JPH09510086A

JPH09510086A - Ｅ型肝炎ウィルスの検出のためのモザイク・ポリペプチド及び方法

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Publication number: JPH09510086A
Application number: JP7521432A
Authority: JP
Inventors: エー．フィールズ，ハワード; イー．キュドヤコフ，ユリー; オー．ファボロフ，マイケル
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 1994-02-15
Filing date: 1995-02-15
Publication date: 1997-10-14
Also published as: AU1877595A; CA2183362A1; WO1995021858A3; WO1995021858A2; US5563032A; EP0804472A1

Abstract

(57)【要約】配列番号：１として配列表中に規定するヌクレオチド配列から成るモザイクＥ型肝炎ウィルス(HEV)ポリペプチドをコードする核酸を提供する。Ｅ型肝炎ウィルスの５，６，23，24，28及び29のエピトープをコードし、そして生来のＥ型肝炎ウィルスにおけるエピトープ−コーディング核酸の間にある核酸を実質的を欠いている核酸をも、提供する。上記モザイク・ポリペプチド−コーディング核酸とストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズし、そして配列番号：１と少なくとも70％の配列相同性をもつ単離核酸をも、提供する。少なくども80％，90％及び95％の配列同一性をもつような核酸をも、提供する。配列番号：２として配列表中に規定したアミノ酸配列から本質的に成るポリペプチドを、提供する。本選択的ハイブリダイジング核酸、及びHEVのペプチド５，６，23，24，28及び29のエピトープをコードし、そしてこのエピトープ−コーディング核酸の間にある核酸を実質的を欠いている核酸によりコードされるポリペプチドをも、提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ｅ型肝炎ウィルスの検出のためのモザイク・ポリペプチド及び方法発明の背景発明の分野本発明は、被験体における抗−Ｅ型肝炎ウィルス活性(anti-hepatitis E viru s activity)の検出のための方法及び組成物に関する。本組成物は、Ｅ型肝炎ウィルスのモザイク・ポリペプチドをコードする核酸及びＥ型肝炎ウィルスのモザイク・ポリペプチドを含む。本法は、本発明のモザイク・ポリペプチドを使用したＥ型肝炎ウィルス感染の血清診断を含む。背景技術Ｅ型肝炎(Hepatitis E virus(HEV))は、経口伝染非−Ａ、非−Ｂ型肝炎（ente rically transmitted non-A，non-B hepatitis(ET-NANB)）の最近発見された剤である。この疾患は、多くの開発途上国において重要な問題として残っている。肝炎ウィルスの他の剤とは異なり、HEV感染は、しばしば、感染した妊婦において高い死亡率に関連する。最初に報告されたET−NANB肝炎の発生は、1955年にインドのNew Delhiで発生した。しかしながら、IgM抗−Ａ型肝炎ウィルスについての血清学的テストが、その原因としてＡ型肝炎を除外するために利用できるようになった後にのみ、これは、ET−NANB肝炎としてひじょうに広く発生していると認識された。この時以降、ET−NANB感染の流行は、多くの国で報告されてきた。最近まで、ET−NANB肝炎発生の診断は、Ａ型肝炎ウィルス(hepa titis A virus(HAV))とＢ型肝炎ウィルス(HBV)の血清学的マーカーの非存在にのみ基づくことができた。その後、ET−NANB肝炎の検出のための特異的なテストは、免疫電子顕微鏡（immune electron microscopy(IEM)）に基づくものであった。ここでは、急性感染個体からの小量の便懸濁液が急性−又は回後期の血清と共にインキュベートされ、そして電子顕微鏡により検査される(Bradley et al．PN AS USA 1987；84：6277-6281，1987)。IEMは、このように、抗体の源として急性及び回後期の血清を使用して27−32nmのウィルス−様粒子を同定した。しかしながら、ほとんどの臨床的試料はIEMを使用して可視化するのに十分なウィルス− 様粒子を含んでいないので、この方法は、臨床的又は免学的分析のために有用ではない。３つのオープン・リーディング・フレーム(open reading frames(ORF))が同定された（Tam et al．Virology，185：120-131，1991）。２つのタイプに共通なH EV エピトープが、ORF2とORF3によりコードされたタンパク質のＣ−末端において同定された（Reyes et al．Gastroenterologia Japonica 26．（suppl．3）： 142-147，1991b；Ｉchikawa et al．Immunol．35：535-543，1991）。これらのエピトープは、ベーターガラクトシダーゼ又グルタチオン−Ｓ−トランスとの大きなハイブリッド・タンパク質として発現され、そして実験的に感染されたカニクイザル（cynomologus macaques）Reyes et al.，in“Viral hepatitis C，D， E”，T．Shilcata，R．H．Purcell，T．Uchida（Eds.）Elsevier Science Publi shers，NY，pp．237-245，1991a）又はヒト（Goldsmith et al.，Lancet 339：3 28-331，1992）から得られた急性及び回後期の血清からの抗体により酵素免疫検定において認識された。これらのハイブリッド・タンパク質は、タンパク質のキメラ部分が折り畳み、そしてそれ故、抗体認識に悪影響を及ぼすことができるという欠点をもつ。さらに、個体は、そのキメラ配列に対して発現された抗体をもつことができ、偽陽性診断をもたらす。 Reyes et al．（in“Viral hapatitis C，D，E”，T．Shikata，R．H．Purcel l，T．Uchida（Eds.）Elsevier Science Publishers，NY，pp．237-2415，1991 ）は、そのBurma株のHEVゲノムから得られたDNAの発現により得られる、ORF3によりコードされたタンパク質のＣ−末端領域の短い断片が、HEVのMexico株により感染されたカニクイザルからの血清と反応しなかったことを立証した。反対に、Mexico株から得られた発現組換え体タンパク質は、HEVのBurma株により感染されたサルからの血清と反応しなかった（Yarbough et al．J．Virol．65：5790-5 797，1991）。ORF3のＣ−末端領域における２つの株の配列比較は、78％の相同性を現す(Yarbough et al.，1991)。従って、被験体の、株−特異的免疫応答は、利用可能な技術を使用する偽陰性診断をもたらすことができる。