JPS5974991A - Ｂ型肝炎細胞表面抗原を生産するための組換えｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は絹換えＤＮＡ技術分野に関し、更に訂−しくは
、絹換えＤＮＡ技術を利用した［３型財炎の細胞表面抗
原性を示１ボリペーノチトの製ｊ青法に関づる。ここに
記載した組換えＤＮＡ分子は、１３型肝炎ウイルス（Ｈ
ＢＶ）の細胞表面抗Ｉｎ＜　（Ｈｆ：３　ｓ八〇）を暗
号化しているＨＢＶのゲノムフラグメンＩ〜を１８養を
稚動物細胞に導入りるための真核性ベクターとして機能
する少なくとも１個のウィルスゲノムまたはその一部を
含有しＣいる。この組換え［’）ＮＡ分子はまた、適当
な宿主にクローニングし、増殖δＵるための細菌性ブラ
スミ１へまたほぞの一部を含有していることもある。１
−（１３ｓＡ！ＪはヒトにおいＣ抗体産生をｆｊｊＪ　
、Ｊので、Ｈｓ”９に対りるワクチンとし−Ｃ使用でき
、また、ヒトにＪ３１）るｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ感染の検出に
も使用Ｊることがてきる。

」；り具体的には、本発明は、（１）　１−ＩＢｓ　Ａ
（１迫伝子を含有りる真核性ベクターの絹みＳ”７で、
（２）　ｌ−１１３ｓ　Ａｇ眉仏嵌子動物の培養細胞に
導入づるためのでの使用、（３）ｌ−ＩＢｓＡりを産生
づる細胞の選択、（４）その１−ＩＢｓｌ産生細胞のレ
ルラインとしての確立、（５）生成したＩ」Ｂ　ｓＡｏ
の単頭１、および（６）イの細胞培養から生産される細
胞表面抗原とじ（−の血清から小隙したＢ型１１炎ウィ
ルスの細胞表面抗原との免疫学内含かつ物理的な比較同
定、に関するものである。さらに本光明は、］バ養動物
却１胞により生産されるＢ型肝炎の細胞表面抗原性を承
りポリペプチドを含有する医薬組成物おＪ、びこのポリ
ペプチドをヒ１〜のＨＢ　Ｖ感染の検出に使用りる方法
に関りる。

Ｌ３型肝炎すなわら血清旧炎（＋−Ｉ　Ｂ　Ｖ　）はと
こにでも見られるウーｒルス竹疾忠てあり、ワクチンの
投！ｊがｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍから身を守るための１１′ｌＩ
−の手段である。最近、２，３の会社（例えばメルク、
シャープＪ３よひドーム（米国）　ｄ３よひパスツール
？＋Ｊｌ究所（フランス田））がＨＢＶに夕・１づるワ
クチンを発売した。このワクチンは、抗原として、ウィ
ルス粒子の外皮に存在しているウィルス蛋白質（ＨＩ３
ｓＡ（１）を含有している。この細胞表面抗原自体には
病原性はないか、ヒ１〜に投句した場合、ＨＢ　Ｖ粒子
に対する抗体の産生を刺ｉｔ！に一！Ｊる。

ＨＢＳ　Ａ（＋の唯一の商業的な１］（給源は、１４８
　Ｖに感染したヒトの白液である。ヒトの血）′＾から
安全なワクチンを生産づるには、面倒な、時間のかかる
製造工程が必要であり、従って比較的費用がかかる（例
えば”　ＨｅｐａＨｔｉｓＢ　　Ｖ　ａｃｃｉｎ　”　
。

にｌｓｆ！Ｖ：Ｃ「Ｎｏｒｔｌｌ　　１ｌＯｌｌａｌｌ
ｄ　　［３！０ｎｌｅ（１ＩＣａ１１）ｌ’ｅｓｓ、　
Ｐ　、　ｆｖｌ　ａＬＩｌｌａｓおよびｌ−’　、　（
−’、　ｕｅｓｒｙ　ｅｄ△ｎｌｓｌｅｒｄａｍ、Ｎ　
ｅＷ　　Ｙ　Ｏｒｋ、○ｘｆｏｒｄ、　（１９８’Ｉ　
　）参照）、、さらに、このワクチンの聞には限りがあ
る。これらの理由から、このワクチンは感染の危険度の
高い人達、例えば医者、看護婦、糖尿病患習、↑・Ｖ性
保菌者の家族、１−ＩＢｓＡ（Ｉ陽性の母親から生まれ
た新生兇などに優先的に使用されている。

大規模にこのワクチン注射を行うためには、１ｈに１３
型肝炎が風土病となっている第３世界の国々においてこ
のワクチン注射を行うには、比較的廉価なイして実質的
に無限のＩ」Ｂ　ｓへｇｉＪＩＮ給源を・ｉＩＴ保づる
ことが極めて重要である。後天性免疫欠１（４症候ｆｌ
Ｙ　（ＡＩ　ｌ）　Ｓ　）の危険性を考慮りると、ＩＢ
ＳＡＵ源としてヒトの血清を使用することは；イするの
が望ましイ（Ｒ、Ｗａｌｇａｔｅ、　Ｎ　ａｔｕｒｅ、
ｖ＋、＋１．３０４．２９７　（１９８３））、従って
、１−ＩＢＳＡ（１の不足を克服し、現在の唯一の商業
的な供給源、すなわらｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖに感染したヒトの
血清に代ってより安全な供給源を確保するために、遺伝
子工学の方法を採用Ｊる必要があると考えられ台。

分子生物学の最近の進歩ににす、ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖの完全
なゲノムをクローンしかつイの配列を決定することが可
１１ヒどなった。さらに、ウィルス蛋白質の暗号領域す
確認された（欧州特訂出願公Ｇ’！　Ｎ　Ｏ，１３８２
８，２０２５１，ｄ３よひ３８７６５　：　Ｆ。

Ｑａｌｉｂｅｒｔ　ら、　　Ｎａｔｕｒｃ、ｖｏｌ、２
８１　、　６４６−６５０　　（１９７９）：Ｍ、Ｐａ
５ｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、ＶＯＩ。

２８２　、５７　！、−＋−５７９（１９７９）　：　
Ｐ　。

Ｖ　ａ　ｌ　ｅｎｚｕｅ　ｌ　ａ　　ら、　　Ｎ　ａｔ
ｕｒｅ、ｖｏｌ、　２８０．８１５−８１９　（１９７
９））。

これらの進歩に引続き、ウィルスゲノム、特に１−Ｉ　
Ｂ　Ｖ細胞表面積Ｉｉ？１（１−ＩＢｓ　／ｌ　）を（
）８号化しているその部分を発現づるための種々の宿主
系か試験された。

宿主生物どじで細菌を使用りると、ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖゲノ
ムに連結さけた強力な細菌性ブ１」モータを使用しても
、ｌ−ｌ　Ｂ　ｓ　Ａりに関係のある免疫原性物買は、
はんの僅か生産されるに過ぎない（Ｃ，Ｊ。

［３ＵｒｒＧｌｌら、　　Ｎａｔｕｒｅ、ｖＯｌ、２７
９．　　／　３−４　７゜（１Ｅ）７９）　　：　　Ｊ
、　　Ｃ，Ｅｄｍａｎら、Ｎ　ａｔｕｌ’ｅ、ＶＯＩ。

２９１，５０３−５０６　　（１９８１）；Ｐ。

１ｌａｃＫＬＶら、　　ｌ−）　ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ　　、　　３　ｃｉ、、ＬＪ　、　　Ｓ　。

△、ｖｏ１．７８．４５１０−４５１４　　（１９８１
））。大腸菌や枯草菌のような細菌中での種々の真核個
遺伝子の発現が報告されてはいるが、次にあげるいくつ
かの１．Ｉｌｊ山からこの絹換えＤＮＡ技術を応用する
には、より高等な生物を使用したほうがより右利（：　
（Ｉ／ｌる。〈１）細菌は、イン１〜ロンを切り前した
り、蛋白質前駆体を分解、開裂したりＪる真核細胞に特
異な加工機構を持っていない：（２）細はロ、Ｌ蛋白質
をグリコジル化しない。これらのＩｌｌ訳後の改変【３
１、この種の蛋白質の免疫１爪性にどつＣ重要Ｃ゛ある
ことがある；（３）細菌は、真核性′）〜１／、アト１
＝成物中のいわ（→）る仁弓ペブチ１−を認識りる分泌
機１１“４を持つ（いない：（４）真核性ブロモークの
ような真核・１１の発現シグナル（信号）は細菌中でＬ
Ｌ聞能ぜり゛、従つ−Ｃ原核性プロモータで置さ摸え／
ｒりればならないゎ真核性）貞嵌子を改変りる必９￥の
あることは、適切な発現に必要な他の信号を破壊する可
能性がある。他の真核性１ス号、例えばポリアデニル化
のための信号に相当りるものは細菌中には全く存在しな
い：（５）真核性生物と原核性生物とては］トンの用法
か異４ｆることかあり、従っ−Ｃ真核性遭成子は原核生
物中では効率良く翻訳されないことがある：（（３）あ
る種の細菌の細胞成分（例えばリボ多糖類）（まし１〜
にとって極めＣ毒性が強く、精製の段階で非１１）に問
題どなることがある。

細菌の環境が、多くの、多分はどんどの真核性またはウ
ィルス性遺伝子の適切な発現（こ適し−Ｃいないどりれ
ば、より高等な生物を阜礎どりる真核性遺伝子発現系を
間発し、利用することが重要Ｃ・ある。

事実、細菌を使用りることが不利（あるため、それに代
る宿主系とじで酵１ｔｌが試験されＩこ〈１〕。

Ｖ　ａｌｅｎｚｕｅｌａら、　Ｎ　ａｕｔｒｅ、ｖｏｌ
、　２９８　、３　／ｌ　７−３５０　（１９８２））
。ｌｌＢｓＡｇ暗号化配列が酵母のアル］−ルデヒトロ
グノーＬ’Ｉｊロエータと連結された。この組換え１つ
ＮＡ分子で形Ｙ′ｉｌｌ＋／、換されＩご酵母はｌ−Ｉ
　Ｂ　Ｓ　Ａ　（＋を合成し、酵母培養物２００戴当た
り２へ・５μりの聞のｌ−ｌ　ｒ３　ｓ△（」を蓄積り
る。しかしながら、この系を使用覆るのに不利な拡（が
ある。第１に、ＨＢＳＡｑは酊１１細胞から１：養１１
に地中に放出されないので、酵母細胞抽出物からｌ−Ｉ
　Ｂ　Ｓ　Ａ　Ｕを単離しな（ノればならない。このた
めには、人がかりイ５精製過程が必要である。宿−十生
物が１−ｌＢｓＡｇを分泌ηれば、それは、Ｌｌ　、１
３　ｓ△りがたえず生産され、それを容易に単離精製′
Ｃ−きるという点において、もっど経済的４１供給源と
なる。第２の欠点は、酵Ｂ］細胞中で生成したｌ−Ｉ　
Ｂ　Ｓ　Ａ　（Ｉはグリコジル化されない、即ら、ドラ
１シル硫酸すＩ〜リウム−ポリアクリルアミド電気泳動
グル中、グル」シル化１−Ｉ　Ｂ　ｓΔｇに相当する帯
を児いｌこすことができない。この１−ＩＢＳＡ（Ｉは
、グリ−ｌシル化されたものより免疫ＩＩ；」生活性が
イ（（い。

グリ」シル化されたベプヂドは、イの安定性が増−人−
りるために、その濃度ｄ３　Ｊ、び免疫ＩＵｊ間を増大
リ−ることができるのである。

ｌ（［３ｓ　Ａ　Ｃ＋を産生ずる哺乳動物のセルライン
を開発り−るための種々の試みかな０れてさた。これら
のヒルラインは、ヒ１〜のｎ１肩１１胞癌（Ｊ、Ｊ。

Ａ　Ｉｅｘａｎｄｅｒら、　　Ｓ、　　Ａ　ｒｒ、ｎｊ
ｃ（１，、Ｊ　、ｖｏｌ、　　５　Ｑ　、　　２１２４
−２１２８　＜１９７６）：Ｄ、ｌ：）、ＡｔＪ　ｅ　
ｎら、　　Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、２８２．　６　’Ｉ
　５−（３ｉ　Ｃ５（’Ｉ　９７９））ｉｆ＞よｃｙり
ａ−ンしｋ　ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖ　　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｃ　Ｉ−
ランスフエフ１〜（形質転換感染）した細胞（Ｓ。

