JPH03150466A - Ｂ型肝炎ウイルスＰｒｅＳ２ 抗体用ラジオイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＢ型肝炎ウィルスワクチン［リコンビバクス（Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｖａｘ）ＩＩＢ　］は、１９８６イ「から
、ヒト用に使用されている。このワクチンは１３型肝炎
ウィルス表面たんぱく質（ＩＩＩＩｓＩのみで構成され
る２０ナノメータの杓子よりなり、［３型肘炎ウイルス
ｆ　ＨＢ　Ｖ　ｌ　を効果的に導き出すことが立証され
ている。その後、追加的アミノ酸配列、すなわち、１’
ｒｃｓ２として知られるＩＩ　Ｂ　Ｓたんぱく質のＮｌ
＋□末端伸張部分も、ＩＩＢＶ免疫にとって重要である
ことが明らかとなった。さらに、ＩＩＩＩＶワクチンに
ｌ’　ｒ　ｃ　Ｓ　２を包含させることは、イＪ益な効
果をもたらすものと考えられた。

現在、絹換えＦ３型肝炎ウィルスＰｒｅＳ２　＋　Ｓ抗
ＩＱ（ＰｒｅＳ２　＋　Ｓ）よりなる第２世代のＩＩＢ
Ｖワクチンが、現代ヒトに使用するために開発されつつ
ある。ＰｒｅＳ２　＋　ＳのＰｒｅＳ２領域に対して発
生した抗体は、ＩＩＢＶの感染性をブロックすることが
知られている。たんぱく質のＰ　ｒ　ｅ　Ｓ　２領域は
、最近ＩＩ　ｌ（Ｖ中和抗体の発ろ１−のための免役的
慢牛エピトープな含むことが立証されている。ヒトの疾
患の進行においてのＰ　ｒ　ｅ　Ｓ　２領域に対する抗
体の重要性は、Ｂ　！Ｆす肝炎ウィルス（ＩＩＢＶ）感
染からの回復と抗Ｐ　ｒ　ｅＳ　２抗体の存在の直接的
相関関係により強調される。

絹換えＰｒｃＳ２＋Ｓ抗原でワクヂン接種を受けた後、
抗ＰｒｃＳ２抗体の高力価を生ずる患者の能力は、ＩＩ
ＢＶ感染からの防護あるいは疾患の最小限化と直接的に
相関つけられることとなる。従って、ＰｒｃＳ２に対す
る抗体応答は、Ｐ　ｒ　ｅ　Ｓ　２とＳとが一つの連続
したペプチドの一部であるにもかかわらず、抗Ｓ抗体か
らのＴ渉無しにアッセイされることは重要である。

現在、いくつかのアッセイ系が、抗Ｉ’ｒｃＳ２抗体の
検出のために利用されている。これらのアッセイの多く
は、ＰｒｅＳ２の一部又は全部よりなる短い合成ペプチ
ドの形態中にＰｒｅＳ２エピトープを組み入れるもので
ある。大たんぱく質の中の小さなペプチド又は断片は、
最大の抗体評価のための適切な構造形態を５えず場合が
あり、従って自然の抗原−抗体相ｔ７作用を正確に示さ
ない場合がある。

さらに、これらのアッセイ系は、検出モードとして、テ
ストサンプル源の抗体に特異的な、放射線標識又は酵素
結合抗体、例えば、１２５１標識又はアルカリホスファ
ターゼ結合抗ヒトＩｇＧか、ヒト血清中の抗ＰｒｅＳ２
抗体を検出するために使用される。これは、以下の理由
から、バッククラランド的な干渉の増大をもたらす。

■　ＰｒｅＳ２に特異的てないテストサンプル中の抗体
との非特異的相互作用： ■　アッセイ装置の成分と、標識された検出抗体とのヒ
非特異的相互作用；および ■　アッセイ装置に非特異的に吸着されたテストサンプ
ルからの抗体と、標識された検出抗体との相互作用 本発明の目的は、抗ＰｒｅＳ２抗体用の改良されたラジ
オイムノアッセイを提供することにある。本発明の他の
目的は、非特異的ハックグラウンドの干渉を減したアッ
セイを提供することにある。本発明のさらに他の目的は
、抗ＰｒｅＳ２抗体のみを選択的に測定するアッセイを
提供することにある。

本発明のこれら及び他の目的は、以上の記載により明ら
かになるであろう、１ 本発明は、生物学的液体中に存在する抗ＰｒｅＳ２抗体
量を測定するだめの方法を提供する。ここで、生物学的
液体としては、以−ドのものよりなるが、これらに限定
されるものではない。

