JPH0671429B2 - 変異化ワクチニアウイルス並びにその製造及び使用方法 - Google Patents

変異化ワクチニアウイルス並びにその製造及び使用方法

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JPH0671429B2 JP57234860A JP23486082A JPH0671429B2 JP H0671429 B2 JPH0671429 B2 JP H0671429B2 JP 57234860 A JP57234860 A JP 57234860A JP 23486082 A JP23486082 A JP 23486082A JP H0671429 B2 JPH0671429 B2 JP H0671429B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は変異化ワクチニアウイルス、その製造及び使用
方法、並びに変異化ワクチニアウイルスの製造において
中間体として製造され又は含まれる変異化又は未変異化
微生物及び一定のDNAシークエンスに関する。特に、本
発明は、天然に生じるウイルスのゲノムを変えたワクチ
ニアウイルス（「ワクチニア変異株」）及びかかるワク
チニア変異株の製造及び使用方法、並びにワクチニア変
異株の製造の中間体として製造され又は含まれる他の未
変異化及び遺伝的に変異化した微生物及び一定のDNAシ
ークエンスに関する。
ワクチニアウイルスはポツクスウイルス科の原形ウイル
スであり、ポツクスウイルス群の他の構成員と同様に、
その大きな寸法及び複雑さで区別される。ワクチニアウ
イルスのDNAは同様に大きくまた複雑である。ワクチニ
アDNAは、例えばシミアン（simian）ウイルス40（SV4
0）がほんの3.6メガダルトン（megadalton）のDNAの大
きさであるのに比較して、約120メガダルトンの大きさ
である。ワクチニアのDNA分子は二重ストランドであり
また、単一ストランドの環がDNAの変性により形成する
ように端末で架橋している。ワクチニアDNAは多くの異
なる制限酵素を使用して物理的に地図が描かれており、
多くのかかる地図がパニカリー（Panicali）らのJ.Viro
l 37,1000〜1010（1981）に示されている。この文献は
ワクチニアウイルスのWR株（ATCC No.VR119）の二つの
大きなDNA変異株の存在を報告しており、この株はポツ
クスウイルスの研究や特性表示のために最も広く使用さ
れてきた。この二つの変異株はＳ（「小さい」）変化株
（ATCC No.VR2034）がＬ（「大きい」）変異株（ATCC
No.VR2035）のDNAにおいては生じない6.3メガダルト
ンの欠失を有する点で異なる。制限酵素Hind III、Ava
I、Xho1、Sst I及びSma Iによる変異株の処理により得
られた地図は上述の文献に示されている。
ワクチニア、即ち真核ウイルスは宿主細胞の細胞質内で
完全に再生産される。それは溶菌ウイルス、即ち、細胞
中のウイルスの複製が細胞の溶解を伴うウイルスであ
る。このウイルスは非腫瘍形成性と考えられる。このウ
イルスは天然痘に対する接種用ワクチンに約200年使用
されてきており、医療関係者はワクチンに使用されると
きのウイルスの性質をよく知つている。ワクチニアの接
種は危険がないわけではないが、危険は概して周知であ
り、明確化されており、比較的良性と考えられている。
本発明の本質は、天然のゲノムを再配列し、そのゲノム
からDNAを除去し、及び／又は天然のワクチニアゲノム
へ、天然のゲノムを分裂するDNA（「外来DNA」）を導入
することにより、天然のワクチニアゲノムを変性してワ
クチニア変異株を生成することである。かかる外来DNA
はワクチニア中の自然のものでも、合成のものでもよ
く、またワクチニア以外の生物に自然に生じるものでも
よい。もしこの外来DNAに遺伝情報が存在するなら、こ
の情報を変異化ワクチニアウイルス経由で真核生物中に
導入することができる。即ち、変異化ウイルスは、そこ
から遺伝情報を欠失させたか又はその中に情報を挿入し
たり又はその内で遺伝情報を再配列した比較的無害なク
ローンベクター（cloning vector）を代表する。ウイ
ルスは感染細胞の細胞質内で複製するので、変異化ワク
チニアウイルスは今まで考えられ又は現在研究中の他の
いかなるものとも異なり、無類の真核クローンベクター
を表わす。
本発見は（Ａ）ワクチニアに感染しやすい哺乳動物に免
疫を施してワクチニアウイルス中に挿入された外来DNA
遺伝暗号を指定された抗原に応答してその動物内で抗体
を生じさせる新規な方法、（Ｂ）真核細胞による、抗原
以外の生物的生成物の新規な製造方法、及び（Ｃ）人間
又は動物の個体又は個体群に欠失遺伝子の導入又は、そ
の個体又は個体群中の欠陥遺伝子を変性し、置換し又は
修理するための遺伝物質を導入する新規な方法において
多くの意義を有する。
宿主による抗原に対する抗体の製造を生じさせる抗原決
定子として宿主内で表現される外来遺伝子を有する、好
適に変異化したワクチニア変異株は、殺された又は弱毒
化された生きた生物を使用する従来のワクチンの欠点を
有さない新規なワクチンを代表する。従つて、例えば殺
された生物からワクチンを製造するには、多量の生物を
成長させ、次にその抗原性に影響を与えることなく、伝
染性を選択的に破壊する処理が必要である。一方、弱毒
化された生きた生物を含むワクチンは常に、弱毒化生物
を病原性の状態にもどす可能性がある。対照的に、病原
性生物の抗原決定子を指定する遺伝子で好適に変異化し
た変異化ワクチニア変異株がワクチンとして使用される
ときは、ワクチニアウイルスが病原性生物の抗原決定子
を指定する遺伝子のみを含み、病原体の複製をつかさど
る生物の遺伝部分を含まないので、病原性生物への復帰
の可能性を避けることができる。
本発明は外来抗原タンパク質を表現するプラスミドを含
む組換え原核生物により抗原を産生することを含む遺伝
子工学を使用する新しい技術に関してさえ利益を付与す
る。例えば、かかる技術には、多量の組換え原核細胞の
産生及びそれによつて生じた抗原タンパク質の精製を必
要とする。これと対照的に、本発明による接種に使用す
る変異化ワクチニアウイルスは免疫性を付与すべき接種
個体内で複製して、生体内で抗原決定子を増幅する。
ワクチンとして、又は抗原以外の生物学的生成物を産生
するために、真核細胞中にベクターとしてのワクチニア
変異株を使用する他の利点は、ウイルスによつて細胞中
に導入された外来遺伝子の転写によつて生成したタンパ
ク質を後翻訳変異する可能性である。かかる後翻訳変
異、例えばタンパク質のグリコシル化は原核系では適当
でなく、かかる変異に必要な付加的酵素が使用できる真
核細胞で可能となる。接種用ワクチニア変異株を使用す
る他の利点は、変異株中に抗原用の遺伝子又は免疫応答
を刺激する付加的な遺伝素子の縦に並んだ繰り返しを導
入することにより、又は変異化ウイルス中の強いプロモ
ーターを使用することにより抗体応答を増幅できること
である。類似の利点は抗原以外の生物学的生成物の産生
にある。
ワクチニアゲノムのより詳細な考察にもどると、DNAの
架橋二重ストランドはそれぞれの長さが約8.6メガダル
トンの転化末端繰り返しに特徴があり、これは約10キロ
塩基対〔kilobasepair（kbp）〕を表わす。全てのポツ
クスウイルスDNAの中心部は類似し、ウイルスの末端部
はより大きく相違しているので、複製のような全てのウ
イルスに共通の機能を中心部がつかさどることを示唆
し、末端部は病原性、宿主の範囲などの他の特徴をつか
さどるように見える。もしかかるゲノムが安定かつ生存
可能な変種を産生しつつ、再配列又はそのゲノムからの
DNA断片の除去により、又はそのゲノムに外来DNA断片を
導入することにより変異化できるなら、再配列、除去又
は天然に生じるDNAに外来DNAを導入することにより分裂
されるその天然のDNA部分は宿主、この場合ワクチニア
ウイルス、の生存可能性及び安定性にとつて非本質的で
なければならない。かかるゲノムの非本質的部分はワク
チニアウイルスのWR株、例えばＬ−変異株中にあるがＳ
−変異株から欠失している場所、即ちゲノムのHind III
F−フラグメント内に存在することが分つた。
ワクチニアウイルスを外来遺伝情報の導入により変異化
することは、ワクチニアウイルスのWR株をそのHind III
−フラグメント中で変性して、そのフラグメントにチ
ミジンキナーゼ（TK）の産生をつかさどる単純性疱疹ウ
イルスタイプＩ（HSV）の遺伝子を導入することにより
説明できる。TKはヌクレオシドチミジンをホスホリル化
して、順次DNAに導入される対応モノ−ホスホリル化ヌ
クレオチドを形成する酵素である。
HSV TK遺伝子は、多くの理由で本発明によりワクチニ
アに導入するのに都合のよい、ワクチニアウイルスにと
つて外来のDNAを代表する。まず第１に、この遺伝子は
比較的直ちに使用できまた、コルベール（colbere）−
ガラピン（Garapin）らにより報告されているように〔P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 76,3755〜3757（1979）〕Bam
HIエンドヌクレアーゼによる消化により産生する単純
疱疹ウイルスDNA断片中に存在する。第２に、このHSV
Bam HIフラグメントは、例えばコルベール−ガラピン
ら（前掲文献）及びウイグラー（Wigler）ら〔Cell11,2
23〜232（1977）〕により報告されているように、従来
プラスミドや真核系に導入されてきた。第３に、経験よ
り、もしHSV TKを外来遺伝子として、真核系に導入で
き、また表現できるなら（これは遺伝部位の不明瞭でな
い忠実な翻訳と転写が必要）、他の外来遺伝子が同様に
導入できかつ表現できることが分つているからである。
添付図面を参照することにより本発明はよりよく理解さ
れるであろう。
第１図を参照すると、ワクチニアウイルスのＬ−変異株
及びＳ−変異株を従来公知で市販されている制限酵素Hi
nd IIIに作用させると、ワクチニアゲノムはそれぞれ文
字Ａ〜Ｏで指定される15又は14のセグメントに開裂す
る。ここで、Ａは最大のフラグメントを、Ｏは最小のフ
ラグメントを示すのに使用される。制限フラグメントの
電気泳動分離はパニカーリ（Panicali）らの上記刊行物
〔J.Virol.37,1000〜1010（1981）〕に記載され、示さ
れている。Ｌ−又はＳ−変異株のいずれより、このよう
にして得られたＦ−フラグメントは分子量8.6メガダル
トンを有する。Ｆ−フラグメントの位置は本出願に添付
の第１図に与えられている制限地図に示されており、Ｆ
−フラグメントの制限地図は第２図に示されている。制
限酵素Hind IIIはヌクレオチドシークエンス−AAGCTT−
を識別し、隣接アデノシン基間を開裂してシークエンス
AGCT−のある「粘着端」を有するフラグメントを与え
る。ワクチニアゲノムの制限によつて直ちに得られる以
上に多量の、ワクチニアのHind III F−フラグメントが
本発明の操作に必要なので、前記フラグメントは増幅の
目的でプラスミドクローンベクター中に挿入される。
即ち、このようにして得られたワクチニアHind III F−
フラグメントは、Hind IIIを含む多くの制限酵素によつ
て１度だけ切断されるプラスミドpBR322中に都合よく導
入される。このpBR322プラスミドはボリバー（Boliva
r）らにより初めて記載され〔Gene２,95〜113（197
7）〕そして多くの出所から米国内で現在市販されてい
る。
pBR322上のHind III開裂部位の位置は、他の制限酵素で
あるEco RI及びBam HIの開裂部位に関連して第3A図に
示した。もし、pBR322がHind IIIで切断され、得られた
開裂DNAがワクチニアHind III F−フラグメントと混合
され、フラグメントが第3A図に示唆されるようにT4DNA
リガーゼで結合されるならば、Ｆ−フラグメントはプラ
スミドに導入されて、第3B図に略図的に示される、分子
量約11.3メガダルトンの新規なプラスミドpDP3を与え
る。ワクチニアHind III F−フラグメントは、pDP3のpB
R322部分に見られる4.5キロ塩基対に対して、約13キロ
塩基対を含む。T4DNAリガーゼは市販の酵素で、このよ
うな使用条件は周知である。
pDP3プラスミドは現在、Ｆ−フラグメントを多量に得る
目的でHind III F−フラグメントを複製するための形質
転換により、大脹菌（E.coli）のような微生物に導入さ
れる。プラスミドを開裂して結合し得る末端を有する直
線状DNAを生成し、次にレプリコン（この場合、ワクチ
ニアHind III F−フラグメントを含むpBR322）を生成す
るために相補的末端を有する外来DNAを挿入する技術
は、形質転換によりレプリコンを微生物に挿入するよう
に（米国特許第4,237,224号と比較せよ）、公知であ
る。
未変性pBR322プラスミドはその宿主微生物、この場合大
腸菌に対するアンピシリン（ampicillin）耐性（AmpR）
及びテトラサイクリン耐性（TetR）を与える。しかし、
Hind IIIはpBR322プラスミドをTetR遺伝子中で切断する
ので、ワクチニアHind III F−フラグメントを導入する
とTetR遺伝子が破壊され、テトラサイクリン耐性が失な
われる。従つて、pDP3プラスミドを含む大腸菌形質転換
体は、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性を
併有する点で未形質転換大腸菌と区別できる。多量に成
長されたのはpDP3で形質転換した大腸菌であり、この大
腸菌から多量のpDP3を回収する。
大腸菌中でプラスミドを増幅できる条件は例えばクレウ
エル（Clewel）の報文〔J.Bacteriol110,667−676（197
2）〕より周知である。大腸菌宿主より増幅プラスミド
を単離する技術も周知であり、例えばクレウエルらのPr
oc.Natl.Acad.Sci.USA62,1159〜1166（1969）に記載さ
れている。
同様に、pBR322プラスミドは制限酵素Bam HIによる処
理で都合よく開裂でき、変異化プラスミドは、コルベー
レ−ガラピンらの上掲の研究（上記引用文中）で全て議
論されているように、Bam HSV TKフラグメントをその
プラスミド中に挿入することにより変異化できる。HSV
TK遺伝子を含むBam HIフラグメントを含有する変異
化プラスミドは再び公知の方法及び多量のプラスミドを
増幅すべく成長させた形質転換細菌により大腸菌中に導
入できる。増幅したBam HSV TK−pBR322組換プラスミ
ドは次にワクチニアのHind III F−フラグメントの増幅
に関してすでに述べた公知技術により、Bam HIで開裂
し、HSV TK遺伝子を含むBam HIフラグメントを単離す
る。
ワクチニアHind III F−フラグメント内に含まれるBam
HI HSV TKフラグメントを有する組換プラスミドを
構成するために、pDP3プラスミドを次にBam HIで部分
的制限に付し、プラスミド内の２つのBam HI開裂サイ
トの一つだけが開裂するようにする。即ち、Hind III F
−フラグメント内のBam HIサイト又はpDP3プラスミド
のpBR322部分内のBam HIサイトのいずれかである（第3
B図）。開裂した直線状のDNAは次に精製Bam HSV TKフ
ラグメントと組合せる。この直線状セグメントは、再び
公知の技術を使用して、組合せそしてT4DNAリガーゼに
よる処理で結合する。
Bam HSV TKフラグメントと開裂pDP3プラスミドとの結
合は、混合物中のフラグメントの種々の組合せにより形
成される多くの種を形成する可能性を与えるランダム又
は統計的な事象であり、これらの全ては同一の「粘着性
末端」を有する。従つて、一つの可能性は、pDP3プラス
ミドのBam HI開裂末端の簡単な再結合で環状プラスミ
ドを再形成することである。今一つの可能性は、二つの
配向のいずれかで二以上のBam HSV TKフラグメントを
結合することである。更に、Bam HSV TKフラグメント
（又はその多数）はpBR322部分内のBam HIサイトで開
裂されたpDP3プラスミドの直鎖DNAと再び二つの配向の
いずれかで組合され、又は一又は二以上のBam HSV TK
フラグメントは再び二つの配向のいずれかでpDP3プラス
ミドのワクチニアHind III F−フラグメント部分内のBa
m HIサイトで開裂された直鎖pDP3DNAと組合し得る。
これらの種々の可能性を特定しまた分離できるように、
結合生成物を、すでに記述した公知の技術により大腸菌
のような単細胞微生物中に挿入する。このように処理し
た大腸菌を次にアンピシリンを含む培地で成長させる。
いずれのプラスミドを含むこれらの細菌も、これらのプ
ラスミドの全てがアンピシリン耐性を与えるpBR322の遺
伝子を含むので、アンピシリン耐性である。従つて、全
ての生残つた細菌は、組換型であり、これは次に、存在
するかもしれないBam HSV TKフラグメントの存在性ま
たは不存在性を更に決定するためにふるい分けする。
これを達成するために、TK遺伝子を含む細菌を放射性ラ
ベルしたTK DNAでの雑種形成により同定する。もし、
このTK遺伝子が細菌中に存在するなら、放射性ラベルし
たTK DNAは細菌中に存在するプラスミドのその部分と
雑種化する。雑種が放射性なので、そのプラスミド内に
TKを含むコロニーは、オートラジオグラフイーで決定で
きる。TKを含む細菌も又成長し得る。最後に、pBR322部
分内に組み込れたTKを有するプラスミドを含む細菌を、
制限エンドヌクレアーゼでの分析によりワクチニアHind
III F−フラグメント内でTKフラグメントを有するもの
から同定し、分離する。
更に詳しく述べれば、アンピシリンを含む栄養寒天板上
で生存し成長する細菌を一部フイルターと平板との接触
によりニトロセルロースフイルターに移す。平板上に残
る細菌は再成長し、原板のレプリカを作るためにニトロ
セルロースフィルターに移した細菌を次にそのDNAを変
異化するために処理する。変異化は例えば移した細菌を
水酸化ナトリウムで処理し、次に中和、洗浄することに
より行なう。次に、ニトロセルロースフイルター上の変
異化DNAを、放射性32Pを含むHSV Bam TKで処理するこ
とにより雑種化する。このように処理したニトロセルロ
ースフイルターを、放射性ラベルしたBam HSV TKによ
る雑種化が生じる部分を暗化するＸ線フイルムに暴露し
た。この暴露し暗化したＸ線フイルムを原板と比較し、
Ｘ線フイルムを暗化させるコロニーに対応する原板上で
成長するコロニーを、Bam HSV TKが存在するプラスミ
ドを含むものとして同定する。
最後に、プラスミド内にBam HSV TK遺伝子がpBR322部
分内に取り込まれているプラスミドを含む細菌と、Bam
HSV TKがプラスミドのＦ−フラグメントに存在する
ものと区別するために、細菌の小さな培養菌を成育し、
プラスミドをホルムズ（Holmes）らの研究〔Anal.Bioc
h.114,193〜197（1981）〕に記載されている公知のミニ
溶菌技術によりその培養基から単離する。このプラスミ
ドは次に環状プラスミドを、pBR322DNA鎖を有するＦ−
フラグメントの原結合の２点で開裂する制限酵素Hind I
IIで消化する。消化生成物の分子量をアガロースゲル上
で電気泳動により決定する。ゲル中の移動距離を分子量
の目もりとする。
もし、Bam HSV TKフラグメント又は多数のフラグメン
トが消化プラスミドのＦ−フラグメント中で見られるな
らば、ゲルはpBR322フラグメントの存在及びBam HSV
TK DNAゼグメント又はそこに含まれるセグメントによ
るＦ−フラグメントの分子量よりも大きな分子量を有す
る別のフラグメントの存在を示す。逆に、もしBam HSV
TKがpBR322中に存在するならば、電気泳動は、Bam H
SV TKフラグメントの分子量により通常の分子量のＦ−
フラグメントとpBR322よりも大きな別のフラグメントの
存在を示す。Bam HSV TKによる変異化がプラスミドの
pBR322部分で生じる細菌はすてる。残りの細菌はそのプ
ラスミドのＦ−フラグメント部分で変異させる。それ
が、Bam HSV TKフラグメントをワクチニアにとり込む
ために使用するプラスミドである。
既述のごとく、DNAフラグメントを組合せてプラスミド
を再生することはランダムな事象であり、このためＦ−
フラグメント中にBam HSV TKを有する多くの異なつた
プラスミド構造が生じる。
Ｆ−フラグメント内のBam HSV TKフラグメントの配向
及び存在するかもしれないかかるBam HSV TKフラグメ
ントの数を決定するために、プラスミドを、そのプラス
ミドのＦ−フラグメント中にBam HSV TKフラグメント
を有することが分つている細菌コロニーの各々より回収
する。前述のミニ溶菌技術をこの目的で使用する。プラ
スミドを次に再び制限分析に付し、このとき市販の制限
酵素Sst Iを使用した。各Bam HSV TKフラグメントは
その中にSst I制限サイトを有し、また、ワクチニアの
Ｆ−フラグメントが同様に単一のSst制限サイトを有す
る（これらのフラグメントの代表例を第3A図及び第3B図
に各々示す）ので、異なる分子量の異なる数のフラグメ
ントがアガロースゲルにおける電気泳動により追跡で