７．１−１白゛ｓ　ｃ　ｌ＋　ｍ　ａ　ｎら、　１つｌ
’Ｏｃ　、　ｌ”Ｊ　ａ口、　Ａ　ｃａｔＪ、　　　Ｓ
　ＯＩ。

Ｕ、Ｓ、Δ、　ｖｏｌ、７７、５５０７−５５１１（１
９８０）：Ｍ、Ｆ、Ｄｕｂｏｉｓら、　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａ１１゜Ａｃａｃｌ、３ｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　
ｖｏｌ、７７．　／Ｉ５　／ｌ　９−４５５３　　（１
９８０）　　：　Ｊ、　　Ｋ、　　ＣＩ＋ｒｉｓｔｍａ
＋＋ら。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＪ、　Ｓ
、　Ａ、　ｖｏｌ、７９゜１８１５−１８１９　　（１
９８２）　　）　　／Ｊ目らｔΔ導される。Ａ、　Ｍ、
　Ｍｏｒｉａｒｌｙらは、！Ｊ　Ａｖ　ノ腎Ｈ細Ｉｌｌ
　ニ、１−Ｉ　Ｃ３Ｖゲノムの４０％を持ったシミアン
（３１１１１１ａｌｌ　）ウィルス４０相挽λ体を感染
さＬ！　／：（ＰｒｏｃＪＪａｔｌ、Ａｃａｄ、３ｃｉ
、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　ＶＯｌ、７８．２６０６−２（
３１０（１９８１））。頭部から尾部までの縦列のｌ−
Ｉ　Ｂ　Ｖゲノムが７ウスの線紐牙細胞に、選択可能な
標識、例えば、単純ヘルペスウィルスデミジンキナ−げ
ｉＭ伝嵌子Ｍ、Ｆ。

１）ｕｂｏｉｓら、　ｐ　ｒｏｃ、　　Ｎ　ａｌｌ、△
ｃａｄ、３　ｃｉ、　Ｕ　、　Ｓ　。

Δ　、　＼ｌｏ１．７７、　　／１５４９−１１５５３
　　（１９８０）　　）、１３Ｊ、ひメソ１〜レキリー
１−一レジスタンス　ジヒト１１菓酸還元酵累層伝子（
Ｊ　、　Ｋ　、　Ｃｌｊｒｉｓｔｍａｎら。

ｐ　ｒｏａ、Ｎ　ａｌｌ、Ａｃａｄ、３　ｃｉ、　ｊｌ
　、　３　、△、ｖｏ１．７９．１８１５−１８１９　
（１９８２））と共に、」Ｉ・ランスノＪ、クション（
同時形質転換感染）にＪ、り導入された。

本発明におい−Ｃは、免疫原付Ｂ型ＩＩＩ炎ウィルス細
胞表面抗原を産生しかつ細胞培養の栄養培地中に高収率
でそれを分泌Ｊ−るレルラインを確立づ−るために、Ｒ
Ｎ　Ａ腫瘍ウィルス、モロニー−マウス肉腫ウィルス（
ＭＳＶ）のゲノムおよび／または１）　Ｎ△ウィルス、
生乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）のグノノ＼、−１６ひにこ
れらのゲノムを改変した構成物を、１ｌ１３３Ａ（Ｉを
暗号化しているｌ−Ｉ　Ｂ　Ｖのゲノム部分のための真
核性ベクターどじで使用１゛る。この抗１ｉｉ’はヒ１
〜に接種づるための活性ワクチンどして有用である。Ｍ
ＳＶおＪ、ひ１３　Ｐ　Ｖゲノムを改変した構成物どは
、例えば真核・ｌ’１発現信号を９２に導入したしの、
おＪ：びＭ　Ｓ　Ｖ　ｉｆ３よひ［３１つＶのゲノムフ
ラグメント、例えば後）ホーりる「形質転換領域」を除
去したしのなどを意味Ｊる。

本明細肖に記載されたＬｌ　［３Ｓ△りの：、ｒｙ造り
法は、既述した先行技術と以下の点Ｃ＾・：なる。づな
わら先行技術におい−Ｃは、）−１ｆ３　Ｖゲノムまた
はその一部分のための真核性ベクターとして、ＭＳＶま
たはＢＰＶを使用し−（おらり゛、；ｊ、た、木ざト明
に（１３いては、このようなベクターを含有し、栄養］
１″１地中に少なくども一種の１３型Ｉｌ［炎の細胞表
面抗「；【を多聞に分泌づる、もっばら咄乳動物由来の
を（（（動物性レルラインを使用しでいる。ｍ後に、本
発明の好ましい実施態様では、Ｌ（Ｂ　ｓ　／＼９を暗
号化している遺伝子の天然の発現イに号を使用している
という点である。

りｒましい天然の真核竹発現イ菖月のもう′１つの例は
マウスの細胞から得られるメタ［ｌブＡネ、′ン（ｍｅ
ｔａｌｌｏｔｌ＋１ｏｎｅｉｎｃ）信号Ｃある（Ｒ，Ｄ
。

１）ａ　ｌ　ｍ日ｅｒ　ら、　　Ｃｅ１ｌ、ｖｏｌ、２
９　、　７０１−７１６（’１９Ｂ２）；Ｒ，ＤＰａ１
ｍ目ｅｒ　ら、　　Ｎ　ａｔｕｒｅ。

ｖｏｌ、３００．６１１−６１５　（１９８２））。本
発明によれ（Ｊ、本発明に適合する組換えＤＮＡ分子を
複製おＪ、び／′Ｊ、たは発現りることのできるあらり
）る育４１１動物性レルライン、例えはＮ　Ｉ　１−１
３　　　＋　　　３　　、　　ｌ　　　ｌ　　　Ｋ−、
Ｖｃｒｏ　　　、　　Ｗ　Ｉ　３８　　、　１３　　＋
−Ｉ　　Ｋ　　、ＣＩＩ　ＯおＪ、ひｌ−１０１−ａ　
’ｔ？ルラインなトラ使用スルことがＣさる。

Ｌス＋に不明細円で使用した用語について説明する： 絹込み〈統合半参壮者治）プロウィルスゲノム１ζ′（
払２木鎖１）　Ｎ△に変換され、特異な過程で宿主細胞
のゲノムに組込まれたウィルスＲＮ　Ａ　０大型末端反
復（Ｌ　ａｒｇｅ　ｔｅｒｍｉｒ＋ａｌ　ｒｅｐｅａｔ
）〈１−王Ｒ）：跳躍１）　Ｎ△ニレメン１〜につい°
Ｃ知られている、真核性プロモータおよびもう１つの発
現イＬ号、例えば近くの遺伝子の発現を５〜５０倍増強
りることができるグルココルチコイド受容部位またはい
わゆる「増強配列」、の両者を化石しているＤＮＡ構造
様の編成のＲＮ　Ａ　ＩＩ・ト瘍ウィルスに特異な配列
。

発現信号：構造遺伝子の転写を促進おＪ：び／または増
強（コン１へロール）づるＤＮ△配列１例えは増強配列
、グルココルチコイド受容部位またはメタロチオネイン
プロ七−夕。

増強配列：いまだ解明されていないＰｉｔ　（ｆ、ｊて
（１４ｊ肯遺伝子の転写を増強づる、真核性ブ１」［−
夕の前に存在リ−る１つＮΔ配列。

グルココルチコイド受容部位（ＧＩＲ８）；グルコ］ル
ヂ■」イトホルモン、例えばゲキリメタソンによって活
性化される細胞質受容体によつＣＨ？ａ識されるｌ）　
Ｎ　Ａ配列。この活性化されｌＪ受容体が結合Ｊること
により、構造遺伝子の転写か増強される。

信号ペプチド（リーダー配列）：遺伝子１産物の分泌を
促づ疎水性のアミノ酸配列。

複製の起源：与えられたゲノムを複製り−るＤ　ＮＡポ
リメラーげのための認識信号として役Ｎ′Ｌつ１〕Ｎ　
Ａ配列。

ボリアデモル化イ＾号；多数のアデニンＪ！基により、
ｊｊえられたＲＮＡを伸長させるＤＮＡ配列であり、こ
れによって、例えばｍＲＮ△が安定化する（イの理由は
まだ解明されていない）。

り［」−ユングビヒクル：微生物宿主中で、それ自体Ｊ
＞　Ｊ、びそれに結合したＩ）　Ｎ　Ａを増幅さけるこ
との乙−さるｌ）　Ｎ△分子。

構造遺伝子：その鋳型、′？Ｉな］つらメツＬンジＶ−
ＲＮ　Ａ、を介して特定のポリペプチドに特異なノアミ
ノ酸配列を暗号化しているＤＮＡ配列。

１ノ−ブグノムフラグメン１〜：全ＤＮＡ配列の一部を
（１η成している１、）　Ｎ　Ａ配列。

形質転換領域：細胞を腫瘍細胞に転換し得る）貞嵌子生
成物を１１８号化している構造遺伝子（腫瘍３ｍ１入　
子　（０ＩＩＣＯ（ＩＱｌｌｅ　＞　　ン　。

プロモータ：構造遺伝子の発現に必要なｌ）　Ｎ　Ａ配
列。

Ｎ　ｌ　ｌ−ｆ　　３　Ｔ　３マウス線組芽細胞：密度
増殖依存性等、ある種の正常細胞の性質を示１確立され
たマウスのセルライア　（Ｑ　、　−１−０ｄａｒＯｄ
３　Ｊ：び１−１゜Ｇｒｅｅｎ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉ
ｏｌ、ｖｏｌ、１　７．　２９９−３１３　　（１９６
３））　　。

Ｌ丁に一マウスｍ雑芽細胞：ヂミジンキナーピ活性（Ｓ
、　Ｋｉｔら、　ＥＸＩＬ　Ｃｅ１ｌ　ｌ’＜ｅｓ、ｖ
ｏｌ、　３１　。

２９７−３１２　（１９６３））を欠落した１株（Ｗ、
　Ｒ、［：ａｒｌｅ、　、Ｊ　、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃ
ａｒ　ｌ　ｎｓｔ。

ｖｏｌ、４．１６ｂ　（１９４３）　）由来の、確立さ
れたマウスのセルライン。

ＶｅｒＯレルライン：アフリカ産ミドリ猿の腎細胞由来
の、（ｌＴｆ立されたセルライン（Ｙ、　Ｙａｓｕ−ｍ
ｕｒａＪ　、ｌ、（７Ｙ、ｌ（ａｗａｋ日ａ、Ｎ　１ｐ
ｐｏｎ　　Ｒ肖１８１１０　　ＶＯＩ。

２１．１２０９　（１９６３））。

微生物宿主ニブラスミドを増殖さけるのに好適な真核１
４または原核性の形質転換し’ＩＣ？る微生物、好まし
くは大腸菌。

添イ」の第１図は本発明に係る新規な絹換えＤＮＡ分子
を組み立てるための方ｄ（を示したものである。

第２図は制限］エンドヌクレアーじで特徴（」Ｇ−Ｊた
組換えＤＮＡ分子を示づ。

第３図はグルココルチコイド受容部位を組換えプラスミ
ドｐＭ　Ｓ　Ｖ　ＨＢ　ｓ４に挿入するための方法を示
している。

第４図は制限−［ンドヌクレアーぜで特徴付けたグルニ
］二１ルヂコイト受容部位を含む組換えＤＮＡ分子を示
している。

第５図はＭＳＶゲノムから腫瘍遺伝子Ｖ−ｍＯ８Ｍが除
去された絹換え１）ＮＡ分子の組み立て方法を示してい
る。

第６図はＭＳＶの形質転換領域が削除されＣＯる紺換え
ＤＮＡ分子を制限エンドヌクレアーゼにより特ｔｆ＆　
（；Ｊ　ｉ　Ｕ示したものである。

第７図は本明細甫に記載したセルラインの生産＞ｌニＩ
３！ｌ’ｌルγ−夕、　ＪＪＪ：ヒｌ−１１，ｓ　Ａｇ
ヲ生産し、ヒトの面ｎ〜以外のワクヂン諒と成り得ると
考えられ（いるＩＴ立されたヒ１〜のセルラインｌ）　
ｌ−Ｃ／ＰＲＦ１５　　（Ｊ、　　Ｊ、Ａｌｅｘａｎｄ
ｅｒら、Ｓ、Ａｆｒ。

ｍａｄ、、）　、ＶＯＩ、　　　５０．　　２　１　２
４−２　１　２８　　（１９７６））どの比較データを
示４゜（△〉：細胞Ｅは紐１、゛Ｊ培地に保持づる。（
Ｂ）：培地は毎日変える。