“血液、血清、プラズマ又は血液生成物、体分泌物及び
排泄物、組織又は組織抽出物並びに細胞槁養液又は細胞
槁養抽出物” 抗１１Ｂｓ抗体は、基体表面１′、に吸着される。次い
で、ＰｒｅＳ２　＋　Ｓたんぱく質の限られたＭが、Ｐ
ｒｅＳ２　＋　Ｓたんぱく質の“Ｓ”部位と抗１１Ｂｓ
抗体の相ｈ：作用により、」−記表面に吸着される（Ｐ
ｒｅＳ２　＋Ｓの吸着は、例えばｒ１５Ａのような非特
異的和げ作用を行うすべての残存部位を占領することが
できる薬剤の存在下で行われる）。次いで、コートされ
た表面は、テストサンプル及び放射線標識抗ＰｒｅＳ２
抗体と共に共存的にインキュベーシミ】ンされる。上記
表面に結合した標識放射線量は、テストサンプル中の抗
１’ｒｃＳ２抗体の量又は有無を決定する。

本発明は、抗ＰｒｅＳ２抗体用のラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）　に関する。

本発明のＲＩＡのための出発物質は、抗Ｂ型肝炎ウイル
ス表面たんばり質（抗ＨＢＳ）抗体である。抗１１Ｂｓ
抗体は種々の源、すなわち、自然感染又は免疫されたヒ
ト又は実験動物又は、絹換え技術により処理された細胞
又は動物から得られるがこれらには限定されない。抗Ｉ
＋　１１　Ｓ抗体は、限定はされないが、ポリクローナ
ル又はモノクローナル抗体又はその断片であることがで
き、さらに、限定されるものではないが、血清、プラズ
マ、腹水液、細胞培養液、細胞抽］１１物又は、−４−
記のものからの抽出物の態であることができる。好まし
い源は、高レベルの抗Ｉ＋　１１３抗体（約Ｉ　Ｘ　ｌ
ｏ’ＭＩＵ／　ｍｌのＡＵＳＡＢ力価）を有することが
判っている個体からのヒト血清又はプラズマである。

抗１１　Ｂ　Ｓ抗体は、適当な基体表面をコートするた
めに使用する。最も一般的な基体のタイプは、プラスチ
ックであり、限定はされないが、ポリエチレン、ポリプ
ロピレン又はポリスチレンが挙げられ、好ましいプラス
チックは、ポリスチレンである。基体は、種々の形状に
形成することができ、限定はされないが、管、皿、級、
マルチウェル（ｍｕｌＬｉｗｅｌｌ）プレート、ビーズ
及びあらゆる容器が挙げられ、ビーズが最も好ましい形
状である。

ビーズは、広範囲のサイズを有することができ、最も好
ましいサイズは、直径約６．３ｍｍである。

抗１１１１３でコートしたビーズは、次いで、限定はさ
れないが合成技術、組換えＤＮＡ技術又は天然源より得
ることのできるＰｒｅＳＺ　＋　Ｓたんぱく質の溶液と
共にインキュベーションする。このインキュベーション
工程中にＰｒｅＳ２＋Ｓをビーズ表面をコートしている
抗）ＩＢＳ抗体とＰｒｅＳＺ　＋Ｓたんぱく質の“Ｓ”
部位の特異的相互作用により、ビーズｆｒ、に吸着させ
る。この吸着操作によりＰｒｅＳＺ＋Ｓたんぱく質の限
られた量がビーズ表面に結合する。ＰｒｅＳＺ　＋　Ｓ
たんぱく質溶液には、非特異的吸石をする残存部位のす
べてを実質的に占領するだめの材料が含まれる。そのよ
うな材料の例とじては、血清アルブミン、血清及びミル
クが挙げられる。この「１的のための最も好ましい材料
は、約１％濃度の牛血清アルブミン（Ｂ５Ａｌである。

ビーズの−様なコーディングを確実に行うために、多数
のビーズ群を同時に調製し、コーディング工程は、−・
定かつゆるやかにタンプリングすることにより行われる
。

１゛記のごとく調製したビーズ（又はいずれかの他の基
体）は、保存することができる。製造後に、基体を乾燥
し、適切な容器に密閉し種々の時間、約−２０℃で保存
する。

抗ＰｒｃＳ２抗体の有無をテストされるべき生物学的液
体のサンプル（テストサンプル）を、１′Ｉ標識抗Ｐｒ
ｅＳＺ抗体の既知量（典型的には約３　Ｘ　１０’　ｃ
ｐｍ　）と混合する。テストサンプルは布釈せずに使用
してもよく、−・連希釈液を調製することもできる。次
いで、この混合物を、［・記のコートしたビーズと共に
インキュベーションする。