天然のプロトタイプ抗原の抗原反応性を保持するモザイク・タンパク質の構築のための戦略が、最近、Ｂ型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen（HBs Ag）に通用された(Kumar et al．Gene 110：137-144，1992)。このタンパク質は、Pres−タンパク質と、HBsAgコンホメーション抗原決定基“ａ”をモデリングする短い領域からの２つの抗原性エピトープから成っていた。これらのエピトープの抗原特性は、短い合成ペプチドを用いて首尾よくモデル化されることができる。人工HBAタンパク質も、導入されたHBsAg抗原性エピトープの免疫反応性を保持していた。最近、HCV 抗原が、タンパク質の３つの大きなセグメント（266，363、及び11 5mers）を１つのポリペプチド鎖に継ぎ合わせることにより構築された(Chien et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89 ：10011-10015(1992))。これらは、担体タンパク質による小さな抗原性として活性な領域の首尾よい発現の文献中の例でもある。これらの抗原は、感受性を欠いている。上記HEVペプチド又は組換え抗原のいずれも、HEV感染の診断のための感高のよく、かつ、特異的な手段を提供しない。従って、感度の欠如及び従来の利用可能なテストの実施の困難性のために、HEV感染のための迅速で、簡単で、そして高感度かつ特異的な診断テストについての必要性が存在する。本発明は、ORF2タンパク質からの、そして互いに併合されたHEV BurmeseとMex ican株のORF3タンパク質からの抗原性エピトープのモザイクを含む人工ポリペプチドにより上記要求を満足させる。この“モザイク（mosaic）”タンパク質は、抗−HEV活性の検出のための診断テストのために価値のある試薬である。発明の要約配列番号：２として配列表中に規定するアミノ酸配列から本質的に成るモザイクＥ型肝炎ウィルス(HEV)ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本核酸によりコードされるモザイク・ポリペプチドは、HEV感染に対する応答において被験体内で作られるHEV抗体について高感度であり、そして特異的である。Ｅ型肝炎ウィルスの５，６，23，24，28及び29のエピトープをコードし、そして生来のＥ型肝炎ウィルスにおけるエピトープ−コーディング核酸の間にある核酸を実質的に欠いている核酸をも、提供する。上記モザイク・ポリペプチド−コーディング核酸とストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズし、そして配列番号：１と少なくとも70％の配列相同性をもつ単離核酸をも、提供する。少なくとも80％，90％及び95％の配列同一性をもつような核酸をも、提供する。配列番号：１として配列表中に規定したヌクレオチド配列から成る核酸によりコードされるポリペプチドを、提供する。本選択的ハイブリダイジング核酸、及びHEVのペプチド５，６，23，24，28及び29のエピトープをコードし、そしてこのエピトープ−コーディング核酸の間にある核酸を実質的を欠いている核酸によりコードされるポリペプチドをも、提供する。発明の詳細な説明核酸配列番号：２として配列表に規定するアミノ酸配列から本質的に成るモザイクＥ型肝炎ウィルス(HEV)をコードする核酸を提供する。本核酸によりコードされるモザイク・ポリペプチドは、HEV感染に対する応答において被験者内で作られるHEV抗体について高感度かつ特異的である。本発明のモザイクＥ型肝炎ウィルス(HEV)ポリペプチドをコードする核酸の特定の例は、配列番号：１として配列表中に規定したヌクレオチド配列から成る。しかしながら、このモザイク・ポリペプチドが、その遺伝子コードの縮重のために、多くの核酸によりコードされることができることは明らかである。上記モザイク・ポリペプチド−コーディング核酸とストリンジェント条件下で選択的にハイブリダイズし、そして配列番号：１と少なくとも70％の配列同一性をもつ単離核酸を、提供する。また、少なくとも80％，90％及び95％の配列同一性をもつ核酸も提供する。それ故、２本鎖形態にあるとき、選択的にハイブリダイジングする上記核酸は、サンプル中の抗−HEVを検出するために使用されることができるユニークな抗原性タンパク質をコードする。このような核酸は、その選択的にハイブリダイズする性質により、ストリンジェント条件下、生来のHEV配列とハイブリダイズしないであろう。“単離された ”とは、他の天然のHEVの核酸のあるものから分離されていることを意味する。 “ストリンジェント条件”とは、ハイブリダイゼーションのプロトコールにおいて使用される洗浄条件をいう。一般的に、この洗浄条件は、できるだけストリンジェントでなければならない（すなわち、温度と塩濃度の組合せが、その変性温度が研究下のハイブリッドの計算Tmよりも約５〜20℃低いものであるように選ばれなければならない）。この温度と塩条件は、フィルター上に固定された参照 DNAのサンプルが着目のプローブとハイブリダイズされ、そして次に異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄されるような予備的実験において経験的に決定されることができる。本発明の核酸は、配列番号：１の核酸によりコードされるエピトープの全てよりも少ないものについてのコーディング配列を含むことができる。例えば、Ｅ型肝炎ウィルスのペプチド５，６，22，23，24，28及び29に対応するエピトープをコードし、そして生来のＥ型肝炎ウィルスにおけるエピトープ−コーディング核酸の間にある核酸を実質的に欠く核酸を、提供する。この核酸は、先に特定したものに加えてペプチド13，33，12，40に対応するエピトープの１以上をコードすることもできる。このような核酸が、その遺伝子コードの縮重のために、例示した核酸からの配列において実質的に相違し、そして未だ本発明のHEVモザイク・タンパク質をコードすることができることは明らかである。より特に、以下のペプチド内に含まれるエピトープをコードする核酸を、本発明のモザイク・ポリペプチドを生成するために使用することかできる：５，６， 22，23，24，28及び29；５，６，22，23，24，28，29及び13；５，６，22，23， 24，28，29及び33；５，６，22，23，24，28，29及び12；５，６，22，23，24，28，29及び40；５，６，22 ，23，24，28，29，13及び33；５，６，22，23，24，28，29，13及び12；５，６，22，23，24，28，29，13及び40；５，６，22，23，24，28，29，13，33及び12 ；５，６，22，23，24，28，29，13，33，12及び40；５，６，22，23，24，28， 29，13，12及び40；５，６，22，23，24，28，29，13，33及び40。これらのペプチドを表１と２に示す。これらの表中に見られるように、これらのペプチドのいくつかは、隣接ペプチドの配列と重複する配列を含む。モザイク・ポリペプチド内で一緒に使用されるとき、それらのエピトープは、連結アミノ酸を除き、一般的に、連続しており、そしてその重複配列を、二重にしない。