第８図は免疫沈澱したＨＢｓ　Ａｇボリベブヂトの電気
泳動分析を示す。例えばセルラインＹ１および１−ラン
スフ■り１〜しくいないＮｉ１−（３Ｉ３細胞からの標
識した蛋白質を、前免疫モルモッ１〜血清よｌ〔はモル
モッ１〜の高力価の抗−Ｈ１３ｓＡり血清とインキュベ
ートし、明細餌に記載したように沈澱さぼる。蛋白質を
ポリアクリルアミ１〜ゲル電気泳動法およびオートラジ
オグラノイーにＪ：り分析する。　　８列：　１４Ｃ−
標識蛋白υり（♂（卑−グロブリン（１５０Ｋ）　、牛
＋（＋目＾）フルブミン（６ε３Ｋ）、卵アルブミン（
４６Ｋ　）　、炭酸１［；）水酵素（３０Ｋ）、および
ラクトグ］」−ｆリンＡ（１８゜４Ｋ）；５列からｄ列
：抗−１−１＋３ｓＡ（Ｉ血消０゜１／（５列）、１〆
（０列）　、ｉ１５　Ｊ、ひ１０／（ｄ列）どインキ１
べ−１−シたセルラインＹ１からの蛋白質；　０列：前
免疫血清１０〆とインキュベー１−シたけルラインＹ１
からの蛋白質；　１列：抗−Ｈｔ３ｓＡｇ血清１０〆と
インキュへ−１〜した１〜ランスフ−Ｌり１〜していな
いＮ１１１　３１’３細胞からの蛋白質。

第９図は１例どして、セルラインＹ１の栄養培地から単
１ｉ！ＩＩ　したＩ］ＢｓΔ０のＣ３Ｃλｉｌｌ哀勾配
沈澱を示している。

第１０図はセルラインＹ１によって生産された２２＋ｖ
の球状の１−ＩＢｓＡ（１粒子の電子顕微鏡写真を例示
的に承りものである。粒子は１％のリンタングステン酸
によるネガティブスタイニングによって肉眼で観察でさ
る。

表１はセルラインＹ１からの１−ｌＢｓＡｇ粒子によっ
（免疫したモルモッ１−の血清中で１Ｆｌられる抗−Ｈ
１’：３ＳＡ（］力１１１Ｉｉを例示覆るものである。

以下に、本発明に係るｌ−１［３ＳＡ（Ｉを生産覆る新
規なヒルラインを確立するだめの出発物質の製造法に゛
ついて記載りる。

１’　、　ＩＩ　）３　ｓΔｇを生産４る育（ＩＬ動物
由来の細胞培１ｊをＭＥ立りるための真核ｆ１ベクター
の組立（ａ）ＭＳＶゲノムの調製 （＋１　）　１３　Ｆ−’　Ｖゲノムの調製（Ｃ）　ｌ
−ｌＢｓ　Ａ（Ｉ　ｉｌ仏嵌子調製（＋Ｉ　）　ｌｌＢ
ｓ　Ａ（１３貞伝子（ｃ　）を用いたＭＳＶ（ａ）およ
び［３ＰＶ　（＋）　）　（１）インヒｌ−Ｉ」ニＡ３
Ｕル組換えによる、本発明方法の出発物質どしての新規
なＭＪＪＡえプラスミド（１〕νｌ５ＶＩ−１１３Ｓ’
ｌ、１１Ｍ５ＶＩ−ＩＢＳ９、＋＋　Ｂ　Ｐ　Ｖ　ｌ−
１１３ｓ　Ｉで／８）の調製。

（ｅ　）上記（（１）で得た新規組換えプラスミドを用
いたＨＢｓＡｃ＋産生レルラインし確立。

後記（ａ　）〜（ｅ　）の詳細な説明の中の各工程は第
１図のフローシー１へに対応している。

Ｉｌ、ＭＳＶゲノムへのｂう１つの真核Ｉ！１発現信号
の導入 （「）グルコ」ルヂコイ１へ受容部位（Ｇ　ＲＳ　）の
調製。

＜ｇ）ＧＲ３（ｆ’）を用いた＋、＋Ｍ　Ｓ　Ｖ　ｌ−
１１３ｓ　１Ｉ（（１）のインビ１へ口にＪ３１ノる組
換えによる、本発明り法の出発物質どしＣのｔＪｉ規絹
換えプラスミド（１ｉｆｖｌ　４　Ｇ　ＲＳ　／　Ｌ　
ＲｌＩＩＭ　４　Ｇ　ＲＳ　／　ｌ−Ｌ’　。

ｐＭ４ＧＲ８／Ｌ２．　　　　Ｉ）Ｉｖ１４Ｇｌ’＜Ｓ
／Ｒ）　　　の　晶Ｉｌｌ　　製（１１）上記の（（１
）で得た新規組換えプラスミドを用いた１−ＩＢＳ八〇
へ生セルラインの確立（［）・ヘー＜１１）に詳細に記
載した各工程は第３図のフ［−］−シーｈに対応してい
る。

＋１１．ＩＶｌｓＶのゲノ１１に含まれている形質転換
領域の除去 去 （１（）改変したＭＳＶゲノム（ｉ）をＨＢＳ　Ａ（］
逍遺嵌子Ｃ）でインビトロにおいて組換えることにＪ、
る、本発明方法の出発物質どしての新規組換えプラスミ
ド（ｐ２Ｌ−ｒＲＨＢｓ　８０．ｌ１２’ＬＴＲＩ−Ｉ
　＋３　ｓ　８２　）の調製 （Ｊ２）上記（ｋ）で・（！１だ新規組換えプラスミド
を用いたｌ−ｌ　１３　ｓへ〇を産生゛りるセルライン
の確立後記の（ｉ）〜（乏）に詳細に記載しｌご各工程
は第５図のフローシー１−に対応している。

以］ニの項目について以下に計速する。

１．１１１３ｓΔｑを産生りる育４１１動物細胞培養を
確）°ノするための真核性ベクターの組立てに＋）ＭＳ
Ｖゲノムの調製 工程１　１９７３年、Ｊｕｄｉｔｌｔ　Ｂａ１ｌ　らに
よりＧ３−１２４と呼ばれるマウスのセルラインが？１
１（立すｔＬり（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、５６．　
２６Ｆ３　（１９７３））。このヒルラインはいくつか
のタイプの１くＮＡ＝腫瘍ウィルス、特にＭＳＶを含ん
でＪ３りかつこれを生産する。このｆ＜　Ｎ　Ａ−腫掲
ウィルスは細胞ゲノムの組込み部分としＣ細胞中に存在
し、そこｌ）＋　ｒら新しいピリオン（ウィルス粒子）
が生成する。細胞は１００単位／戯のペニシリン、１３
よび１００μｇ／ｍＡのス１〜レブ１〜マイシンをンイ
＆１叫しｌこｌ）　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏにＪ、す°改良
されたｌ’ａ（ｌｌｅ培地中て増９１白させる。

ｌ　　Ｍ　Ｓ　Ｖに組込まれたブ］−」ウィルスを宿主
細胞ゲノムから単Ｆｉｌｌ　Ｊる１、この１」的のため
に、細胞ＤＮＡを１　Ｘ　１０　Ｂ細胞り目ら甲Ｎ］リ
−る。１０ｍＭのＥ　Ｄ　’ｒ−Ａを含有している燐Ｍ
緩衝食塩水（ＰＢＳ）５πβ中、室温で１０〜１５分間
インキ］へ−１−ｆｌることにより、細胞をＩ　ＩＩ　
Ｏｖｎのべ１・９冊の表面から分離させる。分ｌｌ１ｌ
ｌ　ｌ、　／こ細胞は、５〕□　ｔｉｔ　−１＝ング（
Ｃｏｒｎｉｎｇ）試験管中、１５０×ｇで３分間、４℃
で遠心分離することにより東める。ｊｉｌられＩこ細胞
ペレッ１−を、冷７；１１１．たＰ　［３Ｓでｉ　ＩＩ
！ｌイ’ｒ１．　：’（＋　Ｌ／、ｌ１ｌび１５０Ｘ（
１’ｅ゛、４°Ｃで３分間遠心分＋ｉ＋ｌｌ　！る。細
胞を溶菌緩衝液（１０ｍＭｌ−リス（１ｌｌｌ’７．　
／Ｉ　）　、　１．５　　ｍＭ　　Ｍ！Ｊ　Ｃ乏２．１
５０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｆｌ　）　１０ｙＲに再懸濁し
、これに非イΔノ・１ノ１の）先？’ｆ＋　／ＩＩＩ　
、　−−ニヂルノニ丁ニルポリ」−チレングリ１１−ル
（Ｎ　Ｐ−／Ｉ　Ｏ）を最終濃度が１％になるＪ、うに
加え、ただｌうにＶｏｒｔｃｘミキ１ナーで１５秒間激
しく振盪させる。この様にして、核膜を破壊μずに外側
輔胞欣たりを溶解りる。細胞核を７５０　Ｘ　（Ｊて２
分間、４°ｃｒ遠心しベレットとして回収づる。この咳
のベレツ１〜はかなり柔かいので、十澄（１々Ｌｉ；　
ｔＬ’ｊ千に取除く。これ以降の工程は室温で＜−＋う
１．ペレッ；〜申〕細１泡核を食ｔ＝　−Ｌ　ｌ）　−
Ｆ　Ａ　２８　Ｆｉ９（１０ｍＭ　　Ｅ　１．）王Ａ、
１５０ｍＭ　　　ＮａＣｆｆ１．、）１０城中に再懸濁
し、おだやかに振盪しＣペレッ１−をＩＭ　１゜蛋白質
分解酵素Ｋ　（［３ｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ　ａＩ＋ｎｈ
ｃｉｍ　）を最終濃度が１００〜２００μｇ／机となる
よう加えて！Ｉ？　含”ｌる。ドｊ゛シル硫酸すトす・
ンノ＼（Ｓ　ｌ）　Ｓ　）を最終）農度が０．５％とな
るように添加しＣ混合す−る。核ｎシ）をＳ　ｌ）　Ｓ
　Ｃ：　：Ｒ解りると、Ｄ　Ｎ　Ａが透電（づ−るｌご
め本１１）丸かかａす」ニア１りる。

この混合物を、蛋白質を消化りる／、−め（Ｊ少４「り
どｂ４時間〜２４時間、３７′Ｃでインキ」べ−１・（
Ｊる。ｌ１ｉｌ容量の〕１ノールを加え（（〕ＮΔを抽
出し、Ｉ）ｌ−１７、８の１〜リス緩種＋８ｕ１０　ロ
１ｌｖ１て飽和する。

この混合物を、Ｄ　Ｎ　Ａの機械的切断を避（）つり１
５分間おだやかに振ぶりる。約１００Ｘ！Ｊで遠心りる
ことにより水層ど右１ｆｆｌ　ＦＩＭどに分蘭ｉＪイ）
。１−）ＮＡを含んている水層を広［」のバスツールビ
ベラ１−を使って新しい５０τβの」−ニングｉ１（制
置に移り１、前記したように〕Ｊ−ノール抽出をしう１
１す繰返り。

この水層に同容量のりＬ：ｌ　Ｄ小ルｌ＼／′イ＼ノア
ミルアル」−ル（２／ｌ：１）を加え、おノご＼ゝ）か
に［）分間ＩｆＧぶづる＋１　］仝心分離しく−７１＜
層ど石１；笈層とに分ｐａｎ　’Ｊる。水層を新しい５
０２Ｉβコーニング試験管に移り。

次いでもう１度り］」ロホルム抽出を行う。水１１りを
２．５倍容量のイソプロパツールと）昆合し、ｌ）　Ｎ
Ａを沈澱さける。１００　ｘ　ｇ　ζ・５う分間遠心分
臼づることによりＤＮＡをペレッＩ〜に回収し、」−溶
液をン〕怠深くデカントして除く。ＤＮＡを１０ｍＭ１
〜リス、２００　　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｆ２　（ｌ１ｌ−
１７，８）　５２廊にｉｌｉ　ｊｌＪ濁し、２．５倍容
量のエタノールを加えＣもう′１度沈澱さける。ペレツ
１〜中のＩ）　ＮＡを１１０ｎ１＋・リス（叶１７．８
）中、室温で一夜溶解さける。以上の方法によりＩ　Ｘ
　１　（’）　８細胞を出発物質として最終的に、１０
００〜２０００１１　（Ｉの１）　ＮＡが１１１られる
。

１−稈３　以上の方法で０８−１２４マウス細胞から調
製したＤＮＡを、制限エンドヌクレアーげ、Ｅｃｏｌ＜
Ｉによりフラグメン１〜に開裂させる。この酵素はウィ
ルスゲノムを開裂しないことが解つ一’Ｃイル（（’、
　、ｖａｎ　　１３　ｅｖｅｒｅｎら、　　Ｃｅ１ｌ、
ｖｏｌ、２７　。

