JPH08500122A

JPH08500122A - 非ａ非ｂ型肝炎の診断及び検出に有効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターペプチド

Info

Publication number: JPH08500122A
Application number: JP6508235A
Authority: JP
Inventors: ワン，チャン・イ; ホセイン，バーバラ
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1992-09-15
Filing date: 1993-09-15
Publication date: 1996-01-09
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: JP2818755B2; WO1994006826A1; US5582968A; NO950977D0; CA2144435A1; EP0662082A1; AU5127693A; NO950977L; EP0662082A4; FI951198A0; FI951198A

Abstract

(57)【要約】本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）並びにＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の診断及び予防に特異的である新規分枝ぺプチドに関する。より詳細には、本発明は、イムノアッセイ技術を用いてのＮＡＮＢＨ患者におけるＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効である少なくとも１個のエピトープを含む、分枝合成置換及びハイブリッドペプチドに向けられるものである。本発明は更に、主題ぺプチドを用いたＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の検出及び診断のためのイムノアッセイ及びキットを提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及び検出に有効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターペプチド本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を含む非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の診断及び予防に特異的である新規分枝ぺプチドに関する。より詳細には、本発明は、イムノアッセイ技術を用いたＮＡＮＢＨ患者におけるＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効である少なくとも１個のエピトープを含む分技合成ペプチドに向けられるものである。本発明は更に、ここで述べるペプチドのハイブリッドである合成ぺプチドに向けられるものである。非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、輸血後肝炎の最も多い形であり、本疾患のキャリアーであるかもしれない潜在的な血液供与者及び他の人を同定するための高感度でかつ特異的な診断スクリ−ニング法が強く要望されてきた。したがって、血液供給系から汚染血液及び汚染血液製品を高い信頼度をもって除去することを可能とする正確なスクリ−ニング法が必要とされている。ＮＡＮＢＨの原因学的因子であるＨＣＶは、いくつかのグループによりクローン化され、同定されてきた[Houghton et al., EP0318216, 1989年5 月発表； Ok amoto et al., (1990) Jpn.J.Exp. Med. 60:167; Houghton et al., EP 0388232 ，1990年9 月発表；及びKato et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:9 524; Arima et al., (1989a) Gastroenterologia Japonica24:540; Reyes et al ., (1990) Science 247:1335; Arima etal., (1989b) Gastroenterologia Japon ica 24:545; Maeno et al ., (1990) Nucleic Acids Res.18:2685] 。ＨＣＶゲノムは長さ１０キロベース(kb)であり、構造及び非構造タンパク質へとプロセシンダされる単一のポリタンパク質をコードする。このポリタンパク質は、Ｎ末端から、構造領域のキャプシド及びエンベロープタンパク質並びに非構造領域のＮＳ−１からＮＳ−５タンパク質を含む。ＨＣＶの抗原性領域のうちいくつかは同定されているが、これらの領域由来のぺプチド及び組換えタンパク質は、ＮＡＮＢＨキャリアーの検出及び診断においてまちまちな感受性と選択性を示す。抗原性領域は、コア又はキャプシドタンパク質[Hosein et al.,(1991) Proc.Natl.Acad. Sci.USA 88:3647; UBI HCV EIAPr oduct Insert (UBI HCV EIA製品説明書) (1990); Okamoto etal., (1990) Jap. J. Exp. Med. 60:223;米国特許第 5,106,726号； Takahashi et al., (1992) J. Gen.Virol. 73:667; Kotwalet al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:44 86]；エンべロープ、ＮＳ−１、ＮＳ−２及びＮＳ−３タンパク質[Wang etal., EP 0468527, 1992年1 月29日発表]；ＮＳ−４タンパク質[Houghton (1989); K uo et al., (1989) Science 244:362; 米国特許第5,106,726号] 並びにＮＳ−５タンパク質[Maeno et al.,(1990) Nucleic Acids Res. 18:2685; Wang (1992)] において報告されている。