JP2003527820A - 概日時計機能及び光周性を制御する遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 光周性及び概日リズムに関与する植物タンパク質をコードする核酸分子が開示される。これらの分子は、光周性及び／又は概日時計に基づく植物の遺伝子発現を改変するために、植物へ導入されうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は、植物における概日時計機能及び光周性を制御する遺伝子に関し、特
にELF3遺伝子に関する。本発明の面には、精製されたELF3遺伝子産物（ELF3タン
パク質）、及びこの遺伝子産物をコードする核酸分子が含まれる。修飾されたEL
F3活性を有する核酸ベクター、トランスジェニック細胞、及びトランスジェニッ
ク植物も提供される。

【０００２】 発明の背景 顕花植物におけるシュートの発達は、茎頂分裂組織の活性により最終的に調節
される連続的な過程である。通常の植物発達における頂端分裂組織活性は、逐次
的かつ進行的であり、生育期（vegetative）→花序期（inflorescence）→花成
期（floral）（V→I→F）という一連の重複する期として要約されうる。過去50
年間にわたり、生育期−花成期移行の調節のための多くのモデルが提唱されてき
た。これらのモデルは、単純な単一経路モデルから複雑な多重経路モデルにまで
及んでおり、生理学的研究に大きく基づいている（概説については、Bernier,19
88を参照のこと）。現代の技術により、研究者は、V→I→F移行の調節をさらに
調査するため遺伝学的方法及び分子的方法を使用することができる。

【０００３】 植物分子生物学者により日常的に実施されている、そのような現代技術の一つ
は、異種遺伝子配列を保持するトランスジェニック植物の作製である。単離され
た遺伝子配列を発現カセットに取り込ませ、植物形質転換ベクターを作製し、多
くの型の植物を形質転換するための方法は、周知である。異種トランスジーンの
導入の結果として修飾された特徴を有するトランスジェニック植物の作製の例に
は、米国特許第5,268,526号（トランスジェニック植物におけるフィトクロム発
現の修飾）、第5,719,046号（細菌性ジヒドロプテロアート（dihydropteroate）
シンターゼ遺伝子の導入による除草剤耐性植物の作製）、第5,231,020号（植物
におけるフラボノイドの修飾）、第5,583,021号（ウイルス耐性植物の作製）、
並びに第5,767,372号及び第5,500,365号（バチルス・チューリンギエンシス（Ba
cillus thuringiensis）遺伝子の導入による昆虫耐性植物の作製）が含まれる。

【０００４】 光の質、光周期、及び温度は、花成の開始にとって重要な、いくつかの種にと
っては必須の、環境的な刺激として機能することが多い。しかし、誘導的な光シ
グナルの受容から花成の開始及び花芽分裂組織形成までの発達経路を直接的に調
節する分子メカニズムに関しては、ほとんど情報が存在しない。エンドウ（ピサ
ム・サティバム（Pisum sativum））（Murfet,1985参照）及びシロイヌナズナ（
Arabidopsis）（Koornneef ら,1991参照）における花成期移行変異体の分析によ
り、花成開始を調節する遺伝学的ヒエラルキーの少なくとも一部が、24時間の明
／暗サイクルにおいて植物が知覚する光の時間数に反応することが証明された。
明期の長さの測定は光周反応と呼ばれる。光周反応は、内因性概日リズムに基づ
き多くの生理学的過程及び発達過程を調節する、一つ又は複数の生物学的時計と
結びついていると以前より考えられてきた。

【０００５】 多くの重要な植物の生理学的過程及び発達過程が、概日リズムにより影響を受
ける。これらには、遺伝子転写の誘導、葉の運動、気孔の開閉、及び花成の光周
性調節が含まれる。これらの植物の過程と概日リズムとの関係は以前より認識さ
れていたが、植物における概日リズムの遺伝学的分析は最近着手されたばかりで
ある。概日調節の遺伝学的分析の大部分は、ショウジョウバエ（Drosophila）及
びアカパンカビ（Neurospora crassa）を用いて実施されており、変異の研究に
よりそれぞれper遺伝子及びfrq遺伝子が単離された（Hall,1990; Dunlap,1993）
。これらの遺伝子は、概日発振器の成分をコードすると考えられている。その理
由の一つとして、ヌル対立遺伝子は、非律動的反応を引き起こし、長周期反応又
は短周期反応のいずれかを生じるこれらの遺伝子の対立遺伝子が存在する。per
及びfrqのmRNAの転写産生は24時間周期で循環し、両遺伝子はそれら自身の発現
を調節する（Edery ら,1994; Aronson ら,1994）。

【０００６】 シロイヌナズナは定量的な長日（LD）植物である。野生型植物は、LD光条件下
で生育した場合、短日（SD）光条件下で生育した場合よりも迅速に花成を開始す
る。花芽形成及び発達に必要な遺伝子を同定するため、SD条件下で生育したアラ
ビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）コロンビア（Columbia）生態型
の集団を、早期花成変異体についてスクリーニングした。次いで、単離された変
異体を付加的なシュート発達異常について調査し、分裂組織機能又は光知覚に関
連した不明確なシュート表現型を有するものを、さらなる分析のため検討した。
そのような変異体は、シュート生育及び生殖器発達を保証する「二重安全装置（
fail-safe）」メカニズムとして、様々な程度で機能する、機能的に余剰の経路
の一部である遺伝子を、同定する可能性がある。そのような機能的に余剰の経路
の例は、ショウジョウバエ（Drosophila）（例えば、Hulskamp ら,1990）及び線
虫（C.elegans）（例えば、Lambie および Kimble,1991）の研究に記載されてい
る。これらのシロイヌナズナのスクリーニングにより同定されたキー遺伝子は、
TERMINAL FLOWER 1（TFL1）遺伝子及びEARLY-FLOWERING 3（ELF3）遺伝子であっ
た（Shannon および Meeks-Wagner,1991; Zagotta ら,1992）。