９７−１０８　（１９８，１））。ウィルスゲノムを含
有しζいるフラグメンｌ−を単離づるために、Ｆ　ｃｏ
　　Ｒ］　　１０００単位、１００ｍＭトリス、ｒ、５
　ｍＭ　　　ＭＣＩ　　Ｃｌ３　．５０　　ｍＭ　　　
Ｎａ　　Ｃ１，２ｍＭメルカプ１〜エタノールを含む総
ｆ８５０００μ（ｕｌ−１７，８）中、細胞ＤＮＡ１０
００１１（Ｊを３７°Ｃで消化づる。消化したＤＮＡを
、２００＋＋＋１ｙ１１’Ｊ　ａ　ＣＩ！、および２．
５倍容量の」−タノールを一２０℃で添加して沈澱させ
、１０　ｍＭｌ〜リス（ｐｌ−１７，８）３０００．＝
ｌ’ｌに再懸濁りる。消化したＤＮＡをプレバラテイブ
グル電気泳動法にＪ、り分画づる［氷酢酸でＩｌＮ　７
　、８に調節し１．＝　／ｌ　０１１１ＭＩ−リス塩阜
、１１１１ＭＩぞ（〕−１−△、５　　Ｉｌｌ〜Ｉ　Ｆ
ｉｌ酸ノーｈリウム中の０．７％アカロース（シグマ、
タイプ■）；グルリイズ：２０ｃｍ（長さ）Ｘ１７Ｇ…
（幅）Ｘｏ、７０ｍ（高さ）；スＩＪ　ツｉリイス：１
３．５引１１（長さ）ＸＯ，Ｆｌｍ（幅）Ｘｏ、７ｃｍ
（高さ）１゜ゲルのスロワ１〜にｌ）　Ｎ　Ａ溶液を入
れる直前に、３０ｍＭＥＤＴ△、０．０５％ゾ［１七）
］−ノールブルー、０．１％Ｓ　Ｉ）　Ｓ　６３　Ｊ：
ひ２％７カロース４００．’を含有している４０％グリ
レリン溶液８００〆を、約６０　’Ｃの温度でこのＤ　
ＮＡ溶液に添加りる。′１８時間、１００　Ｖの電月二
を／）整ノで細胞ＤＮＡフラグメントを分ＰＪ１′ＬＪ
る。

工程４　完全なゲノムの形で組込まれ／、：　Ｍ　Ｓ　
Ｖを含有しＣいるＤＮＡノラグメン１〜を検出、単離づ
るＩこめに、プレパラテイブグルの小ハ〈長さ２０ｃｍ
ｘ幅２ｃｍ）を切り取り、３ｏｕｔｈｅｒｎブロツテイ
ングにイーＪ　ツー　（Ｅ　、　Ｍ　、　Ｓ　ｏｕｊｂ
ｅｒｎ、Ｊ　、　１ｖｌｏｌ。

Ｒｉｏｌ、ｖｏｌ、９８．５０３−５１７　（１９７５
）　）。

プレパラｊイブゲルの残りは、その後の処理を行）ン１
：　’Ｃ゛レル［ｌ−スハーｒト用ノーｌヘフイルム（
し［］フッ・ン）Ｃ響い４°Ｃで保存りる。切り取った
小片中のＩ）　ＮＡは、３　（３（３ｎｍの紫外線を１
０分間あて、０．５Ｎ　　Ｎａ（’）ＩＩ／ＩＭ　　Ｎ
ａＣｌ１溶液中で４１）分間イン１−コベートして変性
させ、ＤＮＡ鎖を分＋’＋１１ｃｘ　ｌ！る。、０．５
Ｂｌ”リス／１．５Ｍ　　ＮａＣｊ２　（ｌ１ｌ−１７
’、　５）中ｒ６０分間インキュへ−１〜してグルを中
和りる。二１〜ロレル１」−スフイルターおＪ、び乾燥
しに組タオルで覆っＩこゲルを３〜ＩＮ　ａ　Ｃｌ　ｙ
”　０　、３　Ｍり［ン酸す１〜リウム（２０×Ｓ　Ｓ
　Ｃ）に２０時間浸し、ＤＮＡをその二１〜ロ廿ル１１
−スフイルターに移゛す。次いでこのニトロレル［」−
スフイルターを減尺下８０’Ｃで２時間加熱−りるど、
ｌ）　Ｎ　Ａ　！＋１が二１〜口セル【」−スに共有結
合りる１、ニック１ｉｌｌｔ＋　（Ｐ、　Ｗ、　　Ｊ、
　ｌλｉ　ｇ　ｌ）　１７ら、Ｊ。

Ｍｏ１．　ｌ−３ｉｏ１．ｖｏｌ、’ｌ　１３．２３７
′−２５１（１９７７））により、〜１３　Ｖ（ｖ□ｍ
ｏｓ”　＞　（７）　形ｈ　％；　Ｉ＊遭伝手工相同の
敢（ＦＪ活性ＤＮ△ブローｌ＼を調製りる。これにより
、組込まれたＭＳＶを含／υＣいるＤＮＡフラグメン１
へをＸ線）ｒルム七に児ることができる。この目的のた
めに、形Ｙｆ転１φ瑣伝子牛産物を暗号化している分子
的にりに１−ンした非相込Ｊｐ　Ｍ　Ｓ　ＶからのＸ　
ｂａ　Ｔ　／　ｌ−ｌ　ｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｉ）　ＮΔフ
ラクメンｌ−０，５Ｂｌ（Ｉを、総量　３０　ｙｄ’の
５０　ｍｔｖｌ　ｌ−リス　（１）Ｈ７，８）、５　　
ｍＭ　　ｖｑ　　Ｃ１１２，１０ｍ〜１メルカプ１〜］
−タノール、Ｑ、１　１１１Ｍ　ｃｌ△−Ｔ−）−ゝ、
０、　１　　ｍＭ　　ｃｌＧｌ−Ｐ、０　、１　　Ｉｎ
Ｍ　＋ｌ−ｌ　’ｌ−Ｐ、５０μＣ１の３２　ｐｄＣ１
−Ｐ　（圧縮−ＩＩ　４００〜ε’３００Ｃｉ　／Ｍ（
１１）　、　１０単位の１ＤＮＡボリメラーげＩ、およ
びｉ　１１１ｇ／　戯１）　Ｎ　ａｓｅ　Ｉの２　Ｘ　
１０−５倍の希釈液３ｉ中、１３°Ｃで７０分間イン−
１−二１１＼−１〜りる。

これにより３Ｘ１０６〜１２Ｘ１０６総ＣＩＮｎ　、即
らｌＸ１０”〜５　Ｘ　１０７　　ｃｐｎ＋／μｑのＤ
　ＮＡを得る。この二Ｉ〜１−ｌレルロースフィルター
を以上のプレハイブリディゼーシ三〕ン（前肩１種形成
）　ＨＪ台物１０鱈を含むプラスチック９・たに蜜月り
る　５０％小ルムアミト、５ＸＳＳＣ１５０ｍＭ燐酸ナ
トリウｌ＼（ｐｉ−１７，０）　、５ｘデンハルｈ　（
［、）　ｅｎ−ｈａｒｄｔ　’　ｓ　）溶液（０，１％
ＢＳＡ、０．１％フィー」ル（ｒｉｃｏｌｌ）　、０．
　１％ポリビニルピロリドン）、２５０μｇ／７１１２
の変哲牛胸腺１）　Ｎへまたは］ノウの精子１）　ＮＡ
。二１〜１〜ロレルロースフイルターこの溶液中、４５
℃で少なくとも１時間〜４１１４間イン−１」−べ−１
−りる。この後、プレハイブリディＬ−ションンＩへ合
物を以下の組成のハイブリティピーシ三］ン混合物に変
える：５０％小ルムノルムアミ１ミＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１２
０ｍＭｇ４酸す１〜リウム（ｐｔ−１７，０＞、ＩＸデ
ンハルト溶液（０，０２％ＢＳ△、０．０２％フイ」ル
、０，０２％ポリビニルビ１−１リドン）、１００μｇ
／πβの変性牛胸腺１つＮＡ」：たは＋、１ヶの精子１
）　Ｎ　Ａ、５　Ｘ　１０５Ｃ１１ｍ／ｉｌの敢用話１
１ニック翻訳Ｄ　Ｎ　Ａブローペ。このイン１−Ｉベー
ションの後、２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、Ｔｊ３　
？ＦＷで夫々５分間ずつ３回よく洗浄し、次い（’０．
’ＩＸ　　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ中、５０℃Ｃ゛ｉ　
５分間、２回洗浄覆る。二１〜ロレルロースフィルター
を６０℃で′１０分間完全に乾燥さける。

この乾燥したフィルターを、２個の増感スクリーンの間
の２枚のＸＩＩフィルムＸＲ５（二ｌタック）に感光さ
ける。最初のＸ線フｒルム（，１３０間感光さけた後現
像し、２番目のフィルｌ＼は７　ＩＩ　１１２に現像づ
る。４個のｔ４を種形成りＮＡフラグメンｌ〜が約１４
ｋｌ）、１２ｋｌ］、１０ｋｌ＋、および８ｋＬＩに観
察される。このＸ線フィルムを、４°ＣＣ゛保存してい
る残りのプレパラアイブグルの横に並ｌ＼る。Ｘ線−ノ
イルム十に見られる８ｋｌ＋の刹１種形成帯の（品に並
／υでいる、ＤＮＡフラグメン１〜を含むゲルの小１−
１．を切り取る。このゲル小片から電気泳動法にＪζす
１つＮΔノラグメントを溶出さける１、このゲル小１−
ｉから得たＤＮＡを既述したように）Ｔノール／り１１
０ホルムで抽出りる。

■程５　上記のブレバラｒ−ｒ７グルから１１？られた
ＤＮＡフラグメン１−と結合さけるための１＜クテリΔ
ファージλチャロン（（／　ｈ旧゛叶）７′Ｉ△（Ｊ　
。

１（、ｄｅ　　Ｗｅｔら、Ｊ、ｏｒ　　＼／　１ｒｏｌ
ｏ（１ｙ、ｖｏｌ、３．３　。

／１０１−４１０　（１９８０）を調！ｌｉ！ｆ−Ｓす
る。チＩ７［］ン４△　Ｄ　ＮＡを制限エンドヌクレア
ーゼＥＣＯＲ１，”Ｃ消化する。このバクテリオファー
ジゲノムには、１９８０１１）ｆ）、２６６９３１１１
）おＪ、び３４５２４１叩に３つのＥｃｏＲＩ部位が存
在する。この線状バクテリオファージゲノムの全長は４
５４１０１叩に）ヱする。ＦｃｏＲＩで消化づると、約
１９１（ＩＪ、Ｉ　１　ｋｌ）、７．８ｋｌ）および６
．８ｋｌ）に４つの７ラグメン１へが１ｑられる。１９
８０１１＋ｐと３４５２／ＩＩ月）の間に位１ｍりるバ
クテリオファージゲノムをプレバラディプグルから得ら
れた［ｃｏＲＩノラグメン１〜ｉ’　ｆｉｆｆ換り−る
。従って、既述したようにして−、グレパラティブアガ
ロースゲルから１９ｋｂ）゛ノクメントおＪ、び１ｌｋ
ｂフラグメン１〜を甲削し、これらを、（’１　、０’
Ｉ甲位のＴ４１ＪＮＡリガーげ（１−Ｎ＜　　ｌ　　　
）　　　、　　　６６　　ロ＋Ｍｌヘ　リ　ス　　（ｌ
１ｌ−１７，６）　　　、　　６゜０　　ｍＭ　　Ｍ（
Ｉ　Ｏ兇２．１０　ｍＭ　　ＤＴＩ−１およびＯ、／Ｉ
ｍＭ　　Δ］］）を含有する全量１５ｉ中、０８−１２
／Ｉマウス細胞ＤＮＡからの８ｋｂＤＮ△ノラクメント
ど結合さける。この反応混合物を４’Ｃ’ｃ　’１８〜
２４時間イ時間インキュー−１−ツのλＣ１）ａｒｏｎ
　４△の絹換えバクテリオファージゲノムを、インビ１
〜口においで感染（’１ノアージを形成りるためにパッ
ケージ（ｐａｃｋａｇｉｎｇ　）　Ｌ／た後、大腸菌株
に８０１に導入り−る。インビ１−口に＋３　ｔＪる引
換えファージのパッケージおよびスクリーニングは、”
　ｆｖｌ　ｅｔｌ＋ｏｄｓ　ｉｎ　Ｆ　１１７ＶｌｌＩ
０１（＋（ＩＶ　”　、　Ｖ　（＋１．　（ｉ　８　。