ＨＣＶ由来抗原に加えて、宿主細胞配列によりコードされると考えられている他のＮＡＮＢＨ関連抗原も存在する。ＧＯＲエピトープとして知られているこのような抗原の一つは、ＨＣＶについてＰＣＲ陽性である人の血清と反応する[Mishiro et al., (1990)Lancet 336:1 400]。 Wang(1992)及び米国特許第 5,106,726号に記載されているように、ある種のＨＣＶ抗原性領域内におけるエピトープのマッピングには、血清学的バリデーション（試験）が用いられており、これらの文献はそれぞれ参照によりここに包含されるものとする。これらのマッピングに関する研究には、良好に特徴づけられたＮＡＮＢＨ血清パネルをスクリ−ニングするために合成ぺプチドが使用されており、強力なＨＣＶ抗原の同定が可能となっている。血清学的バリデーション技術を用いてエピトープ分析が更に改良された結果、ＨＣＶゲノムの別の領域由来の１個若しくはそれ以上のエピトープを含む、長い分枝ぺプチド又はぺプチド融合物内に含まれるアミノ酸残基の小さいクラスターが、より感度の高い優れたＨＣＶ感染並びにＮＡＮＢＨキャリアーの診断及び検出法をもたらすことが発見されるに至った。したがって本発明は、ＮＡＮＢＨセロコンバージョン（血清変換）の早期検出を可能とし、例えば擬陽性を示す血清サンプルの検出が少なくなるという特異性の改善を示す。本発明は、ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染の診断及び検出のための分枝合成ぺプチドに関する。特に、主題であるペプチドは、式：（ぺプチド）₂Ｘ（ぺプチド）₄Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₈Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘは、アミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個のカルボキシル基を有し、それぞれの基がペプチド結合連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログ（類似体）である）で示され、ぺプチド部分は、ＨＣＶに対する抗体と特異的に免疫反応を示す少なくとも１個のエピトープを含む、少なくとも１個の分枝ペプチドを有するぺプチド組成物として提供される。ぺプチド部分は更に、以下の配列：又はＨＣＶ株若しくは分離株における対応領域由来のこれらの配列の１つに対応する配列由来の、約３から約２０の隣接するアミノ酸の少なくとも１個のクラスターを含む。更に又、ペプチド部分か２個又はそれ以上のクラスターを含む場合、クラスターは連鎖基を介して結合させるか、或いはクラスターがそれぞれ上記の配列の異なる配列由来の配列を有している場合、クラスターは直接結合させるか又は連鎖基を介して結合させることが可能である。ペプチド部分が、上記配列の異なる配列由来の配列を含む場合、このようなぺプチドはハイブリッドペプチドと呼ばれる。ハイブリッドペプチドはクラスターを含むことはできるが、必ずしも含まなくてもよい。ハイブリッドペプチド中のクラスクーは直接又は連鎖基を介して結合させることができる。ハイブリッドペプチドにおいては、いずれかの配列由来の隣接するアミノ酸の長さは、約６０残基に及ぶことができる。本発明の別の側面は、イムノアッセイ手順、特にＥＬＩＳＡ手順、又は受身血球凝集（ＰＨＡ）アッセイにおいて、免疫学的に有効な量の主題ぺプチド組成物を用いて、ＨＣＶに対する抗体の検出法又はＨＣＶ感染若しくはＮＡＮＢＨの診断法を提供することである。ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染の検出及び診断のためのイムノアッセイ及びキットも又提供される。本発明によると、エピトープを広範囲に分析した結果、ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染の検出及び診断に有用であるエピトープを純化し、更に定義することが可能となった。この分析により、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染のための有効な診断用ぺプチドが、異なるぺプチド由来の１個又はそれ以上のＨＣＶエピトープを含むぺプチドのハイブリッドである分枝した合成ぺプチド（これも又ここでハイブリッドペプチドと呼ばれる）であることが確立された。更に又、本発明ぺプチドは、ＨＣＶに対する抗体と特異的に免疫反応を示す少なくとも１個のエピトープを有し、そしてＰｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ１１、Ｐｅｐ１８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＨ、ＩＩＩＤ、Ｖ、ＶＩＩＩＥ、ＰｅｐＡと称されるぺプチド又はＨＣＶの別の株若しくは分離株における対応領域由来の相同ぺプチド由来の約３から約２０個の隣接するアミノ酸からなる１個若しくはそれ以上のクラスターを含むぺプチド部分を有する、分枝合成ぺプチドをも含むものである。更に、ここでクラスターぺプチドと呼ばれるこれらのぺプチドのぺプチド部分が２個又はそれ以上のクラスターを含む場合、これらのクラスターは連鎖基を介して結合している。連鎖基は、１個若しくはそれ以上の天然アミノ酸、１個若しくはそれ以上の非天然アミノ酸、又は１個若しくはそれ以上の、ぺプチド結合（若しくはぺプチド様結合）を形成することができ、ぺプチド合成に用いられる条件に対して安定であるアミノ酸アナログからなるが、これらに限定されるわけではない。クラスターを含むハイブリッドペプチドの場合、クラスターは直接結合するか又は連鎖基を介して結合することができる。