CN1051091C - 检测抗丙型肝炎病毒抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检验HCV感染的新的肽和其混合物。这些肽还可用作抗HCV感染之疫苗的活性成分。
Description
本发明涉及用于检测并定量丙型肝炎病毒(HCV)感染的新的线性肽及其混合物。这些肽亦可用作为HCV感染之疫苗中的活性成分。
1973年，引入了一个新的术语：非甲非乙型肝炎(NANB)来描述一种与甲型肝炎或乙型肝炎病毒都没有关联的肝炎。推测NANB是由一种以上的病原因子引起的。确实，此后已鉴定了两种新的负责传播肝炎的病毒。第一种戊型肝炎病毒，该病毒同甲型肝炎病毒一样是通过污染的水传播的。第二种是丙型肝炎病毒，与乙型肝炎病毒相似，该病毒主要是通过被感染的血液传染的。丙型肝炎是那些甲和乙型肝炎血清阴性的病人中最常见到的病毒性肝炎。
尽管为鉴定并消除所有肝炎病毒感染的供血血源作了大量的工作，但仍不断有关于发生输血相关肝炎的报导。常见的是无症状的带病毒者，而且他们常常在感染后10至30年内发展为肝硬化及肝细胞癌。根据其发现地区的统计，在所有输血后肝炎病例中，有50-90％是由HCV感染引起的，而且HCV确实造成了一个世界范围内的主要公共保健问题。
到目前为止，鉴定和分离HCV的尝试尚未获得成功。美国人进行的两次研究证明，NANB感染的血清常常见有丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性提高，或者抗乙型肝炎病毒核心抗原的抗体(抗HBc抗体)呈现阳性。因此，1987年决定针对ALT和抗HBc两项指标筛选所有的血液备用品。据信这些试验已防止了多达50％的输血相关NANB肝炎的发生。
1989年鉴定并克隆了HCV(Choo et al.，Science，244，349-362，1989)。HCV是长10kb的单链RNA病毒，它与黄色病毒有远亲关系，已根据对HCVRNA的序列同黄色病毒RNA的序列相比较，提出了有关HCV的一般组织结构的报导。据信HCV RNA被转译成单一的前体蛋白质，后者进一步被裂解成7或8个较小的蛋白质片段。一般认为前体的第一个区带包括三个分别称为C(核心)、M(膜)和E(外壳)的结构蛋白质分子。但M和E蛋白可被融合在单一蛋白质中。前体的第二个区带包括5个分别定名为NS1至NS5的非结构蛋白质。NS2可能是一种蛋白酶，且NS5可能是RNA聚合酶。
已经发展了几种利用HCV病毒蛋白的各区域来进行HCV诊断试验的方法(如Kuo et al.，Science，244，362-364，1989)。其中一个试验使用了称为C100-3的蛋白质片段。其为含有NS3和NS4非结构蛋白质的融合蛋白。在ELISA试验中，该蛋白质并没有显示出100％有效性。例如，一些有关报导指出，该试验在临床上只能诊断出10-29％发生在感染后不超过90天的急性HCV感染病例，而对于慢性HCV感染病例也只能诊断67-85％(HCV Learning Guide；Abbott Diagnostics Educatio n al Services，April1990；Kuo et al.，Science，244，362-364，1989；Esteban et al.，Lancet，2，294-296，1989；van der Poel et al.，Lancet，2，297-298，1989；Janot et al.，Lancet 2，796-797，1989；Bruix et al.，Lancet 2，1004-1006，1989；Colombo et al.，Lancet 2，1006-1008，1989)。可见，在用于HCV普查中，这些检测法没有显示出足够的灵敏性。
这些HCV检测法的特异性也很低。有的还因为与过氧化物歧化酶反应(用于该检测法中的HCV C100-3蛋白质片段是作为与过氧化物歧化酶(SOD)形成融合蛋白表达的)(Ikeda et al.，Lancet，335：1345-1346，1990)、与类风湿因子反应(Theilman et al.，Lancet，335：1346，1990)或因于高球蛋白血症状态等与自家免疫慢性活动性肝炎直接相关的因素反应(McFarlane et al，Lancet，335：754-757，1990；Boudart et al.，Lancet，336：63，1990)而呈现假阳性。
为了改进基于C100-3蛋白质之检测方法的灵敏性和特异性，已发展了一种重组体免疫印迹分析法(RIBA；Chiron-Ortho)。该检验法使用了两种HCV抗原，即重组HCV蛋白质C100-3(也称为C-100)和C-100的5-1-1片段(该基因产物包含NS3的C末端和NS4之N末端的一部分)。其中使用SOD作为对照。5-1-1抗原是作为与SOD的融合体在大肠杆菌内产生的。C-100肽也是作为与SOD的融合体在酵母中产生的。在使用ELISA法(用C100-3作为抗原)筛选低危险人群特别是美国供血者的基础上，进一步作RIBA分析，结果在所有以ELISA法检验为阳性的样品中，只有19％再次确定为阳性，而且有20％不能确定结果(Men-itove etal.，Lancet，336：243-244，1990)。
最近，由Abbott Laboratories建立了另一种点印迹分析法。该方法中，将四种纯化的重组抗原点在一片硝酸纤维素滤纸的分离部位上。其中一种抗原(SOD-C-100)是在酵母细胞中产生的，另外三种(C-100，HCV核心蛋白和33c)是作为与CMP-KDO合成酶(CKS)的融合蛋白在大肠杆菌中产生的。33c抗原包括了NS蛋白质的大部分。Mimms等人(Lancet，336：1590-1591，1990)报导了用这种检验方法对以ELISA法(其中使用C100-3抗原)确定为HCV阳性的153份样品作重复检验所获得的结果。发现只有一半的样品(75)与两种C-100基因产物，即SOD-C100-3融合蛋白和C-100-CKS融合蛋白呈阳性反应。其他样品则有些不与四种抗原的任一种反应(62)，有些与酵母中产生的SOD-C-100融合蛋白呈非特异性反应(16)。
从上述结果可以看出，目前可利用的基于重组抗原的HCV诊断试验，灵敏性和特异性都很差。这些方法漏检了占很大比例的HCV慢性感染病例(15％-33％)和急性感染病例(70-90％)。约有50％的被检样品为假阳性。此外，对常规筛选血库来说，免疫印迹法的费用太高而且工作量大。为此，有必要发展更为灵敏而且特异性更好的HCV感染的诊断试验方法。
本发明解决了上述问题。它提供了基于特异性HCV肽及其混合物的HCV感染诊断试验法。
本发明的肽选自下列一组肽序列及其类似物：
(i)
a-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPG-b (BCH-423)