”Ｒｅｃｏｍｂｉ１＋ａｎＬ　　ＤＮＡ”　　、　　Ｒ
ａｙ　　Ｗｕ　　ｃｄ。

Ａ　ｃ　ａｄｅｍｉｃ　　Ｐ　　ｌ’ｅｓｓ、　　　ｌ
’Ｊ［！Ｗ　　　　ＹＯｌ’ｋ　　、　　　Ｌ、（ｌｌ
ｌｄｌｌ。

ＴＯｒＯｌｌｔＯ，５ｙ（Ｉｌｌｅｙ、　　５ａｌｌ　
　　ｌ−ｒａｌｌ（：１ＳＣ（１，ｌ　　９１および２
０章（１９７９）＋ご記載の１ｌン人（こ従って行う。

ＲＮＡ肘瘍１クィルスの形質転１襲遺仏ｒについＣ陽性
であることが解ったバクプリＡ）ｊ′−ジλＣｌ＋ａｒ
ｏ＋＋　４Δをプラークから単ｔｉｉ１１．　ｔ、、大
腸菌１１１３１０１に再感染さけて多作に１８香し、そ
こからこのファージＤＮＡを得る。Ｇ３−１２／Ｉ７ウ
ス細胞ゲノムからの組込みＭＳＶゲノムを含有しＣいる
この絹換えファージ［つＮＡの挿入１）　ＮＡをプレバ
ラティブアガロースグルで分離し、次いでブシスミドヘ
クター　ｐｒ３Ｒ３２２の［ｃｏ［ぐ１部位に挿入りる
。この相換えプラスミドは＋＋Ｉｖｌ　Ｓ　Ｖ、、。

と命名し／ｌ−Ｑ ’ｉ−囚６　　この絹換えプラスミドｌ］　ｌｖｌ　Ｓ
　Ｖ　Ｉ　Ｎ　ＴのＱＳｉ　ｌ！ｌを、制限」ンドヌク
レアーげ］三ｃｏＲＩ、Ｋ１＋＋＋Ｉ　、　５ａｌＩ、
Ｂｏｌｌｌおよび１−１ｉ＋＋ｄｌｒｌにＪ、すｔｌ＋
ｉ底的に調へた。この制限部位は、組込まれていないＭ
ＳＶ　（Ｃ，Ｖ、　　Ｂｅｖｅｒｅ＋＋ら、　　Ｃｅ１
ｌ、ｖｏｌ、２７．９’７．−１０８　（１９８１））
の配列と一致しＣいることが解った。隣接づる■１胞性
ＤＮＡの５１　末端の長さは約１００１１１１であり、
３′末端の良さＬＪ、２２００＋叩である。この組換え
プラスミドｌ］〜ＩＳＶ、目Ｔの生物活性を、Ｍ　Ｓ　
Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　１μり当り１０００〜２０００フＡ
−カス形成単位の範囲であることが解つ−ＣいるＮ１ト
１　３１３マウス線紐芽細胞の形態学的転換によりチェ
ックする３、この分子的にクローンしたＭ　Ｓ　Ｖゲノ
ムをＮＩｌ＋３１３マウス線維芽細胞に再導入した後、
イれを、そのｌ＼ルバー１クイルス、モロニー白血病ウ
ィルス（ｆｖｌ　Ｌ　Ｖ　）の助（）を借りＣ感染性粒
子どじＣ回収りる１゜ （ｂ）ＢＰＶゲノムの調製 工程７１型牛乳頭腫ウィルスの形質＋ｌ’／＋換ノラグ
ソノラグメン有し−Ｃいるｌｌｌ換えプラスミド　ｐｌ
”３ＰＶＴ６９４Ｊ、Ｐ、　Ｍ、　ｌ−１ｏ１−１ｏら
により記載されＣいる　（”　Ｖ　ｉ口ＪＳ（！Ｓ　　
ｉｎ　　Ｎａ１ｔ汀ａｌｌｙ　　ＯｃｃｕｒｉｎｇＣａ
ｎｃｅｒｓ”　、　Ｍ、　Ｅｓ５ｅｘ、　ｌ−１，ｚｕ
ｒ　　ｌ−１ａｕｓｅ＋＋、Ｇ。

１−　ｏｄａｒｏ　　ｅｄｓ、、　　Ｃｏｌｄ　　Ｓ　
ｐｒｉｎｇ　　ｌ−ｌ　ａｒｂｏｒ　　ｌ　　ａＬ＋ｏ
−ｒａｊｏｒｙ、　　Ｃｏｌｄ　　Ｓ　ｐｒｉｒ＋ｕ　
　ｌ−ｌ　ａｒｂｏｒ、Ｎ　Ｙ　、ｖｏｌ、７　。

２３３−２＝１７　（１９８０））、この絹換えプラス
ミドＤＮＡを制限エンドヌクレア−１ｕ３ａｍト１１で
消化りる。このＩ）　Ｎ　Ａ　２μｑを、４中位のＢａ
ｍ　　Ｈ］、１５０１１１１ＶＩ　　Ｎａ　Ｃｌ、（３
ｍＭ１−ｒｉｓ　（ｐＨ７，８）　、６　ｍＭ　　Ｉｖ
ｌｑ　ＣＡ２を含有りる全量２０ｉ中、３７°ＣＣ１時
間インキコベー１〜する。

（ｃ　）　１−ＩＢｓ　Ａｑ　ｉ貞伝了の調製工程８　
分子的にクローンされたｌ−１１３Ｖゲノムは１．　Ｗ
、Ｃｌｌｌｎｍ１１１（１３ら（ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａｔ
　１．Ａ　ｃａｌｌ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、ｖｏｌ、７７．１８４２−１８
４６　（１９８０）　）にＪ、り記載されて（１３す、
彼らは、ｌ−ｌ　Ｂ　ｓ　Ａ　！＋に対して陽性の赤十
字供与者の血清がらつ、ｒルス粒子を精製した（亜型ａ
ｄ／ｗ　）　　（アメリカ赤十字、試わ］△ＲＣ２３７
５）。彼らはＥｃ。

Ｒ］線状１−ｌ　１３　Ｖゲノムをバクテリオファージ
λ！ＩＩＷＩＳにり【」−ンし、細菌性プラスミドｐΔ
０１にリープク１」−ンした。

この組換えプラスミド１）ＡＯＩ−１−ＩＢＶがらのＩ
ｌｌ：３Ｖゲノムを、制限エンドヌクレアー１２　Ｅ　
ｃ。

Ｒ１による消化、次いで既述した如きプレパラティＪノ
ｌガ１」−スゲルにょる→プイズ分画く大きさによる分
画）により単離りる。

工程９ＨＢＶゲノムの標本であるこの線状環化りる。こ
の結紮は以下の如くして行う：Ｆｃ。

Ｒ］線状１−Ｉ　Ｂ　Ｖゲノム２μｇを、１単位のＴ４
ＤＮ　Ａ　ＩＪガーげ、６０　　ｍＭｔ−’Ｊ７．　　
（ｐＨ８，０＞、６　ｍＭ　　ＭＣＩ　Ｃ１１２，１０
１１１ＭＤ−Ｉ−１−１０，４１１１Ｍ　　Δ１−ＩＪ
を含む全量２００Ｓ中でインキュベートする。これは分
子内結合に右利なように非常に希釈された溶液である。

あるいは過変光は線状Ｅ　ｃｏ　　ＲＩ　　ｌｌＢ　Ｖ
ゲノムの頭部−屈部絹Ｘ″ｌ＜、によって避けることも
できる。

」二程１０　エＩＪ環化した１月３Ｖ−１，）Ｎ△１μ
りを、４単位の制限］−ンドヌクレア〜１２１３ｑＩＬ
　ＩＩにＪ、す、６．７ｍＭ１〜リス（＋＋１−１７．
８）　、（３，７ｍｆｖ１ＭｇＣＩ１２および６．７ｍ
Ｍメルカプ１〜エタノール中、３７°Ｃで間化する。こ
の消化）［５合物は２　＋１！、１のＨ１３Ｖ　　ＤＮ
Δフラグメン１〜．８Ｉなりらフラグメン１−′′Ａパ
おＪ、びフラグメン１〜”　Ｃ３”を含／υＣいる。フ
ラグメン］〜ｌｊ　Ａ　ｕはＨｆ３ｓＡｇの１旧層官伝
子、そのウィルス性プロ七−夕、でのリーグ配列Ｊ５　
、Ｊ：びぞのポリアゾ゛ニル化（菖号を略号化しており
、その他に、このフラグメンｈ　（７）　５　’末端Ｊ
３よび３′末端に核（ｃｏｒｅ）抗原（’Ｌｌ　１．：
３　ｃ△（１）のための構造）ｍ転子の２個の残存フラ
グメン１〜を含んでおり、フラグメントＢＩ＋は不完全
なｌｌ　Ｂ　ｃＡｇ構造遺伝子を暗号化している。

■稈１１　このようにしＩ＝　＋５１だ消化）１２合物
は、前記（ａ）Ｊｊよび（１））に夫々開戦したＭＳＶ
ゲノムおよび［３Ｐ　Ｖゲノムとのインビトロにお（〕
る絹換えに直接使用づる。しかしこのインビトロに、；
ハノる組換えは、：１！、　４／＜かつ単離したフラグ
メンｊ・”　Ａ　”を用いて（−ｊうこともできる。

（（１）　ｆｉ　ｌ’３　ｓΔ（１逍伝子にＪ：るイン
ビ１−口におｃＪるｌｖｌ　Ｓ　ＶおＪ、びｌ’３　Ｐ
　Ｖの組換え（本発明方法）］二稈１２　環状プラスミ
ドｐＭＳＶ　　　２μｑＮＴ を、６　、　７　　ＩＩＩＭ　Ｉ〜リス（吋４７．８）
、６．７１１１Ｍ　　Ｍ（１（：Ｃ１２および６．７ｍ
Ｍメルカプｊ・エタノール中、制限エンドヌクレアーゼ
Ｂｇ６１１を用いて３７℃で線状化りる。線状ｕＭ　Ｓ
　ＶＥＮＴ自体が結紮づるのを避（Ｊるために、アルカ
リ小ルフＩター１ｉ　（ＣＥ　Ａ　Ｐ　、　Ｂ　ｏｅｌ
＋ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｌ＋ｅｉｍ　）にＪ、＝＞　
ｒ：’　５　’末！）ｉ：から燐酸エステル基を除去づ
る。

２００＋ｎＭのｌ’Ｊ　ａ　ＣＥ　Ｊｊよび２．５イ８
容量のエタノ一ルを加えることにより、線状化したｐＭ
ｓＶＩＮＴを沈澱さぜる。ペレット中のＤＮＡを５ｍ〜
１１〜リス（ｕｌ−Ｃ９，５＞　；Ｊｊよび１単位のア
ルカリ小スフＩターＵを含有している全ｆｆ１２００．
’中に再懸濁し、６０℃で３０分間イン−１−Ｌべ−１
・づる。

インコトユベー１〜しだ後２回フェノール抽出をｔ″ｉ
う。

水層をとり、既述したＨＢＶグノノ＼の１３！Ｊ　ｆｆ
ｉ　ＩＩフラグメント１μ【）ど混合する。この混合物
を一１タノール沈澱さけ、リゲーション（結紮）Ｍ両液
（６１１１Ｍ＋−リス（ｐ＋−１’７．６＞　、Ｃ３１
＋１Ｍ　　ＭｇＣｊ２２．１０１１１Ｍ　　Ｄ−ｒ丁、
０．４　　＋＋＋Ｍ　　Ａｌ　Ｐ、Ｑ、５単位の丁４　
　ＤＮＡり刀’−１’）２０％に再懸濁し、３０分間１
５℃でインキュへ−１・づる。

次いでこのｆＪ、ｆ１合物をリグージョン緩雨液で２０
０ノまで希釈し、さらにＴ４　　ＤＮＡり刀−ゼ０゜５
単位を加え、づ°０で１５時間イン＝１−１へ−１−り
る。

既知の細菌株Ｅ、　ｃｏｌｉ　　１１１３１０１　ヲ、
ｃ−ｔＬＬ１２Ｉ　Ｂ　Ｖゲノムの１３ｇ６Ｕフラグメ
ン１−で絹換えたプラスミドｌ）Ｍ　Ｓ　Ｖ　、Ｎ下を
再導入Ｊるために、］ンピテン１−菌にづる。ＯＤ６５
０　＝０．８の密１ｐまで細菌培養を行う。この培養物
ｈｓ　ｒう２０２〃βを採取し、遠心分前により細菌を
沈降させる。ベレッ１−中の細菌を５０１１Ｍ　　Ｃａ
　（’、　１２１０ｍ、にＰＪ懸濁し、１１ｊび沈降さ
け、次いで５０　ｍｆｖｌ　　ＣａＣ乏２２２〃βに７
］ｊ懸）６１シ、氷上で３０分間インキュペー１〜！Ｉ
る。絹換えたｐＭ　Ｓ　ＶＩＮＴを大腸菌に導入りる１
こめに、この細菌懸濁液１００〆を緩衝液（１０ｍＭ　
ｌ−リス（Ｌｌ＋−１７，（３）　、１０　　ｍＭＭｇ
ＣＡ２．１０　ｍＭ　　Ｃａ　Ｃｌ１２　）１００／’
Ｊ＞よび上記のＬｌ　＋３　ＶゲノムのＢｇＡＩＩフラ
グメン１−Ｊｊ　、Ｊ、び１１　Ｍ　Ｓ　Ｖ　Ｉ　ＮＴ
のリゲーションアッレイからの４０／ｌ’ど混合りる。