詳細なエピトープ分析を受け、主題分枝ぺプチドのペプチド部分が誘導される元となるぺプチドの配列は、上述したとおりであり、Ｐｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ１１、Ｐｅｐ１８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＨ、ＩＩＩＤ、Ｖ、ＶＩＩＩＥ及びＰｅｐＡと称される配列、又はＨＣＶの別の株若しくは分離株における対応領域由来の相同ぺプチド、並びにそれらのアナログ及びセグメントである。ここで使用されている「クラスター」とは、ここに記載するぺプチド配列の１個又はそのアナログ若しくはセグメント由来の３から約２０個の隣接するアミノ酸の配列である。好ましい実施態様においては、クラスターは３から９個の隣接するアミノ酸の配列である。そのアナログ及びセグメントを含む本発明の分枝ハイブリッド及びクラスターペプチドは、体液中のＨＣＶに対する抗体の検出、ＮＡＮＢＨの診断、及び中相若しくは保護抗体を含むＨＣＶに対する抗体の産生を刺激するための健康な哺乳類（特にヒト）へのワクチン接種に有用である。主題である分枝ペプチドは、組合わせ又はセグメント、つまり、非天然アミノ酸を含むアミノ酸を末端アミノ酸に付加された形で有することにより、又はいずれかの末端からアミノ酸を除去することにより、より長い又はより短いぺプチド鎖からなることができる。例えば、ＫＫＫ（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）配列を、ぺプチドのアミノ末端に付加することができる。同様に、Ｍ（メチオニン）残基を、ぺプチド部分のカルボキシ末端、つまりペプチド部分と分枝構造との間に位置させることができる。ここで使用されている「セグメント」は、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効なエピトープを保持している親ぺプチドのより短い領域を意味する。例えば、ＣＩＯＡは、その親ぺプチドであるＶＩＩＩＥのセグメントである。セグメントは、その親ペプチドのいずれかの末端又はその親ぺプチドの内部配列から誘導することができる。主題である分枝ぺプチドは又、ＨＣＶの異なる分離株間の株ごとの変異又はエピトープの免疫原性に影響しない所定の配列中のそのほかの置換に適応させるために、そのアナログを含むこともできる。ＨＣＶはしばしば突然変異を起こすことが示されている。ＰＴ、Ｊ、Ｊ１及びＪ４などいくつかの変異株／分離株が存在することが知られており[Houghton, 1989; Okamoto, 1990; Houghton,1990; 及びKato, 1990]、他の変異株も又存在することが予想されている。保存的置換のための調整、及び非保存的置換が含まれる代替物からの選択は、所定の配列において行うことができる。したがって、分枝合成ペプチドのアナログ、特にハイブリッドペプチドは、ＨＣＶに対する抗体により認識されうる免疫反応性が存在する限り、多様な株に適応させるために、上記配列の列挙されたアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を含むことができる。置換及び挿入は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はペプチド結合若しくはぺプチド様結合を形成することのできるアミノ酸アナログ（例えば、ぺプチドチオールアナログ）により完成させることができる。本発明によるアナログペプチドは、合成し、以下に述べるようにぺプチドの免疫反応性を決定するために、ＨＣＶ血清パネルに対する試験を行う。更に、適当なアミノ酸修飾又は置換により、ＨＣＶ抗体スクリーニングアッセイに有用な、より低いバックグラウンド値又は固相へのより良好な結合能をもたらす特性を有する、所定のアミノ酸配列に基づく各種ペプチドアナログを合成できることが予想されている。特に、非天然アミノ酸を含むぺプチドにより、有意にバックグラウンド値を低下させることができる。主題である分枝ぺプチドは又、複合物（コンジュゲー卜）形成に使用することができる。つまり本ペプチドは、当業界において公知の方法により、直接又は間接的に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの担体タンパク質又は赤血球若しくはラテックス粒子と結合させることができる。ここで使用されている場合、天然アミノ酸は、タンパク質中に通常見出される２０種類のアミノ酸（つまりアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、トリプトファン及びバリン）である。ここで使用されている天然アミノ酸は又、このようなアミノ酸のＤ−体及びＬ−体を含む。ここで使用されている「非天然アミノ酸」は、タンパク質中に見出されようと、天然に見出されようと、又は合成されたものであろうと、他のあらゆるアミノ酸のＤ−体及びＬ−体の両方を含む。非天然アミノ酸としては、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ −アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンなどが挙げられるが、これに限定されるわけではない。本発明の分枝ぺプチドは、式：（ぺプチド）₂Ｘ（ぺプチド）₄Ｘ₂ Ｘ（ぺプチド）₈Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₁₆ Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘは、アミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個のカルボキシル基を有し、それぞれの基がぺプチド結合連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログである）のいずれかにより示される。Ｘは、好ましくは、リジン、又はオルニチンなどのリジンアナログである。アミノ酸アナログは、α−アミノ酸、β−アミノ酸、又はぺプチド結合形成に利用することのできる２個のアミノ基及び１個のカルボキシル基を有するその他の天然若しくは非天然アミノ酸、のいずれかである。本発明の好ましい分枝ペプチドは、二量体、四量体及び八量体であり、特にリジンから成る分枝コア構造を有するもの、つまりＸがリジンであるものである。分枝二量体は特に好ましい。