a-PODVKFPGGGOIV-b (BCH-436)
a-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-437)
a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-438)
a-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-439)
a-RGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLT-b (BCH-443)
a-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLCV-b (BCH-446)
a-RGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGY-b (BCH-448)
a-GPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPI-b (BCH-461)
a-SSIVYEAADVIMHAPGSVPSVR-b (BCH-458)其中，a是氨基末端、1至8个氨基酸或有利于偶联或改善肽之免疫原性或抗原活性的取代基；
b是羧基末端，1至8个氨基酸或有利于偶联或改善肽之免疫原性或抗原活性的取代基；以及
(ii)具有下列通式的串联肽：
a-X-c-Z-b
其中X和Z各自是选自下列一组的氨基酸序列：
-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPG- (BGH-423)
-PQDVKFPGGGQIV- (BCH-436)
-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-437)
-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-438)
-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-439)
-RGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLT- (BCH-443)
-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGV- (BCH-446)
-RGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGY- (BCH-448)
-GPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPI- (BCH-461)
-SSIVYEAADVIMHAPGSVPSVR- (BCH-458)其类似物及其包括X和Y氨基酸序列之至少6个连续氨基酸单元的片段和它们的类似物；
其中a和b定义同上，且如果存在c的话，其为1或2个氨基酸的接头，或有利于偶联两个串联肽或改善串联肽之免疫原或抗原活性的取代基。
本发明的肽及其混合物可用于筛选有HCV感染的血液和体液，并可用于制备抗HCV感染的安全而有效的疫苗。例如，本发明的肽及其混合物可用于各种检测抗HCV抗体的特异性结合试验、用作诱导产生适于检测HCV抗原之抗体的免疫原、以及用于制备抗HCV病毒感染的疫苗。
附图说明
图1显示Takeuchi等人(Nucleic Acids Res.，18，4626，1990)所述之推测的HCV核心基因产物的氨基酸序列。
图2显示Takeuchi等人(文献同上)所述之推测的HCV被膜基因产物的氨基酸序列。
图3显示本发明的肽和为了比较而制备的各种其他肽的氨基酸序列。图中标示了这些肽在图1和2之序列中的定位。位置207、226和229中的半胱氨酸残基(BHC-427、BCH-429和BCH-458)被丝氨酸残基取代。
图1-3中，各序列的氨基酸残基用下列单字母代码表示：A＝ala、C＝cys、D＝asp、E＝glu、F＝phe、G＝gly、H＝his、I＝ile、K＝lys、L＝leu、M＝met、N＝asn、P＝pro、Q＝gln、R＝arg、S＝ser、T＝thr、V＝val、W＝trp、Y＝tyr。
本发明提供了相当于推测的HCV核心基因产物之免疫优势区域的新的肽及其类似物。还描述了一个覆盖推测的HCV被膜蛋白之反应性区域的肽。本发明还提供了这些肽和类似物的混合物及化学结合体(串联体)。正如将从下面的描述中了解到的，这些肽、类似物、混合物和串联体可用于有关HCV和由其引起之感染的多种诊断和预防方法、工具及组合物。
如上所述，本发明的肽选自下列一组肽序列及其类似物：
(i)
a-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPG-b (BCH-423)
a-PQDVKFPGGGQIV-b (BCH-436)
a-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-437)
a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-438)
a-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-439)
a-RGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLT-b (BCH-443)
a-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGV-b (BCH-446)
a-RGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGY-b (BCH-448)
a-GPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPI-b (BCH-461)
a-SSIVYEAADVIMHAPGSVPSVR-b (BCH-458).其中a是氨基末端、1至8个氨基酸或有利于偶联或改善免疫原性或抗原活性的取代基；
b是羧基末端、1至8个氨基酸或有利于偶联或改善免疫原性或抗原活性的取代基；以及
(ii)有下列通式的串联肽：
a-x-c-z-b
其中X和Z各自是选自下列一组的氨基酸序列：
-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPG- (BCH-423)
-PQDVKFPGGGQIV- (BCH-436)
-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-437)