抗１’ｒｃｓ２抗体を標識するのに適切な他の手段の存
在も当業者にとって自明である。標識の他の手段として
は、限定はされないが、異なる放射性同位元素（例えば
３１１．３２Ｐ　、　２６Ｓ　、　１４ｃ　）、酵素（
例えばベロキシダーセ、アルカリフオスファターセ）、
及び蛍光体（例えばフルオレセイン、ローダミン）が挙
げられる。加えて、抗体断片と同様に、ポリクローナル
又はモノクローナル抗体もまた標識及びこの方法におけ
る使用に適していることは、当業者にとって自明なこと
である。

抗ＰｒｅＳ２抗体を含まないことがわかっている、異な
るものではあるが近似するテストサンプル（ネカティブ
コントロール）も、同量の放射線標識抗ＰｒｅＳ２抗体
と混合し、調製したビーズと共にインキュベーションす
る。さらに別に、抗ＰｒｃＳ２抗体を含むことがわかっ
ている、異なるが近似するテストサンプル（ポジティブ
コントロール）を、同量の放射線標識抗ＰｒｅＳ２抗体
と混合し製造したビーズと共にインキュベーションする
。テストサンプルのインキュベーション後、ビーズは、
ＰＢＳでていねいに洗浄し、ビーズに結合した放射０ 線活性ｉ？を測定する。

本方法は、テストサンプル中に存在する抗ＰｒｃＳ２抗
体が、コートされたビーズ層、のＰｒｃＳ２結合部位に
ついて、放射線標識抗ＰｒｅＳ２抗体と競合する“競合
アッセイ”である。従って、高レベルのビーズ結合放射
活性は、テストサンプル中の抗ＰｒｅＳ２抗体が低レベ
ルであることを示し、逆に、低レベルのビーズ結合放射
活性は、テストサンプル中の高レベルの抗ＰｒｃＳ２抗
体を示すことになる６又、ビーズをコートしているＰｒ
ｅＳ２＋Ｓの量は限定的であることが重要である。その
理由は、過剰のＰｒｅＳ２＋Ｓはテストサンプル中の抗
ＰｒｅＳ２と放射線標識抗体によるＰｒｅＳ２エピトー
プについての競合を妨害するからである。

木アッセイは、自然発生＋＋ＢＶ感染又はワクチン接種
患者における抗ＰｒｃＳ２抗体の存在を検出するために
使用することができる。特に、ＰｒｅＳ２含有ワクチン
接種を受けたヒトについて、その結果を評価するために
有用である。

以下の実施例は、本発明を説明するためのもの１ であり、本発明を何ら限定するものではない。

尺胤■」 −Ｉ゛稈Δ： 高力価の抗ＨＢＳ抗体（ＡＵＳＡＢ力価約ｌ　Ｘ　Ｉ　
Ｏ’ＭＩＬＩ／　ｍｌ）を含むことがわかっているヒト
血清を希釈剤として炭酸ナトリウノ＼のｐｌ＋９．６の
緩衝液（約０．０８Ｍ）で］　：　１００に希釈する。

この希釈血清を使用してポリスチレンビーズ（６，４ｍ
ｍ　［ｅ＋径）をコートするビーズ層の最上部が、希釈
血清の表面直ドになるまで、希釈血清にビーズを加える
１、典型的には、約１５０ｍ１の血清溶液を使用する。

ビーズは血清溶液中で、−晩（約１５時間）、４°Ｃで
インキュヘーシＥＪンし、コーティングが施す。次いで
、コーディング溶液を排出し、ビーズを少なくとも５回
蒸留水でていねいに洗浄する。

次いでビーズを風乾し、−２０℃で密閉ガラスびノリ中
で保存する。

抗１１Ｂｓ抗体でコートしたビーズは、次いで、１％Ｂ
ＳＡ及び５　ｎｇ／　ｍ１Ｐｒｅｓ２　＋　Ｓたんぱく
質を含むＰＩ’＋Ｓ溶液中でインキュページ三１ンする
。典型的２ には、抗１１Ｂｓ抗体でコートしたビーズを、ビーズ層
の最上部が、ＰｒｅＳＺ　＋Ｓ溶液のちょうど液面直ド
に達するまでｌ！＋ＯｍｌのＰｒｅＳＺ　＋　Ｓ溶液に
加える。ビーズは、静かに回転させながら室温で約５時
間インキユヘーションする。ＰｒｅＳＺ　＋Ｓ溶液を排
出し、ビーズを少なくとも５回蒸留水でていねいに洗浄
する。次いで、ビーズを風乾し、密閉びん中で一２０度
℃で保存する。

、Ｌ程」ユ 約３　Ｘ　１１０５ｃｐを含む放射線標識（＋２Ｊ）千
ツクローナル抗ＰｒｅＳ２抗体の一定量（通例１０μ℃
）を、プラスチックマルチウェルプレート（通例２０つ
］−ルプレート）の各ウェル中１入れる。