き、セグメントの数及び分子量はＦ−フラグメント内の
Bam HSV TKフラグメントの配向及び存在するかかるBa
m TKフラグメントの数に依存している。Ｆ−フラグメ
ント内のBam TKフラグメントの配向は、Sst Iサイトに
関しBam HSV TKフラグメントが非対称なので、検出可
能である（第3B図）。
例えば、議論している特定の実験において、各々がプラ
スミドのフラグメントに存在する１以上のBam HSV TK
フラグメントを有する六つの細菌コロニーが、大腸菌組
換型において発見された。上記の議論に従つて、これら
の細菌中のプラスミドの制限分析の後、二つの組換プラ
スミドを選択して、更に研究を行なつた。これは、Ｆ−
％フラグメント内のBam HSV TKフラグメントの配向の
方向が反対であるからであつた。
ここで、読者は上記で詳細に議論したようなワクチニア
のＦ−フラグメント中にHSV TK遺伝子を導入すること
が、単にワクチニア ゲノムを変性し、望ましいワクチ
ニア変異株を作る為の多くの可能な方法の一つの例にす
ぎないことを銘記すべきである。従つて、同じ外来遺伝
子をワクチニアゲノムのいま一つの部分に導入するこ
と、又は異なる遺伝物質を、ワクチニアＦ−フラグメン
ト中に、又は、ある他のフラグメント中に導入すること
は全て組換生物を特定する為に、上で議論した例示的テ
ーマの変形を要求するかもしれない。
例えば、ワクチニアＬ−変異株をAva Iで分解すると、
フラグメントＨがＳ−変異株から欠失した部分と共に生
じる（第6A図及びこれに関し以下で議論する部分を参照
されたい）。このＨ−フラグメントは、その中にHSV T
K遺伝子を導入できるようにするBam HIサイトを含む。
Ｆ−フラグメント−HSV TK組換型を特定する為の同じ
方法を、このようなＨ−フラグメント組換型の同定にも
使うことができる。
上で開示したものとは別のＦ−フラグメント−TSV TK
組換型の構造及び特定の為の方法が存在する。例えばpB
R322中のBam HIサイトは、プラスミドをBam HIで開裂
すること及びDNAポリメラーゼＩにより処理によつて除
去し、「粘着性末端」に「充填する」ことができる。こ
の生成物を次にHind IIIで切断し、直線状フラグメント
をアルカリ性フオスフアターゼで処理して、プラスミド
を再び結合により環状にすることを防止する。しかし、
外来DNA、及び特にワクチニアHind III F−フラグメン
トは、処理pBR322に結合することができ、得られたプラ
スミドは再び環状となる。Bam HIによる処理で、プラ
スミドをそのワクチニアＦ−フラグメント部分内におい
てのみ開裂することができる。次に、アルカリ性フオス
フアターゼで開裂生成物を処理し、そしてBam HI HSV
TKフラグメントと結合することにより、組換型をその
組換型が制限エンドヌクレアーゼ開裂及びゲル電気泳動
によりロ別できるような高い割合で生成した。この技術
により、pBR322部分又はＦ−フラグメント中にHSV TK
を有する組換型とを区別し、コロニーを雑種形成する厄
介な工程を省くことができる。
HSV TKをワクチニアＦ−フラグメントを導入すること
により、ワクチニアの例示の突然変異において生成した
プラスミドの議論については、更に研究の為に選んだ二
つの組換型プラスミドを第3C図に示す。ここで、これら
はワクチニアHind III F部分中に一つのBam HSV TKフ
ラグメントを取り込む第１の新規なプラスミド、pDP132
として、又、「頭尾」で結合した二つのBam HSV TKフ
ラグメントが取り込まれる第２の新規なプラスミド、pD
P137として特定される。単一のBam HSV TKフラグメン
トは二つのBam TKフラグメントが第２列の形でpDP137
に含まれると逆の意味でpDP132中に取り込まれる。すな
わち、遺伝子により生成された５′−末端を指定するBa
m HIフラグメント中のTK遺伝子の部分は、Sst I開列サ
イトとそれに、より近接した二つのBam HIサイトとの
間に位置する（再び第3B図を参照）。Bam TKフラグメ
ントにおけるHSV TK遺伝子の転写の方向は５′−末端
から３′−末端に進む。そして、これは第3C図に見られ
るように、pDP132において時計方向である（シムレー
（Smiley）ら,Virology102,83〜93（1980））。逆に、p
DP137中で縦２列に含まれたBam TKフラグメントは、逆
の意味で取り込まれるので、そこに含まれるHSV TK遺
伝子の転写は逆方向、すなわち反時計回りの方向であ
る。ワクチニアHind III F−フラグメント中でBam HSV
TKフラグメントを含む方向は、HSV TK遺伝子の転写
の促進が、Ｆ−フラグメントそれ自体内のプロモーター
サイトによつて始められる場合には重要であるかもしれ
ない。しかし、Bam HSV TKフラグメント及びHSV TK
遺伝子がワクチニアHind III F−フラグメント内でどの
方向で取り込まれるかと関係なくHSV TK遺伝子の転写
がおこるようにHSVプロモーターサイトはBam HSV TK
断片自身内に存在する。
pDP132又はpDP137を含むこれらの大腸菌組換型を次に成
長させ、次の工程の為の多量のプラスミドを生成させ
る。十分な量のプラスミドDNAを分離した時、Hind III
による制限で、HSV TK遺伝子を有する変異ワクチニアH
ind III F−フラグメントが得られる。この変異Hind II
I F−フラグメントは、感染体を生成する為に、以下で
詳細に記述する新規な方法により、ワクチニアウイルス
に導入する。
先行技術を見ると、現在、外来DNAを真核細胞に導入す
るのに主に使用されるベクターはSV40である。SV40のDN
Aは環状であり、プラスミドと同様に処理することがで
きる。すなわち、環状DNAは、制限酵素により開裂し、
外来DNAと組み合わされ、そして結合される。変異DNA
は、真核細胞、例えば動物細胞中に通常の技術によつて
導入することができる（ハマー（Hamer）ら、Nature28
1,35−40（1979））。DNAは感染しやすく、そして生存
し得る突然変異ウイルスを生成する細胞の核中で複製す
る。対照的に、ワクチニアは、真核細胞の細胞質で複製
する。このウイルスの精製DNAは感染性でなく、それ自
体SV40と同様に細胞中でワクチニア変異株を生成するの
に使用することはできない。寧ろ、細胞内における生体
内での外来DNAにより野生型ワクチニアの変異化を含む
新規な技術を使用しなければならない。
本出願人及びエイリーン・ナカノ（Eileen Nakano）の
未公聞報文は、ワクチニアウイルス中のマーカー救済を
示している。これらの実験によれば、Ｓ−変異株に通常
ないＬ−変異株DNA部分を再び適当な条件下でＳ−変異
株中に導入（「救済」）することができる。すなわち、
真核細胞を生きた感染Ｓ−変異株ワクチニアウイルス
と、特殊な構造のＳ−変異株に対し「外来の」DNAを代
表するＬ−変異株DNAの非感染制限フラグメントで処理
する。すなわち、救済されるＬ−変異株DNAの部分は、
それが導入されるＳ−フラグメントのDNA鎖と共直線性
の部分を有するDNA鎖内に存在しなければならない。す
なわち、Ｓ−変異株中に導入される「外来」DNAは、そ
のDNA鎖の両端で、そのＳ−変異株中の対応するシーク
エンスと相同なDNAの部分を有する。これらの相同シー
クエンスは、Ｓ−変異株によつて救済されるＬ−変異株
DNAの部分に付着した「腕」と見ることができる。
この組換の機構は複雑であり、生体外で達成することは
今までできなかつた。明らかに、Ｌ−DNAをＳ−変異株
中に組み込むことは、Ｓ−変異株から欠失した部分を包
囲するシークエンス中に相同塩基対を含む。DNAの一つ
のストランドから他のストランドへの交差は、DNAの生
体内組換に、しばしば起こり、欠失部分を救済する。
生体内組換のこの技術は、ワクチニアDNA以外の外来DNA
をワクチニアのＳ−又はＬ−変異株のいずれかに導入す
る為に使用することができる。従つて、Bam HSV TKフ
ラグメントを、ワクチニアに「外来」のDNAとして取り
込む変異Hind IIIフラグメントを、ワクチニアウイルス
の感染Ｌ−及び／又は感染Ｓ−変異株と共に、変異Ｆ−
フラグメントで真核細胞を処理することにより、ワクチ
ニア中に導入することができる。この場合、Bam HSV
TKフラグメント機能の側面に位置するＦ−フラグメント
の部分は、前述の「腕」として作用し、これは変異Ｆ−
フラグメントが導入されるＬ−又はＳ−変異株に存在す
るDNAと相同のDNAを含む。再び細胞内における生体内工
程、すなわち詳細には知られていない機構により、HSV
TK変異Ｆ−フラグメントを細胞内のワクチニア変異株
中に取り込み、ワクチニアの統制下において複製及び表
現することができる。
この生体内組換技術は、ワクチニア中に未だに他の「外
来」DNAを導入するのに広く適用することができ、かか
る外来DNAがワクチニア自体から誘導されたか、合成さ
れたか、又はワクチニア以外の他の生物から由来するか
どうかとはかかわりなく、ワクチニアゲノムを変性して
広い範囲の外来遺伝物質をその中に取り込ませることが
できる道を与える。
広範囲の細胞は、上述の細胞生体内組換が生じる宿主細
胞として使用することができる。この組換は、しかし、
使用する細胞に応じて、異なる効率で生じる。現在まで
に研究した細胞のうち、ベビー・シリアン・ハムスター
・腎臓細胞〔BHK−21（Clone 13）（ATCC No.CCL1
0）〕は、組換操作において、もつとも有用であること
が分かつている。しかし、CV−１（ATCC No.CCL70）、
ミドリザル腎臓細胞系、及び人間（系143）TK細胞、ヒ
ト細胞系R970−５から誘導された５′−BUdR耐性変異体
を含む他の細胞は、又このような態様で感染し、ワクチ
ニア変異体を生成する。
これらの細胞は、好適にワクチニア及びワクチニアに取
り込まれる外来DNAで処理され、一方都合がよいことに
は、これらの細胞はモノレヤーである。生体内組換の為
に、細胞はワクチニアで感染させ、次にその中に取り込
まれる外来DNAで処理するか、又はまず、外来DNAと接触
させ、次にワクチニアで感染させることができる。第三
の方法として、細胞を処理する時に、ワクチニア及び外
来DNAを同時に存在させてもよい。
ウイルスは、好適には通常の液状培地、例えばこれらの
細胞及びウイルスと適合するリン酸緩衝生理食塩水、ヘ
ルペス緩衝生理食塩水、イーグル・スペシヤル培地（Ea
gle′ｓ Special medium）（血清を添加又は無添加
で）等に存在させながら、細胞モノレヤーと接触する。
外来DNAは、都合がよいことには、リン酸カルシウム沈
殿物の形にありながら、これらの細胞を処理するのに使
用される。DNAを細胞中に導入するかかる技術は、グレ
イアム（Graham）らによる先行技術〔Virology53,456−
467（1973）〕に述べられている。この技術の変形は、
ストウ（Stow）ら〔J.Gen.Virol.33,447−458（197
6）〕及びウイグラー（Wigler）ら〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA76,1375−1376（1979）〕で議論されている。これ
らの報文で教示される処理は、室温で都合よく進行する
が、温度条件は、細胞をウイルス及び／又は外来DNA沈
殿物で処理する時間に従い、生体内組換の種々の効率で
細胞の生存を保持する限界内において変動させることが
できる。感染ワクチニアウイルスの濃度及び外来DNA沈
殿物の量は、組換の速度及び程度に影響する。雰囲気等
の他の要因は、細胞の存在を保持する為に選択する。さ
らもなければ、この三つの必要な成分（細胞、ウイルス
及びDNA）が存在する限り、生体内組換は少なくともあ
る程度進行する。特殊な場合の条件を最適にすること
は、微生物の分野における当業者の能力内において容易
に行なうことができる。
この組換工程の次に、生体内組換によつて突然変異化し
たこれらのワクチニアウイルスは、未突然変異化ワクチ
ニアウイルスから同定し、分離しなければならない。
ワクチニアウイルスに外来DNAを生体内で組み込むこと
によつて変異化したそのワクチニアウイルスが、その外
来DNAの性質又はその変異体の能力とから独立の、少な
くとも二つの方法によつて、未変異化ワクチニアウイル
スから分離し、その外来DNA中に存在するかもしれない
遺伝子を表現することができる。従つて、まず第一に、
変異体ゲノム中の外来DNAを、ゲノムの制限分野によつ
て検出し、変異化生物中のDNAの余分の断片の存在を追
跡することができる。この方法においては、精製溶菌斑
から単離した個々のウイルスは成長し、そしてそのDNA
はそこから抽出され、そして適当な制限酵素により制限
分析に付される。再び、決定されたフラグメントの数及
び分子量を検出することにより、制限前のゲノムの構造
を演澤する。精製溶菌斑を成長させる必要性、しなけれ
ばならない分析の数及び成長し、そして分析したどの溶
菌斑も変異株を含まない可能性の為に、この技術は煩雑
であり、手間取りかつ不確定である。
更に、ワクチニアウイルス中に外来DNAが存在すること
は、ヴイラレアール（Villarreal）等〔Science196,183
−185（1977）〕により教示されている技術の変形を利
用することによつて決定することができる。感染ウイル
スは、感染細胞モノレヤー上にあるウイルス溶菌斑か
ら、ニトロセルロースフイルターに移される。都合がよ
いことに、ニトロセルロースフイルター上の転移ウイル
スの鏡像レプリカは、第二のかかるフイルターをウイル
スが移された最初のニトロセルロースフイルターの側と
接触することによつて作られる。最初のフイルター上の
ウイルスの部分は第二のフイルターに移される。これら
のフイルターの一方又は他方、一般には第一のフイルタ
ーは、雑種形成に使われる。他方の鏡像フイルター上で
行なつた雑種形成技術を使用して組換え型ウイルスの場
所を検出した後、残りのフイルターは組換え型ウイルス
を回収するのにとつておく。
雑種形成の為に、ニトロセルロースフイルター上のウイ
ルスは、それ自身公知の態様で水酸化ナトリウムにより
変性される。この変性遺伝物質は、その存在を決定しよ
うとする遺伝子の放射線でラベルした対応部分と雑種化
される。例えば、Bam HSV TKフラグメントを含むワク
チニア変異株の可能な存在を検出する為に、32Pを含む
対応する放射線でラベルしたBam HSV TKフラグメント
を、このフラグメントの存在で変異化したプラスミドの
検出に関し、既に議論したと同じ方法で使用する。非雑
種化DNAは、ニトロセルロースフイルターから洗浄さ
れ、そして残りの雑種化DNA（放射性）はオートラジオ
グラフイーにより、すなわちフイルターをＸ線フイルム
と接触することにより位置決めされる。変異化ウイルス
を特定したならば、第一のフイルターに移転されたウイ
ルスの鏡像を含む第二のフイルター上に存在する対応ウ
イルス溶菌斑を位置決めし、変異化ウイルスを複製する
為に成長させる。
上述の二種類の方法は、含まれる生物の遺伝子型の分析
を含み、既に述べたように、ワクチニアウイルスに取り
込まれる外来DNAに存在する遺伝子が表現されるか否か
に拘らず、使用することができる。しかし、もし外来DN
Aが表現されるなら、表現型分析を変異体の検出に使用
することができる。例えば、もし遺伝子が、抗体が存在
するタンパク質の製造によつて表現されるならば、変異
体は抗原抗体複合体の形成を使用する方法によつて検出
することができる〔ビーバーフイールド（Bieberfeld）
ら、J.Immunol.Methods.６,249−259（1975）を参
照〕。すなわち、問題の変異株を含むウイルスの溶菌斑
を、変異株ワクチニアの遺伝子型によつて製造されるタ
ンパク質に対する抗体で処理する。過剰の抗体を溶菌斑
から洗浄し、この溶菌斑は、125Iでラベルしたタンパク
質Ａで処理される。タンパク質Ａは、抗原の重い鎖と結
合することができ、従つて、細胞のモノレヤー上に残つ
ている抗原抗体複合体を特にラベルする。過剰の放射性
タンパク質Ａを除去した後、モノレヤーを再び溶菌斑リ
フトでとり上げ、ニトロセルロースフイルター上に移
し、そしてオートラジオグラフイーにかけて放射性物質
でラベルした免疫複合体の存在を検出する。このように
して、抗原性タンパク質を製造する変異化ワクチニアウ
イルスを特定することができる。
外来DNAがHSV TK遺伝子を含むような特殊な場合におい
ては、変異化ワクチニアウイルスはHSV TK遺伝子をそ
の中で表現するので、遺伝子の存在を検出する為のはる
かに単純でかつすぐれた方法が存在する。実際、HSV T
K遺伝子を含むワクチニア変異株と、この遺伝子を含ま
ない未変異化ワクチニアを簡単に区別することができる
ので、ワクチニアゲノム中に単独で存在するか、又はHS
V TK遺伝子と組み合わさつてその中に存在する他の外
来遺伝子を含むワクチニアウイルス変異株を区別する有
効な道具を提供することになる。これらの方法は、以下
において更に詳述する。
真核細胞は、それ自身のTK遺伝子を有し、又、ワクチニ
アウイルスも同様にそれ自身のTK遺伝子（上述のよう
に、DNAにチミジンを取り込ませる為に使用される）を
有するので、これらの遺伝子の存在及び発現は、いくつ
かの場合において、以下で議論する型のワクチニア変異
株中のHSV TK遺伝子の存在及び発現と区別されなけれ
ばならない。この為に、HSV TK遺伝子が、ハロゲン化
デオキシシチジン、特にヨードデオキシチジン（ID
C）、ヌクレオシドをフオスフオリル化するが、ワクチ
ニアのTK遺伝子及び細胞のTK遺伝子のいずれもかかるフ
オスフオリル化に影響しないという事実に基づき使用し
なければならない。IDCを細胞のDNA中に取り込ませる
と、IDCは不溶性となる。一方、非取り込ませIDCは直ち
に水溶性媒体、例えば生理緩衝液で細胞培養から洗うこ
とができる。ワクチニア変異株中のHSV TK遺伝子の発
現を検出する為に以下のようにこれらの事実に基づき使
用する。
すなわち、細胞モノレヤーを、溶菌斑の形成を促進する
条件下、すなわち、細胞の成長を促進し、そしてウイル
スの複製を促進する条件下で変異化ウイルスによつて感
染させる。細胞を感染化したら、それらを市販の放射性
物質でラベルしたIDC（IDC＊）で処理する。このラベル
化は125Iで容易に行なうことができる。もし細胞がHSV
TK遺伝子を含むウイルスで感染され、そしてその中に
存在するHSV TK遺伝子が表現されるならば、細胞はIDC
＊をそのDNA中に取り込む。細胞モノレヤーを生理的緩
衝液で洗浄すれば、取り込まれないIDC＊も洗い流され
る。細胞モノレヤーを次にニトロセルロースフイルター
に移し、そしてＸ線フイルムにさらすと、フイルムの暗
化によつて、溶菌斑中のIDC＊の存在が分かり、そして
ワクチニア変異株によるHSV TK遺伝子の発現が示され
る。
上述の遺伝子型及び表現型分析を使用して、本出願人は
二種類のワクチニア変異株（VP−１及びVP−２）を特定
した。VP−１（ATCC No.VR2032）は、プラスミドpDP13
2による生体内組換によつて変異化したワクチニアＳ−
変異株から由来する組換ワクチニアウイルスである。VP
−２（ATCC No.VR2030）は、pDP137による組換によつ
て変異化したＳ−変異株ワクチニアウイルスである。
第4A図は、HSV TK遺伝子の挿入の部分を示すワクチニ
アゲノムのHind IIIの制限地図である。第4B図及び第4C
図は、VP−１及びVP−２に各々含まれているHind III F
−フラグメントを拡大するものであり、その中に含まれ
ているBam HI HSV TKフラグメントの配向を示す。こ
こで、Ｓ−変異株（すなわち、VP−２）によるpDP137の
生体内組換により、出発プラスミド中に縦に存在するBa
m HI HSV TKフラグメントの一つを欠失させることが
できることに注目しなければならない。
既に述べたように、HSV TK遺伝子が発現するという事
実は、HSV TK遺伝子、又は、単一に又はHSV遺伝子と組
み合わさつて存在する外来遺伝子を含み、又は含まない
変異株を、素早くかつ容易に検出し、かつ特定するのに
使用することができる。この試験及びその基礎は更に以
下で述べる。
出願人は、ワクチニア変異株、特に自然に生じている機
能性TK遺伝子を全く含まないＳ−変異株を、生物的に純
粋な形で単離し、VTK-79（ATCC No.VR2031）と命名し
た。通常前記Ｓ−及びＬ−変異株は、そのHind IIIフラ
グメントＪ中にTK遺伝子を有する。もしワクチニアTK遺
伝子活性のないこの変異株を、既に述べた技術によつて
ワクチニア変異株に取り込ませたHSV TK遺伝子を含む
更に変異化した生物を製造するのに使用すると、得られ
た変異株中に存在するHSV TK遺伝子はウイルス中の機
能性TK遺伝子のみとなる。かかるHSV TK遺伝子の存在
又は不存在は、いくつかの選択された培地の一つにおい
て、ウイルスで感染した細胞を成長させることによつて
直ちに検出することができる。
すなわち、かかる選択された培地の一つは、ブロモデオ
キシウリジン（BUdR）、すなわち、チミジンに類似して
いるが、その培地中に存在するDNA内に存在する時に、
細胞又はウイルスのような生物に対し、非常に突然変異
誘発性でかつ有毒であるヌクレオシドを含む。かかる培