-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-438)
-MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV- (BCH-439)
-RGSRPSWGPNDPRRRSRNLGKVIDTLT- (BCH-443)
-KFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGV- (BCH-446)
-RGRRQPIPKARRPEGRTWAOPGY- (BCH-448)
-GPRLGVRATRKTSERSOPRGRRQPI- (BCH-461)
-SSIVYEAADVIMHAPGSVPSVR- (BCH-458)其类似物及其包括X和Y氨基酸序列之至少6个相连氨基酸单元的片段和它们的类似物；
其中a和b定义同上，且如果存在C的话，其为1或2个氨基酸的接头，或是有利于偶联两个串联肽或改善串联肽之免疫原性或抗原活性的取代基。
本文中使用的术语“类似物”是指在肽链中，在由天然存在之HCV氨基酸序列单元组成的部分内有一处或多处氨基酸插入、缺失、取代和修饰。
对本发明肽之天然氨基酸序列的修饰和取代较好是保守修饰和取代(即这些修饰和取代对肽的二级结构和水处理特性的影响很小)。
其中包括如Dayhoff(Atlas of Protein Sequence and Struc-ture 5，1978)和Argos(EMBO J.，8，779-785，1989)所述的取代。例如，属于下列各组的氨基酸即代表了保守改变：ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；cys，ser，tyr，thr；val，ile，leu，met，ala，phe；lys，arg，his；以及phe，tyr，trp，his。
可按这种方式，用正亮氨酸取代本发明之多肽中的一个易于被氧化的氨基酸，即蛋氨酸。较好的取代包括用D-异构体取代相应的L-氨基酸。
本说明书中使用的术语“氨基酸”(如用于限定a和b及类似物)，除了指HCV之基因产物的固有氨基酸序列外，还包括所有天然氨基酸，呈D-构型的那些氨基酸，以及已知非天然的、合成的、以及被修饰的氨基酸，如高半胱氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸及β-缬氨酸。
如已在简要指出的，可对本发明的肽进行修饰，以使选择的肽更适于用作免疫诊断试剂，或用作疫苗的活性成分，这种修饰常常是有用的并肯定包括在本发明的范围之内。例如，这样的改变包括：——在一个或两个末端加入半胱氨酸残基，以便使用硫代琥珀酰亚胺基-4-(对位马来酰亚胺基苯基)丁酸酯等异双功能交联剂将肽偶联到适当的载体上。优选的交联剂是硫代琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯；——在肽的一个或两个末端加入1至8个附加氨基酸，以利于肽彼此连接，或将肽偶联到载体或较大肽或蛋白质上，或改进肽的物理或化学特性。这些改变的例子是通过酯化反应作为接头的N或C末端酪氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或加入可通过Schiff碱或酰胺形成而连接的赖氨酸。如上所述，这些附加氨基酸可包括任何一种天然氨基酸、呈D-构型的那些氨基酸及已知的非天然的、合成的及被修饰的氨基酸；以及——可借助例如酰化或酰胺化作用对肽的一个或两个末端进行修饰。这些修饰可导致肽所带净电荷的改变并有利于将肽共价连接到固相载体或其他肽上。有利于肽偶联或改善肽之免疫原性或抗原活性的取代基包括C2-C16酰基基团、聚乙二醇及磷脂。
如上面(ii)中提到的串联肽的利用应在本发明的范围之内。这些肽可以是均聚物或共聚物。本发明的肽和串联肽的物理混合物也包括在本发明范围内。
本发明的优选肽是BCH-423、BCH-437、BCH-438和BCH-439。本发明最优选的肽是BCH-438。本发明的优选的肽混合物至少包含BCH-438，更好的是，它们含有BCH-438和BCH-461。
本发明的肽及其混合物的意想不到的优点在于它们的高灵敏性。
它们能够检测大多数，有时是所有为估计HCV诊断药盒之性能所用的市售血清阳性样品中存在的HCV特异性抗体。本发明的肽和其混合物的另一个优点是它们具有高度特异性。例如，使用BCH-437或BCH-438检测63份得自正常供血者人群的被检样品，没有出现假阳性结果。
除了它们在HCV诊断工具、方法及组合物中的应用外，本发明的肽及其组合物还可用于抗HCV感染的疫苗中。
可使用任何一种常规肽生产方法来制备本发明的新肽。这些方法包括化学合成、DNA重组技术及它们的结合使用。我们优选固相合成法。
在该合成方法中，所用的树脂载体可以是肽的固相制备技术中常用的适当树脂，但较好是对位苄氧基醇聚苯乙烯或对位甲基苯甲羟胺树脂。在使第一个被保护的氨基酸偶联到树脂载体上之后，用本领域中通用的标准方法除去氨基保护基团。除去氨基保护基团后，可将剩余的被保护的氨基酸，必要时将侧链被保护的氨基酸，以预期的顺序相继偶联得到选择的肽。另外也可在与树脂载带的氨基酸序列偶联前使用溶液方法偶联多个氨基酸基团。
可按已确定的方法选择适当的偶联剂。例如，适用的偶联剂可以是N，N′-二异丙基碳化二亚胺或N，N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)，或更好是苯并三唑-1-基氧基-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸脂，它们可以单独使用或者更好是在1-羟基苯并三唑存在下使用。另一种有用的偶联方法是利用预生成的被保护氨基酸的对称酐。
将各氨基酸引入到生长之多肽链上所必需的α-氨基保护基团优选9-芴基甲氧羰基(FMOC)，但也可使用任何其他适用的保护基团，只要它不会在偶联条件下降解，而当在生长的肽链上已存在其他保持基团时能够较容易地并且选择性地除去即可。
选择侧链氨基酸保护基团的标准是：(a)保护基团在合成的各步骤，在为除去α氨基保护基团而选择的反应条件下对各种试剂的稳定性；(b)保护基团之战略特性的保留能力(即不会在偶联条件下被裂解掉)，以及(c)保护基团在肽合成结束后及在不会反过来影响肽结构的条件下的易除去性。
可在茴香醚、硫代茴香醚、乙基甲基硫、1，2-乙二硫醇及相关试剂存在下，室温下用加在二氯甲烷中的50-60％三氟乙酸溶液处理1-6小时，以从对位苄氧醇树脂上裂解整个被保护的树脂载带的肽。同时除去对酸最不稳性侧链保护基团。而对酸有较大抗性的保护基团则大多是经HF处理而除去。
可使用本发明的肽作为诊断试剂，按照本领域已知的方法检测并定量分析HCV相关抗体。这些已知方法包括ELISA、血液凝集试验、单点和多点印迹分析法(如RIBA)。