【０００７】 シロイヌナズナのearly-flowering（elf3）変異体は、花芽形成に関して光周
期感受性ではない。ELF3遺伝子座の変異についてホモ接合の植物は、LD生育条件
においてもSD生育条件においても同時期に花成するが、野生型植物の花芽形成は
LD生育条件により促進される（Zagotta ら,1992; Zagotta ら,1996）。LD条件下
では、elf3-1ヘテロ接合体の花成時期は、野生型とホモ接合変異体の中間である
。非光周期感受性に加え、全てのelf3変異体が、光受容又は光シグナル伝達に欠
陥を有する植物に特徴的な長胚軸表現型を示す（Zagotta ら,1992; Zagotta ら,
1996）。同定されている長胚軸変異体の大半は、赤色光が媒介する胚軸伸長の阻
害に欠陥を有する。対照的に、elf3変異体は、主に青色光依存的な胚軸伸長の阻
害に欠陥を有するが、赤色光依存的な胚軸伸長の阻害にも部分的に欠陥を有する
（Zagotta ら,1996）。

【０００８】 ELF3遺伝子の有用性は、改変された概日時計機能及びプログラム化された光周
反応を有するトランスジェニック植物の作製を容易にするであろうと考えられた
。そのような遺伝子が、本発明の対象である。

【０００９】 発明の概要 本発明は、elf3変異型植物へ導入された場合、elf3の非光周期感受性花成及び
伸長した胚軸という欠陥を補足することが示されている、シロイヌナズナから単
離されたELF3遺伝子を提供する。

【００１０】 本発明の一つの面は、ELF3タンパク質の生物学的活性を有する精製されたタン
パク質である。原型シロイヌナズナELF3タンパク質は、配列番号：２に示された
アミノ酸配列を有する。ELF3タンパク質のホモログである、一つ又は複数の保存
的アミノ酸置換により配列番号：２と異なるこのタンパク質の異型も提供される
。そのようなホモログは、典型的には、配列番号：２に示された配列と少なくと
も60％の配列同一性を有する。これらのタンパク質をコードする核酸分子も本発
明の一部である。そのような核酸分子には、配列番号：１、配列番号：３、及び
配列番号：４に記載のヌクレオチド配列を有するものが含まれる。

【００１１】 プロモーター配列がこれらのELF3タンパク質コーディング核酸分子のいずれか
と機能的に連結している組換え核酸分子が、本発明のさらなる面である。本発明
は、そのような組換え核酸分子で形質転換された細胞及び組換え核酸分子を含む
トランスジェニック植物も提供する。そのようなトランスジェニック植物は、例
えば、シロイヌナズナ、コショウ、トマト、タバコ、ブロッコリー、カリフラワ
ー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ、トウモロコシ、コムギ、オオ
ムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクルミでありうる。

【００１２】 本発明のさらなる面は、配列番号：１、３、又は４に示された配列の15個、20
個、30個、50個、又は100個の連続するヌクレオチドを含む、単離された核酸分
子又はオリゴヌクレオチドである。そのような核酸分子又はオリゴヌクレオチド
は、プロモーター配列と機能的に連結していてもよく、そのようなプロモーター
に対してセンス方向で存在しても、又はアンチセンス方向で存在してもよい。プ
ロモーターが接着した、又は接着していない、そのような組換え核酸分子で形質
転換された細胞及び植物も、本発明に含まれる。

【００１３】 本発明のさらなる態様は、記載されたハイブリダイゼーション条件下で配列番
号：１に記載の核酸配列とハイブリダイズし、かつELF3タンパク質の生物学的活
性を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子を含む。密接に関連し
たELF3遺伝子ホモログは、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーシ
ョンにより検出されうるが、関連性の低いホモログは、低ストリンジェンシー条
件下でのハイブリダイゼーションにより検出されうる。高ストリンジェンシー・
ハイブリダイゼーションのための適当な洗浄条件は、50℃、0.2×SSC、0.1％SDS
、1時間という条件でありうる。低ストリンジェンシー・ハイブリダイゼーショ
ンのための適当な洗浄条件は、50℃、2×SSC、0.1％、3時間という条件でありう
る。そのようなハイブリダイズする単離された核酸分子は、植物で発現するため
プロモーターと機能的に連結していてもよい。そのような組換え核酸分子で形質
転換された細胞及びそのような分子を含むトランスジェニック植物も、提供され
る。

【００１４】 本発明は、ELF3遺伝子の5'調節領域も提供する。この調節領域又はその一部は
、特定の遺伝子のELF3様概日リズム発現を得るために使用されうる。例えば、EL
F3の5'調節領域を目的遺伝子のオープンリーディングフレームと機能的に連結さ
せ、得られた組換え構築物を形質転換により植物へ導入することができる。

【００１５】 配列表 添付の配列表に列挙された核酸配列及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の
ための標準的な略号及びアミノ酸のための3文字表記を使用して示されている。
各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は示された鎖の参照により
含まれているものと理解される。

【００１６】 配列番号：１は、シロイヌナズナELF3のcDNA配列及びアミノ酸配列を示す。

【００１７】 配列番号：２は、シロイヌナズナELF3タンパク質のアミノ酸配列を示す。

【００１８】 配列番号：３は、シロイヌナズナELF3のゲノム配列を示す。配列は以下の領域
を含む。

【００１９】 配列番号：４は、シロイヌナズナELF3 ORFのDNA配列及び対応するアミノ酸配
列を示す。

【００２０】 配列番号：５は、4071塩基対のシロイヌナズナELF3の5'調節領域を示す。

【００２１】 配列番号：６〜１１は、シロイヌナズナELF3配列のある部分の増幅に使用され
うるプライマーを示す。

【００２２】 発明の詳細な説明 I．定義 特記しない限り、技術用語は通常の使用法に従い使用されている。分子生物学
における一般的な用語の定義は、1994年にオックスフォード大学出版（Oxford U
niversity Press）より出版されたBenjamin Lewinの「Genes V」(ISBN 0-19-854
287-9)、1994年にブラックウェル・サイエンス社（Blackwell Science Ltd.）よ
り出版されたKendrewら編の「The Encyclopedia of Molecular Biology」(ISBN
0-632-02182-9)、及び1995年にVCH出版社（VCH Publishers,Inc.）より出版され
たRobert A.Meyer編の「Molecular Biology および Biotechnology: a Comprehe
nsive Desk Reference」(ISBN 1-56081-569-8)に見出される。