分枝ぺプチドのぺプチド部分の長さは、約１０から約１００アミノ酸残基であることができる。ぺプチド部分は、好ましくは約１７から約６０アミノ酸残基を含む。更に、ハイブリッド及びクラスターペプチド部分は、ＮＡＮＢＨ関連抗体の検出に有効であるエピトープを含み、本発明の優れた感度及び選択性を保持するのに必要な最少の全体長に最適に調節することができる。本発明の好ましい分枝ぺプチドを、表１に示す。各ぺプチドの由来源を表２に示す。ａ略号：非天然アミノ酸としてノルバリンがＶ、ノルロイシンが１、ヒドロキシプロリンかｐ、オルニチンがｏで示されている以外、アミノ酸配列は、１文字の記号で示されている。他の略号は、リジン二量体がＤＩＭ、リジン八量体がＯＣＴである。ｂこれらのぺプチドの分枝コアは、リジン残基からなり、例えば二量体ぺプチドについては１個のリジン、及び八量体ぺプチドについては７個のリジンからなる。本発明のぺプチド組成物は、１若しくはそれ以上の分枝ハイブリッドペプチド、分枝クラスターぺプチド、又はこのようなぺプチドのあらゆる組み合わせからなることができる。このような組成物は、好ましくは１から１０の分枝ぺプチド、より好ましくは１から４の分枝ぺプチドを含む。好ましい実施態様においては、本発明のぺプチド組成物は、分技ぺプチド（１）Ｃ３二量体、Ｃ９Ｂ二量体、Ｃ６Ａ二量体及び３ＫＨ７二量体；（２）３Ｋ２０４ｈ二量体、Ｃ４二量体、Ｃ２Ｂ八量体；（３）Ｃ４二量体、Ｃ９Ｂ二量体、Ｃ６Ａ二量体及びＨ７二量体；又は（４）３ＫＨ７二量体、Ｃ６Ａ二量体及びＣ４二量体の混合物であることができる。主題ぺプチドの混台物を含むぺプチド組成物中に存在するＮＡＮＢＨ又はＨＣＶの診断又は検出用ぺプチドの有効比率は、当業界における通常の技術者により容易に決定される。代表的には、これらの比率は、ペプチド重量に基づき約１から約５０の範囲である。ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の診断及び検出のための特に好ましいぺプチド組成物は、混合物（１）、つまり分枝ぺプチド３ＫＣ１０Ｂ二量体、Ｃ９Ｂ二量体、Ｃ６Ａ二量体及び３ＫＨ７二量体の重量比５：１５：１：２５の混合物である。ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ感染の検出及び診断における主題ぺプチドの有効性を調べるために、ＨＣＶとの免疫反応性についての数千人もの患者及び正常血清のスクリ−ニングによりあらかじめ選択した特定標本との免疫反応性について、本ぺプチドの試験を行った。このような血清パネルは市販されており、その例は、実施例において記載する。血清学的バリデーションの方針は、標的とするエピトープの予想される特性に依存する。例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ４１トランスメンブレンペプチドなどの普遍的な免疫優性エピトープは、このウイルスに感染していることが知られている患者から得た単一の代表的な血清試料によりスクリ−ニングすることができる。感染した全ての個体によっては認識されないエピトープ、又はそれに対する抗体が後になって産生されるか若しくは一次的にしか産生されないエピトープ、及び特に中和抗体を誘発するエピトープは、大きな血清パネルによりスクリ−ニングしなければならない。本発明においては、この両方のスクリ−ニング法を、主題ぺプチドを用いてＨＣＶのエピトープ解析を改良するために用いることができるが、後者の方法は、優れた選択性及び感度のため、主題ぺプチドの評価に特に有用である。免疫反応性エピトープの同定も又、使用する血清パネルに依存する。パネルが、エピトープに対して最もセロポジティブ（血清陽性）であると思われる集団をより緊密に代表するほど、エピトープが同定され、完全にマッピングされる可能性が大きくなる。したがって、以前に同定されたエピトープからなるアッセイ方法の反応性の範囲を広げるために、感染している恐れがありながら既知のエピトープに対してはセロネガティブ（血清陰性）である個体より得た多数の試料を、スクリ−ニングに用いなければならない。「血清学的バリデーション」の方法は、同定されるべきエピトープが、感染した患者群のサブ集団においてのみ抗体を誘導する場合、特に困難である。このようなエピトープが同定の標的となる場合、酵素イムノアッセイ又はその他の免疫学的試験法により試験した場合にごく弱い反応性しか示さない合成ぺプチドには、特に注意を払わなければならない。この点については、合成ペプチド、特に非天然アミノ酸を有するぺプチドのバックグラウンド吸光度の低さは、弱い反応性を正確に検出することを可能にする。ある場合では、バックグラウンド値に対して５０mAの吸光度は充分に有意であり、ぺプチドのアミノ酸配列の連続精製により重要なエピトープを同定することができる。良い実験室習慣により、２００〜３００mA以下の吸光度の範囲において試験を行っても、一貫した信頼のおける結果を得ることができる。合成ぺプチドを使用することの利点は知られている。ぺプチドがウイルスから生物学的に誘導されるものではないために、疾患を引き起こす病原に曝される危険がない。ペプチドは、メリフィールド合成法[Merri field (1963), J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154]などの標準的な技術を用いて、容易に合成することができる。したがって、試験試薬を製造する過程の間のどの時点においてもＨＣＶとの接触はない。組換えにより発現されたタンパク質（又はぺプチド）よりもぺプチドを用いることによって最少にすることのできる別の問題は、ＨＣＶ融合タンパク質と共に精製される抗原性物質の存在により引き起こされる擬陽性の割合である。例えば、ある正常な個体は、組換えに基づく診断試験に使用される発現系由来の抗原性物質と交差反応性を示すEscherichia co li又は酵母タンパク質に対する抗体を有する。このような正常な個体から得られた血清は、このようなイムノアッセイにおいては擬陽性を示すが、本発明のイムノアッセイにおいてはこのようなことはない。更に又、本発明のぺプチド組成物は、合成されたものであるため、その品質をコントロールすることが可能であり、その結果、試験結果の再現性を確実にすることができる。