使用本发明的肽或肽混合物检测抗HCV抗体的优选常规经典技术是酶联免疫吸附法(ELISA)。该检测方法中，例如可将本发明的肽或其混合物吸附或共价偶联到微量滴定板的小井上。然后用被检血清或受检物处理各小井。洗涤后，向各小井内加入已用过氧化物酶标记的抗人IgG或抗人IgM。用相应底物如3，3′，5，5′-四甲基联苯胺检测过氧化物酶。也可用其他标记物如放射活性、荧光、化学发光或红外发射标记物等代替过氧化物酶，这种改变并没有违背该作为举例说明之分析法的可用性。
用本发明的肽和其混合物检测试验样品或血清中抗HCV抗体的另一种方法是根据所谓“双抗原夹心法”的酶免疫学检测法。该方法是基于Maiolini在Immunological Methods，20，25-34，1978中所描述的工作建立的。根据该方法，使被检血清或其他分析物与已用本发明的肽包被的固相(俘获层)接触，并与已用过氧化物酶或其他信号物质标记的本发明的肽(探查层)接触。
可经一个或两个步骤完成免疫学反应。如果以两个步骤完成免疫学反应，通常在两次保温之间多一个洗涤步骤。免疫学反应完成后通常还要进行洗涤。然后检测过氧化物酶或其他信号，如使用邻苯二胺检测过氧化物酶。该检测法中也可使用前已描述过的其他酶及显色剂。
用于上述分析法中的适当的固相包括有机或无机聚合物，如淀粉酶、葡聚糖、天然或改性的纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、琼脂糖、磁铁矿、多孔玻璃粉、氟化聚乙烯基二烯(kynar)和乳胶、试验容器(即试管、滴定板或玻璃或人造材料的小池)的内壁以及固体(如玻璃或人造材料棒、末端增粗的小棒、带有末端凸角或薄片的小棒)的表面。玻璃或人造材料的小球特别适于用作固相载体。
本发明的肽及其混合物不仅可用于检测或定量分析抗HCV抗体，而且因为本发明的游离的、聚合的或与适当载体结合的肽可用于引发与HCV抗原有免疫学交叉反应活性的抗体、特别是单克隆抗体产生，故也可用于检测并定量分析HCV抗原本身。例如，可给哺乳动物或鸟类动物注射足够量的肽，以引发预期的免疫反应，从而产生这样的抗体，然后即可从所说动物的血清中回收所说的抗体。用于引发抗体产生的适当宿主动物包括例如兔、马、山羊、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、羊和鸡。最好使用本发明的肽及常规技术制备能产生所需单克隆抗体的杂交瘤。
例如，可使用已知的Kohler和Milstein的技术生产单克隆抗体。可使用Sthli等人(J.of Immunological Methods32，297-304，1980)的方法来鉴别针对同一抗原，但针对不同抗原决定基的单克隆抗体。
可使用上述抗体，按照各种通常已知的方法检测或定量分析HCV或其部分。一种方法是，将已知量待检血清样品或其他分析物、放射标记的本发明的肽或其混合物、未标记的本发明的肽或其混合物混合在一起，然后加入给定量的抗本发明肽的抗体且最好是单克隆抗体，并使混合物静止一定时间。然后用本领域已知的方法，如用硫酸铵、聚乙二醇、过量的或与不溶性载体结合的第二抗体、或葡聚糖包被的活性炭处理，以将所得抗体/抗原复合物与未结合的试剂分离开。
然后按已知方法将被标记成分的水平与标准曲线相比较，以确定结合或未结合相中被标记肽的浓度，以及被检样品中的HCV抗原含量。
使用这些抗体的另一种适用检测方法是“双抗体夹心法”。按照这一方法，用两种不同的抗体，如用本发明的肽或其混合物免疫不同种动物如羊和兔而产生的两种抗体处理被检样品。其中一种抗体是被标记的，另一种则包被在固相上。较好的固相是塑料珠，且较好的标记物是辣根过氧化物酶。
在“双抗体夹心法”中，一般是将样品与固相抗体和被标记的抗体一起保温。但也可以先使样品与固相抗体接触，在经过适当洗涤后，再使样品与标记的抗体接触。但最好是用固相和标记的抗体一起处理样品。免疫学反应完成后，洗该混合物并按已知方法检测标记物。在使用过氧化物酶作标记物的情况下，可使用底物如邻苯二胺或四甲基联苯胺检测之。被标记成分的量与分析物或血清样品中存在的抗原量成正比。
也可使用以含有本发明的肽或其混合物，或含有由这些肽及混合物引发产生之抗HCV抗体为特征的适当试验药盒，来完成上述检测和定量分析HCV抗原或抗该病毒之抗体的方法及检测法。
如上所述，本发明的肽和混合物也可用作疫苗的活性成分，以在对HCV病毒感染敏感的宿主体内诱导抗HCV的保护性免疫力。疫苗给药途径、注射的抗原剂量和次数将随不同个体而异，并且与目前用于抗其他病毒感染之保护性免疫力的疫苗差不多。例如，本发明的疫苗是至少含有一种本发明之肽或其混合物的医药上可接受的组合物，其中肽或其混合物的含量应能使该组合物处理的动物包括人产生足可在一定时间内保护该动物免于遭受HCV感染的抗体。
按照已知方法制备疫苗。本发明的疫苗组合物可方便地并常规性地与生理上适用的载体材料如药用盐水、破伤风类毒素及钥孔血蓝蛋白一起合用。本发明的疫苗组合物还可含有佐剂或其他免疫反应增强剂，如明矾制品、脂质体或免疫调节剂。另外，这些疫苗组合物可包含引发抗其他病毒(如乙型肝炎病毒、HIV-1和HIV-2，细胞肥大病毒等)或除HCV以外病原体之免疫力的其他抗原。这些其他抗原的量同样决定于被治疗的哺乳动物和疾病过程。但组合物中抗原的量应能产生足可使被治疗的动物在一定时间内免于遭受该病原体或病毒感染的抗体。
下面描述本发明肽的一般合成步骤及应用方法。
步骤1
制备携带N-FMOC保护之氨基酸残基的树脂
将存在于二氯甲烷(CH2Cl2)和二甲基甲酰胺(DMF)之混合物(4∶1)中的所带之N-FMOC保护的氨基酸残基加到对位苄氧基醇树脂在CH2Cl2∶DMF(4∶1)中的悬浮液(0℃)内。将混合物手动搅拌数秒种后，先用N，N′-二环己基-碳化二亚胺(DCC)，然后再用催化量的4-(二甲氨基)吡啶处理之。于0℃将混合物继续搅拌30分钟，然后于室温下搅拌过夜。相继用CH2Cl2、DMF和异丙醇洗涤滤出的树脂(各洗三次)，最后再用CH2Cl2洗。将树脂悬浮于CH2Cl2中，在冰浴上冷却，并将重蒸馏的吡啶加到搅拌的悬浮液中，然后加入苯甲酰氯。于0℃继续搅拌30分钟，然后再于室温下搅拌60分钟。过滤后，相继用CH2Cl2、DMF和异丙醇洗所得树脂(各洗三次)，最后再用石油醚洗(2次)，然后在高真空下干燥至恒重。按Meienhofer等人(Int，J.PeptideProtein Res.，13，35，1979)所述方法对产生的取代进行分光光度检测，指示出树脂上取代的程度。
步骤2
偶联继后的氨基酸
将携带N-FMOC保护之第一个氨基酸残基的树脂放在Biosearch 9600肽合成仪的反应瓶内，并按下述方法处理之：
1)用DMF洗(4次，每次20秒)，
2)用加在DMF中的30％哌啶溶液预洗(3分钟)，
3)用加在DMF中的30％哌啶溶液去保护(7分钟)，