この混合物を氷」−で１時間、／１２°（Ｃで１分間、
次いｒ２０℃で１０分間イン−１−ＩＩ＼−１−した後
、１１３培地（５（Ｉ　Ｎａ　Ｃｆｆ１．１０リバクＩ
・トリプトン ｌ）ｊｆｌ、蒸８Ｙ１水１乏中）１版を加え、この五含
物を３　７　’Ｃて３　０分間振盪づる。次いてこの混
合物を、！：５０１１ｇ／πクアンピシリンを含イｊす
る寒天平板に、１Ｓ１１仮当り３００〆ずつ分配づる。

これらの寒天平板から幾つかの細菌コロニーを分離りる
。

これらのコロニーを、組換えプラスミドの存在についＣ
ヂ］−ツクする。プラスミド１つＮＡのミニプレバレー
ジョンは、Ｉｆ　、　Ｃ　、　Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍおよ
びＪ。

Ｄｌｏｙ　　（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ，、ｖ
ｏｌ．７．　　１　５　１　３−１５２３，（１９７９
））にｉノ１−〕ζ行う。勿論、組換えプラスミドＤＮ
Ａを増９１１させるのに他の細菌宿主、例えば［、ｃｏ
ｌｉ　　Ｃ６００または△（３３０１を使用してもよい
。

工程１３　幾つかの細菌二Ｉ　１１　”Ｌ−は絹換えブ
１ノスミドを保有していることが解った。プラスミドを
ブレパラ”アーｒブ法により単離し、その特性を調ぺｌ
こ。このブラスミドニ１０ニーの２つ（３１，〜ＩＳＶ
およびｌ−ＩＢｓＡｇ逍伝子を遺転子でいることが（（
ｆ．　認された。これらのプラスミドはＩＩＭ　Ｓ　Ｖ
　ｌ−ｌ　［３　ｓ　４および＋）ＭＳＶＨＢｓ９と命
名された。これらの絹換えプラスミドを種々の制限土ン
ドメクレアーじを用いて特性化した。その構造を第２図
に承り。

１、＋　）で得た＋３　Ｐ　Ｖゲノムのｃ）’ｒ調製し
た１１１３ＳＡｇ遺伝子によるインヒｌ−　１．１　（
の組換え（３Ｌ．既）ホしたＭＳＶゲノムσ月−口３Ｓ
ＡＱ３１ｆｆ伝了による絹換えと全＜　Ｉｉ’ｉ１様に
して行う。この絹換えプラスミドは、　ｐＢ　Ｐ　Ｖ　
Ｌｌ　１３　ｓ　Ｒ　／　８ど命名した。

上記の３個の絹換えプラスミドをコンビテン１〜な大腸
菌株Ｈ　Ｂ　１　０　１に導入うる。得られた形質Φ云
１’ｊｒ　イ本　、　）−１　　［：３　　１　　０　
　１　　−　　Ｊ　　１　　、　）−ｌ　　Ｂ　　１　
　０　　１　　−　　Ｊ　　２　　Ｊ＞よびＨ　Ｂ　１
　０　１　−　Ｙ　１は各々寄託番号２　４　６　３　
。

２　’ｌ　６　’Ｉ　ａ３よび２４６５で”　［）　ｅ
ｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍ−ｌｕｎｇ　　ＶＯＩＩ　　　
Ｍ　　ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ”　　　（　　Ｄ
　　Ｍ　　Ｓ　　）Ｇ　ｏｅｔＬｉｎｇｅｎ，　Ｆ　ｒ
＜　Ｇに寄託されている。

（ｅ）」−記（（１）で１！Ｉられた新規組換えプラス
ミドを狛つｌこｌ−ＩＢＳＡ（＋産生Ｕルラインの）１
１ｆ立く本発明方法） Ｌ捌と上　組換えプラスミドｐＢＰＶｌ−ＩＢｓＲ／ε
３、＋．＋Ｍ　Ｓ　Ｖ　ｌ−Ｉ　Ｂ　ｓ　４およびｌ〕
ＭｓＶｌ−ＩＢｓ９を各々、Ｊ　、　［）　ｏｅｈｍｅ
ｒらの１−ランノＪクション法（　ｐ　ｒｏｅ．　Ｎ　
ａｔ　ｌ　、△ｃａｄ．３　ｃｉ．　Ｕ　、　Ｓ　、△
，ｖｏｌ，７５）、　２　２　（３　８　−　２　２　
７　２　（　１　９　８　２　）　）によりＮＩｌ１３
ｒ３マウス線維芽細胞に導入づる。このプラスミド１Ｄ
ＮＡを取り込んで保持しＣいるマウスの線層１力細胞は
、ＭＳＶの腫瘍遺伝子またはＢ　）’）　Ｖの形質転換
領域により形態学的に変換され、紡錘状の形態をどろ。

これらの細胞は非形質転換細１１べの七゛Ｃ′増殖し、
特徴的な第２層を形成づる。

これらの細胞をクローニングシリンターで採取し、常法
に従い通常の栄養培地（１０％の牛血ｉ＾および５０μ
りのカッ−マイシン／′２〃βを追加したＱ　ｔ．＋　
ｌ　−＋）ｅ　ｃ　ｃ　ｏによる改良［ａ（ＪＩＯ培地
）ｌｌｌＣ増９ｎさけ、多量の培養物を得る。形質転換
細胞とｊ（に採取した非形質転換細胞を除去覆るために
、非形質転換細胞を含まない形質転換細胞をり１１−ン
づるための制限稀釈を？−ｉなう。あるいは形質転換細
胞の選択基準として、軟寒天中の増＋ｌｌ’ｊ法を使用
した。

３種のこれらのクローンをしルラインとしく’　ｂ１ｒ
立づる：Ｙ１は紺換えブラスミ１〜　ＩＩＢ　Ｐ　Ｖ　
Ｈ　［３Ｓ［で／８でトランスフエク１〜しだ後ＩＭ　
Ｓｊ　したもの、ＪｌおよびＪ２Ｃま組換えプラスミド
　１）〜Ｉ　Ｓ　Ｖ　ｌ−ｌ　ｔ３ｓ／Ｉ　ｉｔ５　Ｊ
：　（ｆ　１１Ｍ　Ｓ　Ｖ　ＬＩ　Ｂ　Ｓ　９　テ各々
ｈ　−ｙ　ン−）　Ｊ−９１−した後（Ｉ（ｆ立された
もの。これらの１？ルシインは１−ＩＢＳＡｇを牛産し
、培養培地中にこれをｌＪ９．出することが解った。Ｌ
Ｉ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇは成用免疫分析（ＡＵＳｒくＩΔｌ
　、　Ａ　Ｉ）ｂｏｔｔ　（ＩＪ１究所）にＪ、り検出
される。

これらのしルラインによるｌ−ｌ　１３　ＳΔりの４１
コｉ！７に゛）い（（１）速度論的４ＪＩ究を行い（第
７図参照）、既述した既知のヒ１へのヘパ１ヘーム（Ｉ
ＩＩ細胞癌）レルンイン（１’）Ｉｃ／１つＲＦ　／　
５　）と比較Ｊる。レルシインＹ　Ｉ　Ｕよび、」１は
４００　ｎｇのトＩＢｓ　、ｌ　／培地１２１１８／　
ｔＥを生産り゛る。Ｊ２は６０　ｎ（Ｉのｌ−１１３ｓ
Δす／］８地１廉／′１」を生産づる。第７図に記載し
たものど同一の条１′１下において、ヒ（〜ヘパ１ヘー
ムしルラインＰ　Ｌ　Ｃ／　Ｐ　ＲＦ　／　５は１０μ
ｇのｌＩＢ　ｓΔ！Ｊ／培地１滅／口を生産りる１、こ
れらの結果はｆＩＪ現性のあるものＣある。

シルラインＹ　１１．、Ｊ　１およびＪ２によって生産
されたｂのが１−ＩＢｓＡ（Ｉであることは、以下の方
７人（こより４’ｌｆ　ｉｉＸ　シｌご：（ｉ　）３５
Ｓ−シスディンで４Ｍ識した１１１３　ｓ　Ａ　ｇの免
ＩＣ＞　ｔＡ、　を殿の後、Ｓ　Ｉ）　Ｓポリアクリル
アミドゲル電気泳動 （ｉｉ）ＣｓＣｊ２密度勾配、 （ｉｉｉ　）電子顕微鏡、Ｊ３よび （ｉｖ）モル［ツ１へにお【）る免疫原性試験。

（ｉ）このポリペプチド組成を決定りるために■１胞を
４００ｕＣｉの３５Ｓ　　＞スー１イン（Ｎｅｗ［：　
１ｌｕｌａｎｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ　　Ｃ０ｒｌＬ　
）　Ｃ−生合成的に標識する。３７°Ｃで一夜インキコ
ベートした後培地を集め、蛋白質をモル−しツ１〜また
はヒＩ〜からの抗１−ＩＢｓＡ（１，血清とともにイン
−ＩＪへ−１〜りる。Ｗ。

３ｔｉｌ＋ｂｅおよびＷ、　Ｇｅｒｌｉｃｈらのｈ法（
Ｖｉｒｏ−ｌｏｇｙ、ｖｏｌ、　　１２３．４３６−４
．４．２　（１９８２）　）にＪ、り免疫沈ｉ殿および
Ｓ　Ｄ　ＳポリアクリルアミＩ・ゲル電気泳動による分
析を行う。ヒ１〜血清からの１−（ＩＢｓＡｇについて
３　ｔｉｌ＞ｂｅ　Ａ３　Ｊ、（／　０ｅｒｌ　ｉｃｌ
＋か示しているように、分子量約２　／Ｉ　Ｋ、２３３
に、３４Ｋ　ｉ１３　にび３７１〈の４つのポリペプチ
ドが見出されたく第８図参照）。主要な成分は２　／Ｉ
　Ｋ　Ｊ５まひ２８にのものである。２８］く型が存在
リ−ることは、ｌｌ−１ｓＡの２４に型がクリ」シル化
されたことを示している（１つ、　　ｌ　、ｌ’　ｅＶ
；ｒｓｏｎ、　−１’　ｈｅ　　、）（）旧゛−ｎａｌ
　ｏｆ　　［３ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｌ）ｅｍｉｓｔ
ｒｙ、ｖｏｌ、　２５　（３。

６９７５−６９８３　（１９８１）参照）。

（ｉｉ）浮揚性密度決定のため、細胞の残骸を除去りる
ｌ〔めに培養培地の上澄液を低ｊｌｉ　’Ｃ遠心分ｔｊ
ｌｆｌ（１０００Ｘす）することにより、１−ｌＧ５Ａ
ｇを中１ｉ！Ｉ＋、精製りる。次いでＨＢｓＡｇを、高
速遠心分ｍｌ　ＩＩ　００００ｘｇ）によりペレット化
し、１０　ｍＭ　＋−リス（ｕｔ−１７，５）、１５０
　ｎ１Ｍ　　ＮａＣ忍、ｌ　　ｍＮＩＨヒＩ）　−１’
　ＡにＭ＠濁する。Ｃ５ＱＪ２を１　、２　ｇ／ｃｍ３
の密度になるまで添加し、この試わ１を４°Ｃｒ　６０
時間、２３５０００Ｘ（Ｊで遠心分１ｉｉ１１りる。フ
ラクションを集め、その一部を適当に希釈した後、成用
免疫分析によりＨＢ　ｓへ〇について試験づる。第９図
に示したＣ８Ｃλ勾配中、１−ｌＢｓＡｇは密度１．２
（］／πβに相当するフラクションにｒｔ右し、これは
ヒトの血清中の２２μｍ粒子についＣ求められた値と同
一である（　Ｌ　。

Ｑｅｒｉｎら、　　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、ｖｏｌ、　　
４．　７６３−７６８（１９６９））。

（ｉｉｉ　）　Ｃ３ＣｊＺ勾配のピークフラクションを
濶縮した後、この粒子の特性を電子顕微鏡によりさらＩ
ＪＩＩＲＩ　’＼る。第１０図に示したように、この粒
子はゝ］ｒ均的径が２２１１ｎ＋であり、ヒトの血清中
に見出された１Ｉ１３３Ａ（１粒子と同じである。

（ｉｖ）セ／Ｌ／７’イ＞Ｙ　１　、Ｊ　１　Ｊ３ヨヒ
Ｊ　２　ニヨ−Ｊ　（生産されたトＩＢＳ　Ａ！Ｊはモ
ル七ツ１−に（１３いて免疫原性を示す。２０μりのＨ
ＢＳＡ（ＩＩ５よび０．　１％の水酸化アルミニウムを
含有している生理食塩水１７７βを４匹のモル［ツ１〜
に皮Ｆ注用りる。１週間後にこのワク・チン性用をもう
１度行なう。接種後、時々血液試料を採取し故ｑ」免疫
分析（△ＵＳＡ　Ｂ　、　Ａ　ｂｂｏｔｔ　ｈＩｌ究所
）にか（）る。表１に示し！ごように、全てのモルしツ
１へにおい−Ｕ、　１１１３ｓ　Ａ！１注剣後抗体力価
の上昇が観察された。