地はキツト（Kit）らのExp.Cell Res.31,297−312（19
63）より公知である。他の選択的培地は、リトルフイー
ルド（Littlefield）のProc.Natl.Acad.Sci.USA50,568
−573（1963）のヒポキサンチン／アミノプテリン／チ
ミジン（HAT）の培地、及びデイビス（Davis）らのJ.Vi
rol.13,140−145（1974）に記載されているMTAGGのよう
な変異株、又は、キヤンピオン−ピカルド（Campione−
Piccardo）らのJ.Virol.31,281−287（1979）に記載さ
れているMTAGGの変異株である。これらのすべての培地
はTK遺伝子を含み、それを表現する生物と、TK遺伝子を
含まず、それを表現しない生物とを選択的に分離する。
この培地の選択性は以下の現象に基づいている。
チミジンのフオスフオリル化には二つの物質代謝経路が
ある。第一の物質代謝経路はチミジンキナーゼに依存し
ない。それが中間の機構によりフオスフオリル化チミジ
ンを合成する一方、BUdRをフオスフオリル化せず又は直
接チミジンをフオスフオリル化する。第二の物質代謝経
路は、チミジンキナーゼの活性を含み、チミジン及びそ
の類似的BUdRをフオスフオリル化する。BUdRは有毒な非
常に突然変異誘発性の物質であるので、TK、例えばHSV
TKを生物中に存在させると、BUdRをフオスフオリル化
し、成長している生物のDNA中にそれを取り込み、生物
を死に至らしめる。一方、もしTK遺伝子が存在せず、又
は表現されないならば、又、それに引き続く第一の物質
代謝経路がフオスフオリル化チミジンを合成するが、BU
dRをフオスフオリル化しないならば、物質代謝生物はBU
dRの存在下で生き残る。これはこの物質がDNA中に取り
込まれないからである。
ここで議論する成長の挙動は、添付図面の第５図に要約
される。この図面は、TK（TK+）を表現する生物および
通常の培地において、TKを使用しない第一の物質代謝経
路を阻害するHATのような選択的培地において、及びBUd
Rを含む培地において、TK遺伝子（TK-）を有さない又は
表現しない生物の成長挙動を表にしたものである。TK+
及びTK-生物はTKを要求しない第一の物質代謝経路を使
用することにより、通常の成長培地において成長する。
TKに依存しない第一の物質代謝経路を阻害するHATのよ
うな選択的培地においては、このTK+生物はそれでも酵
素がチミジンをDNAに取り込ませるのに必要なフオスフ
オリル化を達成するので成長する。一方、TK-生物は生
き残らない。対照的に、もし生物がBUdRを含む培地上で
成長するならば、TK+変異株は、TKがBUdRをフオスフオ
リル化し、そしてこの有毒な物質がDNA中に取り込まれ
るので死滅する。対照的に、BUdRが第一の物質代謝経路
によつてフオスフオリル化されないので、TK-変異株はB
UdRがDNA中に取り込まれないので成長する。
従つて、もしワクチニアTKを有さないワクチニアウイル
ム、例えばVTK-79のようなウイルスを本発明の技術によ
つてHSV TK遺伝子を挿入しようとするワクチニアウイ
ルスとして使用するならば、その中のHSV TK遺伝子の
存在及び表現、又は、不存在はHATのような選択的培地
で組換型を単に成長させることによつて直ちに決定する
ことができる。変異化されたこれらのウイルスは、HSV
TKを使用してDNAを合成するので生き残る。
本出願人は実際、ワクチニアTKを有さないワクチニアウ
イルスのいくつかの変異株を精製した。これらをVTK-79
及びpDP132の組換型であるVP−３（ATCC No.VR2036）
及びVTK-79及びpDP137の組換型であるVP−４（ATCC N
o.VR2033）と命名した。後者はHSV遺伝子を表現し、そ
して上述の選択的培地を使用して直ちに特定することが
できる。
VP−５（ATCC No.VR2028）及びVP−６（ATCC No.VR20
29）と命名した二つの付加的な組換型ウイルスは、各々
pDP132及びpDP137とVTK-11（ATCC No.VR2027）すなわ
ちワクチニアTK遺伝子を表現しないワクチニアの公知の
Ｌ−変異株であるものとの組換型である。従つて、DNA
は最大のワクチニアゲノムの長さを過剰に導入すること
ができる。
本発明の技術は、HSV TK遺伝子を、ゲノムの非本質的
部分を特定する為に、ワクチニアゲノムの種々の部分に
導入する為に使用することができる。すなわち、もしHS
V TK遺伝子が、Hind III F−フラグメント中における
ようにワクチニアゲノムに導入することができるなら
ば、導入されるべきゲノムの部分は明らかに非本質的で
ある。ゲノム中の各非本質的サイトは、本発明の方法が
ワクチニアゲノムのかかる非本質的サイトの遺伝的地図
を作成するのに有用となるような外来遺伝子の挿入の為
の好ましい候補である。
更に、もしHSV TK遺伝子をいま一つの外来遺伝子と結
合し、得られた結合DNA物質を、VTK-79のようなワクチ
ニアTK遺伝子を有さないワクチニアウイルス中に導入す
るならば、形成しそして外来遺伝子を有する組換型はHS
V TK遺伝子を表現し、そして上述のふるい技術によつ
てTK-変異株から直ちに分離することができる。
本発明のいま一つの大要には、外来遺伝子を含むワクチ
ニアHind III F−フラグメントを製造すること、及びワ
クチニアTK遺伝子を表現しないが、しかし本発明の技術
による生体内組換により取り込まれたHSV TK遺伝子を
有するワクチニア変異株と共に細胞をそのフラグメント
で処理することが含まれる。ここで既に述べたマーカー
救剤及びワクチニアにTK変異化Hind III F−フラグメン
トを取り込ませる為に使用する生体内技術に関し、その
中でHSV TK変異化Ｆ−フラグメントがいま一つの外来
遺伝子を含むＦ−フラグメントによつて置換されている
いま一つの変異株を産生する為に、交差及び組換が生じ
得る。HSV TK Ｆ−フラグメントが外来遺伝子を含む
Ｆ−フラグメントによつて置換されている得られたワク
チニア変異株は、全体としてTKを含まず、一方優先的に
存在する非変異化親ウイルスは依然としてHSV TK+であ
る。同様に外来遺伝子は、かかるワクチニア変異株中に
存在するHSV TK遺伝子中に挿入され、非変異化TK+親ウ
イルスと比較して組換型生物TK-を与える遺伝子の一体
化を破壊する。二つの例において、外来遺伝子を含むワ
クチニア変異株とTKを全く含まないワクチニア変異株と
を、BUdR及び／又はHATのような特殊な培地上で成長さ
せることにより直ちに分離することができる。
第7A図乃至第7C図は第3A図乃至第3C図と組み合わせるこ
とによつてよりよく理解できる。従つて、第3B図からそ
の中に付加的にDNAを取り込む前のプラスミドpDP3が、
分子量11.3メガダルトン（md）を有することが分かる。
更にDNAを第3B図に示されているようなヘルペスBam TK
フラグメントのように取り込ませ、プラスミドpDP132及
びpDP137を製造させると、後者のプラスミドは各々13.6
及び15.9mdの分子量に増大する。これらの分子量はほぼ
プラスミドに対する複製の上限に近いのでワクチニアHi
nd III F−フラグメントを含むプラスミドを製造するこ
とが望ましいと分かつたが、そのプラスミドは第3B図に
示されるpDP3よりも小さい分子量のものである。かかる
低分子量プラスミドを製造する方法は第7A図乃至第7C図
に示されている。
更に詳細に述べれば、第7A図は、分子量8.6メガダルト
ンのワクチニアのHind III F−フラグメントを含むプラ
スミドpDP3を示す。この図に示されているように、プラ
スミドは制限酵素Pst Iによる開裂を受けやすい三つの
サイトを含む。これらのサイトのうち二つは、プラスミ
ドのＦ−フラグメント内にあり、第三番目は親のプラス
ミドpBR322から由来するプラスミドの部分内に存在す
る。第7A図に更に示されているように、プラスミドpDP3
をPst Iで開裂すると三つのフラグメントが得られる。
単にワクチニアHind III F−フラグメントの部分である
フラグメントは分子量3.7mdである。又、親のpBR322の
部分及びワクチニアHind III F−フラグメントを結合す
る二つの他のフラグメントがある。
最も大きな「精製」Ｆ−サブフラグメントは容易に単離
することができる。第7B図に示されるように、このフラ
グメントはPst IによるpBR322プラスミドの開裂の後Pst
Iサイトの部分でpBR322中に導入される。親フラグメン
トをT4DNAリガーゼと結合すると、第7C図に示されるよ
うに新たなプラスミドpDP120が得られる。これは分子量
がわずか6.4mdのものである。pDP3に比較してより低い
分子量のpDP120プラスミドにより、第3C図に示されるよ
うなプラスミドpDP132及びpDP137におけるような複製の
上限に近づくことなくその中により長いDNAシークエン
スを導入することができる。
第8A図乃至第8D図は、第3A図乃至第3C図を参照するとよ
りよく理解できる。更に詳細に云えば、第3B図及び第3C
図はプラスミドpDP3にヘルペスBamTKフラグメントを取
り込ませ、プラスミドpDP132及びpDP137を形成させるこ
とを示している。本出願の実施例Ｘにより詳細に示され
るように、このヘルペスBam TKフラグメントは、適当
な細胞をワクチニアウイルス及びHind III処理されたpD
P132又はpDP137による同時処理を含む生体内組換技術に
よつてワクチニアウイルス中に導入される。第3C図を参
照することにより、ワクチニアウイルスに生体内組換に
より取り込まされるヘルペスBam TKフラグメントがHin
d IIIサイトでpBR322セグメントと結合されているワク
チニアHind III F−フラグメント中に存在するので、上
述のプラスミドをHind IIIで処理すると、プラスミドpB
R322から本来生じたプラスミドのその部分を削除する。
従つて、ヘルペスBam TK遺伝子はpBR322DNAシークエン
スを有しないワクチニア中に取り込まれる。
しかし、例えばEco RI,Hind III,Bam HI,Pst Iなどの
ようなpBR322プラスミド中で使用できる多くの制限サイ
トの為に、プラスミドは特にDNAシークエンスをその中
に導入するのに有用である。従つて、pBR322をワクチニ
アウイルスのようなベクター中に導入できることは望ま
しいであろう。
第8A図乃至第8D図は、pBR322の可変性DNAシークエンス
を生体内組換、特にpBR322DNAシークエンスを含むVP7及
びVP8である二つのワクチニア変異株を製造することに
より、ワクチニアウイルス中に導入することができる方
法を使用した二つのプラスミドの生成を示す。
更に詳しく述べれば、第8A図は、第3A図に示されるよう
なワクチニアHind III F−フラグメントを示す。直鎖状
セグメントは自己結合して第8A図に示されるような環状
Ｆ−フラグメントを形成する。結合したHind III末端は
各々「ａ」及び「ｄ」として直線状及び環状フラグメン
ト上に示される。Bam HIサイトの側の各末端は「ｃ」
及び「ｂ」として第8A図に示されている。
特に第8B図に示されるように、この環化されたＦ−フラ
グメントは、Bam HIによる処理で、Bam HI末端「ｂ」
及び「ｃ」がHind III末端「ａ」及び「ｄ」に関して示
されている直鎖状DNAシークエンスを生成する。この直
鎖状シークエンスは「転化Ｆ−フラグメント」と名づけ
る。
もし、第8B図に示されるように、同第8B図のBam HI処
理pBR322及び直線状転化Ｆ−フラグメントシークエンス
がT4DNAリガーゼと結合すると、転化Ｆ−フラグメント
及びその親pBR322シークエンスの相対的整列に依存して
二種類のプラスミドが生成する。これらの二種のプラス
ミドは、pDP301B及びpDP301Aとして第8C図に示されてい
る。これらの各々は同じ分子量11.3mdを有する。
これらのプラスミドpDP301A及び301Bを生体内組換によ
つてワクチニアに取り込ませることは第8D図に示されて
いる。すなわち、これらのプラスミドの各々は、生体内
組換によりワクチニアウイルスVTK-79に取り込まれ、各
々はワクチニア変異株VP7（ATCC No.VR2042）及びVP8
（ATCC No.VR2053）を生成する。この図に示されてい
るように、この目的を達成する為にpDP301プラスミドを
各々Sst Iで開裂し、末端がワクチニアウイルスゲノム
のＦ部分に存在する対応するDNAシークエンスと相同で
ある直鎖状DNAシークエンスを生成する。Sst I処理プラ
スミド及びワクチニアウイルスで同時に細胞を処理する
と、pBR322DNAシークエンスをウイルスゲノムに取り込
ませることによる生体内組換が生じる。
VP7及びVP8のワクチニアゲノム中にpBR322シークエンス
を存在させることの利点は、種々の外来DNAシークエン
スをその中に含むように変異させたこれらの変異株及び
pBR322シークエンスを使用することにより、生体内組換
を直ちに行なうことができることである。この場合、導
入されるのはワクチニアゲノム中に及び変異化pBR322DN
Aシークエンス中に存在し、交差及び組換を起こさせる
相同塩基対であり、これはVP10,VP13,VP14及びVP16とし
て特定される更に新しいワクチニアウイルス変異株の調
製に関して以下で示す。
第９図及び第10図は、ワクチニアにインフルエンザ遺伝
子を導入して二種のワクチニア変異株VP9及びVP10を提
供することに関するものである。
インフルエンザゲノムは、八つの分離したRNA断片から
成り、その断片の各々は少なくとも一つの異なるタンパ
ク質を指定する。主な免疫原タンパク質の一つは、赤血
球凝集性タンパク質であり、この為にHA遺伝子がワクチ
ニアに挿入する為に選択された。このインフルエンザウ
イルスのゲノムは、RNAシークエンス中に遺伝子を含
み、プラスミドへの取り込みの為にそれらはcDNAとして
特定されるDNAコピー中に転換されなければならない。
当該技術分野において公知のように、このHA RNAゲノ
ムのcDNAコピーは、逆転写酵素を使用して形成する。こ
れらは、バツクズ（Bacz）らのNucleic Acids Resear
ch ８,5845−5858（1980）に記載されている。
インフルエンザウイルスは、HA遺伝子及び八つの遺伝
子、すなわちノイラミニダーゼ（neuraminidase）を指
定する遺伝子の性質に従つて分類される多くの変異株中
に存在する。インフルエンザウイルス種内においては、
H1−H3と指定されるHA抗原型の三つの主な型が存在す
る。
ワクチニアウイルス変異株VP9及びVP10の製造に際して
は、使用するインフルエンザウイルスは、H1HA遺伝子を
含むA/PR/8/34である。
第9A図は、二つの環状プラスミドpJZ102A及びpJZ102Bを
示す。これらのプラスミドは、インフルエンザ赤血球凝
集法（HA）遺伝子のcDNAコピーを、Hind IIIサイトにお
いてpBR322中に取り込ませることによつて製造した。Ａ
及びＢプラスミド変異株は、その中にあるHA遺伝子の配
向において異なる。このことはHA遺伝子内に含まれ、か
つその遺伝子内のAva Iサイトに近接した遺伝子内にあ
る翻訳開始コードンを参照することによつて第9A図に示
されている。このpJZ102A及びＢ変異株内におけるAva I
サイトと翻訳開始コードンとの相対的位置は第9A図に示
されている。
プラスミドpJZ102Aをワクチニアウイルスの「転化」Ｆ
−フラグメント（第8B図に示されている）の存在下でBa
m HI及びT4DNAリガーゼで処理するとpJZ102A親プラス
ミドがワクチニアＦ−フラグメントと結合しているPJZ1
02A/Fとして第9B図に示されている別のプラスミドが得
られる。
更に第9B図に示されているように、第9B図に示されてい
るこのPJZ102A/Fプラスミドが、生体内組換によつてワ
クチニアウイルスのVTK-79株中に取り込まれると、ワク
チニア変異株VP9（ATCC VR No.2043）が生成し、この
変異株はインフルエンザ赤血球凝集素抗原（HA）遺伝子
を含み、それを表現し、又以下で述べるように哺乳動物
の抗原に対する抗体の生成を促進する為に使用すること
ができる。
第9C図は、PJZ102A/F DNAシークエンスとその中のHA遺
伝子を含むVP9のゲノムの部分を示す遺伝子地図であ
る。
第10A図乃至第10C図は、インフルエンザ赤血球凝集素
（HA）遺伝子を含む第二のワクチニア変異株の製造を示
すものであり、このワクチニア変異株はここではVP10
（ATCC No.VR2044）と呼ぶ。
更に詳しく述べれば、このVP10変異株は、ワクチニアpJ
Z102B（第9A図と比較）からのDNAとワクチニア変異株VP
7で見られるpBR322DNAシークエンスとの生体内組換によ
つて構成され、この変異株のプラスミドpDP301Aからの
製造は、第8C図及び第8D図に示されている。
従つて、第10A図は、環状プラスミドのBam HIによる処
理の後のpJZ102Bの直鎖状DNA地図を示す。HA遺伝子内の
翻訳開始コードンは、その遺伝子内のAva Iサイトに関
して示されており、この遺伝子はプラスミドpBR322のDN
Aシークエンス内に含まれている。第10B図は、生体内組
換によりプラスミドpDP301AをVTK-79に取り込ませた結
果であるワクチニア変異株VP7内に見られるゲノムの部
分を示す。更に詳細に云えば、第10B図は、各々の側を
ワクチニアウイルスのＦ−フラグメントの部分で囲まれ
ているpBR322ゲノムの存在を示しており、このＦ「腕」
の存在によりpBR322DNAシークエンスが初めてワクチニ
アゲノム中に取り込まれる。
本明細書の前半において、HSV TK+ワクチニアウイルス
HSV TK-を与える為の生体内組換の利用に言及した。こ
れは、かかるウイルス中に存在するHSV TK遺伝子を、H
SV遺伝子TK-を与える外来遺伝子を含むHSV TK遺伝子と
置き換えることを含む。現在議論している研究は、他の
DNA特にpBR322DNAを使用する技術を示し、このpBR322DN
Aはワクチニアに対し外来である。すなわち、組換は、
トランスフエクシヨン（供与体）DNA及び感染ウイルス
内において、挿入されるべき外来遺伝子の側面に相同シ
ークエンスがある限り、かかるシークエンスが内生のワ
クチニアシークエンスであるかどうかにかかわりなく、
ワクチニアにおいて起こる。更に他のDNAシークエンス
をワクチニアに導入し、そして続けて同様な大要で生体
内組換に利用することができる。
pJZ102B（第10A図）のpBR322部分及びVP7（第10B図）の
ゲノム内に含まれるpBR322DNAシークエンス中の相同塩
基対の存在により、交差は細胞のVP7及びpJZ102Bによる
同時処理を含む生体内組換の間に生じ、そしてHAフラグ
メントはワクチニアゲノム中に取り込まれて、第10C図
に示されるようにワクチニア変異株VP10を生成する。
VP10は、生体内組換が第10A図乃至第10C図に示されるよ
うにHind IIIとpBR322シークエンスの右端にあるBam H
Iサイトとの間の350塩基対内で生じ得ることを示す。
ウイルスVP9及びVP10がHA遺伝子を発現しているかどう
かを決める為に、一連の組織培養物を調製した。すなわ
ち、第一の一対のペトリシヤーレ中に存在するBHK細胞
をA/PR/8/34インフルエンザウイルスで感染した。いま
一つの一対のペトリシヤーレ中に存在するCV−１細胞を
VP9ワクチニア変異株で感染させた。そして三番目の一
対のペトリシヤーレ中に存在するCV−１細胞をVP10ワク
チニア変異株で感染させた。ウイルスを細胞内で成長せ
さた後、三対のペトリシヤーレの各一つに存在する感染
細胞をH1HA抗血清で処理した。三つの細胞培養基の二つ
のセツト（一つはBHK及び二つのCV−１培養基）をH3HA
抗血清で処理した。全ての細胞培養基を洗浄し、次に
125Iでラベルしたタンパク質Ａで処理した。ラベルした
タンパク質Ａで処理した後、細胞培養基を再び洗浄しラ
ジオオートグラフに付した。もしインフルエンザ抗原が
感染細胞によつて生成されているならば、抗原はH1HA抗
血清中に存在する抗体と反応するが、H3HA抗血清中のも
のとは反応しない。これらの複合体を平板から洗浄しな
いで125Iタンパク質Ａを、もし複合体が存在するならば
その複合体中の残存抗体の重い鎖の一定部分と結合させ
る。
複合体は、A/PR/8/34で感染させ、そしてH1HA抗血清で
処理したペトリシヤーレ中で生成していることが分かつ
た。このことはVP9で感染させたCV−１細胞の場合と同
様であつた。これとは対照的に、VP10で感染させた細胞
中には何も抗原抗体複合体が形成しなかつた。又、A/PR
/8/34又はVP9のいずれかで感染させた細胞培養物におい
ては、これらの培養物をH3HA抗血清で処理した時には、
何も複合体形成が検出できなかつた。
この実験から、まず第一に、VP10ワクチニア変異株がこ
の分析によつては検出できるレベルではH1HA遺伝子を表
現しないことを結論づけることができる。逆にVP9変異
株はこの遺伝子を表現する。更に、表現VP9はH1HAに特
有である。これは、続けてH3HA抗血清と接触させるVP9
処理細胞培養基において何ら複合体が形成しなかつたか
らである。
VP9が試験管内でH1HA遺伝子を表現することを知つてい
