근 내 주입에 의해 백신화하였다. 대조군은 면역시키지 않았다.
HEV에 의한 시험 접종
2 개 그룹의 원숭이들에게 최초 면역 후 86 일째(최종 면역 후 28 일째)에 원숭이 당 HEV XM 균주의 20% 변 현탁액 0.25 ㎖을 시험 접종하였다(원숭이 당 2*10^5 PCR 역가).
시편의 수거
혈청 샘플을 감염 전 및 감염 후 10 주 이상 매주 1 회 취하고 이어서 그 후에 2 주에 한번씩 취하였다. 혈청 ALT를 샘플 수거일에 새로운 혈청에 대해 측정하였다.
대변 시편을 10 일 간 이틀마다 수거하고 이어서 86 일까지 매주 2 회 수거하였다. 바이러스 RNA가 개시 후 연속적으로 검출되지 않는 경우, 바이러스 분비를 역전으로 간주하였다.
HEV 마커의 검출
항-HEV IgG 항체: 2 가지 방법에 의한 원숭이 혈청의 항-HEV IgG의 검출
방법 1은 E2-IgG ELISA로, 상기 분석 과정은 실시예31에 개시되어 있다. 방법 2에서, GL-IgG를 GENELABS DIAGNOSTICS HEV IgG ELISA 키트로 검출하였다. HEV ORF2 및 ORF3의 재조합된 폴리펩타이드를 상기 키트에 사용하였으며, 이는 NE2의 주요 에피토프와 겹치지 않는 HEV ORF2(AA604 내지 AA660) 및 HEV ORF3의 C 도메인의 에피토프를 모방하였다.
바이러스 분비: 실시예 11에 개시된 방법에 의해 대변 중의 HEV RNA를 검출함.
항-HEV IgM 항체: 실시예 32에 개시된 방법에 의해 원숭이 혈청의 항-HEV IgM을 검출함.
결과: 표 22에 개시된 바와 같이, 3 마리의 모든 대조용 원숭이에서 시험 접종 후 1 주일 안에 바이러스 분비, E2-IgM, E2-IgG 및 GL-IgG가 검출되었으며, 이는 HEV가 상기 원숭이들을 감염시켰고 성공적으로 복제하였음을 입증하였다. 3 마리의 면역된 원숭이 중 2 마리에서, 바이러스 분비, E2-IgM 및 GL-IgG가 항상 검출 가능하지는 않았으나, 다른 원숭이에서는 바이러스 분비가 시험 접종 후 3 주째에 시작하였고 E2-IgM 및 GL-IgG는 시험 접종 후 7 주째에 전환되었다. 면역된 원숭이들은 HEV로부터의 감염을 피하거나 증상이 급격히 가벼워졌으며, 이는 폴리펩타이드 239가 효과적인 면역 보호성을 가짐을 입증하였다.
[표 22]
폴리펩타이드 239에 의해 형성된 재조합된 HEV VLP의 면역 보호성
그룹 시험접종 전의 E2-IgG의 역가 바이러스 분비의 지속성(주수) E2-IgM의 개시(주수) GL-IgG의 지속성(주수) E2-IgG의 개시(주수)
면역
HY10 1:5120 없음 검출 안됨 없음 -
HY11 1:5120 3-7 7 7-10 -
HY12 1:10240 없음 검출 안됨 없음 -
대조군
HY13 <1:10 1-5.5 3 3-7 4
HY14 <1:10 0.5-6.5 3 4-16 3
HY15 <1:10 1-5.5 3 5-10 3
실시예 41: 생물학적 시편 중의 전체 항-HEV 항체를 검출하기 위한 이중 항원 샌드위치 ELISA(DS-ELISA) 키트, 그의 제조 및 분석 과정
DS-ELISA 키트는 재조합된 폴리펩타이드 NE2, 효소 희석액(20 mM pH 7.2 PB, 5 ‰ 카제인 및 10% NBS)으로 희석된 작용 NE2-HRP 용액 및 일부 비 생물학적 활성 물질(예를 들어 20 x PBST, 크로마토젠 A, 크로마토젠 B 및 정지 용액 등)이 있는 예비 피복된 미세 웰로 이루어진다(Beijing Wantai biological pharmacy enterprise Co., Ltd로부터 구입).