【００２３】 本発明の様々な態様の概説を容易にするため、以下に用語の定義を提供する。

【００２４】 ELF3遺伝子／ELF3 cDNA：ELF3タンパク質をコードする核酸分子。シロイヌナ
ズナELF3タンパク質をコードする核酸分子は、配列番号：３（シロイヌナズナEL
F3遺伝子）、配列番号：１（シロイヌナズナELF3 cDNA）、及び配列番号：４（
シロイヌナズナELF3オープンリーディングフレーム）に提供されている。本発明
は、配列番号：１、３、及び４に提供された核酸分子のみならず、これらの配列
のホモログ及びオルソログ、ELF3タンパク質をコードするその他の核酸分子、並
びにこれらの配列に由来するプローブ及びプライマーも含む。

【００２５】 elf3変異体：シロイヌナズナのearly-flowering（elf3）変異体は、花芽形成
に関して光周期感受性ではない（Zagotta ら,1992; Zagotta ら,1996）。非光周
期感受性に加え、全てのシロイヌナズナelf3変異体が、光受容又は光シグナル伝
達に欠陥を有する植物に特徴的な長胚軸表現型を示す（Zagotta ら,1992; Zagot
ta ら,1996）。elf3変異体は、主に青色光依存的な胚軸伸長の阻害に欠陥を有す
るが、赤色光依存的な胚軸伸長の阻害にも部分的に欠陥を有する（Zagotta ら,1
996）。

【００２６】 ELF3タンパク質：ELF3タンパク質の生物学的活性を有し、かつ配列番号：２（
シロイヌナズナELF3タンパク質）に示された原型ELF3タンパク質のアミノ酸配列
とのアミノ酸配列同一性を有するタンパク質。原型ELF3タンパク質との関連性が
比較的低いELF3タンパク質は、下記の方法により決定されるように、配列番号：
２に示された配列と少なくとも60％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。関
連性が比較的高いELF3タンパク質は、シロイヌナズナELF3タンパク質と少なくと
も70％、75％、又は80％の配列同一性を有しうる。シロイヌナズナタンパク質と
の関連性が最も高いELF3タンパク質は、ELF3タンパク質の生物学的活性を有し、
かつシロイヌナズナタンパク質と少なくとも85％、90％、又は95％の配列同一性
を有しうる。

【００２７】 ELF3タンパク質の生物学的活性：elf3変異体を補足するタンパク質の能力。el
f3変異体を補足するタンパク質の能力は、標準的な方法を使用して、タンパク質
をコードする遺伝子をelf3変異型植物へ導入することにより、容易に決定されう
る。コードされたタンパク質がELF3タンパク質の生物学的活性を有する場合、こ
れは、elf3変異体と連鎖した特徴（例えば、非光周期感受性花成及び伸長した胚
軸）に関して野生型の表現型を有するトランスジェニック子孫植物の割合として
出現するであろう。

【００２８】 ELF3プロモーター：ELF3転写の空間的時間的調節を担うELF3コーディング配列
の上流（5'）の核酸配列の領域。ELF3転写は概日制御を受けているが、RNAが最
大となるのは、他の既知の概日遺伝子、例えばCAB、CCR2、CCA1、及びLHYよりも
24時間の周期において「遅い」（Wang および Tobin,1998; Schaffer ら,1998）
。ELF3様概日リズム又は循環的転写調節とは、この比較的遅延した転写最大の型
をさす。ELF3転写は、24時間の周期中比較的遅くに最大レベルに達するため、EL
F3プロモーターは概日時計セッティングの改変を可能にするであろう。例えば、
他の概日制御を受ける遺伝子（例えば、クロロフィルa/b結合タンパク質）がELF
3プロモーターから発現する場合、このタンパク質における概日セットは、ELF3
のセットと適合するよう遅延するであろう。さらに、CCA1及びLHYのような時計
成分及び／又は制御因子が、それら自身のプロモーター又は構成的プロモーター
、例えば35Sプロモーターの代わりにELF3プロモーターにより駆動される場合、E
LF3プロモーターは、概日時計の調節下にある他の遺伝子の改変された発現を提
供するために使用されうる。

【００２９】 ELF3プロモーター領域は、配列番号：５に示された4071kbの5'調節領域配列に
含まれるが、当業者であれば、この完全な5'上流領域よりも短い領域、例えばヌ
クレオチド500〜4071、1000〜4071、1500〜4071、2000〜4071、2500〜4071、300
0〜4071、又は4000〜4071を使用することにより、発現が調節されうることを理
解するであろう。この5'調節配列内からの50又は100ヌクレオチドのような短い
配列も使用されうる。そのような配列が、発現ベクターに含まれる場合、ELF3様
概日循環的転写調節を提供する程度は、本明細書に記載の方法により確認されう
る。従って、「生物学的活性を有するELF3プロモーター」という用語は、ORFの5
'末と機能的に連結し植物へ導入された場合、ORFにコードされるタンパク質のEL
F3様（即ち、比較的遅い）概日循環的転写発現を引き起こす、ELF3遺伝子の5'調
節領域、又はそのような領域の一部もしくは異型をさす。

【００３０】 オリゴヌクレオチド：最大約100ヌクレオチド塩基長の直鎖状ポリヌクレオチ
ド配列。

【００３１】 プローブ及びプライマー：核酸プローブ及びプライマーは、本発明において提
供された核酸分子に基づき容易に調製されうる。プローブは、検出可能な標識又
はレポーター分子と接着した、単離された核酸分子を含む。典型的な標識には、
放射性同位体、リガンド、化学発光剤、及び酵素が含まれる。標識方法及び様々
な目的に適当な標識の選択の指針は、例えばSambrook ら(1989)及びAusubel ら(
1987)に記述されている。