4)用DMF洗(8次，每次20秒种)，
5)检查游离氨基基团-Kaiser试验(必须为阳性)，
6)然后将肽树脂与8当量均已溶解于含16当量4-＜甲基吗
啉之无水重蒸馏DMF中的所需FMOC保护的氨基酸和1-
羟基苯并三唑及苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基-氨基)
磷鎓六氟磷酸酯一起振荡1或2小时，
7)用DMF洗(6次，每次20秒种)。
步骤7后，取一等份进行茚三酮试验。如果试验为阴性，即从步骤1重复整个过程以偶联下一个氨基酸。如果试验为阳性或稍呈阳性，则重复步骤6和7。
上面的流程可用于偶联本发明所述肽的各个氨基酸。用FMOC保护N末端也可用于整个合成中的其余氨基酸。
可使用上述偶联程序经掺入氚标记的氨基酸来对肽进行放射标记。
在加入最后一个氨基酸之后，倒过来进行上述流程的步骤1-7以除去末端残基的N-FMOC。用CH2Ol2洗此肽树脂并真空干燥之，得到保护的肽的粗制品。
步骤3
去保护并从树脂上裂解肽
将被保护的肽—树脂悬浮在三氟乙酸(TFA)在含2.5％乙二硫醇和2.5％茴香醚之CH2Cl2内制成的55％溶液中。用N气吹洗混合物并在室温下搅拌1.5小时。过滤该混合物并用CH2Cl2洗树脂。再次用加在CH2Cl2中的20％TFA将树脂在室温下处理5分钟。过滤混合物，用加在CH2Cl2中的20％TFA，然后再用CH2Cl2洗树脂。在低于35℃的真空下蒸发合并的滤液并用无水二甲醚将残留物洗几次。将固体物溶解在10％含水乙酸中并冻干以得到粗产物。
进一步在茴香醚和二甲基亚砜存在下于0℃用HF处理1小时，以使含有arg和cys残基的肽去保护。用10％含水乙酸提取肽，用二甲醚洗并冻干，得到粗产物。
步骤4：
纯化肽
在以流动相梯度装填的C18或C4反相Vydac柱(2.5×25mm)上用制备性HPLC纯化粗肽。监测流出物的220nm吸光率然后过分析性HPLC柱。合并相关部分，然后蒸发并冻干之。用分析性反相层析法和氨基酸序列分析法进一步证实合成肽的特性。
步骤5：
使肽与牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)相连接
使肽连接到预先用4-(对位马来酰亚胺基苯基)丁酸硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-SMPB)或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己基-1-羧酸硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-SMCC)衍化的BSA或KLH上。
将Sulfo-SMPB或Sulfo-SMCC(Pierce Chemi-cals)的水溶液加到BSA或KLH在0.02M磷酸钠缓冲液(pH7.0)中制成的溶液内。室温下将此混合物振荡45分钟，并将活化的载体直接加到预先在4℃下用0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)平衡过的Sephadex G-25柱上。
将相当于活化之载体的第一个吸收峰值(280nm)部分合并到已加入了溶于0.05M磷酸钠缓冲液(pH6.2)中之肽溶液的圆底烧瓶内。用N2气彻底吹洗混合物并在室温下保温过夜。使用3H标记的肽并通过对结合物进行氨基酸分析来监测偶联效率。
步骤6
用酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗HCV抗体
用100μl含有肽或肽混合物(10μg/ml)的溶液(过滤的0.05M碳酸盐—碳酸氢盐缓冲液，pH9.4±0.2)饱和微量滴定板的各小井并放置过夜。我们优先选用Oster Bay Versafill分配系统充填小井。排空各小井(最好用吸管抽吸)并用洗涤缓冲液〔NaCl0.15M；NaH2-PO4，0.060M；乙基汞硫代水杨酸钠，0.01％以及吐温20，0.05％；pH7.4(0.3ml/小井)〕洗各小井两次。然后在37℃下用0.35ml洗涤缓冲液将小井饱和1小时，并用没有吐温20的同一缓冲液洗一次。再次于37℃干燥1小时后备用。同样品缓冲液(磷酸钠，6mM；Na-Cl，0.15M；BAS，2％；胨，1.5％；苄脒，80mM；吐温20，1％；热灭活的山羊血清，40％；乙基汞硫代水杨酸钠，0.01％；终pH＝7.2)稀释待分析的血清样品。用洗涤缓冲液冲洗小井，然后加入已稀释的血清样品(0.1ml)。将其在室温下放置保温30分钟。然后吸空各小井，用洗涤缓冲液迅速洗两次，然后再洗1次洗两分钟。用加在含0.05MTris、0.5M NaCl、0.05％吐温20、0.01％乙基汞硫代水杨酸钠之溶液(pH7.2)中的1％(w/v)牛血清白蛋白稀释结合物溶液(辣根过氧化物酶标记的、亲和层析纯化的羊抗人IgG抗体，0.5mg在5ml50％甘油中)，将所得稀释液加到各小井内并在室温下保温30分钟。然后吸空小井并用洗涤缓冲液洗5次。用100倍体积之含有0.1％(v/v)30％H2O2的0.1M柠檬酸盐—乙酸盐缓冲液(pH5.6)稀释底物溶液(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)(每毫升DMSO含8毫克)，并将所得稀释液加到各小井内(每小井0.1毫升)。10分钟后，用0.1ml2NH2SO4处理各小并的内容物并读出450nm处的光密度。所有检测均以重复的双份进行。
使用基本上如上所述的一般程序制备图3中列出的特异性肽。然后估价它们检测HCV特异性抗体的能力。
实验1
本实验1中，将各个肽以10μg/ml的终浓度溶解于0.05M碳酸钠—碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)中。然后按上述步骤6所述处理小井。
使用购自Boston Biochedica Inc.(BBI)的一组25份抗HCV反应性血清和血浆样品。表1举例说明了9个包括HCV核心蛋白之不同序列的九个合成肽的抗原反应性。
表1
| 样品号 | 用合成肽进行EIA试验 |
| BCH-423 BCH-436 BCH-437 BCH-438 BCH-439 BCH-443 BCH-446 BCH-448 BCH-461 | |