상기 키트의 분석 과정은 하기와 같다: 혈청 시편 50 ㎕를 첨가한 후에 각 웰 당 희석된 NE2-HRP 50 ㎕를 가하고; 상기 플레이트를 가볍게 두드려 시약들을 균질화시키고 37 ℃에서 60 분간 배양하고; 이를 6 회 세척하고 뒤집어 건조시키고; 이어서 크로마토젠 A 및 크로마토젠 B를 가하고; 37 ℃에서 15 분간 배양한 후에, 반응을 2M H2SO4 50 ㎕로 정지시키고; 이어서 각 웰에 대해 450 ㎚에서 기준 파장 620 ㎚로 하여 흡광도를 측정하였다.
항-HEV 항체를 XinJiang로부터 수집한 소, 양, 염소 및 돼지의 혈청, 및 ShangHai로부터 얻은 암탉의 혈청에서 DS-ELISA에 의해 선별하였다. 표 23에 개시한 바와 같이, 항-HEV 항체를 예외 없이 상기 동물들의 종으로부터 검출할 수 있었으며, 돼지에서 양성 비율은 79.9%였다.
[표 23]
DS-ELISA에 의해 선별된 상이한 동물들에서 항-HEV 항체의 양성 비율
동물 검출된 수 반응 수 반응율(%)
소 202 13 6.4
양 24 3 12.5
염소 30 2 6.7
돼지 443 353 79.7
암탉 173 3 1.7
<110> yang sheng tang company ltd. <120> Mab of HEV and its binding active fragment as well as use thereof <130> IEC020054PCT <150> CN01134643.4 <151> 2001-11-08 <160> 31 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 660 <212> PRT <213> Hepatitis E virus <400> 1 Met Arg Pro Arg Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Met Phe Leu Pro Met 1 5 10 15 Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gly Gln Pro Ser Gly Arg Arg Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Phe Trp Gly Asp Arg Val Asp Ser 35 40 45 Gln Pro Phe Ala Ile Pro Tyr Ile His Pro Thr Asn Pro Phe Ala Pro 50 55 60 Asp Val Thr Ala Ala Ala Gly Ala Gly Pro Arg Val Arg Gln Pro Ala 65 70 75 80 Arg Pro Leu Gly Ser Ala Trp Arg Asp Gln Ala Gln Arg Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Ser Arg Arg Arg Pro Thr Thr Ala Gly Ala Ala Pro Leu Thr Ala 100 105 110 Val Ala Pro Ala His Asp Thr Pro Pro Val Pro Asp Val Asp Ser Arg 115 120 125 Gly Ala Ile Leu Arg Arg Gln Tyr Asn Leu Ser Thr Ser Pro Leu Thr 130 135 140 Ser Ser Val Ala Thr Gly Thr Asn Leu Val Leu Tyr Ala Ala Pro Leu 145 150 155 160 Ser Pro Leu Leu Pro Leu Gln Asp Gly Thr Asn Thr His Ile Met Ala 165 170 175 Thr Glu Ala Ser Asn Tyr Ala Gln Tyr Arg Val Ala Arg Ala Thr Ile 180 185 190 Arg Tyr Arg Pro Leu Val Pro Asn Ala Val Gly Gly Tyr Ala Ile Ser 195 200 205 Ile Ser Phe Trp Pro Gln Thr Thr Thr Thr Pro Thr Ser Val Asp Met 210 215 220 Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asp Val Arg Ile Leu Val Gln Pro Gly Ile 225 230 235 240 Ala Ser Glu Leu Val Ile Pro Ser Glu Arg Leu His Tyr Arg Asn Gln 245 250 255 Gly Trp Arg Ser Val Glu Thr Ser Gly Val Ala Glu Glu Glu Ala Thr 260 265 270 Ser Gly Leu Val Met Leu Cys Ile His Gly Ser Pro Val Asn Ser Tyr 275 280 285 Thr Asn Thr Pro Tyr Thr Gly Ala Leu Gly Leu Leu Asp Phe Ala Leu 290 295 300 Glu Leu Glu Phe Arg Asn Leu Thr Pro Gly Asn Thr Asn Thr Arg Val 305 310 315 320 Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ala Arg His Arg Leu Arg Arg Gly Ala Asp 325 330 335 Gly Thr Ala Glu Leu Thr Thr Thr Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp 340 345 350 Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile 355 360 365 Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro 370 375 380 Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro 385 390 395 400 Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val 405 410 415 Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp 420 425 430 Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu 435 440 445 Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val 450 455 460 Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr 465 470 475 480 Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp 485 490 495 Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg 500 505 510 Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr 515 520 525 Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys 530 535 540 Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn 545 550 555 560 Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly 565 570 575 His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro 580 585 590 Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala 595 600 605 Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Phe Asp 610 615 620 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Ala Phe 625 630 635 640 Gln Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Gly Lys 645 650 655 Thr Arg Glu Leu 660 <210> 2 <211> 1990 <212> DNA <213> GENOMIC DNA <400> 2 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc cggcggtggt 120 ttctggggtg accgggttga ttctcagccc ttcgcaatcc cctatattca tccaaccaac 180 cccttcgccc ccgatgtcac cgctgcggcc ggggctggac ctcgtgttcg ccaacccgcc 240 cgaccactcg gctccgcttg gcgtgaccag gcccagcgcc ccgccgttgc ctcacgtcgt 300 agacctacca cagctggggc cgcgccgcta accgcggtcg ctccggccca tgacaccccg 360 ccagtgcctg atgttgactc ccgcggcgcc atcctgcgcc ggcagtataa cctatcaaca 420 tctcccctta cttcttccgt ggccaccggt acaaacttgg ttctatacgc cgctcctctt 480 agcccacttc tacccctcca ggacggcacc aatactcata taatggccac agaagcttct 540 aattatgccc agtaccgggt tgctcgtgcc acaattcgct accgcccgct ggtccccaac 600 gctgttggtg gctacgccat ctccatctcg ttctggccac agaccaccac caccccgacg 660 tccgttgaca tgaattcaat aacctcgacg gatgttcgta ttttagtcca