ＰｒｅＳＺ　＋　Ｓでワクチン接種した患者からの血清
１．２ｍｌ　　（未知のテストサンプル）を個々のウェ
ルに加える。１０のウェルに、抗ＰｒｃＳ２抗体を含ま
ないネガデイプ：コントロールサンプル０．２ｍｌを１
ノ。

え、少なくとも２つのつ上ルに、抗Ｐ　ｒ　ｃ　Ｓ　２
抗体を含むことがわかっているポジティブコントロール
サンプル０．２ｍｌを１ｊえる。サンプルを完全に混合
　　ｑ し、ＰｒｅＳＺ　＋Ｓたんぱく質でコートしたビーズ１
種を、テストサンプル又はコントロールサンプルを有す
る各ウェルに加える。プレートを密閉し、室温で１８〜
２４時間インキュベーションする。ビズを５ｍｌの蒸留
水でそれぞれ３回洗浄し、適切なガンマカウンター中で
放射活性（ｃｐｍ）を測定するために、それぞれプラス
チックデユープに移す。

結果は以下のごとくである。

９６１（希釈なし）　　７０９　　　７３２３　　４０
１６２８９８　　（１：２１ ３５３３　　ｆｌ：４） ？＋２２　　（１：８）’ ＊：カットオフポイントは、ネカディブコントロールの
１と均ｃｐｍにホシディブコントロールの平均ｃｐｍを
プラスして、２で割ったものとして定義される。未知の
テストサンプルについては、ｃｐｍ　４ がカットオフより低ければ抗ＰｒｅＳ２抗体がポジティ
ブであるとされる。１：この希釈においては、カットオ
フ規準を満足させず、従って抗Ｐ　ｒ　ｃ　Ｓ　２抗体
はネガデイプであるとされる。

灸１昨？ ４　ｐｔのチンパンジー群を、ＰｒｅＳ２　＋　Ｓたん
ぱく質のＰｒｃＳ２領域に相当する合成ペプチドで免疫
する。血清サンプルを免疫チンパンジーから集める。２
匹の免疫されていないチンパンジーからも同様に集める
。＋ｍ　２内サンプルを実施例１［稈Ｆ３のごとく処理
する。２匹の免疫されていない動物は、抗ＰｒｃＳ２抗
体が検出されないのに対して、４匹の免疫された動物は
、検出可能レベルの抗ＰｒｃＳ２抗体をｆ」する。

犬籠廻ｊ チンパンジーが酵母生成の絹換えＰｒｅＳ２　＋　Ｓた
んぱく質で免疫されることを除き、実施例２と同様の操
作を行った。免疫チンパンジーからの１ｆ１［清は、検
出ｉｆ能レしルの抗ＰｒｃＳ２抗体を自する。

　５ 実］ｌ肌Ａ １１：、常なヒトのボランディアの群を、酵Ｒ）生成組
換えＰｒｃＳ２＋Ｓたんぱく質で免疫する。血清サンプ
ルを集め抗ＰｒｃＳ２抗体のためのアッセイを実施例１
、二Ｆ稈Ｂに従って行う１．血清サンプルには、検出可
能レベルの抗ＰｒｅＳ２抗体が含まれることが見い出さ
れた。

火胤■１ 正常なヒトボランティア群に異なる投与量で酵母生成組
換えＰｒｅＳＺ＋Ｓたんぱく質をワクチン接種する。＋
ｆｎ清サンプルを１ケ月間隔でワクチン接種者から集め
、実施例１、工程Ｂに従って、抗ＰｒｅＳ２抗体の有無
についてアッセイする。個々の抗体応答曲線が、成功し
た免疫化を示す時間にわたってワクチン接種者から、生
成する。

平成２年１１月２０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的液体中の抗ＰｒｅＳ２抗体を検出する方法
   であって、 （１）ポリスチレンビース表面を抗ＨＢＳ抗体でコート
   し、 （２）ＰｒｅＳ２＋Ｓたんぱく質を抗ＨＢＳ抗体でコー
   トされたビーズへ吸着させ、 （３）別に、約３×１０＾５ｃｐｍの＾１＾２＾５Ｉ標
   識抗ＰｒｅＳ２抗体とそれぞれ混合することによるテス
   トサンプル、ポジティブコントロール及びネガティブコ
   ントロールサンプルを調製し、 （４）（２）のコートされたビーズを（３）で調製した
   サンプルとインキュベーションし、 （５）該ビーズに結合した標識抗ＰｒｅＳ２抗体の量を
   測定し、サンプルの中の抗ＰｒｅＳ２抗体レベルを計算
   することよりなる方法。 ２、抗ＨＢＳ抗体及び吸着されたＰｒｅＳ２＋Ｓたんぱ
   く質でコートされたポリスチレンビーズ。 ３、抗ＰｒｅＳ２抗体の検出に使用できる請求項２記載
   のポリスチレンビーズを含むパッケージ又はキット。