るので、VP9ワクチニア変異株がこのワクチニア変異株
で感染させた動物中に抗体を形成させるのに十分なH1HA
遺伝子を表現することができるかどうかを次にテストし
た。
このテストの為にウサギを静脈注射によりワクチニアウ
イルスVP9で感染させた。17,25及び41日後、血液をウサ
ギからとり出し、血清を集めた。この血清内におけるH1
HAに対する抗体の存在をA/PR/8/34及びVP9による細胞培
養基の感染を含めて既に述べた同様の一連の生体外実験
により試験を行なつた。免疫複合体の形成が、VP9で感
染させた細胞レヤーをウサギの抗血清で処理した時に観
察された。しかし、このテストは単にウサギがワクチニ
アウイルスに対して抗体を生成したことを示すにすぎな
い。すなわち、抗体がH1HA抗原に対し具体的に生成した
かどうかは決定することができない。しかし、ウサギの
血清とA/PR/8/34で感染させたBHK細胞モノレヤーとの間
の複合体の形成は、抗血清中におけるH1HA抗原に特有の
抗体が存在していることを示していた。
HA抗体の製造に関する別の標準として、赤血球凝集阻害
分析を行なつた。この試験は、HAの、赤血球を巨大な複
合体に凝集させる性質を利用するものである。
この分析を実施する為に、ウサギの抗血清をまず第一に
連続して希釈した。この抗血清の一連の希釈溶液を、イ
ンフルエンザウイルスで感染させた細胞を抽出すること
によつて得られた同一の一定量の赤血球凝集素と反応さ
せた。もし抗体が各一連の希釈溶液に導入される赤血球
凝集素の量に等しいか又は過剰の量で抗血清中に存在す
るならば、得られた混合物は、凝集剤すなわちHAに対す
る過剰の抗体の存在の為に混合される赤血球の凝集を阻
害する。
実施した一連の希釈において（45日間の抗血清）、1:32
0以内の全ての希釈物は赤血球の凝集を阻害した。これ
は、加えた過剰のHA抗原の量でH1HA抗体が抗血清中に存
在することを示している。
これらの実験は二つの重要な事実を示している。まず第
一に、本発明の技術によつてワクチニア変異株を形成で
きるということである。この変異株は動物モデルに導入
されると、第一の感染においてさえもワクチニア変異株
内の遺伝子によつて指定されたタンパク質に対する抗体
を製造させる。この遺伝子はワクチニア及びそれを導入
する動物のいずれに対しても外来である。第二に、この
実験は、動物によるワクチニア自体に対する抗体の生成
が、このワクチニア変異株内に含まれる外来DNAによつ
て指定された生成物に対する抗体の同時形成と何ら抵触
しないことを示している。
プラスミドpDP250A及びpDP250Bの調整、及びそのVTK-79
への取り込みによる新しいワクチニア変異株VP12（ATCC
No.VR2046）及びVP11（ATCC No.VR2045）の各々の製
造が第11A図乃至第11E図に示されている。
完全な肝炎Ｂウイルス（HBV）ゲノムを含む環状DNAを単
離することができる。第11A図に示されるように、この
ゲノムは、Eco RIサイトを含む前細胞表面抗原部分を
含めた細胞表面抗原を指定する部分を含むものとして示
される。これらの細胞表面抗原領域は、ゲノム内に含ま
れる「ブロツク」として第11A図に示されている。この
残りのDNAはジグザグ線によつて示されている。このゲ
ノムをEco RI内で処理してこれを開裂すると、直線状
のDNAシークエンスが得られ、これは前細胞表面抗原領
域の部分が直鎖状DNAシークエンスの各端末に存在する
ように、その前細胞表面抗原部分内で開裂する。環状ゲ
ノム中のEco RIサイトの各々の側に存在するこのシー
クエンスの二つの末端は、環状ゲノム及び直鎖状DNAフ
ラグメントにおいてそれぞれ環状及び四角形で表わされ
ている。
HBV DNAフラグメントが第11B図に示されるように、pBR
322中に取り込まれ、縦二列で二つの肝炎Ｂ−フラグメ
ントを含むプラスミドを単離するならば、公知のプラス
ミドpTHBV1が第11B図に示されるように得られる。この
プラスミドはその中にもとの肝炎Ｂゲノムの再構築され
た前細胞表面抗原及び細胞表面抗原部分を含む。この点
は第11B図においてプラスミドpTHBV1について与えられ
ているようにこれらの部分を点線で囲まれていることに
よつて示されている。この完全な製造はハーシユマン
（Hirschman）らのProc.Natl.Acad.U.S.A.77,5507−551
1（1980）によつて示されている。
pTHBV1のこのsAgの部分は制限酵素Bgl IIによるプラス
ミドの処理によつて単離することができる。このpTHBV1
プラスミドのpBR322の部分はBgl IIサイトを含まず、一
方、プラスミド中に縦に二列で含まれている２つのHBV
DNAフラグメントの各々は３つのBag IIサイトを含
む。従つてpTHBV1は６つのBgl IIサイトをすべてHBV D
NA中に含むがそのすべてはsAg領域外にある。従つて第1
1B図及び第11C図に示されるようにpTHBV1のBgl IIによ
る開裂によるＢ型肝炎ウイルスのsAg領域を含む直線状D
NAフラグメントが生成される〔ガリバート（Galibert）
らネイチヤー281,646−650（1979）〕。
このフラグメントはプラスミドpDP120中に組み込まれ
る。このプラスミドpDP120の形成は、第7A図乃至第7C図
にすでに記載している。このpDP120プラスミドがBgl II
サイトを含まない。
酵素Bgl IIに対する認識シークエンスは−AGATCT−であ
りこの開裂部位は−ＡとGATCT−との間にある。一方、B
am HIの認識部位は−GGATCC−でありこの開裂部位は−
ＧとGATCC−との間にある。従つて、もしこれらの認識
部位のいずれかを含むDNAが各々、Bag IIまたはBam HI
で切断されるならば各の場合において−GATC−「粘着性
末端」が形成し、この両端は結合可能である（しかし、
もはやBgl IIまたはBag HIのいずれによる開裂にも付
されない）。
新たなプラスミドpDP250A、pDP250Bを第11C図及び第11D
図に示されるようにpDP120のBam HIによる部分開裂と
そのようにして得られた「粘着性末端」とを肝炎ウイル
スゲノムのBgl IIフラグメントの対応する「粘着性末
端」と結合することによつて形成した。
公知のようにBam HI開裂pDP120の再環化は開裂プラス
ミドをアルカリ性フオフアターゼで処理することによつ
て阻害することができる。この酵素はpDP120の直鎖状DN
Aの５′−開裂末端から末端リン酸基を除去するもので
ある。このリン酸基の除去によりpDP120の再環化反応は
阻害されるが直鎖状pDP120DNAの３′−OH末端とBgl II
フラグメント上に存在する５′−フオスフエート末端と
の反応を邪魔することはない。そして引きつづく環化に
よりpDP250AやpDP250Bのようなプラスミドを生成する。
従つて、後者のテトラサイクリン耐性プラスミドの形成
する確率は上述のアルカリ性フオスフアターゼ処理で増
加させることができる。
究極的にはプラスミドpDP250A及びpDP250BはXho Iを使
用する制限分析により特定し配向を決定することができ
る。
第11D及び第11E図に示されているようにウイルス変異株
VP11及びV12は各々プラスミドpDP250B及びpDP250Aから
これらのプラスミドをVTK-79ワクチニアウイルスで生体
内組換することにより形成することができる。交差及び
組換はこれらのプラスミド中に存在するワクチニアＦ−
フラグメントの長い及び短い「腕」中でおこる。pBR322
から由来するプラスミドのその部分は、ウイルスには取
り込まれない。
第12A図は公知のまた第11B図に既に示されているpTHBV1
プラスミドの構造を示す。この図に示されているように
プラスミドを制限酵素Hha Iで処理すると二つの同一の
フラグメントが得られる。このフラグメントは、細胞表
面抗原を指定し、かつ前細胞表面抗原領域を有さないプ
ラスミド中に含まれるHBVゲノムの領域のみを含む。
（事実、pTHBV1中には多くのHha I制限サイトがあり、
また多くのフラグメントがこの制限酵素による消化によ
つて生じる。しかし、議論している興味のあるフラグメ
ントは得られる多くのフラグメントの最大の物であり、
この事実により容易に単離することができる。）このHh
a Iフラグメントの直線状DNA地図は第12A図に示されて
おり配向の目的でBam HIサイトを示してある。
もし、第12A図のHha Iフラグメントをまず第一にT4DNA
ポリメラーゼで処理し、Hind IIIリンカーをT4DNAリガ
ーゼと共に添加するとフラグメントはHind IIIの粘着性
末端を有するものとして得られる。公知のようにT4DNA
ポリマラーゼは３′から５′方向へのエクソヌクレアー
ゼ活性を有するだけでなく、５′から３′方向へのポリ
メラーゼ活性を有する。この２つの対立する活性は平衡
状態に達するまで第12A図に示されるようなHha Iフラグ
メントの３′−OH末端の「チユーイングオフ（chewing
off）」を生じさせ、ブラント（blunt）（太くて短
い）末端のDNAフラグメントが形成する。このブラント
末端フラグメントは公知のようにHind IIIリンカーで処
理することができる。このリンカーは本質的にHind III
に対する認識シークエンスを含むデカヌクレオチドであ
る。
第12B図の地図に示されているように、得られたフラグ
メントは、Hind IIIの粘着性末端を有し、第12B図に示
されるように、後者のプラスミドをHind III及びT4DNA
リガーゼによる処理により、pBR322中に導入することが
できる。第12C図において特定されるように、特定され
ている得られたプラスミドはpDP252と名づける。
最後に、第12D図に示されているようにこのプラスミド
は、生体内組換によりワクチニア変異株VP8中に導入さ
れ新しいワクチニア変異株VP13（ATCC No.2047）を生
成する。VP13によるHBV遺伝子の表現は検知することが
できなかつた。
第13A図乃至第13C図はさらに２つのウイルス変異株VP16
（ATCC No.VR 2050）及びVP14（ATCC No.VR2048）の
生成を示し、各々、ヘルペス糖タンパクgA＋gBの生成を
指定するヘルペスウイルスタイプＩのDNAシークエンス
を含む。
特により詳細に述べれば第13A図はヘルペスウイルスタ
イプＩすなわち、株KOS〔リトル（Little）ら、Virolog
y112,686−702（1981）〕のEco RIフラグメントＦの地
図を示す。この図から明らかなように、このDNAシーク
エンスはそのシークエンス内に多くのBam HIサイト
（Ｂとして示す）を含む。このシークエンスはEco RI
フラグメントにおいて隣接するBam HIサイト間の長さ
が最大のBam HIフラグメントを代表する領域5.1mdのDN
A領域を含む。
さらに第13A図を参照すればこのEco RIフラグメントは
Eco RI及びT4DNAリガーゼによる処理によつてpBR322中
に導入され２つの新しいプラスミドを生成する。このプ
ラスミドは各々pBL520A及び520Bとして特定され、また
これらのプラスミドはその中のEco RIフラグメントの
配向において異つている。（方向を示すために使われる
Hpa Iサイトによつて示されている）。
最後に、第13C図に示されているように、これらのプラ
スミドは第10図及び第12図において議論したものと同様
の生体内組換及び各々ワクチニア変異株VP16及びVP14の
製造により（pBR322ゲノムを含む）ワクチニアウイルス
変異株VP7に導入される。
従つて、これは（ワクチニアＦ−フラグメントのDNAシ
ークエンスよりもむしろ）pBR322DNAシークエンスを使
用しワクチニアウイルス変異株を生成するための生体内
組換えを行うさらに別の実施例である。また、この方法
によつて得られたワクチニア変異株VP16及び14はワクチ
ニアウイルスのゲノム中に取り込ませようとする外来DN
Aの２万塩基対よりも多く含むという点で興味深い。こ
れはワクチニアに外来DNAを挿入するための最少の上限
を示すものである。
第14A図乃至第14C図はさらに別のウイルス変異株VP17及
びVP18の生成を示すものである。このウイルスにはヘル
ペスウイルスタイプＩ（株KOS）Eco RIフラグメントＦ
のBam HIセグメントを導入する。このEco RIフラグメ
ントＦは5.1メガダルトンのBam RIフラグメントＧを含
むものとして第13A図に示されている。
第14A図はこのBam HIフラグメントを示し、このフラグ
メント内には非対称でかつ配向のために使用される２つ
のSst Iサイトの位置が示されている。
ヘルペス糖タンパクgA＋gB〔デ・ルカ（De Luca）ら、
ibidを参照〕の生成を指定するヘルペスウイルスのこの
Bam HIセグメントはさらに第14A図に示されるようにBa
m HI及びT4DNAリガーゼによる部分消化によつてpDP120
中に導入される（第7C図参照）。
第14B図に示されるように、新しい２つのプラスミドpBL
522A及びpBL522Bが各々分子量11.6メガダルトンを有
し、かつ２つの異なる配向の１つにおいてヘルペスウイ
ルスゲノムのBam HIフラグメントＧを含む。
最後に第14C図に示されるようにこれらのプラスミド
は、VTK-79中に生体内組換により導入されワクチニア変
異株VP17（ATCC No.2051）及びVP18（ATCC No.VR205
2）を生成する。変異株VP17及び18によるヘルペス糖タ
ンパク遺伝子の表現は決定されていない。
第15A図乃至第15F図はさらに別のワクチニア変異株VP22
（ATCC No.VR2054）の製造を示すものでこのVP22にお
いては外来DNAが、ここで示した他のワクチニア変異株
の製造に使用したＦフラグメントと異なる非本質的領域
中のフラグメントゲノムに存在している。
さらに詳細に述べれば、第15A図はワクチニアウイルス
Ｌ−変異株ゲノムのAva I Hフラグメントを示す。第6A
図に示されるように、このAva Iフラグメントは全体が
Ｓ−変異株から欠失した部分内に存在し、従つてウイル
スの生存にとつて非本質的であることがわかつている。
第15A図に示されるように、このAva1HフラグメントはHi
nd III開裂pBR322プラスミドと結合されて、新しいプラ
スミドpDP202を形成する（第15B図参照）。この結合はT
4DNAポリメラーゼを使用してワクチニアのAva I Hフラ
グメントとHind III開裂pBRプラスミドの末端を「ブラ
ントエンデイング」することにより達成することができ
る。このブラント末端DNAシークエンスをT4DNAリガーゼ
の存在下で結合すると、pDP202が形成される。
第15B図にさらに示唆されているように、新しいプラス
ミドpDP202はヘルペスBgl/Bam TKフラグメントと結合
される。この後者のフラグメントはBal IIによる処理で
ヘルペスBam TK DNAフラグメント（第3B図参照）から
得られる。このBal IIによる処理によりBam TKフラグ
メント内に含まれる内生のヘルペスプロモーター部分を
除去する。
すでに記載したようにBal II及びBam HIがこれで処理
したDNA上に同じ「粘着末端」を形成するので得られた
ヘルペスBgl/Bam TKフラグメントがpDP202内のBamサイ
ト中に挿入することができる。
第15C図に示唆されるように、かかる挿入はBam HIによ
る部分消化及びT4DNAリガーゼによる処理によつて行な
うことができる。
pDP202中に存在するワクチニアのＨ−フラグメントは３
つのBam HIサイトを含むので、６つのプラスミドのす
べてがこの領域における挿入により製造することができ
る。即ち、ヘルペスBgl/Bam TK DNAシークエンスの各
々のサイトにおける配向に従つて３つのBam HIサイト
の各々に対し、２種類の変異株を挿入することによつて
得ることができる。後者の配向はそのフラグメントのBa
l II末端の近くにある非対称性Sst1サイトの存在によつ
て認識することができる。
第15C図に示されるように、２つのプラスミド、pDP202T
K/A及びpDP202TK/Dを、ヘルペスBgl/Bam TKフラグメン
トをpDP202中に存在するワクチニアのＨ−フラグメント
内に存在する３つのBam HIサイトの１番目に挿入する
時に得ることができる。同様に２つの他のプラスミドpD
P202TK/E及び/CはBgl/Bam DNAシークエンスを３つの使
用できるサイトの２番目に挿入することによつて得るこ
とができる。最後に、さらに２つのプラスミドpDP202TK
/B及び/FはBgl/Bamフラグメントを第３番目のBam HIサ
イト中の２つの可能な配向の各々に挿入する時に得るこ
とができる。
このプラスミドは、第15D図に詳細に示されており、Bgl
/Bamフラグメントの配向が示されている。
このプラスミドは生体内組換によりVTK-79Lのゲノム中
に取り込ませることができる。第15E図は、このワクチ
ニアゲノムの左側部分のAva Iの地図である。VP22のゲ
ノムである変異株ゲノムの地図が第15Fに示されてい
る。
このワクチニア変異株はBam TKフラグメントがワクチ
ニアのＦ−フラグメント内に存在する変異株VP2、VP4及
びVP6よりもTKの発現が非常に高いので、特に興味深
い。さらにVP22は、外来DNAをここで報告する他のワク
チニア変異株の構造のために便宜上使用したＦ−フラグ
メントとは別のワクチニアゲノムの非本質的部分に導入
することを示す。
最後にヘルペスウイルスの調節シークエンスのすべては
Bgl/BamヘルペスウイルスDNAシークエンスからBal IIの
処理によつてすでに述べたように欠失するのでVP22ワク
チニア変異株は結論的にこの組換ウイルス内における転
写がワクチニアゲノム内の調節信号によつて開始される
ことを示す。
本発明をよりよく理解し、また本発明の利点を示すため
に実施例に従つてさらに本発明を説明する。ここで示さ
れるパーセンテージは特に示さない限り重量％である。
実施例 Ｉ アガロースゲルからのワクチニアHind IIIフラグメント
の単離 制限エンドヌクレアーゼHind IIIをベーリンガー・マン
ハイム・コープより買い入れた。DNAの予備分解は10ミ
リモル（mM）のトリス（Tris）−HCl（pH7.6）、50mM・
NaCl、10mM MgCl2、14mMジチオトレイトール（dithiot
hreitol）（DTT）及び10乃至20マイクログラム（μｇ）
のワクチニアDNA及び20乃至40単位のHind III（１単位
は１μｇのラムダーDNAを30分以内に完全に開裂するに
十分な酵素の量を示す）が存在している牛血清アルブミ
ン（BSA）の10μg/mlを含むHind III緩衝液の0.6ml中で
行なつた。
ワクチニアDNAを以下のようにビリオン（Viron）より抽
出しそして精製した。精製ビリオンは10mMトリス−HCl
（pH7.8）、50mMベータメルカプトエタノール、100mM
NaCl、10mM Na3EDTA、１％サルコシル（Sarkosyl）NL
−97及び26％の庶糖において260ナノメーター（A260）
で測定したときの1mlあたりの光学濃度が50である濃度
において溶菌した。プロテイナーゼＫを１夜370℃で培
養した溶解物の100μg/ml（以下μg/mlはμｇ及びmlで
記載する）に添加した。DNAはフエノール−クロロホル
ム（1:1）の等量を添加することにより抽出した。有機
層を除去し、水性層を中間層が透明となるまで再抽出し
た。クロロホルムによる２度の付加的な抽出を行ない水
性層を0.1mMのNa3EDTAを含む10mMトリス−HCl（pH7.4）
に対し強く４℃で強く透析を行なつた。DNAをフイコー
ル（Ficoll）（これは庶糖とエピクロルヒドリンの合成
高分子コポリマーである）により約100μg/mlまで濃縮
した。
DNAの分解は37℃で４時間行なつた。
反応は10分間65℃に加熱し次に2.5％のアガロース、40
％のグリセロール、５％のナトリウムドデシルサルフエ
ート（SDS）、及び0.25％のブロモフエノールブル（BP
B）を含む水性停止溶液を添加することにより停止させ
た。サンプルは65℃でアガロースゲル上に層を形成させ
電気泳動を行う前に硬化させた。
電気泳動は36mMトリス−HCl（pH7.8）、30mM NaH2P
O4、及び1mM EDTAを含む電気泳動緩衝液において0.8％
のアガロースゲル（0.3×14.5×30cm）中で行つた。電
気泳動は50ボルトで42時間、４℃で行つた。このゲルを
エチジウムブロミド（電気泳動緩衝液中１μg/ml）で染
色した。制限フラグメントを紫外線（UV）光で可視化さ
せそして個々のフラグメントをゲルから切断した。
フラグメントはフオーゲルシユタイン（Vogelstein）ら
のProc.Natl.Acad.Sci.USA76,615−619（1979）の操作
に従い以下のようにガラス粉を使用してアガロースゲル
から分離した。DNAフラグメントを含むアガロースゲル
をNaIの飽和水溶液2.0ml中に溶解した。計算上DNAのμ
ｇ当り10mgのガラス粉を添加した。溶液を夜間25℃で回
転させ、DNAをガラス粉と結合させた。DNA−ガラス粉は
５分間2000rpmで遠心処理により収集した。このDNA−ガ
ラスは次に70％NaIの5mlで洗浄した。このDNA−ガラス