gcccggcata 720 gcctccgagc ttgttatccc aagtgagcgc ctacactacc gtaaccaagg ttggcgctct 780 gttgagacct ccggggtggc ggaggaggag gccacctctg gtcttgttat gctctgcata 840 catggctcac ctgtaaattc ttatactaat acaccttata ccggtgccct cgggctgttg 900 gactttgccc tcgaacttga gttccgcaac ctcacccccg gtaataccaa cacgcgggtc 960 tcccgttact ccagcactgc ccgtcaccgc cttcgtcgcg gtgcagatgg gactgccgag 1020 cttaccacca cggctgctac ccgcttcatg aaggacctct attttactag tactaatggt 1080 gtcggtgaga tcggccgtgg gatagcgctt accctgttta accttgctga caccctgctt 1140 ggcggtctac cgacagaatt gatttcgtcg gctggtggcc agctgttcta ctctcgtccc 1200 gtcgtctcag ccaatggcga gccgactgtt aagctttata catctgtaga gaatgctcag 1260 caggataagg gtattgcaat cccgcatgac atcgacctcg gggagtctcg tgtagttatt 1320 caggattatg acaaccaaca tgagcaggac cgaccgacac cttccccagc cccatcgcgc 1380 cctttttctg tcctccgagc taatgatgtg ctttggcttt ctctcaccgc tgccgagtat 1440 gaccagtcca cttacggctc ttcgaccggc ccagtctatg tctctgactc tgtgaccttg 1500 gttaatgttg cgaccggcgc gcaggccgtt gcccggtcac tcgactggac caaggtcaca 1560 cttgatggtc gccccctttc caccatccag cagtattcaa agaccttctt tgtcctgccg 1620 ctccgcggta agctctcctt ttgggaggca ggtactacta aagccgggta cccttataat 1680 tataacacca ctgctagtga ccaactgctc gttgagaatg ccgctgggca tcgggttgct 1740 atttccactt acaccactag cctgggtgct ggtcccgtct ctatttccgc ggttgctgtt 1800 ttagcccccc actccgcgct agcattgctt gaggatacca tggactaccc tgcccgcgcc 1860 catactttcg atgacttctg cccggagtgc cgcccccttg gcctccaggg ctgtgctttt 1920 cagtctactg tcgctgagct tcagcgcctt aagatgaagg tgggtaaaac tcgggagtta 1980 tagtttattt 1990 <210> 3 <211> 1989 <212> DNA <213> GENOMIC DNA <400> 3 atgcgccctc ggcctatttt gctgttgctc ctcatgtttc tgcctatgct gcccgcgcca 60 ccgcccggtc agccgtctgg ccgccgtcgt gggcggcgca gcggcggttc 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Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 351 <212> DNA <213> cDNA <400> 7 gatgtacaac ttcaggagtc aggacctggc ctcgtgaaac cttctcagtc tctgtctctc 60 tcctgctctg tcactggcta ctccatcacc agtggttatt actggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacataggct acgacggtag caataagtac 180 aacccatctc tcaaaaatcg aatctccatc actcgtgaca catctaagaa ccagtttttc 240 ctgaagttga cttctgtgac tactggggac acagctacat attactgtgt aagagatgtt 300 aagtactact ttgactactg gggtcaaggc accacggtca ccgtatcttc a 351 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> protein <400> 8 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Gly 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Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Ser Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gln Leu 65 70 75 80 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Lys Ser Val Ile Thr Thr Gly Asp Tyr Ala Leu Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Ala Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 339 <212> DNA <213> cDNA <400> 13 aacattatga tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact 60 atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccgctagg 180 gaatctggtg tccctgatcg cttcacaggc agtggatccg ggacagattt tactcttacc 240 atcaacagtg tacaaactga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg 300 tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> protein <400> 14 Asn Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ala Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln 85 90 95 Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 15 <211> 351 <212> DNA <213> cDNA <400> 15 caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60 acatgcaccg tctcagggtt ctcattaatc ggctatggtg taaactgggt tcgccagcct 120 ccagaaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg atggaagcac agactataat 180 tcagctctca aatccagact gagcatcacc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240 aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccat gggggtacga 300 ccggaccctt ttgattactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351 <210> 16 <211> 117 <212> PRT <213> protein <400> 16 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr 20 25 30 Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Met Gly Val Arg Pro Asp Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 17 <211> 339 <212> DNA <213> cDNA <400> 17 gatgttgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatcgtaatg gaaagatata tttgaattgg 120 ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaag cacctaatgt ctcaggtgtc caaactggac 180 cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac acattacccg 300 tacacgtttg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339 <210> 18 <211> 113 <212> PRT <213> protein <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg 20 25 30 Asn Gly Lys Ile Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Lys His Leu Met Ser Gln Val Ser Lys Leu Asp Pro Gly Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 19 <211> 348 <212> DNA <213> cDNA <400> 19 gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggata taaattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120 cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt ccaatgataa tattaagtac 180 aatgagaagt tcaaaggcaa ggccatactg actttagaca aatcctccag cacagcctac 240 atggcgttca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aaccttaact 300 ggggttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctcagcc 348 <210> 20 <211> 116 <212> PRT <213> protein <400> 20 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Asn Asp Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Leu Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Leu Thr Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 21 <211> 240 <212> PRT <213> protein <400> 21 Met Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser 20 25 30 Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr 35 40 45 Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp 50 55 60 Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln 65 70 75 80 His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe 85 90 95 Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val 115 120 125 Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val 130 135 140 Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro 180 185 190 Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala 195 200 205 Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala 210 215 220 Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 225 230 235 240 <210> 22 <211> 258 <212> PRT <213> protein <400> 22 Met Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn 1 5 10 15 Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu 20 25 30 Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala 35 40 45 Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu 50 55 60 Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys 65 70 75 80 Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val 85 90 95 Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu 115 120 125 Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser 130 135 140 Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val 145 150 155 160 Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val 165 170 175 Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr 180 185 190 Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly 195 200 205 Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp 210 215 220 Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala 245 250 255 Val Leu <210> 23 <211> 245 <212> PRT <213> protein <400> 23 Met Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln 20 25 30 Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val 35 40 45 Ala Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln 65 70 75 80 Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala 85 90 95 Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu 100 105 110 Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr 115 120 125 Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr 130 135 140 Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu 145 150 155 160 Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe 165 170 175 Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr 180 185 190 Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu 195 200 205 Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr 210 215 220 Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu 225 230 235 240 Ala Pro Pro Pro Arg 245 <210> 24 <211> 253 <212> PRT <213> protein <400> 24 Met Thr Ser Thr Asn Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu 1 5 10 15 Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu 20 25 30 Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val 35 40 45 Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn 50 55 60 Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly 65 70 75 80 Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp 85 90 95 Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg 100 105 110 Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln 115 120 125 Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val 130 135 140 Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu 145 150 155 160 Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln 165 170 175 Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser 180 185 190 Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn 195 200 205 Thr Thr Ala Ser Asp Gln Asn Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His 210 215 220 Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val 225 230 235 240 Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 245 250 <210> 25 <211> 263 <212> PRT <213> protein <400> 25 Met Ala Ala Thr Arg Phe Met Lys Asp Leu Tyr Phe Thr Ser Thr Asn 1 5 10 15 Gly Val Gly Glu Ile Gly Arg Gly Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu 20 25 30 Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala 35 40 45 Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu 50 55 60 Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys 65 70 75 80 Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val 85 90 95 Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser 100 105 110 Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu 115 120 125 Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser 130 135 140 Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val 145 150 155 160 Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val 165 170 175 Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr 180 185 190 Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly 195 200 205 Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp 210 215 220 Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr 225 230 235 240 Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala 245 250 255 Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg 260 <210> 26 <211> 290 <212> PRT <213> protein <400> 26 Met Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly 1 5 10 15 Leu Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser 20 25 30 Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr 35 40 45 Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp 50 55 60 Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln 65 70 75 80 His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe 85 90 95 Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val 115 120 125 Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val 130 135 140 Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu 145 150 155 160 Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg 165 170 175 Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro 180 185 190 Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala 195 200 205 Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala 210 215 220 Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro His Ser Val 225 230 235 240 Ala Leu Leu Glu Asp Thr Met Asp Tyr Pro Ala Arg Ala His Thr Asp 245 250 255 Asp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Leu Gly Leu Gln Gly Cys Phe Gln 260 265 270 Ser Thr Val Ala Glu Leu Gln Arg Leu Lys Met Lys Val Lys Thr Arg 275 280 285 Glu Leu 290 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 27 His Pro Thr Leu Leu Arg Ile 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 28 Ala Leu Trp Gly Pro Thr Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> peptide <400> 29 Ser Ile Leu Pro Tyr Pro Tyr 1 5 <210> 30 <211> 175 <212> PRT <213> protein <400> 30 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser His Pro Thr Leu Leu Arg 85 90 95 Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val Val 100 105 110 Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp 115 120 125 Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr 130 135 140 Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro 145 150 155 160 Gln Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 165 170 175 <210> 31 <211> 175 <212> PRT <213> protein <400> 31 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Ser Ile Leu Pro Tyr Pro 85 90 95 Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Leu Val Val 100 105 110 Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu Leu Trp 115 120 125 Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr 130 135 140 Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro 145 150 155 160 Gln Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val 165 170 175

Claims (23)

  1. E형 간염 바이러스(HEV) ORF2에 의해 암호화되는 서열식별번호 1로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(들)에 특이적으로 결합하는 단클론 항체, 또는 그의 보존 변체 또는 활성 단편(여기에서 상기 변체 또는 활성 단편 중의 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 본 발명의 단클론 항체의 잔기에 비해 보존적으로 치환, 첨가 또는 결실되었고, 여전히 HEV에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한다); 또는 상기 단클론 항체와 교차 반응할 수 있는 ORF2에 대한 다른 단클론 항체로,
    1) 하이브리도마 세포 주 CCTCC-C200116에 의해 분비되는, E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 8C11; 2) 하이브리도마 세포 주 CCTCC-C200114에 의해 분비되는, E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 13D8; 3) 하이브리도마 세포 주 CCTCC-C200117에 의해 분비되는, E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 8H3; 4) 하이브리도마 세포 주 CCTCC-C200115에 의해 분비되는, E형 간염 바이러스에 대한 단클론 항체 16D7로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 단클론 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    1) 단클론 항체 8C11의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 서열식별번호: 12 및 서열식별번호: 10으로 나타내거나; 또는
    2) 단클론 항체 13D8의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 6으로 나타내거나; 또는
    3) 단클론 항체 8H3의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 14로 나타내거나; 또는
    4) 단클론 항체 16D7의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 각각 서열식별번호: 20 및 서열식별번호: 18로 나타냄
    을 특징으로 하는 단클론 항체.