| 1801-11801-21801-31801-121801-191801-201801-251801-301801-311801-401801-431801-581801-591801-611801-631801-811801-821801-831801-861801-903210-1193210-1273210-2233210-4643210-748 | ＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 ＞22 ＞22 ＞21 ＞18＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 7.8 ＞22 ＞21 ＞1813 0.8 10 15.2 16 0.6 0.4 0.2 0.5＞16 2.6 ＞22 ＞19 ＞18 1.6 ＞22 7.0 1.6＞16 10 ＞22 ＞19 ＞18 6.7 ＞22 5.7 4.0＞16 4.4 ＞22 ＞19 ＞18 4.5 21 5.1 6.915 1.7 ＞22 ＞19 ＞18 1.1 ＞22 0.1 0.3＞16 1.6 ＞22 ＞19 ＞18 1.2 ＞22 0.1 0.3＞16 15 ＞22 ＞19 ＞18 15 15 16 131.7 0.2 0.5 0.9 2.1 0.3 0.0 0.1 0.4＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 19 ＞22 ＞21 ＞18＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 2.5 ＞22 5.0 ＞180.2 0.3 1.6 3.0 3.8 0.2 0.0 0.2 0.2＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 2.3 ＞22 4.7 ＞18＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 2.1 ＞22 4.4 ＞18＞16 10.5 ＞22 ＞19 ＞18 7.6 16 8.0 ＞18＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 ＞22 ＞22 ＞21 ＞18＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 ＞22 ＞22 ＞21 ＞18＞16 20 ＞22 ＞19 ＞18 8.8 21 13 ＞18＞16 2.9 ＞22 ＞19 ＞18 4.0 ＞22 0.4 2.3＞16 8.4 ＞22 ＞19 ＞18 2.5 ＞22 1.7 4.4＞16 1.7 ＞22 ＞19 ＞18 7.2 ＞22 0.9 1.5＞16 3.1 14 ＞19 ＞18 2.5 ＞22 1.0 1.85.6 0.9 8.0 9.7 9.7 0.4 1.1 1.0 1.0＞16 ＞22 ＞22 ＞19 ＞18 ＞22 ＞22 ＞21 ＞18 |
结果代表信号对信号中断的比例。中断是用取自三个正常供血者的血浆样品得到的平均吸光率，其数值已加上了0.100。比例≥1.0表示为反应性样品。BCH-448和BCH-461能够分别在72％(18/25)和80％(20/25)被检样品中检出抗HCV抗体的存在。给人留下深刻的印象的是，BCH-436和BCH-443可检出84％(21/25)被检样品中的抗体，BCH-446中检出88％(22/25)被检样品中的抗体。但更为令人惊奇的结果是，使用BCH-423、BCH-437、BCH-438和BCH-439均可在25份样品中至少检出24份(≥96％)抗HCV反应性样品。为此，使用BCH-423、BCH-437、BCH-438和BCH-439作进一步的实验(见实验3)。
实验2
按上述方法并使用同一组的25份样品检验覆盖推断之被膜蛋白之各部分序列的合成肽。
结果代表了如上计算的信号对信号中断的比例，并列示于表2中。
表2
| 样品序号 | 用合成肽进行EIA试验 |
| BCH-427 BCH-458 BCH-429 BCH-440 BCH-430 BCH-464 | |
| 1801-11801-21801-31801-121801-191801-201801-251801-301801-311801-401801-431801-581801-591801-611801-631801-811801-821801-831801-861801-903210-1193210-1273210-2233210-4643210-748 | 0.3 7.4 1.3 1.1 0.3 0.10.1 8.2 3.3 1.5 0.3 0.10.1 0.1 0.1 0.0 0.1 0.00.1 0.9 0.2 0.0 0.1 0.00.7 8.0 0.9 0.4 0.8 0.30.2 0.7 0.2 0.2 0.2 0.10.2 0.7 0.2 0.0 0.2 0.30.2 0.7 0.2 0.0 0.3 0.40.2 4.0 0.3 0.1 0.3 0.10.3 0.1 0.5 0.1 0.2 0.10.2 ＞20 5.0 3.2 0.4 0.20.1 7.9 0.4 0.3 0.3 0.00.2 0.2 0.2 0.0 0.1 0.00.1 8.6 0.3 0.2 0.2 0.10.1 8.0 0.3 0.3 0.2 0.01.7 3.4 0.4 0.4 0.2 0.10.2 10.8 2.3 1.3 0.3 0.20.3 16.5 2.4 1.5 1.0 0.20.4 4.3 0.6 0.4 0.3 0.10.3 1.2 0.4 0.2 0.3 0.80.3 6.0 0.8 0.3 0.6 0.20.3 1.8 0.8 0.2 1.1 0.10.1 1.0 0.4 0.2 0.2 0.10.1 0.3 0.1 0.1 0.1 0.10.3 ＞20 3.0 9.0 0.6 0.4 |
如表2所示，合成肽BCH-464、BCH-427和BCH-430分别从25份样品中检出0，1和2份反应性样品，可见是很差的抗原。BCH-429和BCH-440也很差，它们只从同一组25份样品中检出6份。BCH-458覆盖与BCH-427相邻的区域，并且与BCH-429有部分重迭，用它检出17份反应性样品，为此是唯一的反应性抗原。
实验3
用实验1中鉴定的四个最好的合成肽对两组明确定性的样品(由BBI出售的)作进一步的检验。第一组包括25份混合滴度的抗HCV样品(PHV-201)，第二组包括15份低滴度抗HCV血清和血浆样品(PHV-101)。结果分别示于表3a和3b中。
表3a
| 样品序号 | 用合成肽进行试验 |
| Abbott Ortho BCH-423 BCH-437 BCH-438 BCH-439 | |