は再び遠心処理により収集し、そして50％緩衝液〔20mM
のトリス−HCl（pH7.2）、200mM NaCl、2mM EDTA〕と
50％エタノールとの混合液で洗浄した。このDNA−ガラ
スを再び遠心処理により収集し、そして20mMのトリス−
HCl（pH7.2）、200mM NaCl及び2mMのEDTAから成る溶液
の0.5ml中に温和に懸濁させた。このDNAを30分間培養す
ることにより、30℃でガラス粉より溶出させた。このガ
ラスを次に15分間10,000rpmで遠心処理により除去し
た。DNAをエタノール析出により上澄液から回収し、そ
して1mMのEDTAを含む10mMのトリス−HCl（pH7.2）中で
溶解させた。
このようにして単離したＦ−フラグメントを以下の実施
例に使用した。
実施例 II ワクチニアHind III F−フラグメントをpBR322のHind I
IIサイトに挿入する（pDP3の構成）〔pBR322−ワクチニ
アHind III〕 ワクチニアHind III F−フラグメントを実施例Ｉで述べ
た予備アガロースゲルから単離した。このフラグメント
を以下のようにpBR322のHind IIIサイト中に挿入した
〔ボリバー（Bolivar）らのGene,２,95−113（197
7）〕。
pBR322の約200ナノグラム（ng）を37℃１時間１単位の
酵素を使用して10mMのトリス−HCl（pH7.6）、50mMのNa
Cl、10mMのMgCl2及び14mMのDTT〔Hind III緩衝物質〕中
のHind IIIで開裂させた。反応は65℃に10分間で加熱す
ることにより停止させた。単離したHind IIIワクチニア
Ｆ−フラグメントの50ngを添加するとDNAが30分間で−7
0℃のエタロール２体積と共析出した。このDNAを70％水
性エタノールで洗浄し、次に乾燥しそして50mMのトリス
−HCl（pH7.6）、10mMのMgCl2、10mMのDTT、及び1mMの
アデノシントリフオスフエート（ATP）を含む結紮緩衝
物質中に再懸濁させた。約100単位のT4DNAリガーゼ〔ニ
ユー・イングランド・バイオラブズ（New England Bi
olabs）〕を添加し得られた混合物を10℃で一夜培養し
た。このリガーゼで処理したDNAを使用してE.coli HB1
01を形質転換させた〔ボイヤー（Boyer）らのJ.Mol.Bio
l.41459−472（1969）〕。
実施例 III 大腸菌の形質転換及び組換プラスミドの選択 コンピテント菌を調製しダガート（Dagert）らのGene
６,23−28（1979）に記載された方法に従つてプラスミ
ドで形質転換を行つた。大腸菌HB101の細菌は50mlのLB
流体培養基〔１％のバクト−トリプトン（bacto−trypt
one）、0.5％のバクト−イースト抽出物（bacto−yeast
extract）、及び0.2％のグルコースで補充された0.5
％のNaCl〕を細胞の一昼夜培養したものの0.3mlで培養
し、次にそれらを培養基がスペクトロフオトメータで測
定したときに650ナノメータ（A650）における光学密度
（吸光度）が0.2となるように37℃で成長させることに
より、被感染性とした。この細胞を次に10分間氷で冷却
し、遠心によりペレツト化し、冷い0.1モル（Ｍ）CaCl2
の20ml中に再懸濁し、20分間氷上で培養した。細胞を次
にペレツト化し冷い0.1MのCaCl2の0.5ml中に再懸濁し、
そして24時間４℃で保持した。細胞は結合DNA（結合緩
衝物質の0.01から0.02ml中に0.2から0.5mg）をコンピテ
ント菌（0.1ml）に転化することにより形質転換させ
た。細胞を次に10分間氷上で、そして５分間37℃で培養
した。LB流体培養基の2.0mlを細胞に転化し、振動を与
えながら１時間37℃で培養した。10マイクロリツトル
（μ）又は100μのアリコートを100μ/mlの濃度
でアンピシリン（ampicillin）（Amp）を含みLB寒天平
板上に広げた。
形質転換した細菌は、アンピシリン耐性（AmpR）コロニ
ーを15μg/mlでテトラサイクリン（Tet）を含むLB寒天
上に移すことにより、組換プラスミド用としてふるいに
かけた。AmpR及びテトラサイクリン感受性（TepS）のい
ずれでもあるこれらのコロニー（約１％）をホルムス
（Holmes）らのAnal.Bioch.114,193−197（1981）の操
作に従つてpBR322に挿入されるそのままのワクチニアHi
nd III F−フラグメント用としてふるいにかけた。形質
転換したE.coliの2.0ml培養菌を37℃で一夜成長させ
た。細菌は遠心分離によりペレツト化し、次に８％の庶
糖、５％のトリトンＸ−100、50mMのEDTA、及び50mMの
トリス−HCl（pH8.0）の溶液105μ中に懸濁し、次に
リゾチーム〔ウオ−シントン バイオケミカルズ（Wort
hington Biochemicals）〕の新鮮な溶液7.5μ〔50mM
トリス−HCl（pH8.0）中に10mg/ml〕を添加した。溶菌
体は１分間沸湯水槽中に置き、次に15分間10,000rpmで
遠心分離した。上澄み液を除去した。プラスミドDNAは
等量のイソプロパノールで析出した。このプラスミドを
Hind III緩衝液40μ中で再懸濁し、２時間Hind IIIの
一単位で分解した。得られた分解物は適当なHind III F
−フラグメント用の1.0％分析アガロースゲル上で分析
を行つた。そのままのHind III F−フラグメントを含む
かかる組換プラスミド（pDP3と名付ける）を更に変異化
するために使用した（第3B図参照）。
実施例 IV pDP3の予備単離 プラスミドDNAの大規模な単離及び精製をクルーエル（C
lewel）らのProc.Natl.Acad.Sci.USA62,1159−1166（19
69）の変異化操作によつて行つた。500mlのLB流体培養
基をpDP3を含む大腸菌HB101の一夜培養基1.0mlで培養し
た。約0.6の光学密度（A600）において、クロラムフエ
ニコールを添加して（100μg/ml）プラスミドの成長を
増幅させた〔クローエル、J.Bacteriol.110667−676（1
972）〕。細菌を更に12乃至16時間37℃で培養した。こ
の時それらの細菌を５分間5000rpmによる遠心分離によ
り収集し、一旦TEN緩衝液〔0.1mMトリス−HCl（pH8.
0）、150mM NaCl、10mM EDTA〕の100mlで一旦洗浄
し、遠心処理により収集し、そして庶糖の0.05Mトリス
−HCl（pH8.0）の25％水溶液14ml中に再懸濁した。4.0m
lのリゾチーム溶液〔0.25Mトリス−HCl（pH8.0）中の5m
g/ml〕を添加し、混合物を30分間、室温で培養し、次に
0.25M EDTA（pH8.0）の4.0mlを添加した。混合液は10
分間氷上に置いた。膵臓のアールエヌアーゼ（RNase）
Ａ（ジグマ・ケミカル・カンパニー）〔0.25Mトリス−H
Cl（pH8.0）中の1mg/ml〕の2.0mlをこの混合物に添加
し、これを次に室温で１分間培養した。細胞を溶菌トリ
トン溶液〔１％のトリトンＸ−100、0.05MのEDTA、0.05
Mのトリス−HCl（pH8.0）〕の26mlを添加することによ
り、溶菌した。この混合物を室温で30乃至60分間培養し
た。溶菌体を４℃30分間、17000rpmの遠心処理により清
澄化した。上澄液を除去しプラスミドDNAを染色体DNAか
らダイ−ブイアント（dye−bouyant）CsCl勾配上で分離
した。
この目的のためにCsCl−エチジウムブロミド勾配を、22
gのCsClを23.7mlの清澄化した溶菌体に溶解することに
より調製した。1.125mlの水溶液エチジウムブロミド（1
0mg/ml）をこの溶液に添加した。混合物は48乃至72時間
44,000rpmにおいてベツクマン60Tiロータ中のポリアロ
マー管内で遠心分離を行つた。この勾配におけるDNAの
得られたバンドは紫外光により可視化され、低い方のバ
ンド（共有結合で閉じたプラスミドDNA）を注射器につ
けられた18ゲージの針により、管に穴を開けるとにより
除去した。エチジウムブロミドをクロロホルムイソアル
ミアルコール（24:1）の体積で繰返し抽出することによ
りプラスミドから除去した。プラスミドは次に0.1mMのE
DTAを含む10mMのトリス−HCl（pH7.4）に対し強く透析
し、CsClを除去した。プラスミドDNAを次にエタノール
析出により濃縮した。
実施例 Ｖ pBR322/ワクチニア／ヘルペス ウイルスTK組変えプラ
スミドの調整 第3B図及び第3C図は、Bam HSV TKフラグメントをＳ又
はＬ−変異株ワクチニア中に挿入するために使用する組
返プラスミドの形成に含まれる工程を要約したものであ
る。ほぼ15μｇの共有結合で閉環されているpDP3をBam
HI〔ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda
Research Laboratories）〕で部分分解し、そしてBa
m HIの７単位を使用して、20mMトリス−HCl（pH8.
0）、7mM MgCl2、100mM NaCl、及び2mMベータメルカ
プトエタノールから成るBam HI緩衝液中で10分間37℃
で培養することにより開裂した。pBR322及びワクチニア
Hind III FはそれぞれBam HIサイトを有するので、部
分開裂により、pBR322又はワクチニアBam HIサイトの
いずれかで切断された直線状プラスミドの混合物が得ら
れる。これらの混合直線状プラスミドはアガロースゲル
における電気泳動によりpBR322及びワクチニアBam HI
サイトの両方で切断されたpDP3のフラグメントから分離
され、１カ所で切断された直線状プラスミドを実施例Ｉ
で述べたようなガラス粉末を使用して単離した。
コルベール−ガラピンらのProc.Natl.Acad.Sci.USA76,3
755−3759（1979）に記載されているように、HSV TKを
指定する2.3メガダルトン（megadalton）（md）のHSV
Bam HIフラグメントを含む組変えpBR322をBam HIで完
全に分解し、2.3mdのBam TKフラグメントを上述のアガ
ロースゲルから単離した。
pDP3Bam TK組換プラスミドは約１μｇのBam HIで直線
化したpDP3を約0.2μｇの単離したBam TKフラグメント
とT4DNAリガーゼを100単位含む結合緩衝液20μ中で10
℃夜間の間に結合することにより調製した。この結合混
合物は実施例IIIで述べたように被感染性大腸菌HB101細
胞を形質転換するために使用した。
実施例 VI HSV TK挿入物を有する組換プラスミドを含む形質転換
細胞の特定のためのそれら細胞のふるい分け 組換プラスミドを含む形質転換細胞をハナハン（Hanaha
n）らのGene10,63−67（1980）に記載されているような
コロニーの雑種形成により、HSV TK挿入物のためにふ
るい分けを行つた。
第１の組のニトロセルロース・フイルター〔シユレイシ
ヤー（Schleicher）及びシユール（Schull）BA85〕を10
0μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天で充填したペトリ
シヤーレ上に置いた。形質転換細胞をこれらのフイルタ
ー上に広げ、シヤーレを一昼夜30℃で、又はコロニーが
漸く見えるようになるまで培養した。第一の組のフイル
ターのそれぞれのレプリカニトロセルロースフイルター
を殺菌したニトロセルロースフイルターを上記の元のフ
イルターのそれぞれの上に設置してこれら二つのフイル
ターをしつかりと圧着することにより、調製した。フイ
ルターの各組を殺菌した外科用ナイフで刻み目をつけ分
離し、そして各フイルターを４乃至６時間100μg/mlの
濃度のアンピシリンを含む新鮮なLB寒天平板に移した。
第一の組のフイルター（オリジナル フイルター）をク
ロラムフエニコール200μg/ml含むLB寒天平板上に置
き、プラスミドの生成を増幅した。レプリカのフイルタ
ーを４℃で貯蔵した。
クロラムフエニコール上24時間経過後、オリジナル ニ
トロセルロース フイルターを以下のように、雑種形成
のために調製した。各ニトロセルロースフイルターを、
５分間0.5N NaOHで飽和した１枚のフアツトマン（What
man）ロ紙上に置き、３分間乾燥したロ紙で吸取り、次
に５分間NaOH飽和ロ紙上に再び戻し、その上の細菌を溶
菌し、そしてそのDNAを変性した。この一連の操作を1.0
Mトリス−HCl（pH8.0）で飽和したフアツトマンロ紙を
使用して繰返し、そして中和のために1.5MのNaClを含む
1.0Mのトリス−HCl（pH8.0）で飽和したロ紙を使用して
三度繰返した。このように処理したニトロセルロース
フイルターを空気乾燥し、80℃２時間真空中で焼いた。
雑種形成化の前にこれらのニトロセルロースフイルター
は、６×SSC〔１×SSC＝0.15M NaCl＋0.015M Naシト
レート（pH7.2）〕、１×デンハート（Denharts）〔１
×デンハート＝フイコール、BSA及びポリビニルピロリ
ドンをそれぞれ0.2％含む溶液〕、変性し剪断したさけ
の精子DNA100乃至200μｇ（S.S.DNA）/ml、1mMのEDTA及
び0.1％SDSの水溶性混合物である予備雑種形成緩衝液60
℃で培養することにより、６〜８時間処理した。この処
理によりフイルターと次にこのフイルターに適用される
非雑種化試験用DNAとの間の結合の量を低下させる。
HSV TK挿入物を含む組換プラスミドのためのふるい分
けを行うために、オリジナルの処理したニトロセルロー
ス フイルターに付着している形質転換コロニーを、２
×SSC（pH7.2）、１×デンハート・ソリユーシヨン、50
μｇのS.S.DNA/ml、1mMのEDTA、0.1％のSDS、10％のデ
キストランサルフエート、及び雑種形成プローブとして
の32P Bam TKを含む雑種形成緩衝液中にそれらのフイ
ルターを浸漬することにより32PでラベルしたBam HSV
TKフラグメントで雑種化した。溶液の放射能のレベル
はおよそ1mlあたり１分間に100,000カウント（cpm）で
あつた。
雑種形成は18乃至24時間にわたつて60℃で行うことがで
きる〔ワール（Wahl）らのproc.Natl.Acad.Sci.USA7636
83−3687（1979）〕。
雑種形成プローブを調製するために、2.3md Bam TKフ
ラグメントをリグビ（Rigby）らのJ.Mol.Biol.113,237
−251（1977）の方法に従つて切断（nick）翻訳により
ラベルした。詳細に述べれば、50mMのトリス−HCl（pH
7.6）、5mM MgCl2、20μＭデオキシシチジン トリフ
オスフエート（dCTP）、20μＭのデオキシアデノシン
トリフオスフエート（dATP）、20μＭのデオキシグアノ
シントリフオスフエート（dGTP）、２μＭ（アルフアー
32p）デオキシチミジン トリフオスフエート（dTTP）
（410キユーリ/mmol）〔アマーシヤム・コーポレーシヨ
ン（Amersham Corporation）〕。1ngのDNアーゼ（DNas
e）I,100単位のDNAポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム）及び１μｇのBam TKフラグメントを含む反
応混合液0.1mlを調整した。この反応混合液を２時間14
℃で培養した。反応は、50μｌの0.5モルEDTAを添加し
そして10分間65℃に加熱することにより停止させた。と
りこまれていないトリフオスフエートをセフアデツクス
G50上で反応混合物をゲルろ化することにより除去し
た。〕 雑種形成の後、過剰のプローグを室温で0.1％のSDSを含
む２×SSC（PH7.2）中で５度、次に60℃で0.1％のSDSを
含む0.2×SSC（pH7.2）で３度、それぞれの洗浄時間を3
0分として行うことによりニトロセルロースフイルター
から除去した。洗浄したフイルターを空気乾燥し、クロ
ネツクスライトニング（Cronex Lightening）及び増幅
のための補力スクリーン（デユポン）を使用して６乃至
18時間−70℃でＸ線フイルム（コダツクのＸ−オマート
Ｒ）を曝露するために使用した。
曝露し、そして現像したＸ線フイルムをどのコロニーが
pBR322ワクチニアBam HSV TK組換型プラスミドを含む
かを決定するために使用した。Ｘ線フイルムを露光させ
るこれらのコロニーは、対応するレプリカニトロセルロ
ースフイルター上に位置していた。かかる陽性のコロニ
ーは、さらに分析のためにレプリカフイルターから取り
出される。このようにしてふるい分けした約1000のコロ
ニーのうち65のコロニーがpDP3内にBam TK挿入物を含
むものとして試験的に特定することができた。
実施例 VII Bam HSV TKを含む組換型プラスミドの制限分析 Bam HSV TK挿入物を有する組換型プラスミドを含むも
のとして実験的に特定したこれら65のコロニーのそれぞ
れは100μg/mlのアンピシリンを含むLB流動培養器の培
養菌2.0mlを培養するために使用した。培養器は次に37
℃で一夜培養した。これらのプラスミドを実施例３に述
べたように各培養器から抽出した。これらのプラスミド
をイソプロパノールの析出の後50μの水に溶解した。
これらのプラスミドが完全な2.3mdのBam HSV TKフラ
グメントを有するかどうか、及びpDP3の中のどのBam H
IサイトにBam HSV TKが挿入されるかを決めるために2
5μの各プラスミド調製体を25μの２×Hind III緩
衝物質と混合し、そして１単位のHind IIIで２時間37℃
で分解した。得られたフラグメントをすでに述べたよう
に1.0％アガロースゲル状で電気泳動することにより分
析した。
分析した65のプラスミド調製物のうち６つはプラスミド
のワクチニアHind III F部分に存在するBam HIサイト
に挿入されたBam HSV TKフラグメントを有することが
分つた。すなわち、これらは直線上pBR322（2.8md）に
対応する分子量のHind III制限フラグメント及びワクチ
ニアHind III フラグメント（8.6md）の分子量よりも大
きいフラグメントを与えた。
これら６つのプラスミドをさらにSet I〔Sac Iのイソシ
ゾーマー（isoschizomer）〕で分析し、ワクチニアHind
III F−フラグメント内に挿入されたBam HSV TKフラ
グメントの数及び配向を決定した。これは、Set I（Sac
I）がBam HSV TKフラグメント及びワクチニアHind I
II Fフラグメントを非対称的に開裂するからである。分
析は25μのプラスミドと25μの２×Sst緩衝物質〔5
0mMのトリス−HCl（pH8.0）、10mMのMgCl2、100mMのNaC
l及び10mMのDTT〕と混合し、そして１単位のSst I（ベ
セスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）で37℃２時間分解
した。得られたフラグメントを１％アガロースゲル上で
電気泳動により分析した。分析した６つのプラスミドの
うち５つは単一のBam HSV TK挿入物を示す10.1md及び
3.5mdの分子量の２つのSst Iフラグメントを与えた。こ
れらのプラスミドのひとつはさらに研究に付するために
選択し、pDP132と命名した。他のプラスミドは、分子量
10.8md、2.8md及び2.3mdを有し、pDP132と比較して反対
方向に縦二列で頭−尾の配向で挿入されたBam HSV TK
挿入物を示す３つのSst Iフラグメントを与えた。この
プラスミドをpDP137と命名した。これらのプラスミドpD
P132及びpDP137は第3C図に図解されている。
実施例 VIII TK-S−変異株ワクチニアウイルスの単離 TK-S−変異株ワクチニアウイルス変異株を単離するため
にウイルス集団を、ウイルスをTK遺伝子を有する生物に
とつて致命的であるBUdRの存在下で細胞中において成長
させることによりかかる変異株に対する強い選択的圧力
にさらした。詳しく述べれば、150mmのペトリシヤーレ
中のイーグルススペシヤル培地（Eagle′ｓ Special
Medium）中で成長するTK-人間（系143）細胞の融合性モ
ノレヤーを20μｇのBUdR/mlの存在下でシヤーレ（20シ
ヤーレ使用）あたりのＳ−変異株ワクチニアウイルスの
約３×103溶菌斑形成単位（pfu）で感染させた。〔イー
グルススペシヤル培地はほとんどの細胞系の成長のため
の市販の栄養媒体である。イーグルスミニマムエツセン
シヤル培地（Eagle′sMiimum Essential Medium）、
ベーサルイーグルス培地（Basal Eagle′ｓ Mediu
m）、ハムス（Ham′ｓ）−F10、培地（Medium）199、RP
MI−1640等の、他の培地も使うことができる。〕成長は
二酸化炭素の豊富な大気中37℃で行う。これは約５％の
CO2含有量を有するようなCO2で付加した空気を与えるCO
2培養器を使用することにより便宜上行われる。
広がつた93の溶菌斑は単離され、そして再び前述の条件
下でまた20μｇのBUdR/mlの存在下でTK-人間（系143）
細胞上で再び溶菌斑を行つた。大きなよく単離された溶
菌斑の数（５）はさらに分析のためにとりあげた。