又、各試験操作には非常に少量のぺプチドしか必要とされないため、そしてペプチドを調製する費用が比較的小さいため、ＨＣＶに対する抗体に関する体液のスクリ−ニング及びＮＡＮＢＨ感染の診断のコストが比較的低い。本発明により調製されるぺプチド及びぺプチド組成物は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、受身血球凝集アッセイ（例えば、ＰＨＡ試験）又はその他のよく知られているイムノアッセイにおいて試験試薬としてこれらを使用することにより、ＨＣＶ感染を検出し、ＮＡＮＢＨを診断するために使用することができる。本発明によると、主題ペプチドと共にいかなる好適なイムノアッセイをも使用することができる。このような技術は、通常の技術者にはよく知られており、多くの標準的な免疫学のマニュアル及びテキストに記載されている。例えば、Harlow et al., (1988 「抗体：実験室マニュアル(Antibodies:A Laborato ry Manual )」，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N Y, 726 pp.を参照されたい。好ましい実施態様においては、イムノアッセイは、本発明のぺプチド組成物により被覆された固相を用いたＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡ技術は、当業界においてはよく知られている。別の好ましい実施態様においては、イムノアッセイはＰＨＡアッセイである。本発明のイムノアッセイは、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶの有無に関して体液及び組織をスクリ−ニングし、それによりこれらを検出し、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の診断において開業医を助けるために使用される。このようなスクリ−ニングに供することのできる体液としては、血液及び血液分画（例えば血清）、唾液、又はＨＣＶに対する抗体を含有するその他の体液が挙げられる。本発明の別の側面は、哺乳類の体液（例えば血清、組織抽出物、組織液）、in vitro細胞培養物の上清及び細胞溶解物（ライセート）におけるＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の検出並びに診断のためのキットに向けられている。本キットは、１個又はそれ以上の本発明のぺプチド（つまりぺプチド組成物）を含むよう適合させた第１の容器を受け取るよう区画化することができる。本発明のキットは、好ましくは、ＮＡＮＢＨ若しくはＨＣＶ感染の検出又は診断のためのＥＬＩＳＡ又はＰＨＡ試験キットである。ＥＬＩＳＡ試験キットとしては、本キットは、（ａ）いずれかの主題のぺプチド組成物により被覆された固相を有する容器（例えば９６ウェルプレート）；（ｂ）陰性コントロール試料；（ｃ）陽性コントロール試料；（ｄ）標本希釈液；及び（ｅ）レポーター分子により標識されている、ヒトＩｇＧに対する抗体、を含む。レポーター分子か酵素である場合、本キットは、該酵素の基質も含む。本主題のキットの使用例においては、試験を行う試料を、哺乳類の体液（必要であれば試料希釈液により希釈したもの）と、もし抗体が存在するのであれば容器に含まれるぺプチドと結合する条件下で、ある時間接触させる。非結合物を除去（例えば、無菌リン酸緩衝生理食塩水により洗浄することにより）した後、二次複合物を、ヒトＩｇＧに対する標識抗体と接触させる。これらの抗体が一次複合物と結合して、三次複合物を形成する。そして、第２の抗体は、レポーター分子により標識されているため、検出のための措置を受けると、三次複合物が検出される。レポ一ター分子は、酵素、放射性同位元素、フルオロフォア（蛍光団）、生物発光分子、化学発光分子、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなどであることができる。ＥＬＩＳＡでは、レポーター分子は好ましくは酵素である。実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるものではない。実施例１分枝クラスターペプチドを用いた早期セロコンバージョン試料におけるＨＣＶのコア領域に対する抗体の検出９６ウェルプレー卜のウェルを、ＨＣＶのコア領域由来の２個の分枝ぺプチド（ペプチドＣ４、表１；及びＶＩＩＩＥと関連し、配列：を有する試験ぺプチドＴ１）のそれぞれについて、pH９．５の１０mMＮａＨＣＯ ₃ 緩衝液中、１μｇ/mlのペプチドにより、１ウェル当たり１００μLを用いて、３７℃において１時間、別々に被覆した。次にぺプチド被覆ウェルを、３重量％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液２５０μLと共に、３７℃で１時間インキュベー卜して非特異的タンパク質結合部位をブロッキングし、続いて０．０５容量％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳにより３回洗浄し、乾燥した。ＨＣＶ抗体陽性患者の血清を含む試験標本を、それぞれ、２０容量％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン及び０．０５容量％ＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳにより、希釈率１：２０（容量対容量）で希釈した。希釈した標本２００μLを各ウェルに加えて、３７℃で１５分間反応させた。次に、非結合抗体を除去するために、ウェルを、０．０５容量％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ溶液で６回洗浄した。ホースラディッシュ（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを第２の抗体トレーサーとして使用し、陽性ウェル内で形成されたＨＣＶ抗体−ぺプチド抗原複合体と結合させた。１容量％正常ヤギ血清及び０．