JP2002128798A - Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｃｖ）に対する抗体の検出のためのペプチド及びその混合物 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｃｖ）に対する抗体の検出のためのペプチド及びその混合物Info
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
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- C07K16/109—Hepatitis C virus; Hepatitis G virus
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＨＣＶ感染の診断および治療を提供するこ
と。 【解決手段】 ＨＣＶ抗原の検出およびＨＣＶ感染に対
するワクチンに使用するペプチドの合成および同定によ
り解決される。
と。 【解決手段】 ＨＣＶ抗原の検出およびＨＣＶ感染に対
するワクチンに使用するペプチドの合成および同定によ
り解決される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＨＣＶ感染の検出及
び定量に有用な新規直鎖状ペプチド及びその混合物に関
する。これらのペプチドはＨＣＶ感染に対するワクチン
の活性成分としても有用である。
び定量に有用な新規直鎖状ペプチド及びその混合物に関
する。これらのペプチドはＨＣＶ感染に対するワクチン
の活性成分としても有用である。
【０００２】
【従来の技術】１９７３年に、Ａ型肝炎又はＢ型肝炎ウ
ィルスのいずれとも関連しない型の肝炎を記述するため
に非Ａ非Ｂ型肝炎(ＮＡＮＢ)という新しい用語が導入さ
れた。ＮＡＮＢは１つより多い要因により起こると推定
された。実際それから肝炎の伝染を担う２種類の新しい
ウィルスが同定された。最初のものはＥ型肝炎ウィルス
でありＡ型肝炎ウィルスと同様に汚水により伝染する。
第２のものはＣ型肝炎ウィルス(ＨＣＶ)であり、Ｂ型肝
炎ウィルスと同様に主に感染血液を介して伝染する。Ｃ
型肝炎は、Ａ及びＢ型肝炎に関して血清陰性の患者に見
られるウィルス性肝炎の最も普通の型である。
ィルスのいずれとも関連しない型の肝炎を記述するため
に非Ａ非Ｂ型肝炎(ＮＡＮＢ)という新しい用語が導入さ
れた。ＮＡＮＢは１つより多い要因により起こると推定
された。実際それから肝炎の伝染を担う２種類の新しい
ウィルスが同定された。最初のものはＥ型肝炎ウィルス
でありＡ型肝炎ウィルスと同様に汚水により伝染する。
第２のものはＣ型肝炎ウィルス(ＨＣＶ)であり、Ｂ型肝
炎ウィルスと同様に主に感染血液を介して伝染する。Ｃ
型肝炎は、Ａ及びＢ型肝炎に関して血清陰性の患者に見
られるウィルス性肝炎の最も普通の型である。
【０００３】すべての肝炎ウィルス感染献血を同定し、
除去する多大な努力にもかかわらず、輸血−関連肝炎が
報告され続けている。無症候性キャリヤーはありふれて
おり、彼らは多くの場合感染後１０−３０年以内に肝硬
変及び肝細胞癌に向かって進行する。それが発見される
国に依存してＨＣＶ感染は輸血後肝炎のすべての場合の
５０％−９０％にのぼり、実際にＨＣＶは世界中で大き
な公衆衛生の問題を提起している。
除去する多大な努力にもかかわらず、輸血−関連肝炎が
報告され続けている。無症候性キャリヤーはありふれて
おり、彼らは多くの場合感染後１０−３０年以内に肝硬
変及び肝細胞癌に向かって進行する。それが発見される
国に依存してＨＣＶ感染は輸血後肝炎のすべての場合の
５０％−９０％にのぼり、実際にＨＣＶは世界中で大き
な公衆衛生の問題を提起している。
【０００４】最近までＨＣＶの同定及び単離の試みは失
敗であった。２つの米国の研究はＮＡＮＢ感染血清が多
くの場合アラニン アミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)
活性が高いことが見受けられるか、あるいはＢ型肝炎ウ
ィルスのコア(core)抗原抗体(抗−ＨＢc)に関して陽性
であったことを示した。従って１９８７年にすべての献
血をＡＬＴ及び抗−ＨＢcに関してスクリーニングする
ことが決定された。これらの試験は輸血−関連ＮＡＮＢ
肝炎の５０％をも予防したと思われる。
敗であった。２つの米国の研究はＮＡＮＢ感染血清が多
くの場合アラニン アミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)
活性が高いことが見受けられるか、あるいはＢ型肝炎ウ
ィルスのコア(core)抗原抗体(抗−ＨＢc)に関して陽性
であったことを示した。従って１９８７年にすべての献
血をＡＬＴ及び抗−ＨＢcに関してスクリーニングする
ことが決定された。これらの試験は輸血−関連ＮＡＮＢ
肝炎の５０％をも予防したと思われる。
【０００５】１９８９年にＨＣＶが同定され、クローニ
ングされた(Ｃhoo et al. Ｓcience, ２４４, ３４９−
３６２, １９８９)。１０kbの一本鎖ＲＮＡウィルスで
あるＨＣＶはフラヴィウィルスの遠縁である。ＨＣＶ
ＲＮＡの配列決定及びそのＲＮＡとフラヴィウィルスＲ
ＮＡの比較によりＨＣＶの普遍的体制が提案された。Ｈ
ＣＶ ＲＮＡは読み込まれて１個の前駆体タンパク質と
なり、それが７又は８個のタンパク質フラグメントに切
断されると思われる。前駆体の第１領域はＣ(コア)、Ｍ
(膜)及びＥ(エンベロープ)と呼ばれる３個の構造タンパ
ク質分子を含むと思われる。しかしＭ及びＥタンパク質
は１個のタンパク質に融合され得る。前駆体の第２の領
域はＮＳ1−ＮＳ5と名付けられた５個の非構造タンパク
質を含む。ＮＳ2はおそらくプロテアーゼであり、ＮＳ5
はおそらくＲＮＡポリメラーゼである。
ングされた(Ｃhoo et al. Ｓcience, ２４４, ３４９−
３６２, １９８９)。１０kbの一本鎖ＲＮＡウィルスで
あるＨＣＶはフラヴィウィルスの遠縁である。ＨＣＶ
ＲＮＡの配列決定及びそのＲＮＡとフラヴィウィルスＲ
ＮＡの比較によりＨＣＶの普遍的体制が提案された。Ｈ
ＣＶ ＲＮＡは読み込まれて１個の前駆体タンパク質と
なり、それが７又は８個のタンパク質フラグメントに切
断されると思われる。前駆体の第１領域はＣ(コア)、Ｍ
(膜)及びＥ(エンベロープ)と呼ばれる３個の構造タンパ
ク質分子を含むと思われる。しかしＭ及びＥタンパク質
は１個のタンパク質に融合され得る。前駆体の第２の領
域はＮＳ1−ＮＳ5と名付けられた５個の非構造タンパク
質を含む。ＮＳ2はおそらくプロテアーゼであり、ＮＳ5
はおそらくＲＮＡポリメラーゼである。
【０００６】ＨＣＶウィルスタンパク質の領域を用いた
ＨＣＶのための数種の診断試験が開発された(例えばＫu
o et al. Ｓcience, ２４４, ３６２−３６４, １９８
９)。そのような試験の１つはＣ１００−３と名付けら
れたタンパク質フラグメントを用いる。これはＮＳ3及
びＮＳ4非構造タンパク質を含む融合タンパク質であ
る。ＥＬＩＳＡにおいて、このタンパク質は１００％有
効ではないことが示された。例えば試験は感染後９０日
以内で臨床的に急性と診断されるＨＣＶの例のわずか１
０−２９％、及び臨床的に慢性ＨＣＶと診断される例の
６７−８５％しか検出しないことを種々の報告が示して
いる(ＨＣＶ Ｌearning Ｇuide；Ａbbott Ｄiagnostics
Ｅducational Ｓervices, Ａpril １９９０；Ｋuo et
al. Ｓcience,２４４, ３６２−３６４, １９８９；Ｅs
teban et al. Ｌancet ２, ２９４−２９６, １９８
９；van der Ｐoel et al. Ｌancet ２, ２９７−２９
８, １９８９；Ｊanot et al., Ｌancet ２, ７９６−
７９７, １９８９；Ｂruix et al.Ｌancet ２, １００
４−１００６, １９８９；Ｃolombo et al. Ｌancet
２, １００６−１００８, １９８９)。従ってこれらの
検定はＨＣＶのスクリーニングプログラムで有効である
ために十分な感受性を示さない。
ＨＣＶのための数種の診断試験が開発された(例えばＫu
o et al. Ｓcience, ２４４, ３６２−３６４, １９８
９)。そのような試験の１つはＣ１００−３と名付けら
れたタンパク質フラグメントを用いる。これはＮＳ3及
びＮＳ4非構造タンパク質を含む融合タンパク質であ
る。ＥＬＩＳＡにおいて、このタンパク質は１００％有
効ではないことが示された。例えば試験は感染後９０日
以内で臨床的に急性と診断されるＨＣＶの例のわずか１
０−２９％、及び臨床的に慢性ＨＣＶと診断される例の
６７−８５％しか検出しないことを種々の報告が示して
いる(ＨＣＶ Ｌearning Ｇuide；Ａbbott Ｄiagnostics
Ｅducational Ｓervices, Ａpril １９９０；Ｋuo et
al. Ｓcience,２４４, ３６２−３６４, １９８９；Ｅs
teban et al. Ｌancet ２, ２９４−２９６, １９８
９；van der Ｐoel et al. Ｌancet ２, ２９７−２９
８, １９８９；Ｊanot et al., Ｌancet ２, ７９６−
７９７, １９８９；Ｂruix et al.Ｌancet ２, １００
４−１００６, １９８９；Ｃolombo et al. Ｌancet
２, １００６−１００８, １９８９)。従ってこれらの
検定はＨＣＶのスクリーニングプログラムで有効である
ために十分な感受性を示さない。
【０００７】これらのＨＣＶ検定の特異性も許容し得な
い程低い。いくらかの誤った陽性はスーパーオキシドジ
スムターゼとの反応(この検定に用いたＨＣＶ Ｃ１０
０−３タンパク質フラグメントはスーパーオキシドジス
ムターゼ、ＳＯＤとの融合タンパク質として発現され
る)(Ｉkeda et al. Ｌancet, ３３５：１３４５−６,１
９９０)、リウマチ因子への反応(Ｔheilman et al. Ｌa
ncet, ３３５, １３４６, １９９０)又は典型的に自己
免疫慢性活動性肝炎に伴う高グロブリン血症の状態(Ｍc
Ｆarlane et al. Ｌancet, ３３５, ７５４−７５７,
１９９０；Ｂoudart et al. Ｌancet, ３３６, ６３,
１９９０)に帰せられた。
い程低い。いくらかの誤った陽性はスーパーオキシドジ
スムターゼとの反応(この検定に用いたＨＣＶ Ｃ１０
０−３タンパク質フラグメントはスーパーオキシドジス
ムターゼ、ＳＯＤとの融合タンパク質として発現され
る)(Ｉkeda et al. Ｌancet, ３３５：１３４５−６,１
９９０)、リウマチ因子への反応(Ｔheilman et al. Ｌa
ncet, ３３５, １３４６, １９９０)又は典型的に自己
免疫慢性活動性肝炎に伴う高グロブリン血症の状態(Ｍc
Ｆarlane et al. Ｌancet, ３３５, ７５４−７５７,
１９９０；Ｂoudart et al. Ｌancet, ３３６, ６３,
１９９０)に帰せられた。
【０００８】Ｃ１００−３に基づく検定の感受性及び特
異性を向上させる試みにおいて、組み替えイムノブロッ
ト検定(ＲＩＢＡ；Ｃhiron−Ｏrtho)が開発された。こ
の試験は組み替えＨＣＶタンパク質Ｃ１００−３(Ｃ−
１００とも呼ばれる)及びＣ−１００の５−１−１フラ
グメント(この遺伝子産物はＮＳ3のＣ−末端及びＮＳ4
のＮ−末端の一部を含む)の２個のＨＣＶ抗原を用い
る。ＳＯＤを標準として用いる。５−１−１抗原はＳＯ
Ｄ融合物としてＥ.coli中で生産される。Ｃ−１００ペ
プチドは酵母中でやはりＳＯＤ融合物として生産され
る。低−危険(low−risk)集団のＥＬＩＳＡスクリーニ
ング(Ｃ１００−３を用いる)の確認にＲＩＢＡを用い、
特に米国の献血者の場合、ＥＬＩＳＡの繰り返し陽性試
料全体のわずか１９％がＲＩＢＡでも陽性とされ、２０
％は未定であった(Ｍenitove et al, Ｌancet, ３３６,
２４３−２４４, １９９０)。
異性を向上させる試みにおいて、組み替えイムノブロッ
ト検定(ＲＩＢＡ；Ｃhiron−Ｏrtho)が開発された。こ
の試験は組み替えＨＣＶタンパク質Ｃ１００−３(Ｃ−
１００とも呼ばれる)及びＣ−１００の５−１−１フラ
グメント(この遺伝子産物はＮＳ3のＣ−末端及びＮＳ4
のＮ−末端の一部を含む)の２個のＨＣＶ抗原を用い
る。ＳＯＤを標準として用いる。５−１−１抗原はＳＯ