上記エピトープ・コーディング配列の編成は、配列番号：１により例示されるようなものであることができる。これらの核酸においては、ストリンジェント条件下での選択的ハイブリダイゼーションを得ることができる。あるいは、モザイク・ポリペプチドは、HEVエピトープ・コーディング核酸の異なる編成をもつ核酸によりコードされることができる。例えば、本発明のモザイク・ポリペプチドにおいては、ペプチド22と23に対応するエピトープ（単複）は、そのタンパク質のＣ−末端に、位置することができる。これらのエピトープは、コンホメーション依存性であり、そしてそれ故、その生来のHEV ORF2内の順番をより密に真似る順番において位置するとき、より良い抗原として作用するであろう。核酸は、ポリペプチドのエピトープ領域にリンクするアミノ酸をコードする配列を含むことができる。これらのリンキング・アミノ酸の目的は、モデリングを最大化し、そしてテストされているサンプル中に存在する抗体にそのエピトープを晒すようなやり方でそのモザイク・ポリペプチドの折り畳みを許容することである。このような核酸は、ダリシン・リンカー（配列番号：１）をコードすることができ、これらのリンカーは、セリンとグリシンの両方並びにそのエピトープの適当な折り畳み及び提示を許容するために決定される他のアミノ酸を含んで成ることができる。このリンキング領域のサイズは、本モザイク・ポリペプチドのモデリング機能により課される限定内で変動することができ、一般的には、２〜６アミノ酸のレンジにある。上記核酸のいずれかの特徴は、核酸が、血清中のHEV抗体を検出することができるモザイク・ポリペプチドをコードしているということである。この核酸によりコードされる特定のモザイク・ポリペプチドは、従来のHEV診断アッセイ又は実施中に教示されるアッセイによる、配列番号：２により例示されるモザイク・ポリペプチドに比較して、その有効性を決定するためにテストされることができる。モザイク・ポリペプチド配列番号：１として配列表中に規定されるアミノ酸配列から本質的に成るHEV モザイク・ポリペプチドを、提供する。本選択的ハイブリダイジング核酸によりコードされるポリペプチドをも、提供する。このポリペプチドは、実施例中にさらに記載するように、HEVオープン・リーディング・フレーム（ORF）²によりコードされるタンパク質からの３つの抗原性として活性な優性領域のモザイクであって、１がBurma HEV株のORF3によりコードされるタンパク質からの抗原性として活性な領域であり、そして１がMexico HEV株のORF3によりコードされるタンパク質からの抗原性として活性な領域であるもの、を含むことができる。（配列番号：２に示す）本HEVモザイク・ポリペプチドの例は、血清中での抗−HEV活性の検出に必要であることが示された短い抗原性として活性な領域だけを含む（Yarbough et al．J．Virol．65：5790-5797，1992；Favor ov et al．J．Virol．Meth．（in press）1993；Khudyakov et al．Virol．194 ：89-96，1993；Dawson et al．J．Virol．Meth．38：175-186，1992；Goldsmit h et al．Lancet 229：328-331，1992）。本モザイク・ポリペプチドは、長いエピトープ間の診断的に無関係な配列を含まない。むしろ、このポリペプチドは、比較的独立した小さな抗原性ドメインから成る。このようなデザインは、そのタンパク質の全体構造及びサイズに対して有意な影響を及ぼさずに、追加の抗原性領域又は同一の抗原性領域のいくつかのコピーの導入により他のHEV特異的モザイク・タンパク質の生成を許容する。Ｅ型肝炎ウィルスのペプチド５，６，22，23，24，28及び29を含んで成り、そして生来のＥ型肝炎ウィルスにおける対応のエピトープの間にあるアミノ酸を実質的に欠いているHEVモザイク・ポリペプチドを、提供する。HEVモザイク・ポリペプチドは、ペプチド13，33，12，40の１以上、又はこれらの特定されたものに加えてその対応エピトープをも含んで成ることができる。これらのエピトープの編成(arrangement)は、配列番号：２により例示されるようなものであることができる。あるいは、モザイク・ポリペプチドは、HEVエピトープの異なる編成をもつことができる。本発明のHEVモザイク・ポリペプチドのいずれかの重要な特徴は、そのモザイク・ポリペプチドが、血清又は他の体液又は組織中でHEV抗体を検出することができるということである。他のHEVモザイク・ポリペプチドは、配列番号：２中に開示したエピトープのサブセットをコードする先に記載した選択的ハイブリダイジング核酸を使用して、本明細書中に記載するように構築される。本診断方法におけるそれらの有効性は、実施例中に提供されるように確認される。他のHEVモザイク・ポリペプチドは、本発明により提供される他のHEV免疫優性エピトープを使用して、本明細書中に記載するように構築される。本モザイク・ポリペプチドは、組換え体ベクター及び宿主内の核酸を使用して以下に記載するように又はペプチド合成法を用いた直接合成により、合成されることができる。直接合成を使用する場合、さまざまなリンキング分子であって、そのモザイク・タンパク質の特異性又は感受性に担当の悪影響を及ぼさないリンキング分子のアミノ酸又は他の種を含むものを、そのモザイク・ポリペプチドのエピトープ領域を結合するために使用することができる。ベクター及び宿主本発明に係るモザイク・ポリペプチド・コーディング核酸及び選択的ハイブリダイジング核酸の両方が、核酸の発現に好適なベクター内に存在することができる。ベクター内の核酸は、その核酸の発現に好適な宿主内に存在することができる。本HEVモザイク・ポリペプチドの例は、実施例中にさらに記載するようにグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)又はベーターガラクトシダーゼとのキメラとして大腸菌(E．coli)内で発現された。抗原の発現に有用であると当業者に知られた多くの大腸菌(E．coli)発現ベクターが存在する。使用に好適な他の微生物宿主は、バチルス属(bacilli)、例えば、バチルス・スブチラス(Bacillus subtilus)、及び他の腸内細菌、例えば、サルモネラ（Salmonella）、セラティア（Serratia）、及びさまざまなシュードモナス(Pseudomonas)種を含む。これらの原核生物宿主においては、ある者は、その宿主細胞と和合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を典型的には含むであろう発現ベクターを作ることもできる。さらに、いずれかの数の、さまざまなよく知られたプロモーター、例えば、ラクトース・プロモーター系、トリプトファン(Trp)プロモーター系、ベーター・ラクタマーゼ・プロモーター系、又はラムダ・ファージからのプロモーター系が存在するであろう。これらのプロモーターは、典型的には、例えば、転写及び翻訳の開始及び終了のために、場合によりオペレーター配列により発現を制御するであろうし、そしてリボソーム結合部位配列をもつであろう。