  3. 제 2 항에 따른 단클론 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 핵산 분자로, 상기 뉴클레오티드 서열이
    1) 단클론 항체 8C11의 중쇄 가변 영역의 서열식별번호: 12로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 11로 나타내고/내거나; 단클론 항체 8C11의 경쇄 가변 영역의 서열식별번호: 10으로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 9로 나타내거나; 또는
    2) 단클론 항체 13D8의 중쇄 가변 영역의 서열식별번호: 8로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 7로 나타내고/내거나; 단클론 항체 13D8의 경쇄 가변 영역의 서열식별번호: 6으로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 5로 나타내거나; 또는
    3) 단클론 항체 8H3의 중쇄 가변 영역의 서열식별번호: 16으로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 15로 나타내고/내거나; 단클론 항체 8H3의 경쇄 가변 영역의 서열식별번호: 14로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 13으로 나타내거나; 또는
    4) 단클론 항체 16D7의 중쇄 가변 영역의 서열식별번호: 20으로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 19로 나타내고/내거나; 단클론 항체 16D7의 경쇄 가변 영역의 서열식별번호: 18로 나타내는 아미노산 서열을 암호화하고, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열을 서열식별번호: 17로 나타내는 핵산 분자.
  4. 1) 항원 결정기가 단클론 항체 8C11 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면상에 노출되고; 형태-의존적이며, 그의 정확한 형성 및 충분한 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되고; 단클론 항체 13D8에 의해 특이적으로 인식되는 항원 결정기와 부분적으로 겹치거나 또는 그에 인접하고; E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 대략적으로 위치하는 상기 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖는 그룹; 또는
    2) 항원 결정기가 단클론 항체 13D8 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면상에 노출되고; 형태-의존적이며, 그의 정확한 형성 및 충분한 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되고; 단클론 항체 13D8에 의해 특이적으로 인식되는 항원 결정기와 부분적으로 겹치거나 또는 그에 인접하고; E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 대략적으로 위치하는 상기 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖는 그룹; 또는
    3) 항원 결정기가 단클론 항체 8H3 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; E형 간염 바이러스 입자의 표면상에 노출되고; 형태-의존적이며, 그의 정확한 형성 및 충분한 노출이 E형 간염 바이러스 ORF2의 폴리펩타이드 단편의 이량체화에 의해 촉진되고; 단클론 항체 8C11이 HEV에 결합 시 공간 구조의 안정성과 충분한 노출을 가지며 MAb 8H3에 결합하는 그의 능력이 이에 의해 현저하게 향상되고; E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 459 내지 601 사이에 대략적으로 위치하는 상기 항원 결정기의 형성에 관여하는 주요 아미노산 잔기를 갖는 그룹; 및
    4) 항원 결정기가 단클론 항체 16D7 또는 그의 동족체의 가변 영역에 특이적으로 결합하고; 선형의 항원 결정기이고; E형 간염 바이러스 ORF2의 아미노산 잔기 499 내지 515 사이에 대략적으로 위치하는 그룹
    으로 이루어진, HEV ORF2에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 상의 상기 항원 결정기 1) 내지 4) 중에서 선택되는 항원 결정기.