【００３２】 プライマーとは、短い核酸分子、典型的には15ヌクレオチド以上の長さのDNA
オリゴヌクレオチドである。プライマーは、プライマーと標的DNA鎖との間にハ
イブリッドを形成させるための核酸ハイブリダイゼーションにより、相補的な標
的DNA鎖とアニールすることができ、次いでDNAポリメラーゼ酵素により標的DNA
鎖に沿って伸長することができる。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反
応（PCR）又はその他の当技術分野において既知の核酸増幅法により、核酸配列
増幅に使用されうる。

【００３３】 プローブ及びプライマーの調製法及び使用法は、例えばSambrook ら(1989)、A
usubel ら(1987)、及びInnis ら(1990)に記載されている。PCRプライマー対は、
例えば、プライマー（Primer）（バージョン0.5、著作権有、1991年、Whitehead
Institute for Biomedical Research、Cambridge、MA）のようなその目的のた
めのコンピュータ・プログラムを使用することにより、既知の配列から導出され
うる。当業者であれば、特定のプローブ又はプライマーの特異性が、その長さと
共に増加することを理解するであろう。従って、例えば、シロイヌナズナのELF3
cDNA又はELF3遺伝子の20個の連続するヌクレオチドを含むプライマーは、15ヌ
クレオチドのみ対応するプライマーよりも高い特異性で、トマトゲノムDNAライ
ブラリーに含まれるトマト由来のELF3遺伝子ホモログのような標的配列とアニー
ルするであろう。従って、より高い特異性を得るためには、シロイヌナズナのEL
F3 cDNA又はELF3遺伝子の配列の20個、25個、30個、35個、40個、50個、又はそ
れ以上の連続するヌクレオチドを含むプローブ及びプライマーが選択されうる。

【００３４】 従って、本発明は、記載された長さの開示されたELF3 cDNA又はELF3遺伝子の
配列を含む単離された核酸分子を含む。そのような分子は、これらの配列の少な
くとも20個、25個、30個、35個、40個、50個、又は100個の連続するヌクレオチ
ドを含むことができ、開示された配列の任意の領域から入手されうる。例えば、
シロイヌナズナのELF3 cDNA、ELF3 ORF、及びELF3遺伝子の配列を、配列の長さ
に基づき半分又は4分の1に配分し、分子を2等分又は4等分したもののうちのいず
れかから、単離された核酸分子を導出することができる。これを例示するため、
配列番号：１に示したシロイヌナズナELF3 cDNAを使用することができる。シロ
イヌナズナELF3 cDNAは、2518ヌクレオチド長であり、従って仮定的に約半分（
ヌクレオチド1〜1259及び1260〜2518）又は約4分の1（ヌクレオチド1〜629、630
〜1259、1260〜1889及び1890〜2518）に分割することができる。シロイヌナズナ
ELF3 cDNAのこれら又はその他の部分の少なくとも20個、25個、30個、35個、40
個、50個、又は100個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子を、選択すること
ができる。従って、代表的な核酸分子は、開示されたシロイヌナズナcDNAのヌク
レオチド1〜1259を含む領域、又はcDNAのヌクレオチド1〜1135もしくは2502〜25
18を含む領域の少なくとも25個の連続するヌクレオチドを含みうる。

【００３５】 配列同一性：2つの核酸配列又は2つのアミノ酸配列の間の類似性は、配列同一
性とも呼ばれる、配列間の類似性という用語で表される。配列同一性は、同一性
（又は類似性もしくは相同性）の割合として測定されることが多い。割合が高い
ほど、2つの配列は類似している。シロイヌナズナELF3タンパク質のホモログは
、標準的な方法を使用して整列化した場合、比較的高度の配列同一性を有するで
あろう。比較を行うための配列整列化方法は、当技術分野において周知である。
様々なプログラム及び整列化アルゴリズムが、Smith および Waterman(1981)、N
eedleman および Wunsch(1970)、Pearson および Lipman(1988)、Higgins およ
び Sharp(1988)、Higgins および Sharp(1989)、Corpet ら(1988)、Huang ら(19
92)、及びPearson ら,(1994)に記載されている。Altschul ら(1994)は、配列整
列化法及び相同性計算の詳細な検討を提示している。

【００３６】 配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、及びtblastxと共に使
用するための、NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（Altschul
ら1990）は、National Center for Biotechnology Information（NCBI、Bethesd
a、MD）を含むいくつかのソース及びインターネット上から入手可能である。そ
れは、http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でアクセス可能である。このプログ
ラムを使用して配列同一性を決定する方法の記載は、http//www.ncbi.nlm.nih.g
ov/BLAST/blast help.htmlで入手可能である。

【００３７】 開示されたシロイヌナズナELF3タンパク質のホモログは、典型的には、NCBI B
last2.0、デフォルトパラメータにセットされたギャップド（gapped）blastpを
使用して、シロイヌナズナELF3のアミノ酸配列との全長整列化で計数された、少
なくとも60％の配列同一性を有する。参照配列とのさらに大きい類似性を有する
タンパク質は、この方法により調査された場合、より大きい同一性の割合、例え
ば少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少
なくとも95％の配列同一性を示すであろう。完全な配列より短い配列を配列同一
性に関して比較した場合、ホモログは、10〜20アミノ酸の短い区間で、少なくと
も75％の配列同一性を有すると考えられ、参照配列との類似性により少なくとも
85％又は少なくとも90％もしくは95％の配列同一性を有しうる。そのような短い
区間での配列同一性を決定する方法は、http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bla
st FAQs.htmlに記載されている。当業者であれば、これらの配列同一性の範囲は
指針のためだけに提供されており、提供範囲外の高度に有意なホモログを得るこ
とも全く可能であることを理解するであろう。本発明は、前記のペプチドホモロ
グのみならず、そのようなホモログをコードする核酸分子も提供する。ELF3ホモ
ログは、典型的には、ELF3タンパク質の生物学的活性も有するであろう。