５つの溶菌斑単離体は、すでに前述の同じ条件下で及び
20μｇのBUdR/mlの存在下又は不存在下で細胞モノレヤ
ー上で成長させるための試験を行つた。BUdRの存在下及
び不存在下での各溶菌斑の相対的成長は記録され、そし
て親のＳ−変異株ウイルスの類似のモノレヤー培層培養
器での相対的成長と比較される。以下にその結果を示
す。
溶菌斑単離物＃79の成長はさらに0,20及び40μｇのBUdR
/mlの存在下で記録し、その親のＳ−変異株ウイルの成
長と比較した。以下に結果を示す。
さらに上記５つの溶菌斑単離物及びＳ−変異株の親をMT
AGGの存在下でのTK-人間（系143）細胞における成長に
対し記録した。MTAGGは以下の物質の存在下において変
異化されたイーグルススペシヤル培地である： ８×10-7M メトトレキセート（methotrexate） 1.6×10-5M チミジン ５×10-5M アデノシン ５×10-5M グアノシン １×10-4M グリシン （デイビス等の前掲書を参照）及びチミジンキナーゼに
対して選択され、そしてチミジンキナーゼ遺伝子を有さ
ない生物に対して不利なものである。かかる実験の結果
を以下に示す： MTAGGの存在下において成長を完全に阻害することを示
す３つの溶菌斑単離体のうち単離体＃79は任意に選択さ
れこの＃79ウイルスで感染した細胞からの抽出物をトリ
チウム化した（3H）チミジンをフオスフオリル化する抽
出物の能力に関して未感染細胞及びＳ−変異株親ウイル
スで感染した細胞からの抽出物とを比較した。結果を以
下の表に示す： （１）BUdRに対する耐性、（２）MTAGGを含む培地にお
ける成長の阻害、及び（３）感染細胞抽出物におけるチ
ミジンの重要なホスホリル化を特定できなかつたことか
らかんがみて、溶菌斑単離体＃79はチミジンキナーゼ活
性を欠くと考えられる。この単離体をVTK-79と呼ぶ。
実施例 IX Ｓ−変異株によるＬ−変異株ワクチニアDNAのマーカー
救済 Ｓ−変異株DNAの４つの標本をマーカー救済の研究のた
めに調整した。第１の標本は、精製した完全なＬ−変異
株ワクチニアDNAから成つている。第２の標本は、制限
エンドヌクレアーゼであるBst E IIで分解されたＬ−
変異株ワクチニアDNAから成り、この制限酵素はＳ−変
異株にはなく、かつＬ−変異株に固有に存在し、またDN
A鎖の両端にＳ−変異株中の対応するシークエンスに相
同なDNAの領域を含むフラグメントＣである供与体DNAフ
ラグメントを生成する。第３及び第４の標本はそれぞれ
Ava I及びHind IIIによつて分解されたＬ−変異株DNAか
ら成つており、この制限エンドヌクレアーゼは特有のＬ
−変異株DNAシークエンス内にあるワクチニアゲノムを
開裂する。これらの４つの標本によつて行なつたマーカ
ー救済の研究によつて、Ｓ−変異株にはない欠失部分を
有するこれらのＬ−変異株DNAフラグメントが、もし、
このフラグメントが欠失領域とともにＳ−変異株中の対
応するシークエンスと相同な末端領域を有するならば、
生体内組換技術により、Ｓ−変異株中に再導入すること
ができる。
これらの研究で使用するフラグメントをより良く理解す
るために、第6A図乃至第6C図を参照されたい。これらの
各図はワクチニアゲノムの左側の末端の部分の制限地図
を示している。詳しく述べれば、各地図は、図に示され
ているように、約60キロ塩基対を含むゲノムの左側末端
領域に関するものである。Ｓ−変異株から欠失したワク
チニアゲノムの部分は、それぞれの地図において、図に
示されている破線の間の領域であつて、長さ約10キロ塩
基対の領域として示されている。
特に第6A図を参照すれば、Ava Iによる分解によつて得
られたフラグメントＨが完全に欠失した領域内にありま
た、Ava 開裂サイトがＳ−変異株の欠失領域内に完全に
入つているので、Ｓ−変異株のDNAと相同な末端DNAフラ
グメントを有さないことが明らかである。
Hind IIIに関する第6B図の制限地図は、この制限酵素が
同様にＳ−変異株の欠失領域と重複するＬ−変異株DNA
フラグメントを製造しえないことを示す。この場合、Ｓ
−変異株と相同なシークエンスはHind IIIのＣ−フラグ
メントの左端に見られる。しかし、フラグメントＣの右
端の制限サイトは、欠失領域内にあたり、そして、Ｓ−
変異株のDNAシークエンスと相同な末端シークエンスは
存在しない。
これとは対称的にBst E IIに関する第6C図に示されて
いる制限地図は、この酵素による分解によつてＳ−変異
株にはない欠失部分を含み、また、Ｓ−変異株の対応す
る部分と相同な左及び右末端の両方に末端部分を有する
フラグメント（フラグメントＣ）を製造することが分
る。
以下で詳述する実験の結果、Ｌ−変異株中に存在する
が、Ｓ−変異株から欠失しているDNAが完全なＬ−変異
株ゲノムから高い効率でＳ−変異株によつて救済され、
Bst E IIのＣフラグメントからより低い効率で救済さ
れ、またAva I及びHind III制限エンドヌクレアーゼに
よつて調製されたＬ−変異株DNAフラグメントのいずれ
からも救済されないということが分る。
欠失したシークエンスが完全なＬ−変異株から救済され
る高い効率はその完全なＬ−変異株とＳ−変異株との間
の単一の交差がＬ−変異株ゲノムタイプを形成するに充
分であるという事実に基づいている。他方、Bst E II
のＣ−フラグメントからの欠失部分を救済するために、
フラグメント及びＳ−変異株との間の交差がこの欠失領
域をＳ−変異株中に取り込ませるためにはＣ−フラグメ
ントの右末端部分と左末端部分との両方で充分でなけれ
ばならない。最後に、Ava I及びHind IIIによる分解か
らはいずれの乗り換え型によつてもＳ−変異型に取り込
ませることのできるDNAフラグメントを生成することが
できないので欠失部分の救済はできない。
マーカー救済は、ストウ等及びウイグラー等（すでにこ
れらは上述した）によつて変形されたグレーアム（Grah
am）等のVirology52,456−467（1973）のリン酸カルシ
ウム技術を使用してCV−１モノレヤー上で行つた。融合
性のCV−１モノレヤーをＳ−変異株ワクチニアウイルス
で感染させ、6cmの直径のペトリシヤーレのいくつか
（５乃至20）のそれぞれに約50乃至200の溶菌斑を作つ
た。細胞を感染させるために成長培地（たとえば10％の
小牛の血清を含むイーグルススペシヤル）を吸い出し、
そして２％の子牛血清を含むイーグルススペシヤルのよ
うな細胞適合性の培地に50乃至200pfu/10.2mlを有する
ウイルスの希釈物を細胞モノレヤーに塗布した。CO2培
養器中37℃１時間にわたつて培養し、ウイルスを細胞に
吸着させた後、前述の４つのＬ−変異株DNA標本をそれ
ぞれ別々にＬ−変異株DNA標本の皿あたり１マイクログ
ラムを含むリン酸カルシウム析出物としてそのモノレヤ
ー中に添加した。40分後、10％の子牛血清を有するイー
グルススペシヤル培地を添加し、最初の添加から時間た
つた後、細胞モノレヤーを４分間緩衝された25％ジメチ
ルスルホキサイドの1ml中に暴露した。この緩衝物質は
１あたり8gのNaCl、0.37gのKCl、0.125gのNa2HPO4・2
H2O、1gのデキストロース及び5gのＮ−（２−ヒドロキ
シエチル）ピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルフオン
酸）（ヘルペス）を含み、最終的なpHは7.05である。こ
のジメチルスルホキシドを除去し、モノレヤーを洗浄
し、栄養寒天上に層を形成させた。CO2培養器中37℃３
日間の後、細胞をニユートラル赤色染料を含む栄養寒天
オーバーレイで染色した。この赤色顔料は非感染細胞を
染色する（栄養寒天＝10％の子牛の血清及び１％の寒天
を含むイーグルススペシヤル培地）。翌日、寒天のオー
バレイを取り除き、モノレヤーをニトロセルロースに移
し、ヴイラリエール等の上記引用文によつて示される現
場雑種形成のために調整した。Ava IによるＬ−変異株
ゲノムの分解により6.8キロ塩基対のフラグメント、す
なわち、フラグメントＨが生成し、また、このフラグメ
ントはＳ−変異株ゲノム中で欠失している特有のDNAシ
ークエンスとともに存在するので（第6A図参照）、32P
でラベルした切断翻訳されたAva I H−フラグメントは
Ｓ−変異株による特有のＬ−変異株DNAシークエンスの
救済を特定するための非常に特有なプローブを提供す
る。
雑種形成化のために、ニトロセルロースフイルターを6c
mのペトリシヤーレ中でフアツトマンNo.1とロ紙円では
さみ、そして、実施例６ですでに述べたような予備雑種
形成化緩衝物質（SSC、デンハート溶液、EDTA及びS.S.D
NA）中60℃で６時間予備雑種形成化した。32 Pでラベルした切断翻訳化Ｌ−変異化Ava Iすなわち、
Ｈ−フラグメントからなる放射性プローブであつて、約
１×108cpm/μｇの固有活性を有するプローブを２×SS
C、１×デンハート、1mMのEDTA、0.1％のSDS、10％のデ
キストランサフエート、及び50μg/mlの超音波処理した
S.S.DNA中で60℃、一夜、約１×105cpm/mlにおいて雑種
形成化のために使用した。この放射性プローブは、リグ
ビーらのJ.Mol.Biol.113,237−251（1977）に従つて製
造した。このフイルターをくり返し室温及び60℃で実施
例VIの洗浄方法を使用してくり返し洗浄し、空気乾燥を
し、そしてラジオオートグラフにかけた。結果を以下の
表Ｉに示す。
第１表 供与体L-変異株の調整 L-変異株遺伝子型を含む溶菌
斑,% そのままのＬ−変異株 ５
Bst E IIの全分解 0.1
Ava Iの全分解 ０
Hind IIIの全分解 ０
5000溶菌斑の最低限を各供与体DNA標本について分析し
た。
実施例 Ｘ ワクチニアウイルス変異株VP−１からVP−６を生成する
ためのpDP132及びpDP137を使用する生体内組換及びレプ
リカフイルターを使用するその特定 供与体DNAの第１のリン酸カルシウム析出物を、50μ
の水中における５μｇのpDP132Hind IIIで分解したDNA,
40μの水における４μｇのＳ−変異株担体DNA（実施
例Ｉで製造したもの）及び10μの2.5M CaCl2混合
し、得られあ混合物を280mMのNaCl、50mMのヘルペス及
び1.5mMのリン酸ナトリウム（pH＝7.1）を含む等体積の
２×ヘルペスホスフエート緩衝物質と混合し、そして室
温で30分間にわたつて析出物を形成させることにより調
製した。第２の析出物はpDP137Hind IIIで分解したDNA
を使用する以外同様に同じ量で調整した。
〔ストウ等の前掲引用文献及びウイグラー等の前掲引用文献によつて詳細に述べられているように、すでに言及したグレーアム等の折出技術の変形はリン酸カルシウム折出物の形成の効率を増大させる高分子量の物質としての担体DNAを採用する。使用する担体DNAは生体内組換技術においてモノレヤー化した細胞を感染させるために使用したウイルスのDNAである。〕
生体内組換のために10％の子牛の血清を含むイーグルス
スペシヤル培地中において成長するCV−１の融合性モノ
レヤーは複数の1pfu/細胞の感染によりＳ−変異株ワク
チニアウイルスで感染する。この感染手続きは実施例IX
に示されると同様である。このウイルスをCO2−培養器
中37℃60分間吸着させるようにさせ、その後、接種材料
を吸い出し、そして細胞モノレヤーを洗浄した。析出し
たDNA標本は別の細胞モノレヤーに塗布し、CO2−培養器
中37℃40分経過した後液状のオーバーレイ培地を添加し
た（10％の子牛血清を含むイーグルスペシヤル）。各場
合においてウイルスはCO2−培養器中37℃で24時間経過
した後、３回の凍結／融解サイクルにより集め、そして
CV−１モノレヤー上に滴下した。約15000の溶菌斑を以
下のように製造したレプリカフイルターを使用すること
により組換ウイルスに対しCV−１のモノレヤー上に分析
を行つた。
栄養寒天オーバーレイの下の融合性CV−１モノレヤー上
に形成した溶菌斑を外科用メスでこの寒天オーバーレイ
をきれいに除去し、モノレヤー上にニトロセルロースフ
イルターをおくことによりそのニトロセルロースフイル
ター上に移した。フイルターとモノレヤーとの良好な接
触は、50mMのトリス緩衝物質（pH＝7.4）及び0.015mMの
NaClで湿らせたフアツトマン第３ロ紙をそのニトロセル
ロースフイルター上におき、セルロースに転移されるモ
ノレヤーが、分離した着色していない溶菌斑を囲む均一
な色を示すまでゴム状ストツパーでつめることによつて
行うことが出来る。（このモノレヤーは前もつてユユー
トラル赤で染色してあり、これは生存している細胞すな
わちウイルス感染によつて溶菌していない細胞によつて
取り込まれる。） 移動されるモノレヤーをその上に有するニトロセルロー
スフイルターをペトリシヤーレから取り出し、モノレヤ
ー側を上にした状態で置いた。上述のトリス−NaCl溶液
で湿らせた第２のニトロセルロースフイルターを直接第
１のニトロセルロースフイルター上におき、これらの二
つのフイルターを乾燥したフアツトマン第３円板で保護
した後にゴム状ストツパーでつめることによりしつかり
と接触させた。ロ紙を取り除いた後、ニトロセルロース
フイルターを方向用のキザミ目をつけそして分離した。
第２の（レプリカ）ニトロセルロースフイルターは第１
のニトロセルロースフイルターに移される細胞モノレヤ
ーの鏡像を含む。第２のフイルターは便宜上きれいなペ
トリシヤーレ中におき冷凍した。この第１のニトロセル
ロースフイルターはプローグとして32PでラベルしたBam
PSV TKフラグメントを使用する雑種形成に付する。
プローブの調製及び雑種形成の技術は実施例VIですでに
述べた通りである。
雑種形成により分析した約0.5％の溶菌斑は陽性、即
ち、Bam HSV TKを含む組換型ウイルスであつた。
雑種形成により第１のニトロセルロースフイルター上で
特定したこれらのウイルスに対応する組換型ウイルスの
溶菌斑は、更に精製を行なうため以下の技術によりニト
ロセルロースレプリカフイルターから単離した。
取り上げようとする溶菌斑よりもわずかに大きい直径の
するどいコルクボーラーを使用して、所望の溶菌斑を、
雑種形成により組換型の特定に使用した第１の又はオリ
ジナルのニトロセルロースフイルターより穿孔して取り
出した。得られた穿孔フイルターをステンシルとして使
用して、レプリカフイルター上の対応溶菌斑を特定し単
離した。即ち、レプリカフイルターはステンシル表面上
にモノレヤー側を上にして置き、サランラツプで覆つ
た。穿孔した第１の又はオリジナルのニトロセルロース
フイルターを第２のフイルター上にモノレヤー側を下に
して置き、フイルターの配向用キザミ目を、溶菌斑の鏡
像が整合するように位置ぎめした。コルクボーラーを使
用して、詰めもの（プラツグ）をレプリカフイルターよ
り除去し、サランラツプの保護レヤーを除いた後、２％
の小牛血清を含む1mlのイーグルスペシヤル培地中に置
いた。ニトロセルロースプラツグを30秒間氷上でこの培
地において超音波をかけてウイルスを解放した。このウ
イルス標本0.2mlと、標本の1:10希釈物の0.2mlを6cmの
ペトリシヤーレ中のCV−１モノレヤー上に平板培養を行
なつた。
溶菌斑の精製工程として、第１のニトロセルロースフイ
ルターの調製、レプリカフイルター、雑種化及び溶菌斑
単離の一連の工程を繰り返した。
pDP132Hind III分解DNAのリン酸カルシウム析出物より
始めて、このように調製した精製溶菌斑の一つを、ワク
チニアウイルスVP−１と名付けた。同様にして、pDP137
Hind III分解DNAより調製した組換型を含む溶菌斑をVP
−２と名付けた。これらのサンプルを制限分解及び他の
技術を含めて、更に研究するため適当な細胞培養基上で
成長させた。
このように、VP−３及びVP−４と名付けた更に二つのワ
クチニア変異株を、救済ウイルスとしてのVTK-79（実施
例VIIIのＳ−変異株ワクチニアウイルス）と各々プラス
ミド供与体DNAとしてのpDP132及びpDP137を使用する生
体内組換により形成した。析出物は、50μの水中の５
μｇのプラスミド供与体DNA、水150μ中の４μｇのVT
K-79担体DNA及び2.5MのCaCl250μを混合し、すでに述
べたヘルペスホスフエート緩衝物質250μの当体積に
一滴一滴添加した。
更に、VTK-79ウイルス担体で感染させるために使用した
細胞はCV−１の代りにBHK−21〔クローン（Clone）13〕
細胞であつた。
VP−５及びVP−６と名付けられた更に二つのワクチニア
ウイルス変異株を、それぞれ変異株VP−３及びVP−４よ
り調製されたpDP132及びpDP137のリン酸カルシウム析出
物を使用して調製した。しかし、変異株VP−５及びVP−
６の場合、担体DNAはVTK-79というよりもワクチニアウ
イルスVTK-11である。
また、BHK−21（Ｃ−13）細胞モノレヤーは感染し、こ
の場合の救済ウイルスはVTK-11であつた。
実施例 XI ワクチニア変異株VP−２によるHSV TKの表現及びその
特定のためのIDC＊の使用 Ｓ−変異株ワクチニアウイルスと、pDP137Hind IIIで分
解したDNAのリン酸カルシウム析出物との生体内組換に
より実施例Ｖで得られたウイルス生成物は、約20個の6c
mペトリシヤーレ上のCV−１細胞の融合性モノレヤー上
に１シヤーレ当り約150の溶菌斑を与えるような濃度で
平板培養した。溶菌斑は液状オーバーレイ培地、例えば
10％小牛の血清を含むイーグルススペシヤル培地で覆つ
た。CO2−培養器中37℃で培養を24〜48時間行つた後、
液状オーバーレイ培地をシヤーレより取り出し、各々に
ついて１〜10μCiの125Iヨードデオキシシチジン（IDC
＊）を含む同一の液状オーバーレイ培地1.5mlで補充し
た。平板は、CO2を十分に含む雰囲気中37℃、一夜培養
し、その後、平板上の細胞モノレヤーをナチユラル赤の
添加による染色し、コントラストにより溶菌斑を可視化
した。
培地を吸入により除去し、モノレヤーをホスフエート−
緩衝生理食塩水溶液で３度洗浄し、各平板の細胞モノレ
ヤーを対応するニトロセルロースフイルター上に印刷し
た。後者は、１〜３日間Ｘ線フイルムに曝露し、現像し
た。
HSV TK遺伝子を含み、それを表現するこれらのウイル
ス溶菌斑はIDC＊をホスホリル化し、それをそのDNA中に
取り込み、DNAを不溶化する。他のホスホリル化せず、
取り込まれないIDC＊は洗浄により除去され、従つて、
Ｘ線フイルムを暗化させる溶菌斑は組換HSV TK遺伝子
を表現するものである。CV−１細胞も、ワクチニアも、
それらはTKを含むけれどもHSV TKに特有の選択的状態
でIDC＊をホスホリル化し、それを取り込む。
組換型生物をラジオオートグラフイーで特定した後、フ
イルタープラグをニトロセルロースフイルターより切り
とり、1mlのオーバーレイ培地に置き（イーグルススペ
シヤル、10％小牛血清）、超音波振動を与え、CV−１モ
ノレヤー上に再び平板培養した。IDC＊分析を繰り返
し、ウイルス単離体を精製した。このように、実施例Ｘ
中で雑種形成により特定されたVP−２と同一のウイルス
を、そこに存在するHSV TK遺伝子の表現に依存する技
術により単離した。
また、この実施例の結果より、これらの生物のいずれか
により本発明の組換生物中でHSV TK遺伝子が表現され
ることが分つた。
pDP137より由来するワクチニア変異株、即ち、VP−２、
VP−４及びVP−６は全て、上述の態様でIDC＊のホスホ
リル化及び取り込みによりその中に存在するHSV TK遺
伝子を表現する。しかし、pDP132から由来する変異株VP
−１、VP−３及びVP−５はその遺伝子を表現しない。こ
れは、たぶんウイルス内の遺伝子の配向が遺伝子転写の
方向と逆なためと考えられる。
実施例 XII HSV TK遺伝子を含む組換型ウイルスの特定及び単離用
選択培地の使用 実施例Ｘに従つて、BHK−21（Ｃ−13）細胞中で、VTK-7
9ワクチニア及びpDP137のリン酸カルシウム析出物の生
体内組換により調製されたウイルスを使用して、人間
（系143）TK-細胞を感染した。更に詳しく述べれば、直
径6cmの５つのペトリシヤーレ中の細胞モノレヤーを各
々選択的MTAGG培地の存在下、100〜10-4のウイルス希釈
物において実施例Ｘのウイルスで感染した。感染技術は
すでに述べたとうりである。
５個のよく分離した溶菌斑を単離し、第２の溶菌斑精製
のためにCV−１モノレヤー上に再び平板培養した。溶菌
斑精製により２度精製された更に一つのよく分離した溶
菌斑を選択し分離した。このように二度溶菌斑精製され
た、よく分離した溶菌斑を選択し、32PでラベルしたBam
HSV TKを使用する現場雑種形成によりHSV TK遺伝子
の存在を分析した。雑種化技術は前述の通りである。HS
V TK遺伝子の存在に対し陽性の変異株ワクチニアウイ
ルスはVP−４で名付けた。
実施例 XIII pDP120の形成 pDP3の約20μｇをPst Iで分解し、得られたフラグメン
トを、実施例Ｉで詳述したものと同様の手続においてア
ガロースゲル上で分離した。ワクチニアHind III F−フ
ラグメントの中間部と対応する3.7mdの分子量を有するP
st Iフラグメントを単離した。
このフラグメントの約500μｇを、20μのオフアーレ
ル緩衝物質（OFB）〔オフアーレル（Ｏ′Farrell）ら、
Molec.Gen.Genetics179,421−435（1980）〕中Pst Iで