  5. 제 4 항에 따른 E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기들 중 하나 이상 또는 그의 조합을 포함하는, 바이러스형 입자를 형성할 수 있는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 그의 단편; 또는 제 4 항에 따른 항원 결정기들 중 하나 이상과 높은 서열 상동성을 갖는 단편 또는 그의 보존 변체 또는 활성 단편으로, 상기 변체 또는 활성 단편 중의 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 본 발명의 단클론 항체의 아미노산 잔기들에 비해 보존적으로 치환, 첨가 또는 결실되었으며, 여전히 바이러스형 입자를 형성하는 능력을 보유하는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 그의 단편.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 4 항에 따른 항원 결정기 1) 및 3)을 또한 포함하는 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 그의 단편.
  7. 제 5 항에 있어서,
    1) 서열식별번호: 22로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 208;
    2) 서열식별번호: 21로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 239;
    3) 서열식별번호: 23으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 243;
    4) 서열식별번호: 24로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 251;
    5) 서열식별번호: 25로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 262; 또는
    6) 서열식별번호: 26으로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 292
    인 단리되거나 재조합된 폴리펩타이드 또는 그의 단편.
  8. 제 7 항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 핵산 분자로, 바람직하게는 상기 뉴클레오티드 서열이
    1) 서열식별번호: 22로 나타내는 아미노산 서열;
    2) 서열식별번호: 21로 나타내는 아미노산 서열;
    3) 서열식별번호: 23으로 나타내는 아미노산 서열;
    4) 서열식별번호: 24로 나타내는 아미노산 서열;
    5) 서열식별번호: 25로 나타내는 아미노산 서열; 또는
    6) 서열식별번호: 26으로 나타내는 아미노산 서열
    을 암호화하는 핵산 분자.
  9. 제 4 항에 따른 E형 간염 바이러스 ORF2의 항원 결정기 1) 또는 3)에 특이적으로 결합하는 제 1 항에 따른 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3의 성질에 상응하는 성질을 갖는 폴리펩타이드 또는 그의 동족체의 선별 방법으로,
    1) 상기 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3을 항원과 항체의 특이적인 결합에 적합한 조건 하에서 충분한 시간 동안 시약과 접촉시키는 단계;
    2) 제 1 항에 따른 단클론 항체 8C11 및/또는 8H3과 반응하는 시약의 존재를 검출하는 단계; 및
    3) 상기 단클론 항체와 반응할 수 있는 상기 시약을 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 따른 방법에 의해 선별된 폴리펩타이드 또는 그의 동족체.
  11. 제 10 항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 변성 서열을 포함하는 핵산 분자.
  12. E형 간염 바이러스 감염의 진단 및/또는 예방용 약제의 제조에서 제 10 항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 동족체의 용도.
  13. 진단 유효량의 제 1 항, 제 4 항, 제 7 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단클론 항체, 항원 결정기, 폴리펩타이드 및 그의 동족체 중 하나 이상, 및 항원과 항체간의 반응에 적합한 검출제를 포함하는, E형 간염 바이러스 감염의 검출을 위한 진단 키트로, 바람직하게는
    1) 샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgG의 검출에 유용하고, 진단 유효량의 제 4 항 및/또는 제 7 항에 따른 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상 및 상응하는 검출 방법에 적합한 검출제를 포함하거나; 또는
    2) 샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 항체 IgM의 검출에 유용하고, 진단 유효량의 제 4 항 및/또는 제 7 항에 따른 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상 및 상응하는 검출 방법에 적합한 검출제를 포함하거나; 또는
    3) 샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 전체 항체의 검출에 유용하고, 진단 유효량의 제 4 항 및/또는 제 7 항에 따른 항원 결정기 및 그의 단편들 중 하나 이상 및 상응하는 검출 방법에 적합한 검출제를 포함하는
    진단 키트.
  14. 면역 유효량의 제 4 항, 제 7 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 및 그의 동족체들 중 하나 이상, 또는 임의의 이들의 조합 및 적합한 면역 보강제를 포함하고, 상기 면역 유효량이 바람직하게는 투여 당 0.0001 ㎎ 내지 0.1 ㎎이고, 보다 바람직하게는 0.001 내지 0.06 ㎎이고, 더욱 바람직하게는 0.01 ㎎ 내지 0.04 ㎎인, E형 간염 바이러스 감염의 예방을 위한 백신 조성물.