| PHV-201-01PHV-201-02PHV-201-03PHV-201-04PHV-201-05PHV-201-06PHV-201-07PHV-201-08PHV-201-09PHV-201-10PHV-201-11PHV-201-12PHV-201-13PHV-201-14PHV-201-15PHV-201-16PHV-201-17PHV-201-18PHV-201-19PHV-201-20PHV-201-21PHV-201-22PHV-201-23PHV-201-24PHV-201-25 | 1.69(P) 1.48(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞223.67(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞223.79(P) 3.95(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞220.27(N) 0.18(N) 0.39 0.11 0.10 0.153.42(P) 2.59(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞223.71(P) 4.81(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞220.26(N) 0.11(N) 0.39 0.27 0.29 0.311.52(P) 1.24(I) 1.17 1.63 3.53 2.542.53(P) 1.27(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞222.17(P) 2.74(I) 12.38 0.33 1.59 0.872.88(P) 2.17(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞223.64(P) 4.77(P) 14.92 15.51 20.39 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞222.67(P) 4.30(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞223.54(P) 3.94(P) 14.46 ＞22 ＞22 ＞220.50(N) 1.53(N) 0.18 0.52 0.67 0.902.61(P) 2.38(P) 1.11 1.72 1.90 2.343.43(P) 2.67(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞221.72(P) 1.69(P) 13.69 13.63 19.48 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞222.50(P) 2.63(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞224.12(P) 5.66(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞22 |
表3b
所有结果均以样品吸收对中断的比例表示。比例≥1.0即被看作有反应性。“Abbott”和“Ortho”下方的数据是由BBI向购买他们的混合滴度抗HCV样品者提供的。括号内的字母P、N和I分别代表“阳性”、“阴性”和“不确定”；该数据是使用这些生产商认定的EIA或RIBA2.0药盒测得并随样品一起由BBI提供的。
| 样品序号 | 用合成肽进行试验 |
| Abbott Ortho BCH-423 BCH-437 BCH-438 BCH-439 | |
| PHV-101-02PHV-101-03PHV-101-04PHV-101-05PHV-101-06PHV-101-07PHV-101-08PHV-101-09PHV-101-10PHV-101-11PHV-101-12PHV-101-13PHV-101-14PHV-101-15 | 0.17(N) 0.27(N) 0.30 0.18 0.20 0.241.88(P) 1.32(N) 1.51 0.63 1.30 1.611.76(P) 3.08(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞213.40(P) 2.17(N) 2.03 0.85 2.04 2.731.64(P) 1.64(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞212.28(P) 1.62(P) 17.3 ＞22 ＞22 ＞213.01(P) 1.59(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞211.86(P) 1.12(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞213.65(P) 3.10(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞210.66(P) 1.82(P) 16.7 ＞22 ＞22 ＞213.02(P) 2.20(P) 15.5 ＞22 ＞22 ＞212.80(P) 2.77(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞211.91(P) 0.85(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞213.69(P) 3.24(P) ＞18 ＞22 ＞22 ＞21 |
样品4、7和19(表3a)被看作是抗HCV阴性，尽管Ortho的EIA试验对样品19给出了一个低阳性信号。补充进行Ortho RIB-A2.0试验，发现样品8和10为“不确定”结果。除用BCH-437和BCH-439检测样品10得出阴性结果外，用我们的合成肽检测的这些样品均为阳性。总地看来，用BCH-438和BCH-439可检测到最强的阳性信号。
表3b中所示的该低滴度抗HCV性能试验样品只包括了用至少一种许可的试验药盒检测时给出信号对中断比例小于4.0之结果的样品。样品2在用所有合成肽进行的所有试验中都是阴性，故可认定其为真正阴性。用RIBA2.0补充药盒检验不能进一步证实样品3和5为阳性。肽BCH-423、BCH-438和BCH-439能够检出这些样品为阳性。在所有其他情况下，用BCH-423、BCH-437、BCH-438和BCH-439测得的信号对中断比例均明显高于用两种市售EIA药盒测得的结果。
用这两组检测工具对已明确定性的样品所作检测的结果表明，被试的合成肽BCH-423、BCH-438和BCH-439要比市售抗HCV试验药盒好得多。使用我们的肽可检出难以用市售药盒检出的样品，即易于出现高信号对中断比例的低滴度样品。
实验4
本实验旨在检测四个优选合成肽对HCV抗体的特异性。为此，从63个正常供血者中收集一组样品(血清和血浆)。表4总结了分别用这四个被试肽对这一组血清阴性样品所作试验的数据。
表4
| 用合成肽进行试验 | ||||