必要な場合には、アミノ末端メチオニンが、その抗原の５′及びフレーム内にMetコドンを挿入することにより提供されることができる。また、その抗原のカルボキシ−末端伸長が、標準的なオリゴヌクレオチド突然変異誘発手順を使用して除去されることができる。さらに、酵母発現を使用することができる。酵母発現系にはいくつかの利点が在る。第１に、酵母分泌系内で作られたタンパク質が正確なジスルフィド対合を示すという証拠が存在する。第２に、翻訳後糖添加が酵母分泌系により効率的に行われる。（MFα−１遺伝子によりコードされる）サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のプレープロ−アルファー因子リーダー領域が、酵母からタンパク質分泌を指令するために日常的に、使用される（Brake et al. ，1984）。プレープロ−アルファー因子のリーダー領域は、シグナル・ペプチド及びKEX2遺伝子によりコードされる酵母プロテアーゼのための認識配列を含むプロ−セグメントを含み：この酵素は、Lys−Argジペプチド解裂−シグナル配列のカルボキシル側上でその前駆体タンパク質を解裂する。この抗原コーディング配列は、上記プレープロ−アルファー因子リーダー領域にフレーム内融合されることができる。この構築物は次に、強い転写プロモーター、例えば、アルコール・デヒドロゲナーゼＩプロモーター又は解糖プロモーターの制御下に置かれる。この抗原コーディング配列の後に翻訳終結コドンがあり、その後に転写終結シグナルがある。あるいは、抗原コーディング配列は、第２のコーディング配列に、例えば、アフィニティー・クロマトグラフィーによる融合タンパク質の精製を容易にするために使用される Sj26又はβ−ガラクトシダーゼに融合されることができる。この融合タンパク質の成分を分離するためのプロテアーゼ解裂部位の挿入が、酵母内での発現のために使用される構築物に利用されることができる。哺乳類細胞は、重要な翻訳後修飾、例えば、折り畳み及びシステイン対合、複雑な炭水化物構造物の付加、及び活性タンパク質の分泌を好む環境においてタンパク質の分泌を許容する。哺乳類細胞内での抗原の発現に有用なベクターは、強力なウィルス・プロモーターとポリアデニレーション・シグナルの間の抗原コーディング配列の挿入を特徴とする。これらのベクターは、選択マーカーとしての使用のためにゲンタマイシン又はメトトレキセート耐性のいずれかを付与する遺伝子を含むことができる。抗原及び免疫反応性断片コーディング配列は、メトトレキセート耐性−コーディングベクターを使用してチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系内に導入されることができる。形質転換された細胞内のベクターDNAの存在は、サザン分析により確認されることができ、そして抗原コーディング配列に対応するRNAの生産は、ノーザン分析により確認されることができる。無傷のヒト・タンパク質を分泌することができる多数の他の好適な宿主セルラインが、本分野において開発されており、そしてCHOセルライン、HeLaセルライン、骨髄腫セルライン、Jurkat細胞等を含む。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、及び必要な情報処理部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニレーション部位、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、等から得られるプロモーターである。着目のDNAセグメントを含むベクターは、よく知られた方法によりその宿主細胞内に伝達されることができるが、それは、細胞宿主のタイプに依存して変化する。例えば、塩化カルシウム・トランスフェクションが、原核生物細胞のために一般的に使用される。一方、リン酸カルシウム処理又はエレクトロポレーションが、他の細胞宿主のために使用されることができる。ヒト・ガンマ−インターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化物質、血液凝固第VIII因子、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原、プロテアーゼNexinl、及びエオシン好性白血球主要塩基性タンパク質の発現のために開発されたものに類似する、哺乳類細胞内での抗原の発現のための他のベクターを、使用することができる。さらに、これらのベクターは、哺乳類細胞（例えば、COS7）内での挿入DNAの発現のために利用されることができるCMVプロモーター配列及びポリアデニレーション・シグナルを含むことができる。変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチド生成物が作られるように、そのコーディング配列の転写を容易にする配列（転写配列）及びその翻訳を容易にする配列を含む。このようなポリヌクレオチドの構築は、本分野においてよく知られている。このようなポリヌクレオチドは、プロモーター、転写終結部位（真核発現宿主におけるポリアデニレーション部位）、リボソーム結合部位、そして、場合により真核発現宿主内での使用のためのエンハンサー、そして、場合により、ベクターの複製に必要な配列を含むことができる。これらの配列が発現制御配列に作用可能な状態で連結され、すなわち、その機能を保証するように位置決めされた後に、DNA配列は、宿主内で発現されることができる。これらの発現ベクターは、典型的には、エピソーム又は宿主染色体DNAの組み込み部分のいずれかとして複製されることができる。一般的には、発現ベクターは、所望のDNA配列により形質転換された細胞の検出及び／又は分泌を許容するための、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン耐性又はハイグロマイシン耐性を含むことができる（例えば、米国特許第 4,704,362号参照）。診断方法本発明は、被験体におけるＥ型肝炎ウィルス感染の検出方法であって、（ａ）配列番号：１の核酸によりコードされるモザイク・ポリペプチドの一定量と、その被験体からの抗体−含有サンプルとを接触させ、そして（ｂ）そのポリペプチドとサンプル中の抗体との抗体認識反応であって、Ｅ型肝炎ウィルス感染の存在を示すものを検出する、段階を含んで成る方法を提供する。被験体におけるＥ型肝炎ウィルスの他の検出方法は、（ａ）本発明の選択的ハイブリダイジング核酸によりコードされるポリペプチドの一定量と、その被験体からの抗体−含有サンプルとを接触させ、そして（ｂ）そのポリペプチドとそのサンプル中の抗体との抗体認識反応であって、Ｅ型肝炎ウィルス感染の存在を示すものを検出する、段階を含んで成る。本明細書中に教示される診断方法においては、モザイク・ポリペプチドの量は、HEV抗体が存在する場合、検出可能な抗体認識反応をもたらすであろうような量であろう。本モザイク・ポリペプチドは、基質に結合され、そして液体サンプル、例えば血液、血清、尿又は唾液により接触されることができる。このやり方で、HEVに特異的な抗体（第１抗体）は、上記結合抗原と特異的に反応するであろう。