  15. 제 1 항에 따른 단클론 항체의 활성 단편으로, 상기 활성 단편이 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 14로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열로 나타내는 가변 영역 중 하나 이상을 포함하고 제 4 항에 따른 항원 결정기들 중 하나 이상과 특이적으로 결합하는 활성 단편.
  16. 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 임의의 단클론 항체의 보존 변체 또는 활성 단편으로, 상기 변체 또는 그의 활성 단편 중의 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 보존적으로 치환, 첨가 또는 결실되었고 여전히 HEV에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 보존 변체 또는 활성 단편.
  17. E형 간염 바이러스 감염의 진단, 예방 및/또는 치료용 약제의 제조에서 제 1 항에 따른 단클론 항체, 또는 그의 활성 단편 또는 보존 변체의 용도.
  18. 진단 유효량의 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 단클론 항체, 및 그의 활성 단편 및 보존 변체 중 하나 이상, 또는 임의의 이들의 조합, 및 항원과 항체의 반응에 적합한 검출제를 포함하고, 면역 유효량이 바람직하게는 용량 당 1 ng 내지 10000 ng이고, 보다 바람직하게는 10 ng 내지 1000 ng이고, 더욱 바람직하게는 100 ng 내지 1000 ng인, 샘플 중의 E형 간염 바이러스 항원의 검출에 사용되는, E형 간염 바이러스 감염의 진단을 위한 진단 키트.
  19. 치료 유효량의 제 1 항에 따른 단클론 항체 및 그의 활성 단편 및 보존 변체 중 하나 이상 및 약학적으로 허용 가능한 비히클 및/또는 부형제를 포함하고, 상기 치료 유효량이 바람직하게는 체중 ㎏ 당 0.001 내지 20 ㎎, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏인, E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 약학 조성물.
  20. 대상자에게 예방 및/또는 치료 유효량의 제 1 항에 따른 단클론 항체 및 그의 활성 단편 및 보존 변체 중 하나 이상을 투여함을 포함하고, 상기 치료 유효량이 바람직하게는 체중 ㎏ 당 0.001 내지 20 ㎎, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎인, E형 간염 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료 방법.
  21. 제 3 항 또는 제 11 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  22. 제 1 항에 따른 단클론 항체 및 그의 보존 변체 또는 활성 단편, 또는 제 10 항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 동족체를 발현할 수 있는, 제 21 항에 따른 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  23. a) E형 간염 바이러스에 특이적으로 결합하는 제 1 및 제 2 항체를 제공하는 단계(이때 상기 제 1 및 제 2 항체 중 하나 이상은 본 발명의 단클론 항체 또는 그의 단편이다);
    b) 상기 제 2 항체에 유효하게 결합하는 신호 발생 인자를 제공하는 단계(이때 발생된 신호의 강도는 오직 상기 제 2 항체의 양에 의존하거나; 또는 바람직하게는 상기 제 2 항체를 신호 발생 인자로 직접 표지한다);
    c) 제 1 항체를 담체와 커플링시켜 제 1 항체-담체 복합체를 형성시키는 단계;
    d) 시험 물질을 상기 제 1 항체-담체 복합체와, 샘플 중에 존재하는 E형 간염 바이러스(존재하는 경우)가 항체-담체 복합체와 결합하도록 접촉시키는 단계;
    e) 신호-발생 인자-2 차 항체-바이러스-1 차 항체-담체의 복합체가 형성되도록 상기 신호 발생 인자에 유효하게 결합하는 제 2 항체를 바이러스-제 1 항체-담체 복합체와 접촉시키는 단계;
    f) 상기 신호 발생 인자에 의해 발생된 신호를 검출하는 단계를 포함하고,
    경우에 따라, 상기 1 차 항체 또는 2 차 항체가 각각 본 발명의 단클론 항체 및 그의 결합 활성 단편 중 하나 이상 또는 임의의 이들의 조합일 수 있는
    샘플 중의 E형 간염 바이러스에 대한 E형 간염 바이러스의 항원 및/또는 항체를 검출하기 위한 방법.
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