【００３８】 他に、2つの核酸分子が密接に関連していることを示すのは、2つの分子が高ス
トリンジェンシー条件下で相互にハイブリダイズするということである。高スト
リンジェンシー条件とは、配列依存的であり、異なる環境的パラメータの下では
異なる。一般的には、高ストリンジェンシー条件は、一定のイオン強度及びpHに
おける特定の配列の熱融解温度（Tm）よりも約5℃から20℃低く選択される。Tｍ
とは、標的配列の50％が、完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする（一
定のイオン強度及びpHにおける）温度である。核酸ハイブリダイゼーションのた
めの条件及びストリンジェンシーの計算は、Sambrook ら(1989)及びTijssen(199
3)に見出される。シロイヌナズナELF3配列と高ストリンジェンシー条件下でハイ
ブリダイズする核酸分子は、典型的には、0.2×SSC、0．1％SDS、55℃、1時間と
いう洗浄条件下で、完全なシロイヌナズナELF3 cDNA又はcDNAの選択された一部
のいずれかに基づくプローブとハイブリダイズする。低ストリンジェンシー条件
を含むハイブリダイゼーション条件に関するより詳細な考察は、以下に提示され
る。

【００３９】 しかしながら、遺伝暗号の縮重のため、高度の同一性を示さない核酸配列が、
類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。全て実質的に同一のタンパク質を
コードする複数の核酸分子を作製するため、この縮重を使用して核酸配列を変化
させうることが理解される。

【００４０】 オルソログ：2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が、共通の先祖配列を
有し、先祖配列を保持する種が2つの種に分裂する際に分岐したのであれば、そ
れらは、相互のオルソログである。オルソログ配列は、又、ホモロガスな配列で
ある。

【００４１】 特異的結合剤：実質的に一定の標的とのみ結合する薬剤。従って、ELF3タンパ
ク質特異的結合剤は、実質的にELF3タンパク質とのみ結合する。本明細書におい
て使用されるように、「ELF3タンパク質特異的結合剤」という用語には、抗ELF3
タンパク質抗体及び実質的にELF3タンパク質とのみ結合するその他の薬剤が含ま
れる。

【００４２】 抗ELF3タンパク質抗体は、Harlow および Lane(1988)を含む多数の参考書に記
載された標準的な手法を使用して作製されうる。特定の薬剤が実質的にELF3タン
パク質とのみ結合することは、日常的な手法を使用又は適合化することにより、
容易に決定されうる。その一つである適当なインビトロ・アッセイでは、ウェス
タンブロッティング法（Harlow および Lane(1988)を含む多くの参考書に記載さ
れた）を使用する。ウェスタンブロッティングは、抗ELF3タンパク質モノクロー
ナル抗体のような、あるELF3タンパク質結合剤が、実質的にELF3タンパク質との
み結合することを決定するために使用されうる。

【００４３】 ベクター：宿主細胞へ導入され、それにより形質転換された宿主細胞を産生す
る核酸分子。ベクターは、複製開始点のような宿主細胞において複製することを
許容する核酸配列を含みうる。ベクターは、一つ又は複数の選択可能マーカー遺
伝子及び当技術分野において既知のその他の遺伝要素も含みうる。

【００４４】 形質転換された：形質転換された細胞とは、分子生物学的技術により核酸分子
が導入されている細胞である。本明細書において使用されるように、形質転換と
いう用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクタ
ーによる形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティ
クルガン加速法による裸DNAの導入を含む、そのような細胞へ核酸分子を導入す
ることができる全ての技術を包含する。

【００４５】 単離された：「単離された」生物学的成分（核酸分子、タンパク質、又は細胞
小器官のような）は、成分が天然に存在する生物の細胞内の他の生物学的成分、
即ち、その他の染色体内又は染色体外のDNA及びRNA、タンパク質、並びに細胞小
器官から実質的に分離又は精製されている。「単離された」核酸分子及びタンパ
ク質には、標準的な精製法により精製された核酸分子及びタンパク質が含まれる
。その用語には、宿主細胞における組み換え発現により調製された核酸分子及び
タンパク質、並びに化学的に合成された核酸分子も内含される。

【００４６】 精製された：精製されたという用語は、完全に純粋である必要はなく、むしろ
相対的な用語である。従って、例えば、精製されたELF3タンパク質調製物は、EL
F3タンパク質が細胞内の天然の環境にある場合よりも濃縮されている調製物であ
る。一般的に、ELF3タンパク質の調製物は、ELF3が調製物の全タンパク質含量の
少なくとも5％を占めるように、精製される。特定の適用の際にはより高い純度
が望ましい場合もあり、その際にはELF3が全タンパク質含量の少なくとも25％、
50％、又は少なくとも90％を占めるような調製物が使用されうる。

【００４７】 機能的に連結した：第一の核酸配列が、第二の核酸配列と機能的な関係におか
れている場合、第一の核酸配列は、第二の核酸配列と機能的に連結している。例
えば、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を与える場合、プ
ロモーターはコーディング配列と機能的に連結している。一般的に、機能的に連
結したDNA配列は、連続しており、2つのタンパク質コード領域を接合する必要が
ある場合には、同一のリーディングフレーム内にある。

【００４８】 組換え：組換え核酸とは、天然には存在しない配列を有するか、又は2つの通
常は分離している配列セグメントを人工的に組み合わせて作成された配列を有す
る核酸である。この人工的な組み合わせは、化学合成、又はより一般的には、単
離された核酸セグメントの人工的操作により、例えば遺伝子組み換え技術により
達成されうる。

【００４９】 cDNA（相補的DNA）：内部に非コーディングセグメント（イントロン）及び転
写を決定する調節配列を欠いたDNA片。cDNAは、細胞から抽出されたメッセンジ
ャーRNAからの逆転写により実験室において合成される。