その後、検出可能な部分に結合し、又はそれにより標識された第２抗体が、第１抗体の検出を強化するために添加されることができる。一般的に、上記又は反応した抗体と非特異的に反応性である第２抗体又は他のリガンドが、上記第２抗体上の多数の部位と反応するその能力について選択されるであろう。従って、例えば、第２抗体のいくつかの分子は、それぞれの第１抗体と反応することができ、これはその第１抗体をより検出可能にする。検出可能な部分は、沈澱又は色の変化の肉眼検出、顕微鏡による視覚的検出、又は分光光度計による自動検出、放射能計計測その他を許容するであろう。検出可能な部分の例は、（蛍光顕微鏡のための）フルオレセイン及びローダミン、（光学又は電子顕微鏡のいずれか及び生物化学的検出のための）西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ、（光学又は電子顕微鏡のための）ビオチン−ストレプトアビジン及び（色変化の生物化学的検出のための）アルカリ性ホスファターゼを含む。本発明のHEVモザイク・ポリペプチド（実施例中に記載する、GST及びベータ・ガラクトシダーゼ・キメラ）は、実施例中にさらに記載するようなヒト抗−HEV 陽性及び陰性血清のパネルを使用して分析された。得られたデータは、HEV感染の診断のための方法における本モザイク・タンパク質の使用を立証する。本発明のモザイク・ポリペプチドは、そのモザイク・ポリペプチドの免疫原性量及び医薬として許容される担体を含んで成るワクチンの構築においで使用されることができる。このワクチンは、例えば、多価ワクチン中の、他の抗原に対する抗体と潜在的に交差反応性であることもできる。このワクチンは、次に、HEV 感染の防止方法において使用されることができる。抗原の免疫原性量は、標準的な手順を使用して決定されることができる。簡単に言えば、各種濃度の推定の特異的免疫反応性エピトープを調製し、動物に投与し、そして各濃度に対する動物の免疫学的応答（例えば、抗体の産生）を測定する。本発明のワクチン中の医薬として許容される担体は、生理食塩水又は他の好適な担体を含んで成ることができる（Arnon，R．(Ed.)Synthetic Vaccines Ｉ：83 -92，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，1987）。アジュバントも本ワクチンの担体の一部であることができ、この場合において、それは、使用される抗原、投与方法及び被験体に基づく標準的な基準により選択されることができる(A rnon，R．(Ed.)，1987)。投与方法は、その使用される特定のワクチン及びそれが投与される被験体に依存して、経口又は舌下手段による又は注射による、ものであることができる。以下の実施例は、本発明を限定することでなく、説明することを意図する。記載したプロトコールは使用されることができるであろうものの典型であるが、当業者に知られた他の手順を使用することもできる。実施例合成オリゴデオキシヌクレオチドオリゴデオキシヌクレオチドを、自動合成装置(Applied Biosystems Model 48 0A)を用いて合成し、そしてTBEバッファー(0.045Ｍ Tris−ポレート、0.001Ｍ EDTA，pH8.3)中７Ｍ尿素を含む１％PAGE中での電気泳動により精製した。オリゴデオキシヌクレオチドを、製造者のプロトコールに従ってモデル230A装置（Applied Biosystem，Fos ter City，CA）を用いた電気溶出によりゲルから回収された。合成遺伝子アセンブリーモザイク・タンパク質をコードする合成遺伝子を、３つのサブ断片からアセンブルした。これらのサブ断片の中の２を、各々４つのオリゴデオキシヌクレオチドからPCRにより合成した。オリゴヌクレオチドを、各反応において10と100pmol の間の最終濃度において使用した。第３のサブ断片を、反応当り、100pmolの濃度においてたった２のオリゴヌクレオチドを使用して合成した。全てのサブ断片を、その反応混合物に適当なオリゴヌクレオチドを添加することにより合成し、その後、30サイクルのPCRを以下のように行った：94℃45秒間、65℃20秒間、及び72℃１分間。合成サブ断片を、各断片の末端に位置する認識部位をもつ適当な制限エンドヌクレアーゼにより処理し、そして次に、３つのサブ断片の全て、50 mM Tris−HCl，pH7.5，10mM MgCl₂，１mM DTT，１mM ATP、及び10ユニットのDN Aリガーゼ(Pharmacia，Piscatamay，NJ)を含む溶液10μｌ中で６時間にわたりライゲートした。１μｌのリガーゼ反応溶液を、PCRにより断片を増幅して、上記のPCR条件を用いて、そしてプライマーとして２つの末端オリゴヌクレオチドを用いて完全長DNAを提供するために使用した。増幅された完全長DNAを、DEAE手順によりアガロース・ゲルから回収し、そして制限エンドヌクレアーゼにより処理して、その合成遺伝子の構造を確認した。 HEVのBurmese及びMexican株の両方における免疫反応性エピトープを含むORF2 とORF3タンパク質の全ての領域が、人工モザイク・タンパク質内に含まれていた。それぞれの抗原性領域が、３つの連続グリシン残基（配列番号：１）により互いに分離された。プラスミド構築プラスミド内への合成断片の挿入に好適な制限エンドヌクレアーゼ認識を得るために、断片を、特別にデザインされた制限部位をもつプライマーの対を使用してPCRにより再増幅した。ベクターpGEX−2T（Pharmacia Biotech Inc.，Piscata way，NJ）による上記断片のクローニングのために、BamHＩ−及びEcoRＩ−部位をもつ合成DNAを、提供した。ベクターPAX−4a＋（United States Biochemical Co.，Clereland，Ohio）による断片のクローニングのために、EcoRＩ−及びSal Ｉ−部位をもつDNA DNA断片を提供した。 pGEX−2T内への合成DNA断片の挿入により得られた最初のプラスミドを、pMEG 330と名付けた。pMEG 330は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(GST)により提示されるＮ−末端部分及び人工モザイク・タンパク質により提示されるＣ−末端半分をもつ融合タンパク質をコードする遺伝子を含む。アセンブルされた遺伝子の忠実度（fidelity）を分析するために、そのクローン化された合成DNA断片の１次を、プライマーとしてのオリゴデオキシヌクレオチドの追加のセットを使用して決定した。予想外に、その合成遺伝子内の欠失であって、グリシン・スペーサー及びHEV Burma−特異的ORF3抗原性エピトープの一部の除去をもたらしたものが発見された。この欠失は、翻訳の期を変化させなかったが、13アミノ酸短いタンパク質の発現をもたらした。合成遺伝子の構造を矯正するために、XhoＩ−t Sau 96Ａ−部位の間に位置するDNA断片を、再アセンブルし、そして配列を確認した後、プラスミドpMEG 330の欠失含有領域を矯正されたDNA断片により置換した。得られたプラスミドpMEG 330−45は、元々デザインされた構造の人工モザイク・タンパク質をコードする合成遺伝子を含む。さらに、矯正された合成遺伝子を、ベクターp4a−2X内に挿入し、プラスミドpMEL 301を得た。