| BCH-423 | BCH-437 | BCH-438 | BCH-439 | |
| 被检样品数：反应性样品数：对非反应性样品测得的平均吸收率：标准差 | 6350.075(n)0.037(58) | 6300.0280.017(63) | 6300.0500.040(63) | 63110.0520.027(52) |
表4显示，BCH-437和BCH-438在所有63份血清阴性样品中未检出任何阳性结果，准确率为100％。在检测血清阴性样品中，BCH-423准确率为92％，BCH-439准确率为82％。因此可以看出，存在于BCH-423和BCH-439上，但BCH-437和BCH-438中没有的氨基酸序列“MSTNP”可能对用BCH-423和BCH-439测得的“假阳性”结果负责。
实验5
联合使用本发明的最优选的肽BCH-438和另外三个合成肽(BCH-446、BCH-448和BCH-461)进行试验，所有这些肽可识别实验1中筛选的大部分抗HCV血清阳性样品。当单独试验时，各合成肽的浓度为10μg/ml。混合物中BCH-438的浓度为6.7μg/ml，第二种肽浓度即为3.3μg/ml。如所指出的，使用前面所述的同样样品稀释液将某些样品稀释50、200、1000或2000倍(方法见实验1)。稀释可使我们更准确地检测出使用某些肽混合物所观察到的灵敏性增加。
表5
| 样品序号 | 稀释度 | 用合成肽进行试验 |
| BCH-438 BCH-446 BCH-448 BCH-461 BCH-438 BCH-438 BCH-438+ + +BCH-446 BCH-448 BCH-461 | ||
| 1801-11801-21801-31801-121801-191801-201801-251801-301801-311801-401801-431801-581801-591801-611801-631801-811801-821801-831801-861801-903210-1193210-127PHV-101-03PHV-101-05PHV-201-10PHV-201-20 | 1/2001/2001/501/2001/2001/2001/2001/2001/2001/501/2001/2001/501/2001/10001/10001/10001/20001/20001/20001/20001/20001/501/501/501/50 | ＞19 18.8 19 14.7 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 16.2 ＞19 ＞19 ＞19 ＞1916.6 1.3 0.3 0.7 19.4 18.5 17.3＞19 ＞19 4.2 0.6 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 3.9 0.8 ＞19 ＞19 ＞19＞19 12.3 3.3 3.6 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 0.0 1.3 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 0.1 0.1 ＞19 ＞19 ＞19＞19 7.2 14.2 5.7 ＞19 ＞19 ＞191.2 0.2 0.2 0.9 0.6 1.0 1.1＞19 ＞19 ＞19 ＞19 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 3.6 ＞19 ＞19 ＞19 ＞192.5 0.1 0.4 0.3 1.1 2.1 2.1＞19 ＞19 4.1 ＞19 ＞19 ＞19 ＞19＞19 ＞19 0.8 14.7 ＞19 ＞19 ＞1912.2 1.7 1.2 11.0 15.7 15.0 18.0＞19 10.7 17.0 9.6 ＞19 ＞19 ＞19＞19 18.7 6.4 8.1 ＞19 ＞19 ＞199.8 1.4 0.9 8.2 13.0 12.2 14.812.7 5.5 0.0 0.2 11.4 13.0 13.211.9 3.0 0.1 0.3 14.3 11.9 11.87.6 18.8 0.0 0.1 18.3 8.2 8.11.7 0.8 0.4 0.7 2.0 1.7 1.82.2 1.1 0.5 1.1 2.9 3.3 2.92.3 0.4 0.1 0.2 0.9 1.6 1.52.6 .05 0.4 4.7 2.5 2.9 5.6 |
表5显示，与单用BCH-438检测血清阳性样品所得结果相比，BCH-438与BCH-446、BCH-448或BCH-461合用时，可检测到相等或更高的信号对信号中断比例，分别为81％、88％和85％。用BCH-438/BCH-461混合物观察到的灵敏性提高是特别显著的。当用BCH-438/BCH-461混合物试验时，几个单用BCH-438发现为低阳性的样品(如1801-81、1801-86和PHV-201-20)出现明显放大了的信号。
虽然我们在本文中提出了许多本发明的实施方案，但显然可以改变我们的基本结构，以提供利用本发明之方法和组合物的其他实施方案。因此，应理解到本发明的范围是由待批权利要求限定的，而不是由借助上述实施例提出的特定实施方案限定的。
Claims (4)
1.检测被分析物中HCV相关抗体之存在的方法，该方法包括使等分的被分析物与选自下列一组的肽接触之步骤：
a-PQDVKFPGGGQIV-b (BCH-436)
a-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-437)
a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-438)
其中a是氨基末端；
b是羧基末端。
2.根据权利要求1的方法，其中的肽选自：
a-KRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-437)
a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-438)
其中a是氨基末端；
b是羧基末端。
3.根据权利要求1的方法，其中的肽选自：
a-KPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIV-b (BCH-438)
其中a是氨基末端；
b是羧基末端。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，选自包括ELISA、血液凝集法、单点和多点印迹检测法的一组方法。
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