０５容量％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳにより１：１８００の比率で希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ希釈液１００μLを、それぞれのウェルに加え、３７℃で更に１５分間インキュベー卜した。ウェルを０．０５容量％ＴＷＥＥＮ２０を含むＰＢＳ溶液で６回洗浄して非結合抗体を除去し、０．０４重量％オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）及び０．１２容量％過酸化水素をｐＨ５．０のクエン酸ナトリウム緩衝液中に含む基質混合物１００μLと反応させた。この基質混合物を使用して、有色生成物を形成させることによって、ペルオキシダーゼ標識を検出した。反応を、１．０MＨ₂ＳＯ₄ １００μLを加えることによって停止し、Ａ₄₉₂nmを測定した。コア領域に対する抗体の検出におけるこれら２種類のペプチドの感度を、最初の抗体応答がコアに対するものであることが知られているセロコンバージョンパネルにより試験した(SerologicalsPanel 4813, Donor 02190D は米国特許第 5,1 06,726号に記載されており；初期コア応答はHosein, 1991に記載されている）。比較のために選択した採血の日付は１９８８年８月３０日であった。ぺプチドＣ４について得られた光学密度は０．３２０であり、Ｔ１に関しては０．５１２であった。ペプチドは両方とも、同じ濃度で被覆した場合、そのＮ末端に３個のリジン残基を有する直鎖状ぺプチドＶｌｌｌ［よりも高い感度を示した。その場合、同一試料についての吸光度は０．０７５であった。実施例２分枝ハイブリッドペプチドは個々のぺプチドと比較して改良された感度と特異性を示すＨＣＶのＮＳ−４及びコア領域由来のエピトープを含む分枝ハイブリッドペプチド３ＫＨ７（表１）の免疫反応性を、実施例１に記載したＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて、４１個の既知のＮＡＮＢＨ試料を含むパネル３において試験した。表３には、コア領域のみに由来する八量体Ｔ２（ＶＩＩＩＥと関連する）及びＮＳ−４領域のみに由来するぺプチドＴ３（配列番号：１１；ＩＩＨと関連する）と比較して、このハイブリッドペプチドが、ＮＳ−４及びコアの両方の領域の反応性を保持していたことが示されている。更に又、試料３〜３５は、単一領域ぺプチドのいずれかと比較して、ハイブリッドペプチドに対して改良された反応性を示した。ハイブリッドペプチド３ＫＨ７の特異性を、スクリ−ニングによりＨＣＶに対する抗体について陰性であるとされた４８の無作為血液供与者試料のパネルにより試験した。陰性試料のうち、ハイブリッドペプチドに関し０．２００Ａを超える吸光度を示したのは１試料のみであったが、これらの試料の２０％が、八量体Ｔ２に関して０．２００Ａを超える吸光度を示した。ＮＳ−４領域由来のエピトープを含むが、コアエピトープを欠いた分枝クラスターぺプチドＣ３は、４８の陰性試料中５試料で、０．２００Ａを超える吸光度を示した。したがって、ハイブリッドペプチドにおける２領域に由来するエピトープの組み合わせによって、ＮＡＮＢＨ検出の特異性が改善された。ａパネル３中の残りの試料は、全ぺプチドについて陰性であるか、又は試験ぺプチドと比較した場合、分枝ハイブリッドペプチドを用いた場合に改善を示さなかった。ｂコントロールペプチドＴ２及びＴ３の配列は、それぞれ、VKFPGGGQIM- 八量体及びKKKSGKPAIIPDREVLYREFDEMEECSQHLPYIEQGMMLAEQFKQKALGLである。実施例３非天然アミノ酸連鎖基を有する分枝クラスターペプチドにおけるＮＡＮＢＨ関連抗休の検出における感度及び特異性の比較実施例１に記載したＥＬＩＳＡアッセイフォーマットによるパネル３試料を用いて、非天然アミノ酸により分離されるクラスターを有するコア領域由来の分枝クラスターぺプチドＣ１０Ｂ（表１）の免疫反応性を、このような非天然アミノ酸を欠いた類似ぺプチドＴ１（実施例１）と比較した。表４には、非天然アミノ酸を含有するぺプチドの吸光度が、非天然アミノ酸を欠いた対応ペプチドの吸光度よりも大きい、つまり分枝ペプチドＣ１０ＢがＴ１よりも高感度であった７試料が示されている。これらの２種のペプチドの特異性は、４８種の陰性試料中、０．２００Ａよりも大きい吸光度測定値を示すものがなかったのと同等であった。非天然アミノ酸により分離されるクラスターを有するＨＣＶのＮＳ−５領域由来の分枝クラスターペプチドＣ８Ｃ（表１）の免疫反応性を、非天然アミノ酸を欠いた対応する分枝ペプチド（Ｃ６Ａ一量体；このぺプチドは天然アミノ酸により分離されるクラスターを有する；表１）と比較した。いずれのペプチドも、パネル３の４１試料中１８試料を陽性として検出した。表５には、非天然アミノ酸を含有するぺプチドの吸光度が、非天然アミノ酸を欠いた対応ぺプチドの吸光度よりも大きかった６試料を示す。表６には、ペプチド３ＫＣ７Ｃ（表１）により、ぺプチドＣ３（表１）と比較して吸光度が増大した、つまり非天然アミノ酸の存在により、ＮＡＮＢＨ及びＨＣＶ検出のためのアッセイの感度が増大した、パネル３由来の４種の反応性試料を示す。更に又、非天然アミノ酸により分離されたクラスターを有するＨＣＶのＮＳ− ４領域由来の分枝クラスターぺプチド３ＫＣ７Ｃを用いて、実施例１に記載したＥＬＩＳＡの手順により測定する場合の特異性も又、顕著に改善された。ぺプチド３ＫＣ７Ｃについては、陰性である４８試料中、０．２００Ａ以上を超える吸光度を示した試料はなかったが、一方、非天然アミノ酸を欠いているが、クラスターを分離する天然アミノ酸を有する分枝ペプチドＣ３については、４８試料中５試料が０．２００Ａを超える吸光度を示した。ペプチドＣ８Ｃに、非天然アミノ酸を付加することによっても特異性が改善され、陰性である無作為供血者試料４８試料中、吸光度が０．２００Ａを超えたのはわずか１試料であったが、ペプチドＣ６Ａについては４８試料中２試料であった。ａ表４から６については、パネル３の残りの試料は、両方のぺプチドについて陰性であるか、又は試験若しくはコントロールペプチドと比較して分枝ハイブリッドペプチドを用いた場合に改善を示さなかった。