このプラスミドは、ベーターガラクトシダーゼにより提示されたＮ−末端部分及びHEVモザイク・タンパク質により提示されたＣ −末端部分をもつ融合タンパク質をコードしている。それぞれのプラスミドについて、クローン化された合成モザイク遺伝子の配列を、ポリメラーゼ連鎖ターミネーター法により確認した。モザイク・ポリペプチド発現及び精製融合タンパク質を発現させるために、大腸菌（E．coli）JM109コンピテント細胞（Invitrogen，Co.，San Diego，CA）を、プラスミドpMG 330−45及びpMEL 30 1により形質転換した。細胞を、600nmにおける光学密度が0.6に等しくなるまで1 00μｇ／mlのアンピシリンを含むLB培地中で増殖させ、その後、その融合タンパク質の発現を制御するプロモーターを、１mMの最終濃度におけるイソプロピル− ベータ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（IPTG）の添加により活性化した。37℃ において４〜６時間増殖させた後、それらの細胞を収穫し、そして溶解物を調製した。 pMEG 330−45によりコードされたグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−HEV モザイク融合タンパク質(GST−HE)を、グルタチオン−Shepharose 4Bカラム(Pha rmacia KLB Biotechnology，Piscataway，NJ)を用いたアフィニティー・クロマトグラフィー（Smith，D．B．and Johnson，K．S.，Gene 67：37-40，1988）により精製した。合成ペプチドペプチドを、製造者のプロトコールに従って、ACT Model MPS 350多ペプチド合成装置(Advanced Chemtech，Louisville，KY)上でFMOC−化学(Barany and Mer rifield，1980)により合成した。アミノ酸分析、高性能液体クロマトグラフィー、及びキャピラリー電気泳動による特徴付けの後、ペプチドを、商業的に入手可能な結合(conjugation) キット（Pierce，Rockfold，IL）を使用してウシ血清アルブミン(BSA)又はKeyho le limpetヘモシアニン(KLH)への結合のために直接、使用した。これらの合成ペプチドを、モルモットを免疫感作して、その後のテストにおける使用のための抗 −ペプチド血清を得るために使用した。モルモット抗−合成ペプチド血清結合合成ペプチドを、CYTREX Titer−Maxアジュバントと混合し、そしてモルモットに４部位において皮下注射した。各部位に、８−18μｇの結合ペプチドを含む約50μｌの混合物を注射した。２週間後、これらの動物をブーストした。これらの動物を、４週間後に採血した。ヒト血清 1987年にメキシコにおいて（ｎ＝５）、1988年にSomaliaにおいて（ｎ＝10）、1990年にTadjikistanにおいて（ｎ＝11）、及び1991にKenyaにおいて（ｎ＝23 ）発生したHEVからの血清を、Hepatitis Branch，National Center for Infecti ous Disease，Centers for Disease control and Prevention，Atlanta，GA及び D．I．Ivanovsky Institute of Virology，Moscow，Russiaに寄託されたコレクションからランダムに選択した。正常血液ドナーから、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎ウィルスに感染したヒトから得られた血清試料を、全世界のHEV非伝染領域から集め、そして陰性対照として使用した。モザイク・タンパク質における抗原性エピトープの適正なモデリングプラスミドpMEG 330−45及びpMEL 301により形質転換させた大腸菌(E．coli) 細胞は、それぞれ、約45KDaと125KDaの予想分子量をもつポリペプチドを作り出す。本モザイク・タンパク質内に含まれた各HEV−特異的抗原性領域の存在を確認するために、これらのタンパク質を、対応の合成ペプチドによるモルモットの免疫感作により得られた血清を用いてウェスタン・ブロット検定及び酵素免疫検定により分析した。ウェスタン・ブロット検定溶解物のアリコートを、ウェスタン・ブロット（Harlow，E.，Lane，D．(1988 )Antibodies．A laboratory manual．Cold Spring Harbor，NY，pp．471-510）により分析した。固定化されたタンパク質を含むニトロセルロース・フィルターを、0.5％Triton Ｘ−100,１％ゼラチン、及び１％ウシ血清アルプミンを含む50 mM Tris−HCl，pH7.5(NET)中100倍希釈したモルモット抗−合成ペプチド血清又はヒト血清と共に20℃において２時間インキュベートした。これらのフィルターを、NETで３回洗浄し、そして次に、NET中１：5000に希釈された西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合されたアフィニティー・クロマトグラフィー精製抗−ヒト IgG又は抗−モルモットIgG(Boehringer Mannheim，Germany)と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ジアミノベンジジン(Sigma，St．Lous，MO)及び過酸化水素を、上記反応を進めるために使用した。アミノ酸394−470位におけるHEV ORF2抗原性領域の同定のために、アミノ酸41 4−433位における配列を含んで成るペプチド33(Khudyakov et al．Virol．198： 390-393，1994)に対して、及びアミノ酸442−460位における配列を含んで成るペプチド13(Khudyakov et al．1993)に対して得られた血清を使用した。アミノ酸5 62−580位におけるORF2抗原性領域の免疫反応性を、モルモット抗−ペプチド40 血清（Khudyakov et al.，1994）を用いて確認した。アミノ酸631−660位におけるORF2領域を、ペプチド23(641−660アミノ酸)に対するモルモット血清(Khudyakov et al．1993)により同定した。ORF3 抗原性領域を、Burmese株について抗−ペプチド５（91−110アミノ酸）及び抗− ペプチド６（105−123アミノ酸）血清及びMexican株について抗−ペプチド29(10 5−123アミノ酸)血清(Khudyakov et al．1993)を使用して検出した。このウェスタン・ブロット検定の結果は、そのモザイク・タンパク質内でデザインされた全てのHEV−特異的抗原性領域の存在及び免疫反応性をはっきりと示している。確認的ウェスタン・ブロット検出を、Favorov et al．（1992）に従って行った。ORF2によりコードされたHEVタンパク質の異なる断片を含む精製された不溶性trpE融合タンパク質C2及びC2−１（Purdy et al.，1992）が、Dr．M．