【００５０】 ORF（オープンリーディングフレーム）：内部に終止コドンを含まないアミノ
酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は、
通常ペプチドへと翻訳可能である。

【００５１】 トランスジェニック植物：本明細書において使用されるように、この用語は、
この型の植物に通常は見出されず、人為的な操作により問題とする植物（又は植
物の原種）へ導入された組換え遺伝子材料を含有する植物をさす。従って、形質
転換により組換えDNAが導入された植物細胞から成長した植物は、トランスジェ
ニック植物であり、導入されたトランスジーンを含有するその植物の子孫（有性
生殖により作製されても、又は無性生殖により作製されても）も全てトランスジ
ェニック植物である。

【００５２】 II. ELF3タンパク質及び核酸の配列 本発明は、ELF3タンパク質、並びにcDNA配列及び遺伝子配列を含むELF3核酸分
子を提供する。原型ELF3配列は、シロイヌナズナ配列であり、本発明は、ELF3タ
ンパク質のレベルが増加、又は減少した、トウモロコシ植物及びコメ植物のよう
なトランスジェニック植物を作製するためのこれらの配列の使用を提供する。

【００５３】 a. シロイヌナズナELF3 シロイヌナズナELF3ゲノム配列は、配列番号：３に示されている。その配列は
、3個のイントロン及び4個のエキソンを含み、696アミノ酸長であるタンパク質
をコードする（配列番号：２は、ELF3タンパク質のアミノ酸配列を示す）。シロ
イヌナズナELF3タンパク質は、既知の公開されているタンパク質と有意な相同性
を有しない。しかし、公開されている一つのシロイヌナズナEST（GenBank # N96
569；Newman ら,1994）は、シロイヌナズナELF3のオープンリーディングフレー
ム（ORF）（配列番号：４）（シロイヌナズナELF3 cDNA（配列番号：１）の1136
〜2501）のヌクレオチド853〜2088に重複している。

【００５４】 ELF3遺伝子に対応するcDNAが配列番号：１に示され、ELF3 ORFが配列番号：４
に示されている。下記のように、シロイヌナズナELF3タンパク質は、ELF3の生物
学的活性を有する。即ち、それは、ELF3遺伝子配列をこれらの植物へ導入し、そ
れによりELF3タンパク質を発現させた場合、elf3変異型植物における非光周期感
受性花成及び伸長した胚軸という欠陥的特徴を補足する。

【００５５】 シロイヌナズナELF3 cDNA及びELF3遺伝子の配列の本明細書における提供によ
り、シロイヌナズナELF3タンパク質をコードする核酸配列を作製するための好ま
しい方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用することができる。例え
ば、シロイヌナズナELF3 cDNA配列のPCR増幅は、植物cDNAライブラリーから直接
的なPCRにより、又は植物細胞から抽出されたRNAを鋳型として使用した逆転写PC
R（RT-PCR）により達成されうる。直接PCR及びRT-PCRの方法及び条件は当技術分
野において既知であり、Innis ら(1990)に記載されている。任意の植物cDNAライ
ブラリーが直接PCRにとって有用であろう。ELF3遺伝子配列は、他のライブラリ
ー、例えばIGFシロイヌナズナBACライブラリー（Mozo ら,1998）から単離されう
る。

【００５６】 PCRプライマーは、増幅されるELF3 cDNA（又は遺伝子）の一部に応じて選択さ
れる。プライマーは、cDNA、オープンリーディングフレーム、完全cDNA分子、又
は完全遺伝子配列の小さなセグメントを増幅するよう選択されうる。異なる長さ
のプライマーに適合させるため、増幅条件の変動が必要となる場合もあり、その
ような考慮は当技術分野において周知であり、Innis ら(1990)、Sambrook ら(19
89)、及びAusubel ら(1992)に記されている。例えば、例にすぎないが、配列番
号：１に示されているシロイヌナズナELF3 cDNA分子（ポリAテールを除く）は、
以下のプライマーの組み合わせを使用して増幅されうる。 cDNAのオープンリーディングフレーム部分（配列番号：４）は、以下のプライマ
ー対を使用して増幅されうる。 これらのプライマーは、例示のためだけのものであり、当業者であれば、これら
の分子の特定の領域を増幅するため、多くの異なるプライマーが、提供されたcD
NA配列及び遺伝子配列から導出されうることを理解するであろう。これらの増幅
法により得られたPCR産物を再シーケンシングすることが推奨される。これは、
増幅配列の確認を容易にし、異なる生態型及び植物集団におけるこの配列の天然
のバリエーションに対する情報も提供するであろう。シロイヌナズナELF3配列に
由来するオリゴヌクレオチドが、そのようなシーケンシング法において使用され
うる。

【００５７】 シロイヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝子の配列に由来するオリゴヌクレオ
チドが、本発明の範囲に包含される。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチ
ドプライマーは、シロイヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝子の配列の少なくと
も15〜20個の連続するヌクレオチドの配列を含む。増幅特異性を増強するため、
これらの配列の少なくとも25個、30個、35個、40個、45個、又は50個の連続する
ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーも使用されうる。

【００５８】 b. 他の植物種におけるELF3遺伝子 ELF3遺伝子のオルソログは、コナミドリムシ（Chlamydomonas）、アメリカ=ト
ガサワラ、トウモロコシ、コメ、ポプラ、タバコ、タネツケバナ（Cardamine）
、及びトマトを含む多数の植物種に存在する（下記実施例４を参照のこと）。シ
ロイヌナズナ由来の原型ELF3タンパク質、並びにこのタンパク質をコードするcD
NA配列及び遺伝子配列の本明細書における提供により、他の植物種に存在するEL
F3タンパク質オルソログをコードするcDNA及び遺伝子のクローニングが可能とな
る。標準的な方法が使用されうる。前記のように、開示されたシロイヌナズナEL
F3タンパク質のオルソログは、ELF3タンパク質の生物学的活性を有し、典型的に
は、NCBI Blast2.0、デフォルトパラメータにセットされたギャップド（gapped
）blastpを使用して、シロイヌナズナELF3のアミノ酸配列との全長整列化で計数
された、少なくとも60％の配列同一性を有する。シロイヌナズナ配列とのさらに
高い類似性を有するタンパク質は、この方法により査定された場合、比較的大き
い同一性の割合、例えば少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少
なくとも90％、又は少なくとも95％の配列同一性を示すであろう。