Ｄ融合物としてＥ.coli中で生産される。Ｃ−１００ペ
プチドは酵母中でやはりＳＯＤ融合物として生産され
る。低−危険(low−risk)集団のＥＬＩＳＡスクリーニ
ング(Ｃ１００−３を用いる)の確認にＲＩＢＡを用い、
特に米国の献血者の場合、ＥＬＩＳＡの繰り返し陽性試
料全体のわずか１９％がＲＩＢＡでも陽性とされ、２０
％は未定であった(Ｍenitove et al, Ｌancet, ３３６,
２４３−２４４, １９９０)。
【０００９】もっと最近になってＨＣＶのための別のド
ット−ブロット検定がＡbbott Ｌaboratoriesにより開
発された。この検定では４種類の精製組み替え抗原を１
枚のニトロセルロース紙上の離れた位置にスポットす
る。抗原の１つ(ＳＯＤ−Ｃ−１００)は酵母細胞により
生産され、他の４つ(Ｃ−１００、ＨＣＶコアタンパク
質及び３３c)はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ(ＣＫＳ)と
の融合物としてＥ.coli中で生産される。３３c抗原はＮ
Ｓ3タンパク質の大部分を含む。Ｍimms et al(Ｌancet,
３３６, １５９０−１５９１, １９９０)は、Ｃ１００
−３を用いたＥＬＩＳＡによりＨＣＶ陽性とわかった１
５３の試料につきこの試験を用いた時に得た結果を報告
した。試料の半分(７５)のみが２個のＣ−１００遺伝子
産物−−ＳＯＤ−Ｃ１００−３融合物及びＣ−１００−
ＣＫＳ融合物−−と反応性であることが見いだされた。
他の試料は４個の抗原のいずれとも反応しない(６２)
か、あるいは酵母中で生産されたＳＯＤ−Ｃ−１００融
合物と非特異的に反応した(１６)。
ット−ブロット検定がＡbbott Ｌaboratoriesにより開
発された。この検定では４種類の精製組み替え抗原を１
枚のニトロセルロース紙上の離れた位置にスポットす
る。抗原の１つ(ＳＯＤ−Ｃ−１００)は酵母細胞により
生産され、他の４つ(Ｃ−１００、ＨＣＶコアタンパク
質及び３３c)はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ(ＣＫＳ)と
の融合物としてＥ.coli中で生産される。３３c抗原はＮ
Ｓ3タンパク質の大部分を含む。Ｍimms et al(Ｌancet,
３３６, １５９０−１５９１, １９９０)は、Ｃ１００
−３を用いたＥＬＩＳＡによりＨＣＶ陽性とわかった１
５３の試料につきこの試験を用いた時に得た結果を報告
した。試料の半分(７５)のみが２個のＣ−１００遺伝子
産物−−ＳＯＤ−Ｃ１００−３融合物及びＣ−１００−
ＣＫＳ融合物−−と反応性であることが見いだされた。
他の試料は４個の抗原のいずれとも反応しない(６２)
か、あるいは酵母中で生産されたＳＯＤ−Ｃ−１００融
合物と非特異的に反応した(１６)。
【００１０】上記から、現在利用できる組み替え抗原に
基づくＨＣＶ診断試験は低い感受性及び低い選択性を示
すことがわかる。それらは大きな割合(１５％−３３％)
の慢性ＨＣＶの例及び大きな割合(７０％−９０％)の急
性の例を見逃す。検出された試料の約５０％は誤った陽
性である。さらにイムノブロット検定は、血液銀行にお
ける日常的スクリーニングには高価で骨が折れすぎる。
従ってＨＣＶ感染の診断のためのより感受性が高くより
特異的な試験の開発が明確に必要とされている。
基づくＨＣＶ診断試験は低い感受性及び低い選択性を示
すことがわかる。それらは大きな割合(１５％−３３％)
の慢性ＨＣＶの例及び大きな割合(７０％−９０％)の急
性の例を見逃す。検出された試料の約５０％は誤った陽
性である。さらにイムノブロット検定は、血液銀行にお
ける日常的スクリーニングには高価で骨が折れすぎる。
従ってＨＣＶ感染の診断のためのより感受性が高くより
特異的な試験の開発が明確に必要とされている。
【００１１】
【発明の概略】本発明は上記の問題を解決する。本発明
は特別のＨＣＶペプチド及びその混合物に基づくＨＣＶ
診断試験を提示する。本発明のペプチドは： (ｉ)
は特別のＨＣＶペプチド及びその混合物に基づくＨＣＶ
診断試験を提示する。本発明のペプチドは： (ｉ)
【表１】 [ここでaはアミノ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカ
ップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は
抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、bはカ
ルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリン
グを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活性
を向上させるのに有効な置換基である]及びこれらの類
似体、ならびに
ップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は
抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、bはカ
ルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリン
グを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活性
を向上させるのに有効な置換基である]及びこれらの類
似体、ならびに
【００１２】(ii)式 a−Ｘ−c−Ｚ−b [式中、Ｘ及びＺは独立して
【表２】 これらの類似体、及びＸ及びＺならびにそれらの類似体
のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続アミノ酸のブロ
ックを含むそのフラグメントから成るアミノ酸配列の群
から選ばれ、a及びbは上記と同義であり、cは、存在す
る場合、１又は２個のアミノ酸あるいはタンデムのペプ
チドのカップリングを容易にするか又はタンデムペプチ
ドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有効な
置換基のリンカーである］を有するタンデムペプチドか
ら成る群より選ばれる。
のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続アミノ酸のブロ
ックを含むそのフラグメントから成るアミノ酸配列の群
から選ばれ、a及びbは上記と同義であり、cは、存在す
る場合、１又は２個のアミノ酸あるいはタンデムのペプ
チドのカップリングを容易にするか又はタンデムペプチ
ドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有効な
置換基のリンカーである］を有するタンデムペプチドか
ら成る群より選ばれる。
【００１３】本発明のペプチド及びその混合物はＨＣＶ
感染に関する血液及び体液のスクリーニング、ならびに
ＨＣＶに対する安全で有効なワクチンの製造に有用であ
る。例えば本発明のペプチド及びその混合物はＨＣＶに
対する抗体の検出のための多様な特異的結合検定で、Ｈ
ＣＶ抗原の検出に有用な抗体を誘起する免疫原として、
及びＨＣＶウィルス感染に対するワクチンの製造で有用
である。
感染に関する血液及び体液のスクリーニング、ならびに
ＨＣＶに対する安全で有効なワクチンの製造に有用であ
る。例えば本発明のペプチド及びその混合物はＨＣＶに
対する抗体の検出のための多様な特異的結合検定で、Ｈ
ＣＶ抗原の検出に有用な抗体を誘起する免疫原として、
及びＨＣＶウィルス感染に対するワクチンの製造で有用
である。
【００１４】 〔図面の簡単な説明〕 図１はＴakeuchi et al. Ｎucleic Ａcids Ｒes., １
８, ４６２６, １９９０)に記載のＨＣＶの推定コア遺
伝子産物のアミノ酸配列を示す。図２はＴakeuchi et a
l(同上)に記載の推定エンベロープ遺伝子産物のアミノ
酸配列を示す。図３は本発明のペプチド及び比較のため
に製造された他の種々のペプチドのアミノ酸配列を示
す。図１及び２の配列中のペプチドの位置も示す。位置
２０７、２２６及び２２９のシステイン残基(ＢＣＨ−
４２７(配列番号：２)、ＢＣＨ−４２９(配列番号：３)
及びＢＣＨ−４５８(配列番号：１３)はセリン残基で置
換された。
８, ４６２６, １９９０)に記載のＨＣＶの推定コア遺
伝子産物のアミノ酸配列を示す。図２はＴakeuchi et a
l(同上)に記載の推定エンベロープ遺伝子産物のアミノ
酸配列を示す。図３は本発明のペプチド及び比較のため
に製造された他の種々のペプチドのアミノ酸配列を示
す。図１及び２の配列中のペプチドの位置も示す。位置
２０７、２２６及び２２９のシステイン残基(ＢＣＨ−
４２７(配列番号：２)、ＢＣＨ−４２９(配列番号：３)
及びＢＣＨ−４５８(配列番号：１３)はセリン残基で置
換された。
【００１５】図１−３において、配列のアミノ酸残基は
以下の１文字記号を用いて示す：Ａ＝ala、Ｃ＝cys、Ｄ
＝asp、Ｅ＝glu、Ｆ＝phe、Ｇ＝gly、Ｈ＝his、Ｉ＝il
e、Ｋ＝lys、Ｌ＝leu、Ｍ＝met、Ｎ＝asn、Ｐ＝pro、Ｑ
＝gln、Ｒ＝arg、Ｓ＝ser、Ｔ＝thr、Ｖ＝val、Ｗ＝tr
p、Ｙ＝tyr。
以下の１文字記号を用いて示す：Ａ＝ala、Ｃ＝cys、Ｄ
＝asp、Ｅ＝glu、Ｆ＝phe、Ｇ＝gly、Ｈ＝his、Ｉ＝il
e、Ｋ＝lys、Ｌ＝leu、Ｍ＝met、Ｎ＝asn、Ｐ＝pro、Ｑ
＝gln、Ｒ＝arg、Ｓ＝ser、Ｔ＝thr、Ｖ＝val、Ｗ＝tr
p、Ｙ＝tyr。
【００１６】 〔発明の詳細な説明〕本発明はＨＣＶの推定コア遺伝子
産物の免疫優性領域に対応する新規ペプチド及びその類
似体を提示する。ＨＣＶの推定エンベロープタンパク質
の活性領域を含む１個のペプチドも記載する。本発明は
これらのペプチドならびに類似体の混合物及び化学的結
合物(タンデム)も提示する。以下の説明から明白な通り
これらのペプチド、類似体、混合物及びタンデムはＨＣ
Ｖ及びそれによって起こる感染に関する多様な診断及び
予防法、装置ならびに組成物において有用である。
産物の免疫優性領域に対応する新規ペプチド及びその類
似体を提示する。ＨＣＶの推定エンベロープタンパク質
の活性領域を含む１個のペプチドも記載する。本発明は
これらのペプチドならびに類似体の混合物及び化学的結
合物(タンデム)も提示する。以下の説明から明白な通り
これらのペプチド、類似体、混合物及びタンデムはＨＣ
Ｖ及びそれによって起こる感染に関する多様な診断及び
予防法、装置ならびに組成物において有用である。
【００１７】上記で示した通り、本発明のペプチドは
(ｉ)
(ｉ)
【表３】 [ここでaはアミノ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカ
ップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は
抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、bはカ
ルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリン
グを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活性
を向上させるのに有効な置換基である］及びこれらの類
似体、ならびに
ップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は
抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、bはカ
ルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリン
グを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活性
を向上させるのに有効な置換基である］及びこれらの類
似体、ならびに
【００１８】(ii)式 a−Ｘ−c−Ｚ−b [式中、Ｘ及びＺは独立して
【表４】 これらの類似体、及びＸ及びＺならびにそれらの類似体
のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続アミノ酸のブロ
ックを含むそのフラグメントから成るアミノ酸配列の群
から選ばれ、a及びbは上記と同義であり、cは、存在す
る場合、１又は２個のアミノ酸あるいはタンデムのペプ
チドのカップリングを容易にするか又はタンデムペプチ
ドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有効な
置換基のリンカーである］を有するタンデムペプチドか
ら成る群より選ばれる。
のアミノ酸配列の少なくとも６個の連続アミノ酸のブロ
ックを含むそのフラグメントから成るアミノ酸配列の群
から選ばれ、a及びbは上記と同義であり、cは、存在す
る場合、１又は２個のアミノ酸あるいはタンデムのペプ
チドのカップリングを容易にするか又はタンデムペプチ
ドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有効な
置換基のリンカーである］を有するタンデムペプチドか
ら成る群より選ばれる。
【００１９】本文で用いられる“類似体”は、天然に存
在するＨＣＶアミノ酸配列のブロックを含む類似体のそ
の部分のペプチド鎖の１又はそれ以上の部位におけるア
ミノ酸挿入、欠失、置換及び修飾を示す。
在するＨＣＶアミノ酸配列のブロックを含む類似体のそ
の部分のペプチド鎖の１又はそれ以上の部位におけるア
ミノ酸挿入、欠失、置換及び修飾を示す。
【００２０】本発明のペプチドの本来のアミノ酸配列に
対する好ましい修飾及び置換は同類のものである(すな
わちペプチドの二次構造及びヒドロパシー性(hydropath
ic property)への影響が最小であるもの)。これらには
Ａtlas of Ｐrotein Ｓequenceand Ｓtructure ５, １
９８９にてＤayhoffにより、及びＥＭＢＯ Ｊ., ８, ７
７９−７８５, １９８９にてＡrgosにより記載されてい
るような置換が含まれる。例えば以下の群の１つに属す
るアミノ酸は同類置換を示す：ala, pro, gly, glu, as
p．gln, asn, ser, thr；cys, ser, tyr, thr；val, il
e, leu, met, ala, phe；lys, arg, his；及びphe, ty
r, trp, his。
対する好ましい修飾及び置換は同類のものである(すな
わちペプチドの二次構造及びヒドロパシー性(hydropath
ic property)への影響が最小であるもの)。これらには
Ａtlas of Ｐrotein Ｓequenceand Ｓtructure ５, １
９８９にてＤayhoffにより、及びＥＭＢＯ Ｊ., ８, ７
７９−７８５, １９８９にてＡrgosにより記載されてい
るような置換が含まれる。例えば以下の群の１つに属す
るアミノ酸は同類置換を示す：ala, pro, gly, glu, as
p．gln, asn, ser, thr；cys, ser, tyr, thr；val, il
e, leu, met, ala, phe；lys, arg, his；及びphe, ty
r, trp, his。
【００２１】同様にして酸化され易いアミノ酸であるメ
チオニンは本発明のペプチドにおいてノルロイシンによ
り置換することができる。好ましい置換はＤ−異性体の
対応するＬ−アミノ酸への置換も含む。
チオニンは本発明のペプチドにおいてノルロイシンによ
り置換することができる。好ましい置換はＤ−異性体の
対応するＬ−アミノ酸への置換も含む。
【００２２】本文で用いられる“アミノ酸”という用語
(例えばa及びbならびに類似体の定義中)は、ＨＣＶの遺
伝子産物の本来のアミノ酸配列を言う場合以外は、天然
のアミノ酸のすべて、Ｄ−立体配置であるそれらのアミ
ノ酸、及び既知の本来でない、合成、及び修飾アミノ
酸、例えばホモシステイン、オルニチン、ノルロイシン
及びβ−バリンを含む。
(例えばa及びbならびに類似体の定義中)は、ＨＣＶの遺
伝子産物の本来のアミノ酸配列を言う場合以外は、天然
のアミノ酸のすべて、Ｄ−立体配置であるそれらのアミ
ノ酸、及び既知の本来でない、合成、及び修飾アミノ
酸、例えばホモシステイン、オルニチン、ノルロイシン
及びβ−バリンを含む。
【００２３】上記に簡単に示した通り、選ばれたペプチ
ドを免疫診断薬として、又はワクチンの活性成分として
より有用にするために本発明のペプチドを修飾すること
は、多くの場合有用であり、確実に本発明の範囲内であ
る。そのような変更には例えば以下が含まれる： −ペプチドのスルホスクシンイミジル−４−(ｐ−マレ
イミドフェニル)ブチレートなどのヘテロ(hetero)二官
能基性架橋剤を有する適したキャリヤーヘのカップリン
グを容易にするための、一方又は両方の末端へのシステ
イン残基の付加。そのような結合を行うための好ましい
試薬はスルホスクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミド
メチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート及びＮ
−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピ
オネートである。
ドを免疫診断薬として、又はワクチンの活性成分として
より有用にするために本発明のペプチドを修飾すること
は、多くの場合有用であり、確実に本発明の範囲内であ
る。そのような変更には例えば以下が含まれる： −ペプチドのスルホスクシンイミジル−４−(ｐ−マレ
イミドフェニル)ブチレートなどのヘテロ(hetero)二官
能基性架橋剤を有する適したキャリヤーヘのカップリン
グを容易にするための、一方又は両方の末端へのシステ
イン残基の付加。そのような結合を行うための好ましい
試薬はスルホスクシンイミジル−４−(Ｎ−マレイミド
メチル)シクロヘキサン−１−カルボキシレート及びＮ
−スクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチオ)プロピ
オネートである。
【００２４】−ペプチドの互いの結合を容易にする、担
体又はより大きなペプチドあるいはタンパク質へのカッ
プリングのための、又はペプチドの物理的あるいは化学
的性質を修正するための、ペプチドの一方又は両方の末
端における１−８個の追加のアミノ酸の付加。そのよう
な変更の例はエステル化反応を介したリンカーとしての
Ｎ−又はＣ−末端チロシン、グルタミン酸又はアスパラ
ギン酸及びシッフ塩基を介して結合することができるリ
シンの付加、あるいはアミド形成である。上記の通り追
加のアミノ酸は天然のアミノ酸、Ｄ−立体配置のそれら
のアミノ酸及び既知の、本来でない、合成の及び修飾さ
れたアミノ酸のいずれも含むことができる。
体又はより大きなペプチドあるいはタンパク質へのカッ
プリングのための、又はペプチドの物理的あるいは化学
的性質を修正するための、ペプチドの一方又は両方の末
端における１−８個の追加のアミノ酸の付加。そのよう
な変更の例はエステル化反応を介したリンカーとしての
Ｎ−又はＣ−末端チロシン、グルタミン酸又はアスパラ
ギン酸及びシッフ塩基を介して結合することができるリ
シンの付加、あるいはアミド形成である。上記の通り追
加のアミノ酸は天然のアミノ酸、Ｄ−立体配置のそれら
のアミノ酸及び既知の、本来でない、合成の及び修飾さ
れたアミノ酸のいずれも含むことができる。
【００２５】−例えばアシル化又はアミド化によるペプ
チドの一方あるいは両方の末端の誘導。これらの修飾は
ペプチドヘの正味の電荷の変化を生ずるか、又は固体担
体、キャリヤー又は他のペプチドヘのペプチドの共有結
合を容易にもする。カップリングを容易にする、又はペ
プチドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有
効な置換基の例は、Ｃ2−Ｃ15アシル基、ポリエチレン
グリコール及びリン脂質である。
チドの一方あるいは両方の末端の誘導。これらの修飾は
ペプチドヘの正味の電荷の変化を生ずるか、又は固体担
体、キャリヤー又は他のペプチドヘのペプチドの共有結
合を容易にもする。カップリングを容易にする、又はペ
プチドの免疫原性あるいは抗原活性を向上させるのに有
効な置換基の例は、Ｃ2−Ｃ15アシル基、ポリエチレン
グリコール及びリン脂質である。
【００２６】上記の(ii)に示されている通り、タンデム
ペプチドの使用は本発明の範囲内である。これらのペプ
チドはホモポリマー又はコポリマーであることができ
る。本発明のペプチドの物理的混合物及びタンデムペプ
チドも本発明の範囲内である。
ペプチドの使用は本発明の範囲内である。これらのペプ
チドはホモポリマー又はコポリマーであることができ
る。本発明のペプチドの物理的混合物及びタンデムペプ
チドも本発明の範囲内である。
【００２７】本発明の好ましいペプチドはＢＣＨ−４２
３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３７(配列番号：６)、Ｂ
ＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列
番号：８)である。最も好ましい本発明のペプチドはＢ
ＣＨ−４３８(配列番号：７)である。本発明の好ましい
ペプチド混合物及びタンデムは少なくともＢＣＨ−４３
８(配列番号：７)を含む。ＢＣＨ−４３８ (配列番号：
７)及びＢＣＨ−４６１(配列番号：１４)を含むのがさ
らに好ましい。
３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３７(配列番号：６)、Ｂ
ＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列
番号：８)である。最も好ましい本発明のペプチドはＢ
ＣＨ−４３８(配列番号：７)である。本発明の好ましい
ペプチド混合物及びタンデムは少なくともＢＣＨ−４３
８(配列番号：７)を含む。ＢＣＨ−４３８ (配列番号：
７)及びＢＣＨ−４６１(配列番号：１４)を含むのがさ
らに好ましい。
【００２８】本発明のペプチド及び混合物の予想に反し
た利点は、その高い感受性である。これらはＨＣＶ診断
キットの性能の評価のために販売されている市販のパネ
ルに存在する血清陽性が確認された試料の大多数、又は
時にはすべてにおいてＨＣＶ−特異的抗体を検出するこ
とができる。本発明のペプチド及び混合物の他の利点
は、その高い特異性である。例えばＢＣＨ−４３７(配
列番号：６)又はＢＣＨ−４３８(配列番号：７)を用い
て、正常な献血集団から採取した６３の試料を調べた場
合、誤った陽性は記録されなかった。
た利点は、その高い感受性である。これらはＨＣＶ診断
キットの性能の評価のために販売されている市販のパネ
ルに存在する血清陽性が確認された試料の大多数、又は
時にはすべてにおいてＨＣＶ−特異的抗体を検出するこ
とができる。本発明のペプチド及び混合物の他の利点
は、その高い特異性である。例えばＢＣＨ−４３７(配
列番号：６)又はＢＣＨ−４３８(配列番号：７)を用い
て、正常な献血集団から採取した６３の試料を調べた場
合、誤った陽性は記録されなかった。
【００２９】さらにＨＣＶ診断装置、方法及び組成物中
で使用する他に、本発明のペプチド及びその混合物はＨ
ＣＶ感染に対するワクチンにおいても有用である。
で使用する他に、本発明のペプチド及びその混合物はＨ
ＣＶ感染に対するワクチンにおいても有用である。
【００３０】本発明の新規ペプチドの製造のために、従
来のペプチド製造法のいずれも用いることができる。こ
れらには合成、組み替えＤＮＡ法及びそれらの組み合わ
せが含まれる。我々は固相合成につき言及する。
来のペプチド製造法のいずれも用いることができる。こ
れらには合成、組み替えＤＮＡ法及びそれらの組み合わ
せが含まれる。我々は固相合成につき言及する。
【００３１】その合成法の場合、樹脂担体はペプチドの
固相製造のために当該技術で従来用いられてきたいずれ
の適した樹脂であることもできる。p−ベンジルオキシ
アルコールポリスチレン又はp−メチルベンズヒドリル
アミン樹脂が好ましい。樹脂担体への第１の保護アミノ
酸のカップリングの後に、当該技術で従来用いられてき
た標準的方法によりアミノ保護基を除去する。アミノ保
護基の除去の後、残りの保護アミノ酸、及び必要なら側
鎖保護アミノ酸を所望の順序で逐次カップリングさせ、
選ばれたペプチドを得る。代わりに樹脂−担持アミノ酸
配列とのカップリングの前に複数のアミノ酸群を溶液法
を用いてカップリングさせることができる。
固相製造のために当該技術で従来用いられてきたいずれ
の適した樹脂であることもできる。p−ベンジルオキシ
アルコールポリスチレン又はp−メチルベンズヒドリル
アミン樹脂が好ましい。樹脂担体への第１の保護アミノ
酸のカップリングの後に、当該技術で従来用いられてき
た標準的方法によりアミノ保護基を除去する。アミノ保
護基の除去の後、残りの保護アミノ酸、及び必要なら側