Purdy， Hepatitis Branch，Centers for Disease Control and Prevention，Atlanta，G eorgiaにより好意により提供された。抗−HEVのためのEIA エピトープ特異的抗体に対する人工HEV−特異的モザイク・タンパク質内に含まれた各抗原性領域のアクセス可能性についてさらに確認するために、プラスミドpMEG 330−45によりコードされたGST−融合タンパク質を、アフィニティー精製し（材料及び方法参照）、そしてマイクロタイター・ウェルの表面上に受動的に吸着された。ウェスタン・ブロット検定において使用されたモルモット抗−ペプチド血清を、EIAフォーマットにおいても使用した。比較のために、その対応合成ペプチド及びペプチド結合物をも、EIAにおいて使用した。５μｇ／mlの濃度におけるアフィニティー精製GST−HEタンパク質(110μｌ)を、マイクロタイター・ウェル(Immulou II，Dynatech Laboratories，Inc.)に吸着させた。ヒト及びモルモット血清を、0.1％ Tween20及び10％正常ヤギ血清を含む0.1Ｍホスフェード−バッファー生理食塩水、pH7.5中で１：100に希釈した。マイクロタイター・プレートのウェルの表面に吸着された組換えタンパク質に対する抗体の結合を、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに結合したヒト又はモルモットIgGに対するアフィニティー精製抗体(Company)を用いて同定した。Ｐ／Ｎ比として表されるカットオフ(cut off)は、陰性対照の平均プラスその平均を３標準偏差（SD）上廻るものとして統計的に確立し、そして2.1に等しいものであった。ここで、Ｐは、抗−HEV陽性試料の49 0nmにおける光学密度の値を表し、そしてＮは、陰性対照の上記光学密度の値を表す。典型的には、陰性対照についての光学密度の値は、0.05±0.001であった。全ての抗−ペプチド血清が、上記モザイク・タンパク質と免疫反応した。この観察は、抗−合成ペプチド抗体に対する人工タンパク質内に含まれた全HEV−特異的抗原性領域のアクセス可能性を立証する。免疫反応性の程度は、そのエピトープ及び抗−ペプチド血清に依存して変動することができた。例えば、HEV ORF2 タンパク質のＣ−末端領域からのエピトープは、他の抗原性領域に比べて対応の抗−ペプチド血清とのより低い抗原反応性を示した。他方において、合成ペプチド28と29（表１）から得られた抗−ペプチド血清は、その対応合成ペプチドとによるよりも、Mexican株のORF3タンパク質のＣ−末端部分から得られたモザイク・ポリペプチドの領域と、より免疫反応性であった。この観察は、その天然抗原又は合成ペプチドと比べて、抗−ペプチド抗体の異なる免疫学的反応性又は異なる程度の抗原性エピトープ・モデリングに起因することができる。Mexican HEV ORF3タンパク質のＣ−末端抗原性エピトープは、これらのエピトープがその天然抗原において提示されるやり方を真似る人工モザイク・タンパク質のＣ−末端に位置し；一方、HEV ORF2タンパク質のＣ−末端領域は、それらのエピトープがその天然抗原において見られるやり方とは異なり、その人工モザイク・タンパク質に終結せずに（non-termin ally）位置する。天然抗原とモザイク・タンパク質内でのこれらのエピトープの位置の相違は、それらの免疫反応特性に影響を及ぼすことができる。それにも拘らず、我々の実験において観察されたように異なるHEV−特異的抗原性エピトープの抗原反応性は、そのモザイク・タンパク質内に含まれたエピトープが免疫反応性のやり方でモデル化されることを立証する。合成ペプチド又はBSAに結合させたペプチドを使用したEIAを、本質的に先に記載したように行った。但し、プレートを、他に記載されるように（Khudyakov et .，1993；Favorov et al.，1994）ウェル当り５μｇのペプチド又は0.5μｇのペプチド結合体によりコートした。典型的には、陰性対照についての光学密度は、 0.02±0.002であった。モザイク・ポリペプチドの診断適格（Diagnostic relerance）モザイク・タンパク質の診断能力を確認するために、我々は、全世界の異なる領域内でのHEV発生から得たヒト血清のパネルを使用した。正常血液ドナーから、及び全世界の非伝染領域からのＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、及びＣ型肝炎ウィルスに対する抗体について血清学的に陽性であるヒトから得た30血清試料のパネルを、陰性対照として使用した。全試料の抗−HEV状態を、ウェスタン・ブロット検定( Favorov et al．1992)及び最近開発された合成ペプチド−EIA(Favorov et al 19 93)により予備的に測定した。HEV発生から得られた全30血清試料は、HEV−特異的IgG抗体を含むことが判明した。これらの血清は、GST−モザイク・タンパク質との強いIgG免疫反応性をも立証された。モザイク・タンパク質と免疫反応性である抗−HEV陽性血清についてのＰ／Ｎ比のレンジは、2.1−500であった。統計的な分析を、抗−HEV EIAについて上述したように行った。いくつかの抗−HEV陽性試料は、１：50000を超えるタイターをもっていた。 HEV−特異的配列の一部の欠失を含むプラスミドpMEG 330によりコードされるタンパク質についても分析した。この欠失誘導体モザイク・タンパク質が、その完全長タンパク質に比較してかなり弱い抗原反応性を示したことは注目に値する。この欠失含有タンパク質の抗原反応性は、85−95℃において２分間のその精製タンパク質の熱変性により、いくぶん改善された。驚ろくべきことき、熱変性は、その正しい配列を含むタンパク質の抗原特性を低下させた。これらの２つのタンパク質の抗原特性におけるこの不一致は、その欠失により直接的に影響されないそれらのHEV−特異的エピトープの巨大構造のモデリングにおける差異を反映することができる。これらの結果は、１のポリペプチド鎖内の多くの異なるエピトープ領域の組合せが必ずしも、適正に折り畳まれたモザイク・タンパク質をもたらすことを期待されることができないということを示している。例えば、Burmese HEV株のORF3 抗原性領域内のたった５つのアミノ酸の小さな欠失を含むHEVモザイク・タンパク質が、その抗原全体の抗原特性を劇的に減少させた。この結果は、モザイク・タンパク質内の抗原性エピトープの適正なモデリングが、その２次及び３次構造に対する注意を要求することができ、そしてそれらの相対的な有効性を決定するための人工抗原のいくつかの変異体についての日常的な構造及びテストを要求することができるということを示唆している。交差反応性エピトープの排除感染剤に特異的な抗体の３−４％が、いくつかの宿主特異的タンパク質をも認識することができることが知られている。このような抗体の交差反応性についての多くの例が在り、そしてこの現象は、部分的に、偽陽性結果の原因であることができる。合成ペプチドを使用する我々の実験においては、我々は、先に、HEV非感染領域から得られた血清の約10％と免疫反応性であり、そしてウェスタン・ブロット検定と合成ペプチド−EIAの両方により抗−H EV活性を欠いていることが示された。