実施例４その直鎖状親ぺプチドと比較してより短い分枝ペプチドにより得られたＮＳ−５免疫反応性の改善ＨＣＶのＮＳ−５領域由来のＣ２Ａという１７残基分枝八量体クラスターペプチド（表１）は、パネル３からの４１試料中、配列： ARPDYNPPLVETWKKPDYYYEPPVVHGCPLPPPKSPPVPPPRKKRT（配列番号：１２）を有する４４残基ぺプチドであるその直鎖状親ぺプチドＴ４と反応する２３試料全てにおいて抗体を検出することができた。表７には、直鎖状ペプチトＴ４よりもペプチド八量体Ｃ２Ａについてより大きい吸光度を示したパネル３から得た５試料を示す。ａパネル３の残りの試料は、両方のぺプチドについて陰性であるか、又は４４量体と比較して１７量体を用いた場合に改善を示さなかった。実施例５分枝ぺプチド混合物を用いたセロコンバージョンパネルにおけるＮＡＮＢＨ関連抗体の早期検出二量体ぺプチドである３ＫＣ１０Ｂ、３ＫＨ７、Ｃ９Ｂ及びＣ６Ａの混合物（それぞれ１、５、３、０．２５μg/ml）で９６ウェルプレ一卜のウェル上を被覆し、実施例１記載のＥＬＩＳＡ手順を用いて測定を行った。各分枝ぺプチドの配列を表１に示す。この混合物の感度を、実施例１記載のセロコンバージヨンパネル４８１３を用いて、フォーマットＣぺプチド (EPO 0468527 A2に記載、それぞれ５、３及び２μg/mlで被覆されたぺプチドＩＩＨ、Ｖ及ひＶＩＩＩＥからなる）のそれと比較した。表８には、セロコンバージョン試料は、抗体がフォーマットＣにより検出される１週間前に、ぺプチド混合物については一貫して陽性であったことが示されている。１９８８年８月９日及び８月１６日の採血日における初期試料は、アッセイのカットオフ付近における抗体応答の変動を示し、１９８８年７月１９日に行われたこの患者の輸血からの受動抗体の検出を示している。ａ略号：ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼｂフォーマットＣ及び混合物の組成は、実施例５に記載されている。配列表（１）一般的情報（i）出願人：ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド（ii）発明の名称：非Ａ非Ｂ型肝炎の診断及び検出に有効な新規分枝ハイブリッド及びクラスターぺプチド（iii）配列の数：１２（iv）連絡先住所：（Ａ）名宛人：ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレーテッド（Ｂ）街路：２５デービッズ・ドライブ（Ｃ）市：ホーポージ（Ｄ）州：ニューヨーク（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号 (ZIP)：１１７８８（ｖ）コンピュータ一読取り形式：（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換機（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：PatentIn Release ♯1.0,バージョン ♯1.25 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（vii）弁理士／代理人の情報：（Ａ）氏名：M.Lisa Wilson （Ｂ）登録番号：３４，０４５（Ｃ）参照／ドケット番号：９０５５（ix）通信の情報：（Ａ）電話：５１６−２７３−２８２８（Ｂ）ファックス：５１６−２７３−１７１７（Ｃ）テレックス：（２）配列番号１に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６１アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号１０に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号１０：（２）配列番号１１に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ペプチド（xi）配列：配列番号１１：（２）配列番号１２に関する情報：（i）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：ぺプチド（xi）配列：配列番号１２：

Claims

【特許請求の範囲】１．式：（ぺプチド）₂Ｘ（ぺプチド）_４Ｘ₂ Ｘ（ぺプチド）₈Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ぺプチド）₁₆Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘはアミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個のカルボキシル基を有し、それぞれの基がぺプチド結合連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログである）で示される少なくとも１個の分枝ペプチドを含むぺプチド組成物であって、該ぺプチド部分は、ＮＡＮＢＨ関連抗体と特異的に免疫反応を示す少なくとも１個のエピトープを含み、該ぺプチド部分は、配列番号１〜１０（Ｐｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ１１、Ｐｅｐ１８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＨ、ＩＩＩＤ、Ｖ、ＶＩＩＩＥ、ＰｅｐＡ）、及びＨＣＶ株又は分離株における対応領域由来の該配列のいずれかに対応する配列よりなる配列群から選択される約３から約２０の隣接するアミノ酸の少なくとも１個のクラスターを含み；該ぺプチド部分が２個又はそれ以上のクラスターを含む場合、該クラスターは連鎖基を介して結合しており、該連鎖基は少なくとも１個の天然アミノ酸、非天然アミノ酸又はアミノ酸アナログであり、該２個又はそれ以上のクラスターが上記配列群の異なる配列由来の配列を有する場合、該クラスターは直接結合するか又は該連鎖基を介して結合することができ；そして該ペプチド部分が約１０から約１００のアミノ酸からなることを特徴とする、ぺプチド組成物。