鎖保護アミノ酸を所望の順序で逐次カップリングさせ、
選ばれたペプチドを得る。代わりに樹脂−担持アミノ酸
配列とのカップリングの前に複数のアミノ酸群を溶液法
を用いてカップリングさせることができる。
【００３２】適したカップリング剤の選択は確立された
技術に従う。例えば適したカップリング剤は単独の、又
は好ましくは１−ヒドキロキシベンゾトリアゾールの存
在下におけるＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカーボジイミド又
はＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカーボジイミド(ＤＣＣ)あ
るいは好ましくはベンゾトリアゾール−１−イルオキシ
−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロ
ホスフェートである。別の有用なカップリング法は、予
備形成された保護アミノ酸の対称無水物を用いる。
技術に従う。例えば適したカップリング剤は単独の、又
は好ましくは１−ヒドキロキシベンゾトリアゾールの存
在下におけるＮ,Ｎ'−ジイソプロピルカーボジイミド又
はＮ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカーボジイミド(ＤＣＣ)あ
るいは好ましくはベンゾトリアゾール−１−イルオキシ
−トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロ
ホスフェートである。別の有用なカップリング法は、予
備形成された保護アミノ酸の対称無水物を用いる。
【００３３】成長中のポリペプチド鎖に導入される各ア
ミノ酸のために用いられる必要なα−アミノ保護基は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル(ＦＭＯＣ)が好
ましいが、他のいずれの適した保護基もそれがカップリ
ング条件下で分解せず、成長中のペプチド鎖にすでに存
在する他の保護基の存在下で容易に及び選択的に除去で
きれば用いることができる。
ミノ酸のために用いられる必要なα−アミノ保護基は９
−フルオレニルメチルオキシカルボニル(ＦＭＯＣ)が好
ましいが、他のいずれの適した保護基もそれがカップリ
ング条件下で分解せず、成長中のペプチド鎖にすでに存
在する他の保護基の存在下で容易に及び選択的に除去で
きれば用いることができる。
【００３４】側鎖アミノ酸のための保護基の選択の基準
は：(a)合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のため
に選ばれる反応条件下における種々の試薬に対する保護
基の安定性；(b)保護基の戦略上重要な性質の保持(すな
わちカップリング条件下で分裂しないこと)及び(c)ペプ
チド合成の完了時に他の点でペプチド構造に影響を与え
ない条件下で容易に保護基が除去できることである。
は：(a)合成の各段階でα−アミノ保護基の除去のため
に選ばれる反応条件下における種々の試薬に対する保護
基の安定性；(b)保護基の戦略上重要な性質の保持(すな
わちカップリング条件下で分裂しないこと)及び(c)ペプ
チド合成の完了時に他の点でペプチド構造に影響を与え
ない条件下で容易に保護基が除去できることである。
【００３５】完全に保護された樹脂−担持ペプチドは、
適したスカベンジャー、例えばアニソール、チオアニソ
ール、エチルメチルスルフィド、１,２−エタンジチオ
ール及び関連試薬の存在下でメチレンクロリド中の三フ
ッ化酢酸の５０％−６０％溶液を用い、室温で１−６時
間、p−ベンジルオキシアルコール樹脂から切断するの
が好ましい。同時に酸に不安定な側鎖保護基のほとんど
が除去される。酸に対して抵抗性がより強い保護基は典
型的にＨＦ処理により除去される。
適したスカベンジャー、例えばアニソール、チオアニソ
ール、エチルメチルスルフィド、１,２−エタンジチオ
ール及び関連試薬の存在下でメチレンクロリド中の三フ
ッ化酢酸の５０％−６０％溶液を用い、室温で１−６時
間、p−ベンジルオキシアルコール樹脂から切断するの
が好ましい。同時に酸に不安定な側鎖保護基のほとんど
が除去される。酸に対して抵抗性がより強い保護基は典
型的にＨＦ処理により除去される。
【００３６】本発明のペプチドは、当該技術において周
知の方法に従うＨＣＶ関連抗体の検出及び定量のための
診断薬として有用である。これらにはＥＬＩＳＡ、血球
凝集反応、単一ドット(single−dot)及び多−ドット検
定法(multi−dot assay method)(例えばＲＩＢＡ)が含
まれる。
知の方法に従うＨＣＶ関連抗体の検出及び定量のための
診断薬として有用である。これらにはＥＬＩＳＡ、血球
凝集反応、単一ドット(single−dot)及び多−ドット検
定法(multi−dot assay method)(例えばＲＩＢＡ)が含
まれる。
【００３７】本発明のペプチド又はペプチド混合物を用
いたＨＣＶに対する抗体の測定のための好ましい簡単な
従来の方法は、酵素結合イムノソルベント検定法(ＥＬ
ＩＳＡ)である。この検定では、例えば本発明のペプチ
ド又は混合物をミクロタイタープレート(microteter pl
ate)のウェル上に吸着させるか、又は共有結合によりカ
ップリングさせる。その後ウェルを試験するべき血清又
は被検体で処理する。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識
した抗−ヒトＩgＧ又は抗−ヒトＩgＭをウェルに加え
る。例えば３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンな
どの対応する基質でペルオキシダーゼの測定を行う。例
としてのこの検定の有用性に反することなくペルオキシ
ダーゼを他の標識、例えば放射性、蛍光、化学発光又は
赤外発光標識により強化することができる。
いたＨＣＶに対する抗体の測定のための好ましい簡単な
従来の方法は、酵素結合イムノソルベント検定法(ＥＬ
ＩＳＡ)である。この検定では、例えば本発明のペプチ
ド又は混合物をミクロタイタープレート(microteter pl
ate)のウェル上に吸着させるか、又は共有結合によりカ
ップリングさせる。その後ウェルを試験するべき血清又
は被検体で処理する。洗浄後、ペルオキシダーゼで標識
した抗−ヒトＩgＧ又は抗−ヒトＩgＭをウェルに加え
る。例えば３,３',５,５'−テトラメチルベンジジンな
どの対応する基質でペルオキシダーゼの測定を行う。例
としてのこの検定の有用性に反することなくペルオキシ
ダーゼを他の標識、例えば放射性、蛍光、化学発光又は
赤外発光標識により強化することができる。
【００３８】試料又は血清中のＨＣＶに対する抗体の存
在を本発明のペプチド及び混合物を用いて決定する他の
方法は、いわゆる“二抗原サンドイッチ検定(Ｄouble−
Ａntigen−Ｓandwich−Ａssay)”に従う酵素免疫試験で
ある。この方法はＩmmunological Ｍethods, ２０, ２
５−３４, １９７８に記載のＭaioliniの研究に基づい
ている。この方法に従い、試験するべき血清又は他の被
検体を、本発明のペプチドを塗布した固相(捕獲層)、及
びペルオキシダーゼ又は他の信号により標識した本発明
のペプチド(プローブ層)と接触させる。
在を本発明のペプチド及び混合物を用いて決定する他の
方法は、いわゆる“二抗原サンドイッチ検定(Ｄouble−
Ａntigen−Ｓandwich−Ａssay)”に従う酵素免疫試験で
ある。この方法はＩmmunological Ｍethods, ２０, ２
５−３４, １９７８に記載のＭaioliniの研究に基づい
ている。この方法に従い、試験するべき血清又は他の被
検体を、本発明のペプチドを塗布した固相(捕獲層)、及
びペルオキシダーゼ又は他の信号により標識した本発明
のペプチド(プローブ層)と接触させる。
【００３９】免疫反応は１又は２段階で行うことができ
る。２段階で免疫反応を行う場合、２回のインキュベー
ションの間に典型的に洗浄段階を行う。免疫反応の後も
通常洗浄段階を行う。その後、例えばペルオキシダーゼ
の場合o−フェニレンジアミンを用いてペルオキシダー
ゼ又は他の信号を測定する。すでに記載したものも含め
て他の酵素及び色原体をこの検定で用いることもでき
る。
る。２段階で免疫反応を行う場合、２回のインキュベー
ションの間に典型的に洗浄段階を行う。免疫反応の後も
通常洗浄段階を行う。その後、例えばペルオキシダーゼ
の場合o−フェニレンジアミンを用いてペルオキシダー
ゼ又は他の信号を測定する。すでに記載したものも含め
て他の酵素及び色原体をこの検定で用いることもでき
る。
【００４０】上記の検定法で用いるのに適した固相には
有機及び無機ポリマー、例えばアミラーゼ、デキストラ
ン、中性又は修飾セルロース、ポリエチレン、ポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、アガロース、マグネタイ
ト、多孔質ガラス粉末、ポリビニルジエンフルオリド(k
ynar)及びラテックス、試験管の内壁(すなわちガラス又
は人造材料の試験管、タイタープレート又はキュベッ
ト)ならびに固体の表面(すなわちガラス及び人造材料の
棒、末端を厚くした棒、末端に突出部又はラメラのある
棒)が含まれる。ガラス又は人造材料の球が固相キャリ
ヤーとして特に適している。
有機及び無機ポリマー、例えばアミラーゼ、デキストラ
ン、中性又は修飾セルロース、ポリエチレン、ポリスチ
レン、ポリアクリルアミド、アガロース、マグネタイ
ト、多孔質ガラス粉末、ポリビニルジエンフルオリド(k
ynar)及びラテックス、試験管の内壁(すなわちガラス又
は人造材料の試験管、タイタープレート又はキュベッ
ト)ならびに固体の表面(すなわちガラス及び人造材料の
棒、末端を厚くした棒、末端に突出部又はラメラのある
棒)が含まれる。ガラス又は人造材料の球が固相キャリ
ヤーとして特に適している。
【００４１】本発明のペプチド及びその混合物はＨＣＶ
に対する抗体の測定及び定量のみに有用なわけではな
い。遊離の、重合した、又は適したキャリヤーに複合化
した本発明のペプチドはＨＣＶの抗原に対して免疫学的
に交差反応性の抗体、特に及び好ましくはモノクローナ
ル抗体の誘起に有用なので、それらはＨＣＶ抗原自身の
測定及び定量にも有用である。例えばそのような抗体
は、所望の免疫応答を誘起するのに十分な量のペプチド
を哺乳類又は鳥類の動物に注射し、該動物の血清から該
抗体を回収することにより生産することができる。抗体
の誘起に適した宿主動物には、例えばウサギ、ウマ、ヤ
ギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ及びニ
ワトリが含まれる。本発明のペプチド及び従来の方法を
用いて所望のモノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマを製造するのが好ましい。
に対する抗体の測定及び定量のみに有用なわけではな
い。遊離の、重合した、又は適したキャリヤーに複合化
した本発明のペプチドはＨＣＶの抗原に対して免疫学的
に交差反応性の抗体、特に及び好ましくはモノクローナ
ル抗体の誘起に有用なので、それらはＨＣＶ抗原自身の
測定及び定量にも有用である。例えばそのような抗体
は、所望の免疫応答を誘起するのに十分な量のペプチド
を哺乳類又は鳥類の動物に注射し、該動物の血清から該
抗体を回収することにより生産することができる。抗体
の誘起に適した宿主動物には、例えばウサギ、ウマ、ヤ
ギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ及びニ
ワトリが含まれる。本発明のペプチド及び従来の方法を
用いて所望のモノクローナル抗体を生産するハイブリド
ーマを製造するのが好ましい。
【００４２】例えばモノクローナル抗体生産のための周
知のＫohler及びＭilsteinの方法を用いることができ
る。同一の抗原に対して向けられているが異なるエピト
ープに対して向けられているモノクローナル抗体を区別
するためにＳtaehli et alの方法(Ｊ. of lmmunologica
l Ｍethods, ３２, ２９７−３０４, １９８０)を用い
ることができる。
知のＫohler及びＭilsteinの方法を用いることができ
る。同一の抗原に対して向けられているが異なるエピト
ープに対して向けられているモノクローナル抗体を区別
するためにＳtaehli et alの方法(Ｊ. of lmmunologica