あらかじめ開裂したpBR322の250μｇで接合した。この
乾燥物質は、トリス−アセテート（pH7.9）3.5mM、酢酸
カリウム66mM、酢酸マグネシウム10mM、牛血清アルブミ
ン100μg/ml及びジチオトレイトール（dithiothreito
l）を含む。接合のため、1mMのアデノシントリホスフエ
ート（ATP）及び約20単位のT4DNAリガーゼ〔ニユー・イ
ングランド・バイオラブズ（New England Biolab
s）〕を存在させた。混合物を16時間16℃で維持した。
接合混合物を使つて被感染性大腸菌HB101を形質転換し
た。AmpS、TetR組換型は、実施例IIIにおいて記述した
方法に類似した適当な抗性物質平板上に選択した。いく
つかの組換型プラスミドを実施例VIIにおけると同様にP
st I及びBam HIによる制限分析により分析し、その構
造を確認した。正確な構造を有するプラスミドを含む１
つのコロニーは大規模に成長し、実施例IVのように回収
し、pDP120と名付けた。
実施例 XIV pDP301A及び301Bの形成：及びVP7及びVP8の形成 約10μｇのプラスミドpDP3をHind IIIで開裂し、8.6md
のワクチニアＦ−フラグメントを実施例Ｉで議論したも
のと同様の技術を使用して約５μｇの量でアガロースゲ
ルより分離した。フラグメントは、1mMのATP及び80単位
のT4DNAリガーゼを含む1.0mlのオフアーレル緩衝物質
（OFB）中16℃、16時間培養することにより自己接合さ
せた。
培養後、反応は10分間65℃で加熱することにより停止さ
せ、DNAはエタノールで析出させた。
自己接合したHind III F−フラグメントは250μのOFB
中に再懸濁し、Bam HIの30単位で４時間分解した。反
応は、10分間65℃で加熱することにより停止させ、得ら
れたDNAフラグメントは１％のアガロースゲル上で分離
した。Bam HIサイトの近くで転化した8.6md Hind III
F−フラグメントに対応するバンドは、前述の技術を使
用して単離した。
転化Hind III F−フラグメントは以下のようにpBR322の
Bam HIサイトに挿入した。
pBR322は通常の技術によりBam HIにより開裂した。直
鎖状プラスミドは小牛の腸アルカリ性ホスフアターゼ
（CIAP）で処理して、５′−ホスフエートを除去し、再
環化を防止した〔チヤコナス（Chaconas）ら、Methods
in Enzymol.65,75（1980）〕。より詳細に述べれ
ば、pH9.0に調整した400μのOFB中の５μｇの直鎖状p
BR322を37℃、30分間0.75単位のCIAP〔ベーリンガー・
マンハイム（Boehriger Mannheim）〕と混合した。更
に、0.75単位のCIAPを転化し、混合物を60℃、30分間分
解した。DNAは、ワクチニアDNAの精製に対する実施例Ｉ
に記載されたフエノール抽出により脱タンパク質化し
た。
上記により処理したpBR322DNAの約450μｇを1mM ATP及
び20単位のT4DNAリガーゼを含む15μのOFB中で16時
間、16℃で転化Hind IIIF−フラグメントの約400μｇと
結合した。接合混合物を使用して、実施例IIIですでに
述べたように、大腸菌HB101細胞を直接形質転換した。
この形質転換細菌を実施例IIIで述べたように、適当な
抗性物質平板上に培養することによりAmpR、TetS用にふ
るい分けした。
組換型プラスミドは、ミニ溶菌体（実施例IIIで既述）
のHind III制限分析によりふるい分けし、どのプラスミ
ドがどの方向に挿入Hind IIIF−フラグメントを含むの
が決めた。異なる方向にフラグメントを含むこれら二つ
のプラスミドを各々pDP301A及び301Bと名付けた。
これらのプラスミドを使用して、逆方向にワクチニアHi
nd III F−フラグメントのBam HIサイト中に挿入され
たpBR322DNAを各々含む新たな二つの組換型のワクチニ
アウイルスを形成した。
さらに詳細に述べれば、pDP301A及びpDP301Bは、実施例
Ｘで述べたよう生体内組換によりVTK-79中に挿入され
る。しかし供与体DNA（Sst Iで分解したpDP301A又はpDP
301B）の10μｇ及びVTK-79担体DNAの２μｇを使用し
て、リン酸カルシウム析出物を調製した。この折出物は
救済ウイルスとしてのVTK-79で感染させたCV−１細胞に
添加するのに使用したものである。
組換型ウイルスはプローブとしての切断翻訳されたpBR3
22DNAを使用して実施例Ｘで開示したレプリカフイルタ
ー技術を使用することによりふるい分けした。
pDP301AからのpBR322DNAシークエンスを生体内でVTK-79
と組換えたウイルスをVP−７と命名し、一方、pDP301B
からのpBR322DNAを含む組換型ウイルスをVP−８と命名
した。
実施例 XV PJZ 102A/Fの製造及びVP−９の製造 pBR322中に挿入された、インフルエンザウイルスA/PR/8
/34の赤血球凝集素（HA）遺伝子を指定する完全なcDNA
シークエンスを含むプラスミドはバツクズ（Bacz）等の
Nucleic Acids Research８,5845−5858（1980）で作
られたプラスミドのひとつである。このプラスミドはpB
R322のHind IIIサイトに挿入されたHA遺伝子用の完全な
ヌクレオチド暗号づけシークエンスを含む。
このプラスミド中の赤血球凝集素シークエンスはpJZ102
Aと命名された元のプラスミドの約500ngをOFB中のHind
IIIで消化し、次に前述のT4DNAリガーゼ及びATPを使用
して結合することにより方向が変わつた。
結合混合物は非感染性E.coliを形質転換するために使用
し、細菌をAmpR,TetSコロニーのためにふるい分けし
た。ミニ溶菌標本からの組換プラスミドはプラスミドの
Ava I分解及びアガロースゲル上の分析により逆方向に
存在する赤血球凝集素シークエンスのためにふるい分け
した。HAシークエンスがpJZ102A中に発見されるものと
逆方向に存在しているプラスミドをpJZ102HBと命名する
（第9A図参照）。
pJZ102Aの約500ngをすでに述べたようにOFB中のBam HI
で消化することにより直線状とした。直線状となつたpJ
Z102Aは転化Hind III F−フラグメントの約500ngで結合
した。後者のＦ−フラグメントは便宜上pDP301AのBam
HI分解によつて得られる（実施例第XIVを参照）。
結合は16時間にわたつて16℃で約20単位のT4DNAリガー
ゼと1mMのATPを含むOFBの20μ中で生じた。
結合混合物を使用して直接非感染性大腸菌RR1細胞を既
述のように形質転換した〔ボリバー（Bolivar）等のgen
e２,95−113（1977）〕。
形質転換した細胞をアンピシリン平板状に平板培養し、
組換型のためのふるい分けを実施例VIですでに述べたよ
うにプローブとしての切断翻訳したワクチニアHind III
F−フラグメントDNAを使用してコロニー雑種形成化す
ることにより行つた。
雑種形成化により陽性であることが分つたコロニーから
のDNAをHind III制限分析及びアガロースゲル電気泳動
により分析した。
ワクチニアHind III F−フラグメントのBam HIサイト
中に挿入されたpJZ102Aを含むプラスミドを単離し、pJZ
102A/Fと命名した。
実施例XVで詳細に記載した生体内組換技術を使用して、
pJZ102A/Fからの環状供与体DNA10μｇをVTK-79単体DNA
とともにVTK-79ワクチニアウイルス中に組換えるために
使用した。組換型ウイルスはプローブとしての切断翻訳
したHind III HAフラグメントを使用してレプリカフイ
ルター技術によりふるい分けした。この単離された組換
型ウイルスをVP−９と名づけた。
実施例 XVI VP−10の調整 プラスミドpJZ102B（第10A図参照）を10μｇの環状供与
体pJZ102B DNA,2μｇのVTK-79担体DNA及びCV−１細胞
を用いて標準プロトコールを使用する生体内組換によつ
てVP−７中に挿入した。HAシークエンスを含む組換型ウ
イルスのふるい分けはプローブとしての切断翻訳したHi
nd III HAフラグメントを用いてすでに述べたレプリカ
フイルター技術によつて行つた。
陽性の溶菌斑を単離し、これを精製し、そしてVP−10と
命名した。
実施例 XVII VP−９及びVP−10によるHA遺伝子の発現の特定 栄養培地中にBHK−21細胞を含む２つの6cmペトリシヤー
レを約200pfusのA/PR/8/34インフルエンザウイルスで感
染させた。別の対の，栄養培地中にCV−１細胞のモノレ
ヤーを含む6cmのペトリシヤーレを約200pfusのVP−９ワ
クチニア変異株で感染させ、また栄養培地中にCV−１モ
ノレヤーを含む第３番目の対の6cmペトリシヤーレを約2
00pfusのVP−10で感染させた。
ウイルムを37℃48時間成長させ、37℃１時間ニユートラ
ル赤で染色し、溶菌斑を可視化させた。栄養培地を吸い
取り、細胞モノレヤーを1mg/mlの牛血清アルブミン（BS
A）を含むリン酸塩緩衝化した生理食塩水（PBS）で３度
洗浄した。
５μのH1HAウサギ抗血清を含む1.5mlのPBS−BSAを３
つの組のペトリシヤーレのそれぞれに加えた。このシヤ
ーレを室温で１時間培養した。３つの細胞培養器（ひと
つはBHKで２つはCV−１の培養器）から成る第２の組を
５μのH3HAウサギ抗血清を含む1.5mlのPBS−BSAで処
理し、室温で１時間培養した。
次に、細胞モノレヤーのすべてをPBS−BSAで３度洗浄
し、次に約１μCiの125Iでラベルしたタンパク質Ａ（ニ
ユー・イングランド・ニユークリア）を含む1.5mlのPBS
−BSAを６つのペトリシヤーレのそれぞれに添加した。
これらのシヤーレを室温で約30分間培養し、放射性物質
を吸いとつた。細胞モノレヤーをPBS−BSAで５度洗浄し
た。６つの平板のそれぞれにある細胞モノレヤーを対応
するニトロセルロースフイルター上に印刷し、そしてそ
れを１乃至３日間Ｘ線フイルムに曝露した。このフイル
ムを次に現像した。
ラジオオートグラフからBHK細胞モノレヤーがA/PR/8/34
で感染されH1HA抗血清によつて処理したペトリシヤーレ
において複合体が形成していることが分つた。同様に曝
露フイルムはVP−９で感染させ、そしてH1HA抗血清で処
理したCV−１細胞モノレヤーに対して見出された。この
ことは、このサンプルにおいて抗原抗体複合体が形成し
たことを示している。４つの他のサンプルのすべては複
合体形成に対し陰性であつた。
実施例 XVIII ウサギにおけるVP−９によるHA表現の決定 ニユージーランド産白ウサギをそれぞれ静脈内（IV）
（ウサギNo.1）又は筋肉内（IM）（ウサギNo.2）のいず
れかで4OD（A260において）単位の精製VP−９変異株ワ
クチニアウイルスで感染させた。
各ウサギから血を取り、感染前（前免疫血清）及び感染
から17日、25日及び41日後におけるそれぞれの抗血清を
集めた。各ウサギからの抗血清を以下のようにワクチニ
アウイルス感染を中和する能力を試験した。
抗血清の一連の希釈物を標準ウイルス溶菌斑形成培地
（２％の胎児性牛の血清を含むイーグルススペシヤル培
地）中で調整し、次に等容量の感染ワクチニアウイルス
（100−300pfus）と混合した。各混合物を４℃で一夜保
持した。次にこの混合物をすでに述べたように60mmのペ
トリシヤーレ中CV−１モノレヤーを感染させるのに使用
した。血清中に存在する特定のワクチニア中和抗体を形
成した溶菌斑の全数の減少によつて示した。かかる分析
の結果を以下の表Ｉに示す。
対照として、1:20に希釈したものにおける前免疫抗血清
又は抗血清のないものがウサギNo.1については上記分析
においてほぼ約180の溶菌斑を示し、ウサギNo.2につい
ては240の溶菌斑を示した。125 Iタンパク質Ａ分析を実施例XVIIにおけるように行つ
た。詳細に述べれば、A/PR/8/34血清で感染させたBHK−
21細胞の３つのモノレヤーを抗A/PR/8/34結成及び抗ワ
クチニア血清又はウサギNo.1の45日後の採血から得た抗
VP−９血清のいずれかをそれぞれ25mlで処理した。
各モノレヤーを洗浄し、125Iタンパク質Ａで処理するこ
とは実施例XVIIに示したとうりである。
同様に、ワクチニアウイルス（Ｓ−変異株）で感染させ
た細胞の３つのモノレヤーを同一の３つの抗血清標本で
処理し、またすでに述べたように125Iタンパク質Ａと反
応させた。
結果を以下の表に示す。この表からVP−９によつて表現
されるインフルエンザ赤血球凝集素に対する抗体をウサ
ギによつて生成できることを示している。
VP−９感染ウサギによるHA抗体の形成は赤血球凝集素
（HI）力価の測定により試験した。
即ち、HI試験は、「アドバーンスド・ラボラトリー・テ
クニーク・フオー・インフルエンザ・ダイアグノシス，
イムノロジー・シリーズNo.6,プロシージユアル・ガイ
ド1975（Advanced Laboratory Techniques for Inf
luenza Diagnosis,Immunology Series No.6,Procedu
ral Guide1975）」〔ユー・エス・デイパートメント・
エイチ・イー・ダブリユー，パブリツク・ヘルス・サー
ビス，センター・フオー・デシース・コントロール，ビ
ユアロー・オブ・ラボラトリース（U.S.Dept.HEW,Publi
c Health Service,Center for Disease Control,B
ureau of Laboratories），ジヨージア州アトラン
タ〕に記載されている標準プロトコールに従つてうさぎ
No.1（IV）からの前免疫血清、25日及び41日後の血清に
ついて行つた。
以下の表IIIは、３＋HA単位を使用して決めたHI力価
を、試験した種々の抗血清とともに掲げる。A/PR/8/34
インフルエンザウイルスで感染したBHK細胞の抽出物をH
I赤血球凝集素の源として使用した。
実施例 XIX pDP250A及び250Bの形成；及びVP11及びVP12の形成 プラスミドpTVBT1は、ハーシユマン（Hirschman）らPro
c.Natl.Acad.Sci.USA77,5507−5511（1980）及びクリス
トマン（Christman）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA79,18
15−1819（1982）に記載される方法により構成すること
ができる。
pBR322のEco RIサイトに頭尾配列で挿入された二つのH
BVゲノム（サブタイプayw）を含む約20μｇのpTHBV1プ
ラスミドをBgl II制限エンドヌクレアーゼにより開裂し
た。
フラグメント、1.0％のアガロースゲル上で分離し、HBV
細胞表面抗原及び前細胞表面抗原を指定するHBV DNAシ
ークエンスの1.5mdフラグメントを単離した（ガリバー
トの前掲引用文献参照）。
約500ngのpDP120を実施例Ｖに記載したのと同様の条件
下でBam HIで部分的に分解した。
得られた分解物を実施例XIVで記載したのと同様にして
小牛の腸アルカリホスフエート（CIAP）で処理した。最
後に、Bgl IIで分解したpTHBV Iプラスミドの上記フラ
グメントを前述のと同様の条件下でCIAP処理pDP120Bam
HI分解物のBam HIサイト中に接合した。
接合混合物を使用して、すでに述べた被感染性大腸菌RR
Iを直接形質転換した。
得られたAmpS,TetRコロニーはXho I及びPst Iにより可
能な組換型のミニ溶菌体を分離し、アガロースゲル上で
分析することにより、組換型プラスミド用にふるい分け
した。
二つの組換型プラスミドを単離した。これは、二つの可
能な方向のそれぞれで、pDP120のワクチニア部分中に存
在するBam HIサイトにHBV Bal IIを挿入することに対
応する。これらのプラスミドをpDP250A及びpDP250Bと名
付ける（第11図）。
最後に、HBV細胞表面抗原及び前細胞表面抗原シークエ
ンスを含む組換ワクチニアウイルスを、環状pDP250A又
はpDP250Bのいずれかを20μｇ及び２μｇのVTK-79担体D
NAを前述の感染ウイルスとしてのVTK-79とともに使用し
て生体内組換（実施例Ｘ）により形成した。
プローブとしての切断翻訳pTHBV DNAとともにレプリカ
フイルター技術を使用して組換型のためにふるい分けを
行なつた。
一又は二つの方向でHBVウイルスのBgl IIフラグメント
を含む組換型ワクチニアウイルスを第11D図及び第11E図
に示されるようにVP11及びVP12として示した。（HBV転
写の通常の方向を第11D図中でプラスミドについて示し
た。） 実施例 XX pDP252の形成;VP13の形成 20μｇのプラスミドpTHBV（実施例XIX）をHha I制限エ
ンドヌクレアーゼで分解した。このHha I制限分解物の
最大のフラグメントは1084の塩基対を含み、細胞表面抗
原を指定する肝炎Ｂウイルスの全シークエンスを含み、
前細胞表面抗原を指定する領域を有さない（ガリバート
らの前掲引用文献を参照）。
このフラグメントをHind IIIリンカーを使用してHind I
IIサイトでpBR322中に挿入した。詳細に述べれば、前述
の予備調製ゲルより単離した約400ngのHBV Hha Iフラ
グメントをデオキシアデノシン トリホスフエート（dA
TP）、デオキシグアニジントリホスフエート（dGTP）、
デオキシシトシン トリホスフエート（dCTP）及びデオ
キシチミン トリホスフエート（dTTP）を各2mM含むOFB
40μ中に存在する６単位のT4DNAポリメラーゼ（P/Lバ
イオケミカルズ）で処理した。この混合物を、30分間37
℃で培養して、Hha I制限エンドヌクレアーゼによつて
生じたフラグメントののびた３′−末端を剪断した（オ
フアーレルらの前掲引用文献）。
反応時間後、約500ngのホスホリル化Hind IIIリンカー
（コラボラテイブ・リサーチ）、2.5μの20mMアデノ
シントリホスフエート、１μの100mMスペルミジン
〔カル・バイオケム（Cal.BHiochem.）及び１μ（約8
0単位）のT4DNAリガーゼを添加し、培養を７時間10℃で
続けた。
反応を10分間65℃で停止し、400ngのpBR322を添加し
た。
Hind IIIリンカー及びpBR322を約20単位のHind IIIを添
加し、４時間37℃で分解することにより混合物を分解し
た。
もう一度、反応を10分間65℃で加熱することにより停止
させ、末結合リンカーをフーペス（Hoopes）らのNuclei
c Acids Research９,5493（1981）に従うスペルミン
析出により除去した。
より詳しくは、H2O中の0.2Mスペルミン2.5μを反応混
合物に添加し、スペルミン中10mMとした。反応混合物を
15分間氷上で培養し、形成した析出物を遠心分離により
収集した。残存スペルミンを、DNAペレツトを75％エタ
ノール、0.3M酢酸ナトリウム及び10mMの酢酸マグネシウ
ム中に再懸濁することにより、そのDNAより除去した。
この混合物を60分間氷上で培養した。残存スペルミンは
エタノールに溶解し、DNAの懸濁液となつた。この懸濁
液を再び遠心分離によりペレツトとし、1mMのATP及び約
20単位のT4DNAリガーゼを含む20μのOFBに再び溶解し
た。pBR322とHind III結合フラグメントとの結合を10
℃、16時間行つた。
結合混合物は前述のように被感染性大腸菌RR Iを形質転
換するために直接使用した。形質転換型をアンピシリン
平板上に平板培養し、前述のコロニー雑種形成によりふ
るい分けた。
雑種形成により陽性であると分つたコロニーをミニ溶菌
体を制限分解することにより分折した。Hind IIIサイト
中に挿入されたHha Iフラグメントを含むプラスミドをp
DP252と名付けた。
HBV細胞表面抗原を指定するHha I HBVフラグメントを含
む組換ワクチニアウイルスを、実施例XVに示された担体
DNAとしての２μｇのVP8DNAとCV−１細胞用感染ウイル
スとしてのVP8とともに、供与体DNAとしての10μｇの環
状pDP252を使用する標準生体内組換プロトコールを用い
て形成した。
ウイルスを、プローブとしての切断翻訳Hha I HBVフラ
グメントとともにレプリカフイルター技術を使用して組
換型用にふるい分けた。
得られた組換型ウイルスをVP13と名付ける。
実施例 XXI pBL520A及び520Bの調製;VP14及びVP16の調製 ピグナツテイー（Pignatti）らのVirology93,260−264
（1979）によつて記述されているように抽出した、約20
μｇのヘルペスウイルスタイプＩ、株KOS、DNAをEco R
Iで分解し、得られたフラグメントをアガロースゲル上
で分解した。Eco RIフラグメントＦは通常の技術によ
つてゲルより単離した。
Eco RIフラグメントＦの約200ngをpBR 322の60ngで接
合し、Eco RIで分解し、次に実施例XIVに記載したよう
に小牛のアルカリホスフエートで処理した。このCIAPで
処理したpBR322及びEco RIFフラグメントを、1mMのATP
及び約80単位のT4DNAリガーゼを含むOFBの20μ中で、
16時間、16℃で接合した。
全結合混合物を使用して、既述の実施例に示したように