２．２個又はそれ以上の上記ペプチドの混合物からなる請求の範囲第１項記載のぺプチド組成物。３．上記ぺプチドが担体との複合物を形成する請求の範囲第１項記載のペプチド組成物。４．上記クラスターが５から９の隣接するアミノ酸からなる請求の範囲第１項記載のぺプチド組成物。５．上記ぺプチド部分が更に上記配列のいずれかの配列のセグメントからなる請求の範囲第１項記載のペプチド組成物。６．上記配列が配列番号３（Ｐｅｐ１１）と称される配列である請求の範囲第１項記載のペプチド組成物。７．上記ぺプチドがＣ２Ａ、Ｃ２Ｂ、Ｃ６Ａ、Ｃ６Ｂ、Ｃ８Ａ、Ｃ８Ｂ又はＣ８Ｃである請求の範囲第６項記載のペプチド組成物。８．上記配列が配列番号４（Ｐｅｐ１８）と称される配列である請求の範囲第１項記載のぺプチド組成物。９．上記ぺプチドがＣ９Ａ又はＣ９Ｂである請求の範囲第８項記載のぺプチド組成物。１０．上記配列が配列番号６（ＩＩＨ）と称される配列である請求の範囲第１項記載のぺプチド組成物。１１．上記ぺプチドがＣ３、Ｃ５Ａ、Ｃ５Ｂ、Ｃ５Ｃ、３ＫＣ５Ｃ、Ｃ７Ａ、Ｃ７Ｂ、Ｃ７Ｃ又は３ＫＣ７Ｃである請求の範囲第１０項記載のぺプチド組成物。１２．上記配列が配列番号７（ＩＩＩＤ）と称される配列である請求の範囲第１項記載のペプチド組成物。１３．上記ぺプチドがＣＩＡ又はＣＩＢである請求の範囲第１２項記載のペプチド組成物。１４．上記配列が配列番号９（ＶＩＩＩＥ）と称される配列である請求の範囲第１項記載のぺプチド組成物。１５．上記ペプチドがＣ４、ＣＩ０Ａ、ＣＩ０Ｂ又は３ＫＣ１０Ｂである請求の範囲第１４項記載のぺプチド組成物。１６．式：（ぺプチド）₂Ｘ（ぺプチド）₄Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₈Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（ペプチド）₁₆ Ｘ₈ Ｘ₄ Ｘ₂ Ｘ（式中、Ｘはアミノ酸、又は２個のアミノ基及び１個のカルボキシル基を有し、それぞれの基がぺプチド結合連鎖を形成することが可能であるアミノ酸アナログである）で示される少なくとも１個の分枝ハイブリッドペプチドを含むぺプチド組成物であって、該ぺプチド部分は、ＨＣＶに対する抗体と特異的に免疫反応を示す少なくとも１個のエピトープを含み、該ぺプチド部分は、以下に挙げる配列のいずれかに由来する第１の配列、及びそれぞれの配列が以下に挙げる配列の異なる配列由来である１個又はそれ以上のさらなる配列から成り、該配列は配列番号１〜１０（Ｐｅｐ３、Ｐｅｐ８、Ｐｅｐ１１、Ｐｅｐ１８、Ｐｅｐ２５、ＩＩＨＩＩＩＤ、Ｖ、ＶＩＩＩＥ、ＰｅｐＡ）、ＨＣＶ株又は分離株における対応領域由来の該配列のいずれかに対応する配列、該配列のいずれかの配列のアナログ、及び該配列のいずれかのセグメントの群から選択され；そして該ぺプチド部分が約１０から約１００のアミノ酸からなることを特徴とする、ぺプチド組成物。１７．上記配列が配列番号３、配列番号７及び配列番号９（Ｐｅｐ１１、ＩＩＩＤ及びＶＩＩＩＥ）と称される配列である請求の範囲第１６項記載のぺプチド組成物。１８．上記ぺプチドがＨ１である請求の範囲第１７項記載のぺプチド組成物。１９．上記配列が配列番号１及び配列番号４（Ｐｅｐ３及びＰｅｐ１８）と称される配列である請求の範囲第１６項記載のぺプチド組成物。２０．上記ぺプチドがＨ３である請求の範囲第１９項記載のぺプチド組成物。２１．上記配列が配列番号３及び配列番号４（Ｐｅｐ１１及びＰｅｐ１８）と称される配列である請求の範囲第１６項記載のぺプチド組成物。２２．上記ぺプチドがＨ４Ａ又はＨ４Ｂである請求の範囲第２１項記載の組成物。２３．上記配列が配列番号６及び配列番号９（ＩＩＨ及びＶＩＩＩＥ）と称される配列である請求の範囲第１６項記載のペプチド組成物。２４．上記ぺプチドがＨ６Ａ、Ｈ６Ｂ、Ｈ７又は３ＫＨ７である請求の範囲第２３項記載のぺプチド組成物。２５．上記配列が配列番号７及び配列番号９（ＩＩＩＤ及びＶＩＩＩＥ）と称される配列である請求の範囲第１６項記載のペプチド組成物。２６．上記ぺプチドがＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ２Ｃ、Ｈ２ＣＫ、Ｈ２Ｄ又はＨ２ＤＫである請求の範囲第２５項記載のぺプチド組成物。２７．ペプチド３ＫＣ１０Ｂ、Ｃ９Ｂ、Ｃ６Ａ及び３ＫＨ７を含むぺプチド組成物。２８．ぺプチド３ＫＨ７、Ｃ６Ａ及びＣ４を含むぺプチド組成物。２９．ぺプチドＣ３、Ｃ４及びＣ２Ｂを含むぺプチド組成物。３０．ぺプチドＣ４、Ｃ９Ｂ、Ｃ６Ａ及び３ＫＨ７を含むぺプチド組成物。３１．請求の範囲第１項から第３０項のいずれか１項記載のペプチド。３２．イムノアッセイ手順において、有効量の、請求の範囲第１項から第３０項のいずれか１項記載のぺプチド組成物を使用することを特徴とする、ＮＡＮＢＨ関連抗体を検出する方法。３３．イムノアッセイ手順において、有効量の、請求の範囲第１項から第３０項のいずれか１項記載のぺプチド組成物を、体液、組織又は組織抽出物と、該ぺプチド組成物と該体液、該組織又は該組織抽出物中の抗体との間での複合体形成に充分な時間接触させ、そして該複合体に検出のための措置を行うことを特徴とする、ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染を検出する方法。３４．上記イムノアッセイ手順がＥＬＩＳＡ又はＰＨＡ手順である請求の範囲第３２項又は第３３項記載の方法。３５．請求の範囲第１項から第３０項のいずれか１項記載のぺプチド組成物を含むよう適合させた第１の容器を含むことを特徴とするＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の検出又は診断のためのキット。３６．上記キットがＥＬＩＳＡ又はＰＨＡ試験キットである請求の範囲第３５項記載のキット。３７．ＮＡＮＢＨ又はＨＣＶ感染の検出及び診断のためのＥＬＩＳＡ試験キットであって、（ａ）請求の範囲第１項から第３０項のいずれか１項記載のぺプチド組成物により被覆された固相を有する容器；（ｂ）陰性コントロール試料；（ｃ）陽性コントロール試料；（ｄ）標本希釈物；及び（ｅ）レポータ一分子により標識されている、ヒトＩｇＧに対する抗体を含むことを特徴とするＥＬＩＳＡ試験キット。