ORF2によりコードされるタンパク質のアミノ酸515−530位における領域(Khudyakov et al．1994)を同定している。このデータは、この領域が、ORF2タンパク質の非特異的反応性に貢献することができることを示唆している。免疫診断試薬として使用されたタンパク質からのこれらの領域の排除は、これらの試薬の特異性を改良し、そしてより特異的な診断テストをもたらした。株依存性免疫反応性の適応 HEVモザイク・ポリペプチドは、２つの公知のHEV株に属する２つの異なるHEV タンパク質からの抗原性エピトープを、１つのポリペプチド内で、接続する。HE Vのために、ORF3タンパク質の強い株依存性の免疫反応性が、HEV感染カニクイザルを使用した実験においても観察されている（Yarbough et al．1991）。この厳格な株特異性はヒト血清を用いて確認されなかったけれども(Khudyakov et al． 1993)、我々は、全世界の異なる部分からの血清試料(Khudyakov et al．1993)とのこれらのペプチドの抗原反応性に対する、ORF3タンパク質のＣ−末端領域から得られた合成ペプチドの１次構造のいくつかの影響を観察した。この観察のサポートにおいて、ORF3タンパク質内の厳密なBurmese又はMexican株−特異的エピトープ（Khudyakov et al．J．Gen．Virol．75，1994）の存在を立証するデータが得られた。さらに、両HEV株から得られたペプチドの組合せが、これらのペプチドの各々単独よりも抗−HEV陽性血清(Khud yakov et al．1993)のより大きなパーセンテージを検出した。まとめると、これらのデータは、上記２つのHEV株からの抗原が、血清中の抗 −HEV活性の検出のためのテストの開発のために使用されなければならないということを示唆している。しかしながら、これらのエピトープだけの適用は、HEV 感染の全てのケースの検出のためには十分ではなく(KhudyaKov et al．1993)、そしてORF2タンパク質からの追加のエピトープがその全体的な感度を改良するために使用されなければならない(Farokov et al．1993)。本明細書の全体にわたり、さまざまな刊行物を引用する。これらの刊行物の開示を、ここで、全体として、本発明の属する分野の技術水準をより十分に説明するために本明細書中に、引用により取り込む。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年２月２１日【補正内容】請求の範囲１．配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードする核酸。２．配列番号：１のヌクレオチド配列をもつ、請求項１に記載の核酸。３．配列番号：１と少なくとも70％の配列同一性をもち、かつ配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチドと同じ機能をもつポリペプチドをコードする、核酸。４．その発現に好適な形態にある、先の請求項のいずれか１項に記載の核酸を含んで成るベクター。５．その発現に好適な形態にある、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸を含んで成る宿主。６．配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチド。７．請求項３に記載の核酸によりコードされたポリペプチド。８．配列番号：３、４、７、８、９及び10のいずれかのアミノ酸配列を含んで成り、その生来のＥ型肝炎ウイルス内の配列のアミノ酸の間にあるアミノ酸を実質的に欠いている、モザイク・ポリペプチド。９．被験体におけるＥ型肝炎ウイルス感染の検出方法であって：ａ．その被験体からの抗体含有サンプルを、請求項６〜８のいずれかに記載のポリペプチドと接触させ；そしてｂ．そのポリペプチドとサンプル中の抗体との抗体認識反応であってＥ型肝炎感染の存在を示すものを検出する、を含んで成る方法。 10．Ｅ型肝炎ウイルスによる感染に対する免疫感作における使用のための医薬の製造のための、請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。 11．Ｅ型肝炎ウイルスによる感染に対して被験体を免疫感作させる方法であって、その被験体を免疫感作するのに有効な量の請求項６〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含んで成る方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者キュドヤコフ，ユリーイー. アメリカ合衆国，ジョージア 30329，アトランタ，ドゥルイドバレードライブ 1402−エフ (72)発明者ファボロフ，マイケルオー. アメリカ合衆国，ジョージア 30329，アトランタ，ドゥルイドバレードライブ 1405−エフ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２として配列表中に規定するアミノ酸配列から本質的に成るモザイク・ポリペプチドをコードする核酸。２．核酸の発現に好適なベクター内の、請求項１に記載の核酸。３．核酸の発現に好適な宿主内の、請求項２に記載の核酸。４．請求項１に記載の核酸によりコードされたポリペプチド。５．ストリンジェント条件下請求項１に記載の核酸と選択的にハイブリダイズし、そして配列番号：１と少なくとも70％の配列同一性をもつ核酸。６．ベクター内の、請求項５に記載の核酸。７．ベクターのための宿主内の、請求項６に記載の核酸。８．請求項５に記載の核酸によりコードされたポリペプチド。９．配列番号：１として配列表中に規定されたヌクレオチド配列から成る、請求項１に記載の核酸。 10．被験体におけるＥ型肝炎ウィルス感染の検出方法であって：ａ．その被験体からの抗体含有サンプルを、一定量の請求項４に記載のポリペプチドと接触させ；そしてｂ．そのポリペプチドとサンプル中の抗体との抗体認識反応であってＥ型肝炎感染の存在を示すものを検出する、を含んで成る方法。 11．被験体におけるＥ型肝炎ウィルス感染の検出方法であって：ａ．その被験体からの抗体含有サンプルを、一定量の請求項８に記載のポリペプチドと接触させ；そしてｂ．そのポリペプチドとサンプル中の抗体との抗体認識反応であってＥ型肝炎感染の存在を示すものを検出する、を含んで成る方法。 12．Ｅ型肝炎ウィルスによる感染に対して被験体を免疫感作する方法であって、その被験体を免疫感作するのに有効な量の請求項４に記載のポリペプチドを投与することを含んで成る方法。 13．Ｅ型肝炎ウィルスのペプチド５，６，22，23，24，28及び29を含んで成り、そして生来のＥ型肝炎ウィルス内のペプチドのアミノ酸の間にあるアミノ酸を実質的に欠く、モザイク・ポリペプチド。 14．被験体におけるＥ型肝炎ウィルス感染の検出方法であって：ａ．その被験体からの抗体含有サンプルを、一定量の請求項13に記載のポリペプチドと接触させ；そしてｂ．そのポリペプチドとサンプル中の抗体との抗体認識反応であってＥ型肝炎感染の存在を示すものを検出する、を含んで成る方法。