被感染性大腸菌RR I細胞を形質転換した。
形質転換大腸菌をアンピシリン平板上で成長させ、Am
pR,TetR形質転換大腸菌を、既述のミニ溶菌斑の制限分
析により組換型プラスミド用にふるい分けした。制限分
析はHpa I及びEco RIで行ない、プラスミド中にEco R
IFフラグメントが挿入される方向を決定した。
二つの反対方向のそれぞれの方向でpBR322に挿入された
HSV Eco RI Ｆフラグメントを有する二つのプラスミ
ドを第13B図に示されるようにpBL520A及びpBL520Bと名
付けた。
二つの新規な組換型VP14及びVP16、これらのプラスミド
及びVP7を使用して実施例Ｘ及びXVで記載される生体内
組換技術で形成した。より詳しく述べれば、pBL250A又
はpBL250Bを20μｇ、２μｇのVP7単体DNA及びVP7ウイル
スを使用してCV−１細胞を処理し生体内組換を行つた。
組換型ウイルスは、プローブとしての切断翻訳HSVEco
RI Ｆフラグメントを使用するレプリカフイルター技術
でふるい分けした。
実施例 XXII pBL522A及び522Bの形成;VP17及びVP18の形成 約20μｇのpBL520A（実施例XXI）をBam HIで分解し、
得られたフラグメントをアガロース上で分離した。HSV
DNA（株KOS）のBam HI Ｇフラグメントと対応する
5.1mdのフラグメントを実施例Ｉで記載したような技術
を使用してゲルより単離した。
実施例Ｖですでに述べたものと同様の技術を使用して、
プラスミドpDP120をBam HIで部分的に分解し、プラス
ミドを直線化した。分解プラスミドを更に実施例XIVで
述べたように小牛の腸アルカリホスフアターゼで処理
し、環化を防止した。
このように処理された約100ngのpDP120DNAを、1mMのATP
と約80単位のT4DNAリガーゼを含むOFB20μ中で16時間
16℃で前述のBam HI Ｇフラグメントで接合した。
その後、接合混合物は先行する実施例で記載するよう
に、被感染性大腸菌RR Iを形質転換するために直接使用
した。
形質転換した大腸菌を、プローブとしてのHSV Eco RI
フラグメントを使用する前述のコロニー雑種形成によ
り、AmpS,TetR組換型用にふるい分けした。雑種形成に
より陽性のコロニーは、Bam HI及びSst Iによるミニ溶
菌斑の制限分析によりふるい分けし、完全なHSV Bam
HI Ｇフラグメントが挿入されたか否か及び得られたプ
ラスミド内のその配向を決定した。
二つの組換型プラスミドはこのように見い出された。そ
れぞれのプラスミドは親プラスミドpDP120中に反対方向
でHSV Bam HI Ｇフラグメントを含む。新しいプラス
ミドをpBL522L及び522Bと名付けた。
また、実施例Ｘ及びXVに詳細に記載した生体内組換技術
を使用して、20μｇの供与体pBL522A又はＢを各々μｇ
の担体VTK-79DNAと結合し、リン酸カルシウム析出物を
形成した。これと、ワクチニアVTK-79ウイルスを使用し
て、各々がVP17及び18と名付けられている二つのウイル
ス変異株の生成物で処理した。
ワクチニア変異株はプローブとしてのHSV Eco RIF−
フラグメントによるレプリカフイルター技術を使用して
特定した。
実施例 XXIII TK-S−変異株からのＬ−変異株TK-ワクチニアウイルス
の形成 野生型ワクチニアウイルスにおいて、ワクチニアTK遺伝
子はHind III Jフラグメント中に存在することが知られ
ている〔ハルビー（Hruby）ら、J.Virol.43,403−409
（1982）〕。従つて、実施例VIIIのTK-79S−変異株ワク
チニアウイルスのHind III Jフラグメントは遺伝子を不
活性化するTK遺伝子中に変異を有しなければならない。
TK-L−変異株ワクチニアウイルスはTK-79S−変異株のHi
nd III Jフラグメントを使用して以下のようにして得ら
れる。
TK-79のHind III フラグメントは実施例II中のHind III
Fフラグメントに対すると同様にして、pBR322に挿入さ
れる。得られたプラスミドは標準生体内組換プロトコー
ルにおいて、特に10μｇのプラスミド供与体DNA、担体
としての２μgL−変異株ワクチニアDNA及びＬ−変異株
ワクチニアウイルス感染CV−１細胞とともに使用され
る。
後代ウイルスは、40μｇのBUdRの存在下で（前述の）人
間TK-細胞（系143）を感染するために使用する。成長し
たウイルスはBUdRの存在下で溶菌斑精製し、単一溶菌斑
よりのウイルスを選択し、VTK-79L（ATCC No.VR2056）
と名付けた。新たなウイルスがTK-79S−変異株のＪ−フ
ラグメントを含む組換型と同様の有害変異体であるか否
かを決定することはできなかつた。後者は有害である。
実施例 XXIV pDP202の形成 約34μｇのＬ−変異株ワクチニアウイルスDNAをAva I制
限エンドヌクレアーゼで、Ava I緩衝物質〔20mMトリス
−HCl（pH7.4）、30mM NaCl、10mM MgCl2〕中で完全
に分解し、得られたフラグメントを既述のアガロースゲ
ル上で分離した。このAva I H−フラグメントはアガロ
ースゲルから単離した。
50μのHind III緩衝物質中のpBR322約400ngをHind II
Iで完全に分解した。反応は10分間65℃で加熱して停止
した。このとき、45μ（約600ng）の単離ワクチニアA
va I H−フラグメントを添加した。次に、全混合物をエ
タノールで析出させた。得られたDNAペレツトを9.5μ
のT4DNAオリメラーゼ緩衝物質〔20mMトリス−HCl（pH7.
6）、10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール、30μＭ d
TTP、33μＭ dGTP、33μＭ dCTP及び33μＭのdATP〕
に再溶解した。DNAフラグメントのはみ出た５′−末端
は1.5単位のT4DNAポリメラーゼの添加及び37℃の培養に
より充填された。50分後、0.5μの0.02M ATP溶液を
１μ（約80単位）のT4DNAリガーゼとともに使用し
て、ATPに関して1mMの反応混合物を調製した。結合は、
20時間10℃で行つた。
全結合混合物を、被感染性E.coli HB101を形質転換す
るために直接使用した。
形質転換細菌はアンピシリン平板上のニトロセルロース
フイルター上に平板培養を行つた。組換コロニーはプロ
ーブとしての切断翻訳ワクチニアAva I H−フラグメン
トを使用するコロニー雑種形成によりふるい分けた。
コロニーより単離され、コロニー雑種化で陽性であつた
プラスミドをHind IIIで分解し、前述のようにアガロー
スゲル上で分析した。pBR322のHind IIIサイトに挿入さ
れたAva I H−フラグメントを含むかかるプラスミドを
精製し、pDP202と名付けた。更に、Sst I及びBam HIで
の制限分析によるこのプラスミドの特定によりプラスミ
ド内のフラガメントの配向を決めた（第15A図）。
実施例 XXV プラスミドpDP202TK/A−Ｆの形成:VP22の形成 プラスミドpDP202TK/A−Ｆを、pDP202のワクチニアAva
I H−フラグメント部分の三つのBam HIサイトのそれぞ
れにHSVのBgl II/Bam HI TKフラグメントを挿入して
調製した。Bal II/Bam IIフラグメントは、HSV TK遺伝
子を指定する領域を含むが組み込まれたHSVプロモータ
ーシークエンスを含まない〔マクナイト（McNight）ら
のCell25,385−395（1981）〕。
これは、まず、プラスミドをBam HIで部分消化するこ
とによりBam HIサイトで直線化された直線pDP202プラ
スミド（7.3md）を単離することにより達成される。Bgl
II/Bam HI TKフラグメントは、HSV Bam TKプラス
ミド（実施例Ｖ）をBgl II及びBam HIで消化すること
により調製した。Bgl II消化により、一つのサイトでBa
m HI TKフラグメントが開裂し、TK遺伝子の指定領域
を含む1.8mdフラグメントと、HSVプロモーターを含むBa
m HI TKフラグメントの５′−末端に対応する0.5mdフ
ラグメントを生じる、この1.8md Bgl II/Bam HIフラ
グメントをアガロースゲルより単離した。
プラスミドpDP202TK/A−Ｆを調製するために、前述のよ
うにCIAPで処理したBam HI直線状pDP202約500ngを1mM
ATPと約100単位のT4DNAリガーゼを含むOFB20μ中
で、16時間16℃で前述のBgl II/Bam HI TKフラグメン
ト250ngで接合した。全接合混合物をすでに述べたよう
に被感染性の大腸菌RR I細胞を形質転換するために使用
した。この形質転換細胞はアンピシリン平板上で培養
し、コロニーはBam HIによるミニ溶菌体の制限分析に
よりふるいにかけ、どのBam HIサイトでBgl II/Bam H
I TKフラグメントが挿入され、どのように配向してい
るかを決めた。部位及び配向の方向は、Sst Iによる制
限分析により確認した。この手続により、Bgl II/Bam
HI TKフラグメントが両配向でワクチニアAva I H−フ
ラグメント中の三つのBam HIサイトの各々に挿入され
ていることが分つた。各プラスミドpDP202TKは文字Ａ乃
至Ｆで示す（第150図）。
プラスミドの標本量を成長させ、精製し、実施例Ｘ及び
XVの標準生体内組換プロトコールを使用して組換型ウイ
ルスを調製するために使用した。即ち、各組換型プラス
ミドからの供与体DNA約20μｇを担体としてのVTK-79DNA
2μｇと混合し、リン酸カルシウム析出物の形で、VTK-7
9Lウイルスで感染したCV−１細胞のモノレヤーに添加し
た。組換型ウイルスは、プローブとしての切断翻訳HSV
Bam TK DNAを使用する前述のレプリカフイルター技
術を利用してふるい分けた。
VTK-79L及びpDP202TK/Eの生体内組換より単離した一つ
の組換型ウイルスを単離し、VP22と名付けた。この変異
株は、125I−ヨードデオキシシチジン分析（IDC＊）で
測定したときに、VP2、VP4又はVP6（前述したもの）よ
りも、感染細胞中でHSV TK活性の高いレベルを与える
ので特に興味深い。
更に詳しく述べれば、VP4及びVP22を使つて、適当な希
釈物質でCV−１モノレヤーを感染させ、60mmのペトリシ
ヤーレについて200の溶菌斑を得た。各シヤーレを125I
IDCで処理し、実施例XIに述べられたように洗浄し
て、HSV TK活性のレベルを比較した。
感染細胞モノレヤーは、Ｘ線フイルムの単一シート上に
置かれたニトロセルロースフイルター上に上げて、各フ
イルターによるフイルムの相対的露光度（暗化度）を比
較することにより、TK活性のレベルを比較した。
IDC＊分析の結果より、Ｌ−変異株がHSV TK活性を全く
有さないこと、従つて、フイルムを露光しないことが分
つた。実施例XIにおいてHSV TK活性を有することが分
つたVP4は、フイルムを弱く暗化した。一方、VP22はVP4
の15〜20倍露光した。このことは、HSV TK活性の非常
に高いレベルを示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は、制限酵素としてHind IIIを使用して決定した
ワクニチアWR株のＬ−及びＳ−変異株の遺伝子地図であ
り、Ｌ−変異株の末端Ｃ−フラグメント中のシークエン
スの欠失を示すものである。この欠失はゲノムの末端繰
り返し部分の外にある。欠失DNAシークエンスはＬ−変
異株の構造に特有であり、Ｓ−及びＬ−変異株の成長は
同一なので、この欠失領域は非本質的でなければならな
い。 第２図は二つの更に別の制限サイト、即ちSst I及びBam
HIサイトを含めて、より詳細に示したワクチニアHind
III F−フラグメントを示し、Bam HIサイトにおい
て、外来DNAは本質的なワクチニア遺伝子の防害をする
ことなくワクチニアHind III F−フラグメント中に導入
することができる。 第3A図乃至第3Ac図は、ワクチニアHind III F−フラグ
メントにHSV TK遺伝子を導入する方法を略図的に示す
ものである。 第４図は、本発明により調製したワクチニア変異株の制
限地図であり、VP−１及びVP−２と名付けられる二つの
ウイルス変異株中のHind III F−フラグメントにHSV T
K挿入物が存在することを示している。 第５図は、可能な組換ウイルスをふるい分けして、HSV
TK遺伝子の存在の有無を決めるのに有効な技術を掲げ
た表である。 第6A図乃至第6C図は、種々の制限フラグメントと、対応
するＳ−変異株より欠失した個有のＬ−変異株DNAシー
クエンスとの関係を示す。ワクチニアWRゲノムの左側末
端部分の制限地図を示す。 第7A図乃至第7C図は、pBR322と結合したワクチニアHind
III F−フラグメントの部分を含み、第3B図に示される
ようにプラスミドpDP3よりも小さい分子量を有する新し
いプラスミドpDP120の製造方法を略図的に示す。 第8A図乃至第8D図は、二つのプラスミドpDP301A及びpDP
301Bの調製を略図的に示したもので、これらのプラスミ
ドはpBR322のDNAシークエンスをワクチニアウイルス中
に取り込ませてワクチニア変異株VP7及びVP8を製造でき
るようにするものである。 第9A図乃至第9C図は、ワクチニア変異株VP9の製造を略
図的に示すもので、そのゲノム中には、第8A図乃至第8D
図で示されるような技術を使用してインフルエンザの赤
血球凝集素遺伝子（HA）が取り込まれる。 第10図は、インフルエンザの赤血球凝集素（HA）遺伝子
を含むが、VP8を使用して生体内組換により直接調製し
た更に別のワクチニア変異株VP10の構造を示す。 第11A図乃至第11E図は、VP11及びVP12と名付けられたワ
クチニア変異株の構造を示し、各変異株はそのゲノム中
に、ワクチニアVTK-79がそれぞれ新たに構成したプラス
ミドpDP250B及びpDP250Aによる生体内組換により取り込
まれているＢ型肝炎ウイルスの細胞表面抗原を指定する
DNAシークエンスを含む。 第12A図乃至第12D図は、新しいプラスミドpDP252の構造
を略図的に示す。このプラスミドは、pBR322をＢ型肝炎
ウイルス（HBV）ゲノムの部分と結合するもので、この
部分は全て、細胞表面抗原を指定するHBV領域ゲノムの
領域内にある。これらの図は得られたpDP252プラスミド
をワクチニアVP8に導入することを示し、得られたワク
チニア変異株をVP13と名付けた。 第13A図乃至第13C図は、更に二つのプラスミドpBL520A
及びpBL520Bの構造と、VP7に挿入して更に二つのワクチ
ニア変異株VP16及びVP14を製造することを示す。各変異
株は、単純性疱疹ウイルスタイプＩ及びIIの主な免疫タ
ンパク質の二つであるヘルペス糖タンパク質gA＋gBを指
定するヘルペスウイルスＩのDNAシークエンスを含む。 第14A図乃至第14C図は、Eco RIヘルペスＦ−フラグメ
ント中に存在する、第13A図に示される5.1mdのBam HI
フラグメントＧを取り込んだ更に二つのプラスミドpBL5
22A及びＢの構造を含む〔デルカ（De Luca）らのVirol
ogy 122,411−423（1982）〕。 第15A図乃至第15F図は、外来DNA、即ち、ヘルペスBgl/B
am TKフラグメントが非本質的部分のＦ−フラグメント
以外のその部分中のワクチニアゲノムに挿入されている
更に別のワクチニア変異株VP22の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/33 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） 8412−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ワクチニアゲノムの、ワクチニアウイルス
    の複製にとって非本質的な領域中で、ワクチニアウイル
    スにおいて自然発生的でないDNAの存在により合成的に
    変異化した（modified）組換え型ワクチニアウイルス。
  2. 【請求項２】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的で
    ない前記DNAが蛋白質の生成により宿主中に発現され
    る、特許請求の範囲第（１）項に記載の組換え型ワクチ
    ニアウイルス。
  3. 【請求項３】前記蛋白質が抗原である、特許請求の範囲
    第（２）項に記載の組換え型ワクチニアウイルス。
  4. 【請求項４】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的で
    ない前記DNAが生体内組換えにより前記ウイルスに導入
    された、特許請求の範囲第（１）項に記載の組換え型ワ
    クチニアウイルス。
  5. 【請求項５】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的で
    ない前記DNAがウイルスのDNAを含む、特許請求の範囲第
    （１）項に記載の組換え型ワクチニアウイルス。
  6. 【請求項６】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的で
    ない前記DNAが細菌のDNAを含む、特許請求の範囲第
    （１）項に記載の組換え型ワクチニアウイルス。
  7. 【請求項７】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的で
    ない前記DNAが合成DNAを含む、特許請求の範囲第（１）
    項に記載の組換え型ワクチニアウイルス。
  8. 【請求項８】真核細胞に、ワクチニアゲノムの、ワクチ
    ニアウイルスの複製にとって非本質的な領域中で、ワク
    チニアウイルスにおいて自然発生的でないDNAを含有す
    るように変異化した組換え型ワクチニアウイルスを感染
    させることにより真核細胞においてDNAを複製する方
    法。
  9. 【請求項９】前記DNAが前記真核細胞に対して外来性の
    ものである、特許請求の範囲第（８）項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記真核細胞による蛋白質の産生によ
    り、前記DNAが前記真核細胞によって表現される特許請
    求の範囲第（９）項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的
    でないDNAでワクチニアウイルスDNAを、ワクチニアゲノ
    ムの、ワクチニアウイルスの複製にとって非本質的な領
    域中で、生体内組換えする方法において、供与DNAの存
    在下、細胞相溶性媒体中のワクチニアウイルスで細胞を
    感染させ、前記供与DNAは、ワクチニアゲノムの部分と
    相同するDNAシークエンスが、ワクチニアウイルスにお
    いて自然発生的でない前記DNAの側面に位置する（flank
    ed）ものからなる、ワクチニアウイルスにおいて自然発
    生的でない前記DNAをワクチニアゲノムの非本質的な領
    域中に導入させる方法。
  12. 【請求項１２】前記の側面に位置する（flanking）DNA
    シークエンスは、ワクチニアウイルスにおいて自然発生
    的でない前記DNAの存在の他は、ワクチニアウイルスの
    非本質的領域におけるワクチニアウイルスのゲノムの部
    分と同一線形順序に配列されている（co-linear）、特
    許請求の範囲第（11）項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的
    でないDNAでワクチニアウイルスDNAを、ワクチニアゲノ
    ムの、ワクチニアウイルスの複製にとって非本質的な領
    域中で、生体内組換えする方法において、供与DNAの存
    在下、細胞相溶性媒体中のワクチニアウイルスで細胞を
    感染させ、前記供与DNAは、ワクチニアDNAのセグメント
    （segment）中にワクチニアウイルスにおいて自然発生
    的でない前記DNAが存在するものからなる、ワクチニア
    ウイルスにおいて自然発生的でない前記DNAをワクチニ
    アゲノムの非本質的な領域中に導入させる方法。
  14. 【請求項１４】ワクチニアDNAの前記セグメントが、ワ
    クチニアウイルスにおいて自然発生的でない前記DNAの
    存在の他は、ワクチニアゲノムの部分と同一線形順序に
    配列されている、特許請求の範囲第（13）項に記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】ワクチニアウイルスにおいて自然発生的
    でない前記DNAがワクチニアDNAの前記セグメントの非本
    質的領域内に存在する、特許請求の範囲第（14）項に記
    載の方法。
  16. 【請求項１６】前記細胞が細胞モノレヤー（monolaye
    r）に存在する、特許請求の範囲第（14）項又は（15）
    項に記載の方法。
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