この括性ににす、本発明り法にＪ、り培養動物細胞、例
えば形質転換したｌ’Ｊ　Ｉ　ｌ−１３Ｔ　３マウス線
紐芽細胞、Ｌ　−１−Ｋ−マウス線層１芽絹胞、および
ザル腎細胞（ＶｅｒＯＬ？ルライン）によって生産され
るｌ−Ｉ　Ｂ　ｓへ〇を用いて、抗体産生を刺激したり
、あるいＩＡ、ヒ１へにＪ＞　（）る１ＩＩ３Ｖ感染を
検出する１ｊ法、Ｊ３よびイれを含む組成物を（ＩＴ「
立りることが可能となった。

本発明にＪ：っで生産されるｌ−１１３ｓへ〇は、単独
Ｃ１あるいは食塩水の様な通常の薬学的にｉ＋［容し１
ｑるｌｌｊ体または希釈剤、あるいはこの分野で知られ
Ｃいる添加剤、例えばチＡメル４ノルまたは水酸化アル
ミニウム懸濁液（＋＋Ｈ６，７）の形のアジ−７バン１
へどじての水酸化アルミニウム（０，１％）おにびマン
ニットと共に、ヒ］〜のトＩＢＶ感染の予防法およびそ
のための医薬組成物に使用り゛ることができる。ワクチ
ンは５〜２０μ１−ＩＢｓＡｃ＋の範囲の投り吊Ｃ１１
，２，６Ｊｊよび゛１２ケ月の間隔で３〜４回投与りる
。大ｍ生産Ｊるための細胞培養技術、例えばビーズまた
は繊維−Ｖの増殖あるいはローラボトル培養などはよく
知られＣいる（例えばＪ、ＦｅｄｅｒおよびＷ　、　Ｒ
、Ｔ　ｏｌｌ）ｅｒｔ。

３ｃｉ、△ｍｅｒ、、　ｖｏｌ、２４８　（１）　、　
２４−３１（ｉ　’）　８３　）参照）。

１１、ＭＳＶゲノムへのその他の真核性発現信号のり９
人 （［）グルココルチコイド受容部位（Ｇ　ＲＳ　）の調
シｊ Ｔ稈１５　マウスの乳房腫瘍ウィルス（Ｍ　Ｍ　’ｒＶ
）の大型末端繰り返しを含有しＣいるプラスミドＤＭＭ
−ｒＶｓａｕ３Ａ　　５／ｌを」二稈７に記載したよう
に３μｍ　　１−ＩＩで消化づる。これにより、ｐＢＲ
３２２を含有りる’ｌ　３６２　ｌ叩ノラグメン１〜お
よびＭ　Ｍ　Ｔ　Ｖの大型末端繰り返しからクローンさ
れた３５０１）Ｉ）フラグメンｊ・がｊＭ　ｍｌＪりる
（Ｊ、Ｅ。

Ｍａｊｏｒｓ　６−３よびｌ−１、Ｅ　、　Ｖ　ａｒｍ
ｕｓ　、　Ｎ　ａｔｒｕｅ、ｖｏｌ。

２８９．２５３−２５８　（１９８１））。この３５０
１１＋３　　ＤＮＡフラグメンｌへは、活性化グルー１
］ルチ］イドポル−［ンー受容体コンプレックスに特異
的に結合づる配列を含／υ１：Ｊ３す、隣接づる遺伝子
の転写率を増大さける。

工ｌ上丙−この３５０ｂ＋＋　　ｒ）ＮＡフラグメン）
〜を工程３および４に記載したようにプレバラティブゲ
ル電気泳動法により回収りる。

（（＋　）ｐＭｓＶｌ−ＩＢｓ　４のＧ　ＲＳによるイ
ン上１〜口にＪ３りる絹換え（本発明方法） ■稈′１７　プラスミドＩＢＭ　Ｓ　Ｖ　Ｉ−１１３Ｓ
　Ａ　（５μｇ）を６．７ｍＭ１−リ、／、　（ＩＩ　
７．８　）　、６゜７ｍＭＭＣＩＣｆｆ１２および６．
７ｍＭメルカプ１へエタノール中、制限エンドヌクレア
−１ｊＢｇλ■５３中位を用いで３７°Ｃで１０分間、
部分的に消化する。フラグメンｌ−をプレパラティブア
ガ［１−スグル上で分離する。２個のＢＯｊｌａＩｒ部
位の内の１個の開裂により線状化した完全なプラスミド
Ｉ）ＭＳＶＩ−ＩＢｓ４に相当づる帯を工程３および４
に記載しＩごＪ：うにブレパラティブゲル電気泳動法に
より回収りる。回収した線状プラスミドｌ）ＮＡｐＭＳ
ＶＩＩｆ３ｓ４を、クルー１］ルヂコイド受容部位を禽
む３５０１叩の［３μｍ　　ト１１フラグメン１〜でイ
ンビ１〜［］にあい（−絹換える。自己結紮を防ぐため
に、工程１２に記載したようにｐＭｓＶＨｆ３ｓ／ｌを
牛の腸ノフルカリ小スファターｔｆｆｉ（ＣＩＡＰ）で
消化りる。

ＬＷ上［線状化したプラスミド＋＋ＭＳＶＨＢＳ／Ｉ（
１／ｌｇ）をプラスミドｐＭ　Ｍ　−１−Ｖ　Ｓ　ａｕ
３　Ａから得た３　５０　ｌ１ｌ）のＢａ１ｌＩ　Ｈｉ
ミツラグメン−０。

５μｇど混合し、■稈１２に記載したように結合さける
。この結合しｊ、：Ｄ　Ｎ　ＡをＥ　、ｃｏｌｉ　ｌ−
Ｉ　Ｂ　１０１に導入りる。

」二稈′１９　幾つかの１１１菌コロニーは組換えプラ
スミドを含有していることが解った。このプラスミドを
プレパラディプ法にＪ、り中部１し、制限（酵素）分析
法によりその特性を調べる。２個のプラスミドは、１−
ＩＢＳＡ（＋遺伝子の５′末端の０ｇ乏■部位に仲人さ
れた３　５０　ｂｌｌ　　Ｇ　ＲＳフラグメン１〜の唯
一のコピーを含んＣいることが解った。これらのプラス
ミドのうらの１′つ、りなわら１）Ｍ４Ｇ　ＲＳ　Ｌ　
Ｒは、このＧ　ＲＳフラグメン１〜を１−１１−３　ｓ
ＡＣ＋遺伝子と同じ方向に含イ１しており、もう１つの
プラスミド、ｒ）Ｍ　４　Ｇ　ＲＳ　１．、　ｌ−は、
０１でＳフラグメント・を反対方向に含／υている。１
゛っのプラスミド、　ｐＭ４　Ｇ［＜Ｓ　！−２は、５
’ｒ３すｊＺ　ｊｆ部イ）ｌにＧ　ｌ＜　Ｓフラグメン
トの２つの」ビーを含／υで゛いることが解った。４番
１」のプラスミドは、ｌ−Ｉ　Ｌ３　ｓΔｇ遺伝子の３
′のＢ！Ｊ！１１部位にＧ　ＲＳフラグメントの唯一の
コピーを含んＣいることが解っＩこ。

このプラスミドは１１Ｍ４ＧＲ３Ｒど命名されＩこ。

これらのプラスミドの構造を第４図に承り。

（１１）グルココルデー１イド誘導性の、１１１３ｓΔ
！ｊ生産レルラインの確立（本発明１５法）工程２０　
工程１９に記載した組換えプラスミドを、■稈１４に記
載したようにＮ　Ｉ　１−１　３　Ｔ　３マウス線紹芽
細胞に導入する。またこの引換えプラスミドを、選択マ
ーカーとしての単純泡疹ウィルスからのヂミジンギナー
ゼ遺伝子を用いて、Ｌ　’Ｉ”　Ｋ−マウス線絹芽細胞
にも導入Ｊる（　Ｍ　。

Ｗｉ！Ｊ１ｅｒら、Ｃｅ１ｌ、ｖｏｌ、１６，７７７−
７８５（１９７９））。

ＩＩＩ、Ｎ、＋　ｓ　ｖゲノムに含まれでいる形質転換
領域の除去 （ｉ　）ＭＳＶゲノムから腫瘍遺伝子Ｖ　−Ｉｎ　４１
３　Ｍの除去（本発明方法） Ｌ范幻１　プラスミドｐＭｓＶ、ＮＴ　５μｑを１ｃｏ
Ｒ［およびＢ　ｇ尼Ｂで消化づる。ＭＳＶゲノムの左半
分を含有し、５’　−ＬＴＲを含む３８００１印フラグ
メン１〜を工程３　ｄ３よび４に記載したＪ、うに、プ
レバラ“アイブゲル電気泳動法により回収かつ溶ＩＩ−
旨りる。

Ｌ膨ＬＬ　プラスミドｐＭＳＶ　　　　５］１をＮＴ １１　ｉｎｄ　Ｉｆ　テ消（ｅ　Ｌ／、ＭＳＶｆ７）３
’　−ＬＴＲを含有している１００Ｑｂｐフラグメン］
・を、工程３および４に記載したように、ゲル電気泳動
法ａ３よひ電気溶出により単離する。

二【ム１　り１］−ニングブラスミド　＋＋ＫＫ９２Ｃ
−２を２個の制限酵素、ＩＥｃＯＲＩおよびＢｕ乏■で
消化覆る。

］二」亡二２４　　　ｐＭｓＶ、図工の３８００１月゛
フラグメントを、■稈２３で得た線状化プラスミドに結
合させ、１三、ｃｏｌ　ｉ　ｌ−ｌ　Ｂ　１０１に導入
する。制限部位が非対象であるので全ての絹換えプラス
ミドは五゛「実に同じ方向にＭＳＶ５’−Ｌ　ｌ’ｌ−
＜を含むことになる。

工程２５　このプラスミドをブ１ノバラティＶ法により
単離し、制限エンドヌクレア−１ｉ　ｌ−１ｉ　ｎｄ　
Ｉｌｌにより消化づる。

Ｌ厖り史　１）ＭＳＶ、Ｎ、からの１０００１］１）の
１−１　ｉｎｄ　■フラグメントをこの部位に結合８１
、「。

ｃｏｌｉ　　Ｉ」Ｂ　１０１に導入する。２個のｆｖｌ
　Ｓ　ＶＩ　Ｔ　Ｒを同じ方向に含有しているシラスミ
１〜を同定Ｊ゛るために、絹換えプラスミドを含有し−
Ｃいることが解った細菌コロニーの性質を、ＫｐｎＩを
用い１．ｌ制限エンドヌクレアーげ消化により調べる。

１１１＾１の絹換えプラスミド、ＩＮＫ　Ｋ　２　ｌ−
丁１（をプレバラアイブ法により単則し、制限エンドヌ
クレアー　１分４月ににり詳細にぞの性質を調へた（第
６図参照）。

（１り）改変されたＮ、’＋　ｓ　ｖゲノム（旧＜　Ｋ
　２　Ｌ　−１−１λ）（７）ＩＩＢｓＡ（Ｉ遺伝子に
よるイン上１−口に（１３りる紺換え（本発明方法） Ｕ入７］−稈２６で得たプラスミドｐＫＫ２し］１又を
制限上ントヌクレアーゼＢｏｌｌＩで線状化りる。

Ｌ忙ＬＬ　線状化したこのプラスミドＩ）ＫＫ２１−１
’　Ｒヲ、ｔｌ　１３　ｓ　Ａ　Ｏ：Ｎ転子を含むＨＢ
Ｖ（７）Ｂｇｇ　ＩＩフラグメン１へ（工程１１に記載
したようにしく単離）と結合ａ　ｌ！　、　Ｅ　、ｃｏ
ｌｉ　Ｉ−（Ｂ　１０１　（、：：導入３ｊる。紺換え
プラスミドを含有している細菌コローーを中目１し、工
程６に従って制限エンドヌクレ）ｌ　　Ｉｉ消化により
特徴付け、１−ＩＢｓＡｏｉＵ伝子のブｊ向転子める。

１１囚のプラスミド、ｐ２　Ｌ　Ｔ’　ＲＨ［３ｓ８２
は、２飼のし−ｒ　Ｒど同じ方向にｌ−ｌ　１３　ｓ△
（１３Ｎ仏子を含有していることが解った。もう１つの
プラスミド、ｐ　２　Ｌ　−Ｉ−Ｒｌ−１１，３ｓ　８
０は、ＨＢＳＡ（ｉｌｌ壬子反対方向に含有し−Ｃいる
ことが解った。これらの２個のプラスミドを第６図に示
す。