l Ｍethods, ３２, ２９７−３０４, １９８０)を用い
ることができる。
【００４３】一般に既知の種々の方法を、上記の抗体を
用いたＨＣＶ又はその一部の測定あるいは定量に使用す
ることができる。そのような方法の１つの場合、既知量
の検定するべき血清試料又は他の被検体、本発明の放射
性標識ペプチド又は混合物、及び本発明の非標識ペプチ
ド又は混合物を混合し、本発明のペプチドに対する既知
量の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を加え、混合
物を放置する。その後、得られる抗体／抗原複合体を、
硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、過剰の又
は不溶性担体に結合した第２抗体、あるいはデキストラ
ン−塗布活性炭などで処理することによる当該技術で既
知の方法により非結合試薬から分離する。
用いたＨＣＶ又はその一部の測定あるいは定量に使用す
ることができる。そのような方法の１つの場合、既知量
の検定するべき血清試料又は他の被検体、本発明の放射
性標識ペプチド又は混合物、及び本発明の非標識ペプチ
ド又は混合物を混合し、本発明のペプチドに対する既知
量の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を加え、混合
物を放置する。その後、得られる抗体／抗原複合体を、
硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、過剰の又
は不溶性担体に結合した第２抗体、あるいはデキストラ
ン−塗布活性炭などで処理することによる当該技術で既
知の方法により非結合試薬から分離する。
【００４４】その後標識ペプチドの濃度を結合又は非結
合相中で測定し、標識成分の量をそれ自体既知の方法で
標準曲線と比較することにより試料のＨＣＶ抗原含有量
を決定する。
合相中で測定し、標識成分の量をそれ自体既知の方法で
標準曲線と比較することにより試料のＨＣＶ抗原含有量
を決定する。
【００４５】検定においてこれらの抗体を用いる他の適
した方法は、“二抗体サンドイッチ検定(Ｄouble−Ａnt
ibody−Ｓandwich−Ａssay)”である。この検定に従い
試験するべき試料を２種類の抗体、例えばヒツジとウサ
ギなどの異なる動物を本発明のペプチド又は混合物ある
いはそれらの組み合わせで免疫することにより誘起した
抗体で処理する。抗体の１つを標識し、他を固相上に塗
布する。好ましい固相はプラスチックビーズであり、好
ましい標識は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
した方法は、“二抗体サンドイッチ検定(Ｄouble−Ａnt
ibody−Ｓandwich−Ａssay)”である。この検定に従い
試験するべき試料を２種類の抗体、例えばヒツジとウサ
ギなどの異なる動物を本発明のペプチド又は混合物ある
いはそれらの組み合わせで免疫することにより誘起した
抗体で処理する。抗体の１つを標識し、他を固相上に塗
布する。好ましい固相はプラスチックビーズであり、好
ましい標識は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００４６】典型的に“二抗体サンドイッチ検定”の場
合、試料を固相抗体及び標識抗体と共にインキュベート
する。しかし試料を最初に固相抗体と接触させ、その後
場合により洗浄した後に試料を標識抗体と接触させるこ
ともできる。しかし試料を固相抗体及び標識抗体で一緒
に処理するのが好ましい。免疫反応の後、混合物を洗浄
し、当該技術分野で既知の方法に従って標識を測定す
る。標識としてペルオキシダーゼを用いる場合、測定は
例えばo−フェニレンジアミン又はテトラメチルベンジ
ジンなどの基質を用いて行うことができる。標識成分の
量は被検体又は血清試料中に存在する抗原の量に比例す
る。
合、試料を固相抗体及び標識抗体と共にインキュベート
する。しかし試料を最初に固相抗体と接触させ、その後
場合により洗浄した後に試料を標識抗体と接触させるこ
ともできる。しかし試料を固相抗体及び標識抗体で一緒
に処理するのが好ましい。免疫反応の後、混合物を洗浄
し、当該技術分野で既知の方法に従って標識を測定す
る。標識としてペルオキシダーゼを用いる場合、測定は
例えばo−フェニレンジアミン又はテトラメチルベンジ
ジンなどの基質を用いて行うことができる。標識成分の
量は被検体又は血清試料中に存在する抗原の量に比例す
る。
【００４７】上記の通り、ＨＣＶ抗原又はこのウィルス
に対する抗体の測定及び定量のための方法及び検定は、
本発明のペプチド又は混合物、あるいはこれらのペプチ
ド及び混合物により誘起されたＨＣＶに対する抗体を特
徴とする適した試験キットで行うこともできる。
に対する抗体の測定及び定量のための方法及び検定は、
本発明のペプチド又は混合物、あるいはこれらのペプチ
ド及び混合物により誘起されたＨＣＶに対する抗体を特
徴とする適した試験キットで行うこともできる。
【００４８】上記の通り本発明のペプチド及び混合物
は、このウィルスに感染し易い宿主においてＨＣＶに対
して保護的免疫を誘起することができるワクチンの活性
成分としても有用である。投与経路、抗原投薬量、及び
注射の回数と頻度は患者によって異なり、他のウィルス
感染に対して免疫を与えるために現在用いられている場
合に対応するであろう。例えば本発明のワクチンは、そ
の組成物で処置したヒトを含む哺乳類において一定期間
ＨＣＶ感染から処置哺乳類を保護するのに十分な抗体を
誘起するのに有効な量で、少なくとも１種類の本発明の
ペプチド又は混合物を含む製薬学的に許容し得る組成物
である。
は、このウィルスに感染し易い宿主においてＨＣＶに対
して保護的免疫を誘起することができるワクチンの活性
成分としても有用である。投与経路、抗原投薬量、及び
注射の回数と頻度は患者によって異なり、他のウィルス
感染に対して免疫を与えるために現在用いられている場
合に対応するであろう。例えば本発明のワクチンは、そ
の組成物で処置したヒトを含む哺乳類において一定期間
ＨＣＶ感染から処置哺乳類を保護するのに十分な抗体を
誘起するのに有効な量で、少なくとも１種類の本発明の
ペプチド又は混合物を含む製薬学的に許容し得る組成物
である。
【００４９】ワクチンは既知の方法に従って製造され
る。本発明のワクチン組成物は、医薬品等級の食塩水、
破傷風トキソイド及びキーホールリンペット(keyhole l
impet)ヘモシアニンなどの生理学的に許容し得るキャリ
ヤー材料と従来通り簡単に合わせることができる。本発
明のワクチン組成物はアジュバンド又は他の免疫応答の
増強剤、例えばミョウバン組成物、リポソーム又はイム
ノモジュレーター(immunomodulators)も含むことができ
る。さらにこれらのワクチン組成物はＨＩＶの他に、他
のウィルス(例えばＢ型肝炎、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−
２、サイトメガロウィルス)又は病原体に対する免疫を
与えるための他の抗原を含むことができる。これらの他
の抗原の量はやはり処置するべき哺乳類及び疾患の経路
に依存する。しかし抗原は、処置した哺乳類を一定期間
その病原体又はウィルスから保護するのに十分な抗体を
誘起するのに有効な量で存在しなければならない。
る。本発明のワクチン組成物は、医薬品等級の食塩水、
破傷風トキソイド及びキーホールリンペット(keyhole l
impet)ヘモシアニンなどの生理学的に許容し得るキャリ
ヤー材料と従来通り簡単に合わせることができる。本発
明のワクチン組成物はアジュバンド又は他の免疫応答の
増強剤、例えばミョウバン組成物、リポソーム又はイム
ノモジュレーター(immunomodulators)も含むことができ
る。さらにこれらのワクチン組成物はＨＩＶの他に、他
のウィルス(例えばＢ型肝炎、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−
２、サイトメガロウィルス)又は病原体に対する免疫を
与えるための他の抗原を含むことができる。これらの他
の抗原の量はやはり処置するべき哺乳類及び疾患の経路
に依存する。しかし抗原は、処置した哺乳類を一定期間
その病原体又はウィルスから保護するのに十分な抗体を
誘起するのに有効な量で存在しなければならない。
【００５０】本発明のペプチドの合成及び利用の一般的
方法を下記に示す。
方法を下記に示す。
【００５１】方法１： Ｎ−ＦＭＯＣ保護アミノ酸残基を担持する樹脂の製造 メチレンクロリド(ＣＨ2Ｃl2)及びジメチルホルムアミ
ド(ＤＭＦ)の混合物(４：１)中の所望のＮ−ＦＭＯＣ保
護アミノ酸残基を、ＣＨ２Ｃl２：ＤＭＦ(４：１)中の
ｐ−ベンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に０℃で加
えた。混合物を手動で数秒間撹拌し、その後Ｎ,Ｎ'−ジ
シクロヘキシル−カーボジイミド(ＤＣＣ)続いて触媒量
の４−(ジメチルアミノ)ピリジンで処理した。混合物を
０℃でさらに３０分間、及びその後室温で終夜撹拌し
た。濾過した樹脂をＣＨ2Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパ
ノール(それぞれ３回づつ)で連続して洗浄し、最後にＣ
Ｈ 2Ｃl2で洗浄した。樹脂をＣＨ2Ｃl2に懸濁し、水浴中
で冷却し、再蒸留ピリジンを撹拌懸濁液に加え、その後
ベンゾイルクロリドを加えた。０℃で３０分間、その後
室温で６０分間撹拌を続けた。濾過の後、樹脂をＣＨ2
Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ３回づつ)
で連続して洗浄し、最後に石油エーテル(２回)で洗浄
し、その後重量が一定になるまで高真空下で乾燥した。
Ｍeienhofer et al.(Ｉnt. Ｊ. Ｐeptide Ｐrotein Ｒe
s., １３, ３５, １９７９)に従った置換の分光光度測
定は、樹脂上の置換の程度を示す。
ド(ＤＭＦ)の混合物(４：１)中の所望のＮ−ＦＭＯＣ保
護アミノ酸残基を、ＣＨ２Ｃl２：ＤＭＦ(４：１)中の
ｐ−ベンジルオキシアルコール樹脂の懸濁液に０℃で加
えた。混合物を手動で数秒間撹拌し、その後Ｎ,Ｎ'−ジ
シクロヘキシル−カーボジイミド(ＤＣＣ)続いて触媒量
の４−(ジメチルアミノ)ピリジンで処理した。混合物を
０℃でさらに３０分間、及びその後室温で終夜撹拌し
た。濾過した樹脂をＣＨ2Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパ
ノール(それぞれ３回づつ)で連続して洗浄し、最後にＣ
Ｈ 2Ｃl2で洗浄した。樹脂をＣＨ2Ｃl2に懸濁し、水浴中
で冷却し、再蒸留ピリジンを撹拌懸濁液に加え、その後
ベンゾイルクロリドを加えた。０℃で３０分間、その後
室温で６０分間撹拌を続けた。濾過の後、樹脂をＣＨ2
Ｃl2、ＤＭＦ及びイソプロパノール(それぞれ３回づつ)
で連続して洗浄し、最後に石油エーテル(２回)で洗浄
し、その後重量が一定になるまで高真空下で乾燥した。
Ｍeienhofer et al.(Ｉnt. Ｊ. Ｐeptide Ｐrotein Ｒe
s., １３, ３５, １９７９)に従った置換の分光光度測
定は、樹脂上の置換の程度を示す。
【００５２】方法２： その後のアミノ酸のカップリング Ｎ−ＦＭＯＣ保護第１アミノ酸残基を担持する樹脂をＢ
iosearch ９６００ Ｐeptide Ｓynthesizerの反応容器
に入れ、以下の通りに処理した： １)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で４回) ２)ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で予備洗浄(３分
間) ３)ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で脱保護(７分
間) ４)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で８回) ５)遊離のアミノ基に関する検査−Ｋaiser試験(陽性で
なければならない) ６)その後ペプチド樹脂を、すべて１６当量の４−メチ
ルモルホリンを含む乾燥再蒸留ＤＭＦに溶解した８当量
の所望のＦＭＯＣ−保護アミノ酸及び１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールならびにベンゾトリアゾール−１−イ
ルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェートと共に穏やかに１−２時間振る。 ７)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で６回)。
iosearch ９６００ Ｐeptide Ｓynthesizerの反応容器
に入れ、以下の通りに処理した： １)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で４回) ２)ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で予備洗浄(３分
間) ３)ＤＭＦ中のピペリジンの３０％溶液で脱保護(７分
間) ４)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で８回) ５)遊離のアミノ基に関する検査−Ｋaiser試験(陽性で
なければならない) ６)その後ペプチド樹脂を、すべて１６当量の４−メチ
ルモルホリンを含む乾燥再蒸留ＤＭＦに溶解した８当量
の所望のＦＭＯＣ−保護アミノ酸及び１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールならびにベンゾトリアゾール−１−イ
ルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフ
ルオロホスフェートと共に穏やかに１−２時間振る。 ７)ＤＭＦで洗浄(各２０秒で６回)。
【００５３】段階７の後、ニンヒドリン試験のためにア
リコートを採取した。試験が陰性の場合、次のアミノ酸
のカップリングのために方法を段階１から繰り返した。
試験が陽性又はわずかに陽性の場合、段階６及び７を繰
り返した。
リコートを採取した。試験が陰性の場合、次のアミノ酸
のカップリングのために方法を段階１から繰り返した。
試験が陽性又はわずかに陽性の場合、段階６及び７を繰
り返した。
【００５４】上記の案は本発明に記載のペプチドのそれ
ぞれのアミノ酸のカップリングに用いることができる。
ＦＭＯＣを用いたＮ−保護も合成を通じて残りのアミノ
酸のいずれの場合も用いることができる。
ぞれのアミノ酸のカップリングに用いることができる。
ＦＭＯＣを用いたＮ−保護も合成を通じて残りのアミノ
酸のいずれの場合も用いることができる。
【００５５】上記のカップリング案を用いたトリチウム
化アミノ酸の挿入により放射活性ペプチドを製造するこ
とができる。
化アミノ酸の挿入により放射活性ペプチドを製造するこ
とができる。
【００５６】最後のアミノ酸の付加後、上記案の段階１
−７に戻ることによりＮ−末端残基のＮ−ＦＭＯＣを除
去する。ペプチド樹脂をＣＨ2Ｃl2で洗浄し、真空中で
乾燥し、保護された粗ペプチドを得る。
−７に戻ることによりＮ−末端残基のＮ−ＦＭＯＣを除
去する。ペプチド樹脂をＣＨ2Ｃl2で洗浄し、真空中で
乾燥し、保護された粗ペプチドを得る。
【００５７】方法３： 脱保護及び樹脂からのペプチドの切断 保護ペプチド−樹脂を、２.５％のエタンジチオール及
び２.５％のアニソールを含むＣＨ2Ｃl2中の三フッ化酢
酸(ＴＦＡ)の５５％溶液に懸濁した。混合物をＮ2でフ
ラッシングし、室温で１.５時間撹拌した。混合物を濾
過し、樹脂をＣＨ 2Ｃl2で洗浄した。樹脂を室温にてＣ
Ｈ2Ｃl2中の２０％ＴＦＡで５分間再度処理した。混合
物を濾過し、樹脂をＣＨ2Ｃl2中の２０％ＴＦＡで洗浄
し、その後ＣＨ2Ｃl2で洗浄した。合わせた濾液を３５
℃以下の真空中で蒸発させ、残留物を乾燥ジメチルエー
テルで数回洗浄した。固体を１０％の酢酸水溶液に溶解
し、凍結乾燥して粗生成物を得た。
び２.５％のアニソールを含むＣＨ2Ｃl2中の三フッ化酢
酸(ＴＦＡ)の５５％溶液に懸濁した。混合物をＮ2でフ
ラッシングし、室温で１.５時間撹拌した。混合物を濾
過し、樹脂をＣＨ 2Ｃl2で洗浄した。樹脂を室温にてＣ
Ｈ2Ｃl2中の２０％ＴＦＡで５分間再度処理した。混合
物を濾過し、樹脂をＣＨ2Ｃl2中の２０％ＴＦＡで洗浄
し、その後ＣＨ2Ｃl2で洗浄した。合わせた濾液を３５
℃以下の真空中で蒸発させ、残留物を乾燥ジメチルエー
テルで数回洗浄した。固体を１０％の酢酸水溶液に溶解
し、凍結乾燥して粗生成物を得た。
【００５８】アルギニン及びシステイン残基を含むペプ
チドを、アニソール及びジメチルスルフィドの存在下で
０℃にて１時間ＨＦ処理することによりさらに脱保護し
た。ペプチドを１０％酢酸水溶液で抽出し、ジメチルエ
ーテルで洗浄し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。
チドを、アニソール及びジメチルスルフィドの存在下で
０℃にて１時間ＨＦ処理することによりさらに脱保護し
た。ペプチドを１０％酢酸水溶液で抽出し、ジメチルエ
ーテルで洗浄し、凍結乾燥して粗ペプチドを得た。
【００５９】方法４： ペプチドの精製 Ｃ18又はＣ4逆相充填のＶydacカラム(２.５×２５mm)上
で可動相の勾配を用いた分取ＨＰＬＣにより粗ペプチド
を精製した。溶出物を２２０nm続いて分析ＨＰＬＣで監
視した。関連する留分を集め、蒸発させ、凍結乾燥し
た。合成ペプチドの同定は分析逆相クロマトグラフィー
及びアミノ酸分析により確認した。
で可動相の勾配を用いた分取ＨＰＬＣにより粗ペプチド
を精製した。溶出物を２２０nm続いて分析ＨＰＬＣで監
視した。関連する留分を集め、蒸発させ、凍結乾燥し
た。合成ペプチドの同定は分析逆相クロマトグラフィー
及びアミノ酸分析により確認した。
【００６０】方法５： ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)又はキーホールリンペット
ヘモシアニン(ＫＬＨ)へのペプチドの複合化 あらかじめスルホスクシンイミジル ４−(p−マレイミ
ドフェニル)ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)又はスルホ
スクシンイミジル ４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を
用いて誘導化したＢＳＡ又はＫＬＨにペプチドを複合化
した。
ヘモシアニン(ＫＬＨ)へのペプチドの複合化 あらかじめスルホスクシンイミジル ４−(p−マレイミ
ドフェニル)ブチレート(スルホ−ＳＭＰＢ)又はスルホ
スクシンイミジル ４−(Ｎ−マレイミドメチル)シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート(スルホ−ＳＭＣＣ)を
用いて誘導化したＢＳＡ又はＫＬＨにペプチドを複合化
した。
【００６１】スルホ−ＳＭＰＢ又はスルホ−ＳＭＣＣ
(Ｐierce Ｃhemicals)の水溶液を０.０２Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ７.０)中のＢＳＡ又はＫＬＨの溶液
に加えた。混合物を室温で４５分間振り、活性化キャリ
ヤーをすぐに０.１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
０)で平衡化したＳephadex Ｇ−２５カラムに４℃で適
用した。
(Ｐierce Ｃhemicals)の水溶液を０.０２Ｍのリン酸ナ
トリウム緩衝液(pＨ７.０)中のＢＳＡ又はＫＬＨの溶液
に加えた。混合物を室温で４５分間振り、活性化キャリ
ヤーをすぐに０.１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.
０)で平衡化したＳephadex Ｇ−２５カラムに４℃で適
用した。
【００６２】活性化キャリヤーに対応する第１ピーク吸
収(２８０nm)の留分を丸底フラスコで合わせ、それに
０.０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.２)中のペ
プチドの溶液を加えた。混合物にＮ2を十分にフラッシ
ングし、室温で終夜インキュベートした。カップリング
効率を3Ｈ−標識ペプチドを用いて、及び複合体のアミ
ノ酸分析により監視した。
収(２８０nm)の留分を丸底フラスコで合わせ、それに
０.０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液(pＨ６.２)中のペ
プチドの溶液を加えた。混合物にＮ2を十分にフラッシ
ングし、室温で終夜インキュベートした。カップリング
効率を3Ｈ−標識ペプチドを用いて、及び複合体のアミ
ノ酸分析により監視した。
【００６３】方法６： 酵素結合イムノソルベント検定(ＥＬＩＳＡ)によるＨＣ
Ｖに対する抗体の検出 ミクロタイタープレートの各ウェルにペプチド又はペプ
チドの混合物(１０μg／ml)を含む溶液１００μl(０.０
５Ｍの炭酸塩一重炭酸塩濾過緩衝液、pＨ９.４±０.２)
を飽和させ、終夜放置した。好ましいことに我々は、ウ
ェルを満たすためにＯster Ｂay Ｖersafill分配装置を
用いた。ウェルを空にし(好ましくは吸引により)、洗浄
緩衝液(ＮaＣl、０.１５Ｍ；ＮaＨ２ＰＯ４、０.０６０
Ｍ；チメロサール、０.０１％及びＴween２０、０.０５
％；pＨ７.４(０.３mＬ／ウェル))で２回洗浄した。そ
の後ウェルを３７℃にて０.３５mlの洗浄緩衝液で１時
間飽和させ、Ｔween２０を含まない同緩衝液で１回洗浄
した。再び３７℃で１時間乾燥した後、ウェルは使用の
準備ができた。分析するべき血清試料を試料緩衝液(リ
ン酸ナトリウム、６mＭ；ＮaＣl、０.１５Ｍ；ＢＳＡ、
２％；ペプトン、１.５％；ベンズアミジン、８０mＭ；
Ｔween２０、１％；熱不活化ヤギ血清、４０％；チメロ
サール、０.０１％、最終pＨは７.２)で希釈した。ウェ
ルを洗浄緩衝液で濯いでから希釈血清試料(０.１ml)を
加えた。これらを室温で３０分インキュベートした。そ
の後ウェルを空にし、迅速に２回、及びその後２分間で
１回洗浄緩衝液で洗浄した。Ｔris、０.０５Ｍ；ＮaＣ
l、０.５Ｍ；Ｔween２０、０.０５％；チメロサール、
０.０１％(pＨ７.２)を含む溶液中の１％w／vウシ血清
アルブミンで希釈した複合体溶液(ヒトＩgＧに対するペ
ルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗体、５ml
の５０％グリセロール中０.５mg)を各ウェルに加え(０.
１ml)、室温で３０分間インキュベートした。その後ウ
ェルを空にし、洗浄緩衝液で５回洗浄した。基質溶液
(３,３',５,５'−テトラメチル−ベンジジン)(ＤＭＳＯ
１ml当たり８mg)を、０.１％v／vの３０％Ｈ２Ｏ２を含
む１００体積の０.１Ｍクエン酸塩−酢酸塩緩衝液(pＨ
５.６)で希釈し、各ウェルに加えた(ウェル当たり０.１
ml)。１０分後、各ウェルの内容物を０.１mlの２Ｎ Ｈ
２ＳＯ ４で処理し、４５０nmで光学濃度を読み取った。
すべての測定は二重に行った。
Ｖに対する抗体の検出 ミクロタイタープレートの各ウェルにペプチド又はペプ
チドの混合物(１０μg／ml)を含む溶液１００μl(０.０
５Ｍの炭酸塩一重炭酸塩濾過緩衝液、pＨ９.４±０.２)
を飽和させ、終夜放置した。好ましいことに我々は、ウ
ェルを満たすためにＯster Ｂay Ｖersafill分配装置を
用いた。ウェルを空にし(好ましくは吸引により)、洗浄
緩衝液(ＮaＣl、０.１５Ｍ；ＮaＨ２ＰＯ４、０.０６０
Ｍ；チメロサール、０.０１％及びＴween２０、０.０５
％；pＨ７.４(０.３mＬ／ウェル))で２回洗浄した。そ
の後ウェルを３７℃にて０.３５mlの洗浄緩衝液で１時
間飽和させ、Ｔween２０を含まない同緩衝液で１回洗浄
した。再び３７℃で１時間乾燥した後、ウェルは使用の
準備ができた。分析するべき血清試料を試料緩衝液(リ
ン酸ナトリウム、６mＭ；ＮaＣl、０.１５Ｍ；ＢＳＡ、
２％；ペプトン、１.５％；ベンズアミジン、８０mＭ；
Ｔween２０、１％；熱不活化ヤギ血清、４０％；チメロ
サール、０.０１％、最終pＨは７.２)で希釈した。ウェ
ルを洗浄緩衝液で濯いでから希釈血清試料(０.１ml)を
加えた。これらを室温で３０分インキュベートした。そ
の後ウェルを空にし、迅速に２回、及びその後２分間で
１回洗浄緩衝液で洗浄した。Ｔris、０.０５Ｍ；ＮaＣ
l、０.５Ｍ；Ｔween２０、０.０５％；チメロサール、
０.０１％(pＨ７.２)を含む溶液中の１％w／vウシ血清
アルブミンで希釈した複合体溶液(ヒトＩgＧに対するペ
ルオキシダーゼ標識アフィニティー精製ヤギ抗体、５ml
の５０％グリセロール中０.５mg)を各ウェルに加え(０.