【００５９】 ELF3タンパク質オルソログをコードする配列をクローニングするため、通常の
ハイブリダイゼーション法及びPCR増幅法の両方が利用されうる。これらの技術
に共通なのは、シロイヌナズナELF3 cDNA又はELF3遺伝子の配列に由来するプロ
ーブ又はプライマーの、標的ヌクレオチド調製物へのハイブリダイゼーションで
ある。この標的は、通常のハイブリダイゼーション法の場合、cDNAライブラリー
又はゲノムライブラリーであってよく、PCR増幅の場合には、cDNAライブラリー
もしくはゲノムライブラリー又はmRNA調製物であってよい。

【００６０】 標準的な方法を使用して、問題とする植物種から調製されたcDNAライブラリー
又はゲノムライブラリーに対して直接PCRを実施するか、又は植物細胞から抽出
されたmRNAを使用してRT-PCRを実施することができる。PCRプライマーは、シロ
イヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝子の少なくとも15個の連続するヌクレオチ
ドを含むであろう。当業者であれば、シロイヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝
子と増幅すべき標的核酸との間の配列の差違が、比較的低い増幅効率を引き起こ
しうることを理解するであろう。この差違を埋め合わせるため、比較的長いPCR
プライマー又は比較的低いアニーリング温度が、増幅サイクルに用いられる。比
較的低いアニーリング温度を使用する場合、増幅特異性を増強するため、ネステ
ィッド（nested）プライマー対を使用した連続的な増幅が必要な場合がある。

【００６１】 通常のハイブリダイゼーション技術の場合、ハイブリダイゼーションプローブ
は、好ましくは、放射性標識のような検出可能標識に接合しており、プローブは
、好ましくは、少なくとも20ヌクレオチド長である。当技術分野において周知で
あるように、ハイブリダイゼーションプローブの長さを増加させることにより、
特異性が増強される傾向がある。シロイヌナズナのcDNA又は遺伝子配列に由来す
る標識されたプローブは、植物のcDNAライブラリー又はゲノムライブラリーとハ
イブリダイズさせることができ、ハイブリダイゼーションシグナルは当技術分野
において既知の手段を使用して検出することができる。次いで、ハイブリダイズ
するコロニー又はプラーク（使用されるライブラリーの型による）を精製し、そ
のコロニー又はプラークに含まれるクローニングされた配列を単離し特徴を決定
する。

【００６２】 又は、シロイヌナズナELF3のオルソログを、発現ライブラリーの免疫学的スク
リーニングにより入手することができる。開示されたシロイヌナズナELF3核酸配
列の本明細書における提供により、異種発現系（例えば、大腸菌(E.coli)）にお
いてタンパク質を発現させ、そこから精製し、シロイヌナズナELF3タンパク質に
特異的な抗体（モノクローナル又はポリクローナル）を作製するために使用する
ことができる。抗体は、本明細書に提示されたシロイヌナズナELF3アミノ酸配列
由来合成ペプチドに対して作製することもできる。抗体を作製する方法は、当技
術分野において周知であり、Harlow および Lane(1988)に記載されている。その
ような抗体は、日常的な方法を使用して、ELF3オルソログをクローニングするこ
とが望まれる植物から作製された発現cDNAライブラリーをスクリーニングするた
めに使用されうる。選択されたcDNAは、シーケンシングにより確認されうる。

【００６３】 c. ELF3配列異型 シロイヌナズナのELF3タンパク質、並びにELF3 cDNA及びELF3遺伝子の配列の
本明細書における提供により、これらの配列の異型の作出が可能である。

【００６４】 異型ELF3タンパク質には、開示されたシロイヌナズナELF3配列とアミノ酸配列
が異なるが、ELF3タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質が含まれる。
そのようなタンパク質は、例えば部位特異的突然変異導入又はPCRを含む標準的
な手法を使用して、シロイヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝子のヌクレオチド
配列を操作することにより作製されうる。最も単純な修飾は、一つ又は複数のア
ミノ酸の、類似の生化学的特性を有するアミノ酸との置換を含む。これらのいわ
ゆる保存的置換は、得られるタンパク質の活性に対して最小限の影響を与えると
考えられる。表１は、保存的置換と見なされる、タンパク質内の最初のアミノ酸
と置換されうるアミノ酸を示す。

【００６５】

【表１】

【００６６】 タンパク質の機能又はその他の特徴におけるより実質的な変化は、表１に挙げ
られたものよりも保存性が低いアミノ酸置換を選択することにより得られる。そ
のような変化には、置換近傍のポリペプチド骨格構造（例えば、シート状もしく
はヘリックス状のコンフォメーション）、標的部位における分子の電荷もしくは
疎水性、又は特異的な側鎖の大きさ、の維持に対する効果が、より有意に異なる
残基の変化が含まれる。以下の置換は、一般的に、タンパク質の特性を最も大き
く変化させると予想される；（a）親水性残基（例えばセリル又はトレオニル）
を、疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル
、又はアラニル）と（又は疎水性残基により）置換する；(b)システイン又はプ
ロリンを、任意の他の残基と（又は任意の他の残基により）置換する。（c）正
の電荷を有する側鎖を有する残基（例えば、リシル、アルギニル、又はヒスチジ
ル）を、負の電荷を有する残基（例えば、グルタミル又はアスパルチル）と（又
は負の電荷を有する残基により）置換する；又は（d）大きい側鎖を有する残基
（例えば、フェニルアラニン）を、側鎖を欠く残基（例えば、グリシン）と（又
は側鎖を欠く残基により）置換する。誘導体タンパク質をコードする遺伝子が、
elf3変異体における非光周期感受性花成及び伸長した胚軸という欠陥を補う能力
を分析することにより、ELF3タンパク質誘導体における、これらのアミノ酸の置
換、欠失、又は付加の効果を査定することができる。又は、下記実施例２に記さ
れたような概日影響を受けるCAB-luc転写及び／又は葉移動を研究することによ
っても、効果を調査することができる。