（ｆｉ　）　Ｊ二記（ｋ　）で得られ／ｊ新規組換えプ
ラスミドを保持している、トＩＢｓＡ！Ｊ’Ｌ産しルラ
インの確立（本発明方法） 工」ｙ」シ９−　工程２８に記載した絹換えプラスミド
を、選択マーカーとし−（の細菌性眉転子キリンチンー
グ゛Ｉニンボスホリボシル１゛・ランス−）Ｊシーぜ（
ｇｐｔ）どとらに、微■江用によりＮ　Ｉ　１−１３Ｔ
３マウス線紐芽細胞おＪ、びＶｅｒｏ細胞に導入’Ｊル
（Ｒ、Ｃ，ＭＬｌｌｌｉ（ｆａｎ　Ｊ＞よびＰ　、　Ｆ
３　ｅｒｇ。

Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａ１１．△ｃａ＋Ｊ、３ｃｉ、　Ｕ、　
Ｓ、Δ、　■Ｏ１，７Ｂ　。

２０７２−２０７６（１９８１））。

【図面の簡単な説明】

第１図はトＩＢｓ　Ａ（＋を生産Ｊるレルラインを作成
Ｊるための工程を示リフ［１−シー１〜、第２図は絹］
免えｌ）　Ｎへ分子の制限地図、第３図はＧ　ＲＳ挿入
の１稈を示リフローシー１〜、第４図はグルココルブ二
１イド受容部位を含Ｎする引換えＩ）　Ｎへ分子の模式
図、第５図はＭＳＶゲノムからＶ　−ｎｌ　ＯＳ　”の
除去を行うための工程を示でフローシー１〜、第６図は
ＭＳＶの形質転換領域が除去された絹換えＩ）　Ｎへ分
子の模式図、第７図は１−ｌＢｓＡｇの生産ｊ！１８度
を１、リグラノ、第８図は免疫沈澱したトＩＢｓＡ（Ｉ
ボリベブブドの電気泳動分析の結果を示づ一グラフ、第
９図【、１目１３ｓ　ＡＯ粒子のＣ３ＣＬ勾配沈降を示
リグラフ、第１０図は２２　＋ｏｎ球状＋１ＢＳ△ｕ　
ｉ：ｒ子の電子顕微鏡写真である。 １’ｌ　ｉ’ｌ　ｆｌｆ　ｌ（’Ｉｆ人　マックス・ブ
ランク・グげルシＩ７〕Ｉ〜・ツア・ フ［ルデルング・テ゛了。 つ・ｒツレシシャファン舎ニー・ ファ１り 代　理　人　弁理士　前出　　葆　　ばか会名ＦＩＧ、
ＩＡ ＤＮＡ紬ゑ Ｂａｍ　　ＨＩ　ｔ’＃’１．仏（１−Ｅｒｏ　ＲＩＩ
ＤＮＡ消（Ｌ　　　　　　　（１ｔ＋−ｔｌ、／　りｏ
ｏ、ｔ−＋ＬｂｌＦＩＧ、ＩＢ リヂーシノン（ＨＣｓＡｇ　　ｔ　　ＭＳＶＩメ”＜ｈ
　ＤＮＡ　／１７ａ−７ （工旦旦） ＃ｂ枦ＤＮＡ／）Ｌう／入 フエクトＩｃｊ石仏ルラインの＆ｔ１ ｔｉｔｔ皿） −４１ＶｓＡｕ３Ａ　　　　　　　　ｐＭｓＶＨＢｓ４
り石３１ｙリ　　　　　　　　　　　　　　　（工ｔｔ
（７１＃１ｉ什ｐｃＤＮＡのりσ−ン （工性２０） ＦＩＧ、５Ａ ＯＮ△フラクメシトのに鳥を 井＠ぐデラ１、ミド　ｐＫＫ２ＬＴＲの７０−ノＦＩＧ
、ＳＢ ＨＦ３ｓＡｇ含肩フｊフメン１−゛ム゛と結合ＤＩＪＡ
の１ランス７１フト １：、ｌ−ろ４にルラインの確立 （１脛２９） Ｊ＋　　　　　　　　　　　　　１２　　　　　　　　
　　ＰＬＣ／ＰＲＦ１５’？ｅｌ　　　　　８ 日 ＹＩ　　　　　　　　　ＰＬＣ／ＰＲＦ１５ＦＩＧ、　
７ Ａ、　　Ｂ　　ＣＤ［Ｆ −１− 纏 一一一＠ ＦＩＧ、８： ＦＩＧ、９： Ｆ旧、１０： 第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／９１　） （７■発　明　者　ラニー・シュトラトヴアドイッ連邦
共和国８０００ミュンヘ ン８１エレクトラシュトラーセ５ 番 （ア多発　明　者　ヨツト・デーマー ドイツ連邦共和国８０３３マルチイ ンスリード・アム・クロプファ ーシュビッツ・マックス・ブラ ンク・インステイテユート・フ ユア・ビオケミ−（番地の表示 なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．８）形質転換領域およびゲノムの複製起源を含有し
   −Ｃいる牛の乳頭肺ウィルスのＤＮＡフラグメン１〜、
   および １〕）Ｂ型ＩＩＦ炎細胞表面抗原の構造遺伝子、真核性
   ブ［ｌモータ、リーダー配列およびポリアデニル化イへ
   号を含有しているＢ型肝炎ウィルスの１′）ＮＡフラグ
   メン１へ、を含有してなる絹換えＤＮＡ分子。 ２．８）大型末端繰り返しおよび形質転換遺伝子、Ｖ　
   −Ｉｌｌ　ＯＳ　”　を含む完全なウィルスゲノムを含
   有しているＵ　Ｉに一マウス肉腫ウィルスの引込Ｊ、れ
   たブＩ」ウィルス１ＯＮ△、および １．１）　＋３型１１１炎柵胞表面抗原の構造ｊ貞嵌子
   、真核＋’ｌブ（コシータ、リーダー配列およびポリア
   デニル七（、ｉ号を劇イｊしｔいるＢ型ＩＩＩ炎ウィル
   スのＤＮＡノシグメン１へ、を含有してなる組換えＤＮ
   Ａ分子。 ３、プロモータ、リーダー配列およびポリアデニル化信
   号がＢ型肝炎ウィルス由来のものである第１項または第
   ２項に記載の紺換えｌ）　Ｎ　Ａ分子。 ４、Ｂ型肝炎細胞表面抗原の構造遺伝子の転写率を増強
   さける配列をさらに含有してなる第１項〜第３項のいず
   れかに記載の紺換え１つＮＡＡ分子５、グルココルチコ
   イド受容部位を含有しているマウスの乳用腫瘍ウィルス
   からの大型末端繰り返しのフラグメンｉ〜をさらに含有
   してなる第１項〜第４項のいずれかに記載の絹換え１つ
   ＮＡＡ分子６、プロウィルスＤＮＡ　　ａ）が、マウス
   のヒルラインＧ３−１２４のゲノムから得られ／（Ｈ’
   Ｅ　Ｆ］ユニーウス肉腫ウィルスの引込まれたプロウィ
   ルスＤＮＡである第２項へ・第５　Ｊｊ：ｊのいザ′れ
   かに記載の組換えＤ　Ｎ　Ａ分子。 ７、成分ａ）が形質転換領域を含んＣいない第１項〜第
   ６項のいずれかに記載の相換えｌ）　Ｎ△分子。 ８、微生物宿主中で複製しｊＳ？るクーロニングビヒク
   ルをさらに含有してなる第１１ｆ４−第７１）′１のい
   ザれかに記載の絹換えＤＮＡ分子。 ９、第８項に記載の組換え（つＮへ分子を少なくとも１
   個含有りる微生物宿主。 １０、育（１１動物細胞を増殖させるのに適した栄養ｊ
   ８地中で・Ｂ型泪炎ウィルスの抗体産生を刺激Ｊる少な
   くとも１個のＢ型肝炎細胞表面抗原を生産し得る第１項
   〜第８Ｊｒｌのいずれかに記載の組換え１）　Ｎ△分子
   を少なくとも１個含有づる育４１Ｆ動物細胞。 １１、第１０項に記載のを椎動物細胞を使用し、該を椎
   動物細胞を増殖させるのに適した栄養ｊ８地中Ｃ゛、１
   ３型１１’ｌ炎ウイルスの抗体産生を刺激づる少なくと
   も′１個のＢ型肝炎細胞表面抗原を生産づる７Ｊ法。 １２、第１０７ｆｆｌに記載のを椎動物細胞により生産
   される、Ｂ型肝炎の細胞表面抗原性を示しＢ型肝炎ウィ
   ルスに対りる抗体の産生を刺激する抗原。 １３、Ｎ１１１　３Ｔ３マウス線紺芽細胞を増殖さｌる
   のに適した栄養培地中でＢ型肝炎ウィルスに対づる抗体
   産生を刺激する少なくとも１個のＢ型肝炎細胞表面抗原
   を生産し１ｑる第１１Ｊ′−１〜第８１Ｆｊのいずれか
   に記載の少なくとも１ｎ６１の絹換えｌ）　ＮＡ分子を
   含有覆るＮ　ｌ　＋−＋　　３　Ｔ　３マウス線糾オ細
   胞。 １４、第１３項に記載のＮ　Ｉ　１−＋　　３　Ｔ　３
   ンウス線紺芽細胞を用いて、該線維財細胞を増殖さける
   のに適した栄蘇培地中″ｃ′Ｂ型肝炎ウィルスに幻りる
   抗体の産生を刺激する少なくとも１個のＢ型肝炎細胞表
   面抗原を生産り−る方法。 １Ｖ５．第１３１ｉ　ｋ　記載ノＮ　Ｉ　＋−１３Ｔ　
   ３　？　ウス線組芽細胞によって生産される、１−３型
   肝炎の細胞表面抗原性を示しかつＢ型肝炎ウィルスにス
   ＝Ｊ　Ｊる抗体の産生を刺激りる抗原。 １Ｇ、アフリカ産ミドリ猿の腎細胞を増りｉさけるのに
   適した栄養培地中でＢ型肝炎ウィルスに対する抗体産生
   を刺激づる少なくとも１個のＢ型肝炎細胞表面抗原を生
   産し得る第１項〜第８項のいずれかに記載の少なくとも
   １個の紺換えＤＮＡ分子を含有−４るアフリカ産ミドリ
   猿の腎柵１１１１！（ｖｅｒｏセルライン）。 １７、第１６項に記載のアフリカ産ミドリ猿の腎細胞を
   使用して、該細胞を増殖さけるのに適した栄養培地中で
   Ｂ型肝炎ウィルスに対づる抗体産生を刺激りる少なくと
   も１個のＢ型Ｉｌｌ炎細胞表面ｂｃ　Ｉｉｉを生産りる
   方法。 １Ｆ３．第１６Ｊ１″１に記載のアフリカ産ミドリ猿の
   腎細胞により生産される、Ｂ型肝炎細胞表面抗原性をン
   へしかつ（Ｂ型肝炎ウィルスに対リ−る抗体産生を刺激
   りる抗原。 １９．１１−に−マウス線組芽細胞を増殖さけるのに適
   した栄養培地中でＢ型肝炎ウィルスに対りる抗体産生を
   刺激り−る少なくとも１個の１３型肝炎の細胞表面抗原
   を生産し得る第１項〜第８項のいり゛れかに記載の少な
   くとも１個の組換えＤＮＡ分子を自有りるＬ　Ｔ　Ｋ−
   マウス線紐舅細胞。 ２０、第′１９項に記載のＬ　−ｒ　Ｋ−マウス線維芽
   細胞を用い゛Ｃ１該線紐芽細胞を増殖させるのに適した
   栄養培地中で１３型ｎ−＋炎つィルスに対する抗体産生
   を刺激Ｊる少なくとも１個のＢ型肝炎細胞表面抗ＩＩ：
   １を生産する方法。 ２１゜第１９項に記載の線維Ｕ細胞により生産される、
   Ｂ型肝炎細胞表［ｉ抗原性を示しかつ［Ｂ型肝炎ウィル
   スに対りる抗体の産生を刺激−４る抗原。 ２２、第１０．１３．１６および１９項のいずれかに記
   載の脊椎動物細胞により生産されるかつＢ型肝炎細胞表
   面抗原性を承り少４Ｃ＜とｂ１個の抗原ａ３よび薬学的
   に許容し社する担体または希釈剤をＳｎする、ヒトにお
   りる］３型訂炎ウイルス感染に対づる抗体の産生を刺激
   Ｊるための医薬組成物。 ２３、第１０．１３，１６Ｊ３よび１９項のいづ゛れか
   に記載のを椎動物細胞にＪ、リリし産される「）型ｎ１
   炎ウィルス細胞表面抗原性を承り少４Ｃくとも１個の抗
   原を含有りる、Ｂ型肝炎ウィルスに対りる抗体検出用の
   診断用組成物。