１ml)、室温で３０分間インキュベートした。その後ウ
ェルを空にし、洗浄緩衝液で５回洗浄した。基質溶液
(３,３',５,５'−テトラメチル−ベンジジン)(ＤＭＳＯ
１ml当たり８mg)を、０.１％v／vの３０％Ｈ２Ｏ２を含
む１００体積の０.１Ｍクエン酸塩−酢酸塩緩衝液(pＨ
５.６)で希釈し、各ウェルに加えた(ウェル当たり０.１
ml)。１０分後、各ウェルの内容物を０.１mlの２Ｎ Ｈ
２ＳＯ ４で処理し、４５０nmで光学濃度を読み取った。
すべての測定は二重に行った。
【００６４】実質的に上記の一般的方法を用い、図３に
概略を示す特定のペプチドを製造した。その後これらの
ペプチドをＨＣＶ−特異的抗体検出の能力につき評価し
た。
概略を示す特定のペプチドを製造した。その後これらの
ペプチドをＨＣＶ−特異的抗体検出の能力につき評価し
た。
【００６５】実験１ 実験１では各ペプチドを０.０５Ｍの炭酸ナトリウム−
重炭酸塩緩衝液(pＨ９.６)中の１０μg／mlの最終濃度
で溶解した。その後ウェルを方法６に記載の通りに処理
した。
重炭酸塩緩衝液(pＨ９.６)中の１０μg／mlの最終濃度
で溶解した。その後ウェルを方法６に記載の通りに処理
した。
【００６６】Ｂoston Ｂiomedica Ｉnc.(ＢＢＩ)からの
２５の抗−ＨＣＶ活性血清及び血漿試料のパネルを用い
た。表１はＨＣＶのコアタンパク質の異なる配列を含む
９個の合成ペプチドの抗原活性を示す。
２５の抗−ＨＣＶ活性血清及び血漿試料のパネルを用い
た。表１はＨＣＶのコアタンパク質の異なる配列を含む
９個の合成ペプチドの抗原活性を示す。
【００６７】
【表５】
【００６８】結果は信号対カットオフ比を示している。
カットオフは３人の正常な献血者から採血した血漿試料
を用いて得た平均吸収率であり、それに０.１００の値
を与えた。＞１.０の比率が活性試料を示す。ＢＣＨ−
４４８(配列番号：１２)及びＢＣＨ−４６１(配列番
号：１４)は調べた試料のそれぞれ７２％(１８／２５)
及び８０％(２０／２５)で抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出
することができた。ＢＣＨ−４３６(配列番号：５)及び
ＢＣＨ−４４３(配列番号：１０)が試料の８４％(２１
／２５)で抗体を検出し、ＢＣＨ−４４６(配列番号：１
１)がスクリーニングした試料の８８％(２２／２５)で
抗体を検出したことはさらに印象深かった。しかし最も
印象的な結果はＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ
−４３７(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：
７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて観察さ
れ、それらはすべて２５中少なくとも２４(＞９６％)の
抗−ＨＣＶ活性試料を検出することができた。従って今
後の実験はＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４
３７(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及
びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて行った(実験
３を参照)。
カットオフは３人の正常な献血者から採血した血漿試料
を用いて得た平均吸収率であり、それに０.１００の値
を与えた。＞１.０の比率が活性試料を示す。ＢＣＨ−
４４８(配列番号：１２)及びＢＣＨ−４６１(配列番
号：１４)は調べた試料のそれぞれ７２％(１８／２５)
及び８０％(２０／２５)で抗−ＨＣＶ抗体の存在を検出
することができた。ＢＣＨ−４３６(配列番号：５)及び
ＢＣＨ−４４３(配列番号：１０)が試料の８４％(２１
／２５)で抗体を検出し、ＢＣＨ−４４６(配列番号：１
１)がスクリーニングした試料の８８％(２２／２５)で
抗体を検出したことはさらに印象深かった。しかし最も
印象的な結果はＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ
−４３７(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：
７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて観察さ
れ、それらはすべて２５中少なくとも２４(＞９６％)の
抗−ＨＣＶ活性試料を検出することができた。従って今
後の実験はＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４
３７(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及
びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて行った(実験
３を参照)。
【００６９】実験２ 推定エンベロープタンパク質の一部を含む配列を有する
合成ペプチドを２５試料の同一パネルを用いて上記の通
りに試験した。結果は上記の通りに算出される信号対カ
ットオフ比を示しており、表２に示す。
合成ペプチドを２５試料の同一パネルを用いて上記の通
りに試験した。結果は上記の通りに算出される信号対カ
ットオフ比を示しており、表２に示す。
【００７０】
【表６】
【００７１】表２に示されている通り、合成ペプチドＢ
ＣＨ−４６４(配列番号：１５)、ＢＣＨ−４２７(配列
番号：２)及びＢＣＨ−４３０(配列番号：４)は非常に
劣った抗原であり、それぞれ２５試料のパネルから０、
１及び２試料を検出する。ＢＣＨ−４２９(配列番号：
３)及びＢＣＨ−４４０(配列番号：９)もこの２５試料
のパネルから６試料しか検出しないので劣っている。Ｂ
ＣＨ−４２７(配列番号：２)に隣接する領域を含み、Ｂ
ＣＨ−４２９(配列番号：３)と部分的に重複しているＢ
ＣＨ−４５８(配列番号：１３)は１７試料を検出し、唯
一の活性抗原である。
ＣＨ−４６４(配列番号：１５)、ＢＣＨ−４２７(配列
番号：２)及びＢＣＨ−４３０(配列番号：４)は非常に
劣った抗原であり、それぞれ２５試料のパネルから０、
１及び２試料を検出する。ＢＣＨ−４２９(配列番号：
３)及びＢＣＨ−４４０(配列番号：９)もこの２５試料
のパネルから６試料しか検出しないので劣っている。Ｂ
ＣＨ−４２７(配列番号：２)に隣接する領域を含み、Ｂ
ＣＨ−４２９(配列番号：３)と部分的に重複しているＢ
ＣＨ−４５８(配列番号：１３)は１７試料を検出し、唯
一の活性抗原である。
【００７２】実験３ 実験１で同定された最良の４個の合成ペプチドをＢＢＩ
により販売されている十分に特定化された試料の２系列
に関してさらに調べた。第１のパネルは２５の抗−ＨＣ
Ｖ混合力価試料(ＰＨＶ−２０１)を含み、第２の系列は
１５の低力価抗−ＨＣＶ血清及び血漿試料(ＰＨＶ−１
０１)を含む。結果をそれぞれ表３a及び３bに示す。
により販売されている十分に特定化された試料の２系列
に関してさらに調べた。第１のパネルは２５の抗−ＨＣ
Ｖ混合力価試料(ＰＨＶ−２０１)を含み、第２の系列は
１５の低力価抗−ＨＣＶ血清及び血漿試料(ＰＨＶ−１
０１)を含む。結果をそれぞれ表３a及び３bに示す。
【００７３】
【表７】
【表８】
【００７４】すべての結果は試料吸収対カットオフ比と
して表す。＞１.０の比率を活性と考える。“Ａbbott”
及び“Ｏrtho”の下のデータは、ＢＢＩが彼らの抗−Ｈ
ＣＶ混合力価性能パネルを購入した客に示したものであ
る。括弧内のＰ、Ｎ及びＩの文字はそれぞれ“陽性”、
“陰性”及び“未定”を示し、このデータはこれらの製
造者の確認ＥＩＡ又はＲＩＢＡ２.０キットを用いて
得、ＢＢＩによりパネルと共に与えられた。
して表す。＞１.０の比率を活性と考える。“Ａbbott”
及び“Ｏrtho”の下のデータは、ＢＢＩが彼らの抗−Ｈ
ＣＶ混合力価性能パネルを購入した客に示したものであ
る。括弧内のＰ、Ｎ及びＩの文字はそれぞれ“陽性”、
“陰性”及び“未定”を示し、このデータはこれらの製
造者の確認ＥＩＡ又はＲＩＢＡ２.０キットを用いて
得、ＢＢＩによりパネルと共に与えられた。
【００７５】ＯrthoのＥＩＡは試料１９に関して低い陽
性の信号を示しているが、試料４、７及び１９(表３a)
は抗−ＨＣＶ陰性であると考えた。試料８及び１０は補
足的なＯrtho ＲＩＢＡ２.０試験により“未定”とされ
た。これらの試料は、ＢＣＨ−４３７(配列番号：６)及
びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて陰性であった
試料１０を除いて我々の合成ペプチドの場合陽性である
とされた。一般にＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて最強の陽性信号が
得られることがわかる。
性の信号を示しているが、試料４、７及び１９(表３a)
は抗−ＨＣＶ陰性であると考えた。試料８及び１０は補
足的なＯrtho ＲＩＢＡ２.０試験により“未定”とされ
た。これらの試料は、ＢＣＨ−４３７(配列番号：６)及
びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて陰性であった
試料１０を除いて我々の合成ペプチドの場合陽性である
とされた。一般にＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて最強の陽性信号が
得られることがわかる。
【００７６】表３bに示したこの抗−ＨＣＶ低力価性能
パネルは、認可を受けた２つの試験キットの少なくとも
１つを用いて４.０より低い信号対カットオフ比を与え
た試料のみを含んだ。試料２はすべての試験及びすべて
の合成ペプチドにより陰性であることがわかり、従って
真に陰性と考えられる。試料３及び５はＲＩＢＡ２.０
補足キットを用いて陽性と確認できなかった。ペプチド
ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３８(配列
番号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)はこれら
の試料を陽性と検出することができた。他のすべての場
合、ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３７
(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて測定した信号対カ
ットオフ比は２つの市販のＥＩＡにより測定した場合よ
りずっと高かった。
パネルは、認可を受けた２つの試験キットの少なくとも
１つを用いて４.０より低い信号対カットオフ比を与え
た試料のみを含んだ。試料２はすべての試験及びすべて
の合成ペプチドにより陰性であることがわかり、従って
真に陰性と考えられる。試料３及び５はＲＩＢＡ２.０
補足キットを用いて陽性と確認できなかった。ペプチド
ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３８(配列
番号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)はこれら
の試料を陽性と検出することができた。他のすべての場
合、ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３７
(配列番号：６)、ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)を用いて測定した信号対カ
ットオフ比は２つの市販のＥＩＡにより測定した場合よ
りずっと高かった。
【００７７】十分に特性化された試料のこれら２つのパ
ネルを用いて得た結果は、調べた合成ペプチドの中でＢ
ＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３８(配列番
号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)が一貫して
市販の抗−ＨＣＶ試験より優れていることを示す。我々
のペプチドは困難な低力価試料を高い信号対カットオフ
比で容易に取り上げる。
ネルを用いて得た結果は、調べた合成ペプチドの中でＢ
ＣＨ−４２３(配列番号：１)、ＢＣＨ−４３８(配列番
号：７)及びＢＣＨ−４３９(配列番号：８)が一貫して
市販の抗−ＨＣＶ試験より優れていることを示す。我々
のペプチドは困難な低力価試料を高い信号対カットオフ
比で容易に取り上げる。
【００７８】実験４ この実験の目的は４種類の好ましい合成ペプチドのＨＣ
Ｖ抗体に対する特異性の測定である。これを行うため
に、試料群(血清及び血漿)を６３の正常な献血者から集
めた。表４は、これらの４種類のペプチドのそれぞれを
この血清陰性試料のパネルについて試験した場合に得ら
れたデータをまとめている。
Ｖ抗体に対する特異性の測定である。これを行うため
に、試料群(血清及び血漿)を６３の正常な献血者から集
めた。表４は、これらの４種類のペプチドのそれぞれを
この血清陰性試料のパネルについて試験した場合に得ら
れたデータをまとめている。
【００７９】
【表９】
【００８０】表４はＢＣＨ−４３７(配列番号：６)及び
ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)が１００％の精度であ
り、６３の血清陰性試料のいずれからも陽性の結果を検
出しなかったことを示す。血清陰性試料の評価において
ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)の精度は９２％であり、
ＢＣＨ−４３９の精度は８２％であった。従ってＢＣＨ
−４２３(配列番号：１)及びＢＣＨ−４３９(配列番
号：８)に存在するがＢＣＨ−４３７(配列番号：６)及
びＢＣＨ−４３８(配列番号：７)に不在のアミノ酸配列
“ＭＳＴＮＰ”にＢＣＨ−４２３(配列番号：１)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)の場合に得られた“誤った
陽性”の結果の責任があると思われる。
ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)が１００％の精度であ
り、６３の血清陰性試料のいずれからも陽性の結果を検
出しなかったことを示す。血清陰性試料の評価において
ＢＣＨ−４２３(配列番号：１)の精度は９２％であり、
ＢＣＨ−４３９の精度は８２％であった。従ってＢＣＨ
−４２３(配列番号：１)及びＢＣＨ−４３９(配列番
号：８)に存在するがＢＣＨ−４３７(配列番号：６)及
びＢＣＨ−４３８(配列番号：７)に不在のアミノ酸配列
“ＭＳＴＮＰ”にＢＣＨ−４２３(配列番号：１)及びＢ
ＣＨ−４３９(配列番号：８)の場合に得られた“誤った
陽性”の結果の責任があると思われる。
【００８１】実験５ 本発明の最も好ましいペプチドであるＢＣＨ−４３８
を、実験１でスクリーニングした抗−ＨＣＶ血清陽性試
料の大多数を認識した他の３種類の合成ペプチド(ＢＣ
Ｈ−４４６(配列番号：１１)、ＢＣＨ−４４８(配列番
号：１２)及びＢＣＨ−４６１(配列番号：１４))と組み
合わせて試験した。単独で試験する場合、各合成ペプチ
ドの濃度は１０μg／mlであった。混合物中のＢＣＨ−
４３８の濃度は６.７μ／mlであり、第２のペプチドは
３.３μg／mlで含まれた。示されている通りいくかの試
料は前記と同一の試料希釈剤を用いて５０−、２００
−、１０００−又は２０００−倍に希釈した(案に関し
て実験１を参照)。希釈によりペプチド混合物のいくつ
かの場合に観察される感度の向上のより正確な測定が可
能になる。
を、実験１でスクリーニングした抗−ＨＣＶ血清陽性試
料の大多数を認識した他の３種類の合成ペプチド(ＢＣ
Ｈ−４４６(配列番号：１１)、ＢＣＨ−４４８(配列番
号：１２)及びＢＣＨ−４６１(配列番号：１４))と組み
合わせて試験した。単独で試験する場合、各合成ペプチ
ドの濃度は１０μg／mlであった。混合物中のＢＣＨ−
４３８の濃度は６.７μ／mlであり、第２のペプチドは
３.３μg／mlで含まれた。示されている通りいくかの試
料は前記と同一の試料希釈剤を用いて５０−、２００
−、１０００−又は２０００−倍に希釈した(案に関し
て実験１を参照)。希釈によりペプチド混合物のいくつ
かの場合に観察される感度の向上のより正確な測定が可
能になる。
【００８２】
【表１０】
【００８３】表５はＢＣＨ−４４６(配列番号：１１)、
ＢＣＨ−４４８(配列番号：１２)及びＢＣＨ−４６１
(配列番号：１４)と組み合わせたＢＣＨ−４３８(配列
番号：７)の混合物が、調べた血清陽性試料のそれぞれ
８１％、８８％及び８５％に関して、ＢＣＨ−４３８
(配列番号：７)のみを用いて観察される比率と比較して
同等か又は高い信号対カットオフ比を検出することを示
している。ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)／ＢＣＨ−４
６１(配列番号：１４)混合物の場合に観察される感度の
向上は特に顕著である。ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)
のみの場合低−陽性であることが見いだされたいくつか
の試料(例えば１８０１−８１、１８０１−８６及びＰ
ＨＶ−２０１−２０)は、ＢＣＨ−４３８(配列番号：
７)／ＢＣＨ−４６１(配列番号：１４)混合物を用いて
試験すると信号がかなり増大する。
ＢＣＨ−４４８(配列番号：１２)及びＢＣＨ−４６１
(配列番号：１４)と組み合わせたＢＣＨ−４３８(配列
番号：７)の混合物が、調べた血清陽性試料のそれぞれ
８１％、８８％及び８５％に関して、ＢＣＨ−４３８
(配列番号：７)のみを用いて観察される比率と比較して
同等か又は高い信号対カットオフ比を検出することを示
している。ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)／ＢＣＨ−４
６１(配列番号：１４)混合物の場合に観察される感度の
向上は特に顕著である。ＢＣＨ−４３８(配列番号：７)
のみの場合低−陽性であることが見いだされたいくつか
の試料(例えば１８０１−８１、１８０１−８６及びＰ
ＨＶ−２０１−２０)は、ＢＣＨ−４３８(配列番号：
７)／ＢＣＨ−４６１(配列番号：１４)混合物を用いて
試験すると信号がかなり増大する。
【００８４】前記にて本発明の多くの具体化を示した
が、我々の基本的構築物を変更して本発明の方法及び組
成物を用いる他の具体化を与えることができることは明
らかである。従って本発明の範囲は上記に例として示し
た特定の具体化ではなく添付される請求の範囲により限
定されると認識されるであろう。
が、我々の基本的構築物を変更して本発明の方法及び組
成物を用いる他の具体化を与えることができることは明
らかである。従って本発明の範囲は上記に例として示し
た特定の具体化ではなく添付される請求の範囲により限
定されると認識されるであろう。
【００８５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> BioChem ImmunoSystems Inc. <120> Peptides and mixtures thereof for detecting antibodies to hepatiti s C virus (HCV) <160> 17 <210> 1 <211> 26 <212> PRT <400> 1 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly 20 25 <210> 2: <211> 18 <212> PRT <400> 2 Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 1 5 10 15 Ser Ser <210> 3 <211> 22 <212> PRT <400> 3 His Ala Pro Gly Ser Val Pro Ser Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg 1 5 10 15 Cys Trp Val Ala Leu Thr 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <400> 4 Gly Ser Val Phe Leu Ile Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg 1 5 10 15 His Glu Thr Val Gln Asp 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <400> 5 Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <400> 6 Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gln Ile Val 20 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <400> 7 Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp 1 5 10 15 Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <400> 8 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 2530 <210> 9 <211> 29 <212> PRT <400> 9 Thr Thr Leu Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Thr Ala Ala Phe 1 5 10 15 Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val 20 25 <210> 10 <211> 27 <212> PRT <400> 10 Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro Arg Arg Arg Ser 1 5 10 15 Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 20 25 <210> 11 <211> 24 <212> PRT <400> 11 Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro 1 5 10 15 Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 20 <210> 12 <211> 23 <212> PRT <400> 12 Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg 1 5 10 15 Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr 20 <210> 13 <211> 22 <212> PRT <400> 13 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His Ala Pro Gly 1 5 10 15 Ser Val Pro Ser Val Arg 20 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <400> 14 Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser 1 5 10 15 Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile 20 25 <210> 15 <211> 23 <212> PRT <400> 15 Thr Ala Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val 1 5 10 15 Met Asp Met Val Ala Gly Ala 20 <210> 16 <211> 190 <212> PRT <400> 16 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Asn Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 180 185 190 <210> 17 <211> 190 <212> PRT <400> 17 Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp 1 5 10 15 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His 20 25 30 Ala Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys 35 40 45 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro 50 55 60 Thr Thr Thr Leu Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Thr Ala Ala 65 70 75 80 Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu 85 90 95 Ile Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln 100 105 110 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 115 120 125 Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Val 130 135 140 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly 145 150 155 160 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 165 170 175 Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly 180 185 190
【図１】 Ｔakeuchi et al. Ｎucleic Ａcids Ｒes.,
１８, ４６２６, １９９０)に記載のＨＣＶの推定コア
遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
１８, ４６２６, １９９０)に記載のＨＣＶの推定コア
遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図２】 Ｔakeuchi et al(同上)に記載の推定エンベ
ロープ遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
ロープ遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図３】 本発明のペプチド及び比較のために製造され
た他の種々のペプチドのアミノ酸配列を示す。図１及び
２の配列中のペプチドの位置も示す。位置２０７、２２
６及び２２９のシステイン残基(ＢＣＨ−４２７(配列番
号：２)、ＢＣＨ−４２９(配列番号：３)及びＢＣＨ−
４５８(配列番号：１３)はセリン残基で置換された。
た他の種々のペプチドのアミノ酸配列を示す。図１及び
２の配列中のペプチドの位置も示す。位置２０７、２２
６及び２２９のシステイン残基(ＢＣＨ−４２７(配列番
号：２)、ＢＣＨ−４２９(配列番号：３)及びＢＣＨ−
４５８(配列番号：１３)はセリン残基で置換された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 33/577 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (72)発明者 マルテイアル・ラクロア カナダ国ジエイ４エツクス ２アール９・ ケベツク・ブロツサード・リツチモンド 9025 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CC24 4C085 AA03 AA04 BA87 BB11 DD51 DD86 4H045 AA10 AA11 AA30 BA18 CA02 EA31 EA53 FA33
Claims (14)
- 【請求項１】(配列番号：７) a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFP
GGGQIV-b (BCH-438) ［ここでａはアミノ末端、１−８個のアミノ酸あるいは
カップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又
は抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、ｂは
カルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリ
ングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活
性を向上させるのに有効な置換基である］及びこれらの
類似体を含む群より選ばれるペプチド。 - 【請求項２】 式(配列番号：７) a-KPQRKTKRNTNRRPQD
VKFPGGGQIV-b (BCH-438) 及び(配列番号：１４)a-GPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPI-b
(BCH-461) ［ここでａはアミノ末端、１−８個のアミノ酸あるいは
カップリングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又
は抗原活性を向上させるのに有効な置換基であり、ｂは
カルボキシ末端、１−８個のアミノ酸あるいはカップリ
ングを容易にする、又はペプチドの免疫原性又は抗原活
性を向上させるのに有効な置換基である］のペプチドを
含む混合物。 - 【請求項３】 請求項１に記載のペプチド及び請求項２
に記載のそれらの混合物を特徴とする、被検体中のＨＣ
Ｖ関連抗体の存在を検出する方法。 - 【請求項４】 被検体のアリコートを請求項１に記載の
ペプチド及び請求項２に記載のそれらの混合物と接触さ
せる段階を含む、被検体中のＨＣＶ関連抗体の存在を検
出する方法。 - 【請求項５】 ＥＬＩＳＡ、血球凝集反応、単−ドット
及び多−ドット検定から成る群より選ばれる請求項４に
記載の方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載のペプチド及び請求項２
に記載のそれらのペプチドの混合物から成る群より選ば
れるペプチドと免疫学的交差反応性の抗体ならびに該抗
体の混合物。 - 【請求項７】 モノクローナル抗体又は該モノクローナ
ル抗体の混合物である、請求項６に記載の抗体。 - 【請求項８】 請求項６又は７に記載の抗体を特徴とす
る被検体中のＨＣＶ抗原の存在を検出する方法。 - 【請求項９】 被検体のアリコートを請求項６又は７に
記載の抗体と接触させる段階を含む、被検体中のＨＣＶ
抗原の存在を検出する方法。 - 【請求項１０】 請求項１に記載のペプチドあるいは請
求項２に記載の混合物を含み、該ペプチド又は混合物
が、処置された哺乳類をある期間ＨＣＶウィルス感染か
ら保護するのに十分な抗体を哺乳類において誘起するの
に有効な量で組成物中に存在する、製薬学的に許容し得
る組成物。 - 【請求項１１】 生理学的に許容し得るキャリヤーを含
む、請求項１０に記載の組成物。 - 【請求項１２】 免疫応答のアジュバンド又は増強剤を
含む、請求項１０に記載の組成物。 - 【請求項１３】 ＨＣＶウィルス以外の病原体に対する
第２の抗原を含み、該抗原が、処置された哺乳類をある
期間病原体による感染から保護するのに十分な抗体を誘
起するのに有効な量で存在する、請求項１０に記載の組
成物。 - 【請求項１４】 哺乳類を請求項１０−１３のいずれか
１つに記載の組成物を用いて製薬学的に許容し得る方法
で処置する段階を含む、ヒトを含む哺乳類をＨＣＶ感染
から保護する方法。
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