【００６７】 ELF3 cDNA又はELF3遺伝子の異型は、標準的なDNA突然変異誘発技術、例えばM1
3プライマー突然変異誘発により作製されうる。これらの技術の詳細は、Sambroo
k ら(1989)の第15章に提供されている。そのような技術の使用により、開示され
たシロイヌナズナのELF3 cDNA又はELF3遺伝子の配列とわずかに異なるが、依然
としてELF3タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする異型を作
出することができる。本明細書に特別に開示されたDNA分子及びヌクレオチド配
列の誘導体であり、欠失、付加、又は置換により開示されたものと異なるが、依
然としてELF3タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードするDNA分
子及びヌクレオチド配列が、本発明に包含される。最も単純な形態では、そのよ
うな異型は、分子を導入する特定の生物のコドン使用バイアスに適合させるため
、コード領域の改変により、開示配列と異なっていてもよい。

【００６８】 又は、ヌクレオチド配列は実質的に改変されているが、開示されたシロイヌナ
ズナELF3タンパク質配列と実質的に類似したアミノ酸配列を有するタンパク質を
コードするよう、コード配列を改変させるため、遺伝暗号の縮重を利用すること
により、コード領域を改変することができる。例えば、シロイヌナズナELF3タン
パク質の23番目のアミノ酸残基はアラニンである。このアラニン残基は、ヌクレ
オチドコドントリプレットのGCAによりコードされる。遺伝暗号の縮重のため、
他の3つのヌクレオチドコドントリプレットGCT、GCC、及びGCGもアラニンをコー
ドする。従って、シロイヌナズナELF3 ORFのヌクレオチド配列はこの位置を、ア
ミノ酸組成又はコードされたタンパク質のその他の特徴に影響を与えることなく
、これらの3つの代替的コドンのいずれかへ変化させることができる。遺伝暗号
の縮重に基づき、前記のような標準的なDNA突然変異導入技術又はDNA配列の合成
により、本明細書に開示されたcDNA配列及び遺伝子配列から、異型DNA分子を導
出することができる。従って、本発明は、ELF3タンパク質をコードするが、遺伝
暗号の縮重のため開示された核酸配列と異なっている核酸配列も包含する。

【００６９】 配列番号：２に示された原型ELF3タンパク質との配列同一性に関して、ELF3タ
ンパク質の異型を定義することもできる。前記のように、ELF3タンパク質は、EL
F3の生物学的活性を有し、かつシロイヌナズナELF3タンパク質と少なくとも60％
の配列同一性を有する。そのようなタンパク質をコードする核酸配列は、単にEL
F3タンパク質のアミノ酸配列に遺伝暗号を適用することにより容易に決定され、
そのような核酸分子は、配列の一部に相当するオリゴヌクレオチドを構築するこ
とにより容易に作製される。

【００７０】 開示されたシロイヌナズナのELF3 cDNA及びELF3遺伝子の配列に由来する核酸
分子には、開示された原型ELF3核酸分子又はそれらの断片と、高ストリンジェン
シー条件下でハイブリダイズする分子が含まれる。高ストリンジェンシー条件と
は、55℃、6×SSC、5×デンハルト溶液、0.1％SDS、及び100μgの切断された（s
heared）サケ精子DNA中でのハイブリダイゼーションを行い、続いて55℃、2×SS
C、0.1％SDS、次に1×SSC、0.1％SDS、最後に0.2×SSC、0.1％SDSでの連続的な1
5〜30分間の洗浄という条件である。

【００７１】 低ストリンジェンシー条件（関連性の低いホモログを検出するための）は、前
記と同様に、ただし50℃（ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件の両方）で
実施される。しかし、検出されたシグナルの強度により、最初の2×SSC、0.1％S
DSでの洗浄の後、洗浄工程を停止させてもよい。

【００７２】 下記のように、改変された光周性又は概日リズムの表現型を有する植物を作製
するため、シロイヌナズナのELF3遺伝子又は cDNA、及び他の植物由来のこれら
の配列のオルソログを、形質転換ベクターへ取り込ませ、植物へ導入することが
できる。

【００７３】 III. ELF3の植物への導入 一旦特定の植物の特徴の決定に関与するタンパク質をコードする核酸分子（例
えば、cDNA又は遺伝子）が単離された後は、標準的な技術を使用して、特定の植
物の特徴を修飾するためトランスジェニック植物においてcDNAを発現させること
ができる。基本的な手法は、例えば、植物細胞においてcDNAを発現させる調節配
列（例えば、プロモーター）とcDNAが機能的に連結するよう、cDNAを形質転換ベ
クターへクローニングすることである。次いで、多数の技術のうちの一つ（例え
ば、エレクトロポレーション）により、形質転換ベクターを、植物細胞へ導入し
、導入されたcDNAを含有する子孫植物を選抜する。好ましくは、形質転換ベクタ
ーの全部又は一部が、植物細胞のゲノムへ安定的に組み込まれる。植物細胞へ組
み込まれ、導入されたcDNA及び発現を調節するための関連配列（導入された「ト
ランスジーン」）を含有する形質転換ベクターの部分は、組換え発現カセットと
も呼ばれる。

【００７４】 導入トランスジーンを含有する子孫植物の選抜は、改変された表現型の検出に
基づく。そのような表現型は、形質転換ベクターへクローニングされたcDNAから
直接生じるものであってもよいし、又は形質転換ベクターへ取り込まれた優性選
択可能マーカー遺伝子の包含の結果として、化学的薬剤（抗生物質のような）に
対する増強された耐性として出現するものであってもよい。

【００７５】 クローニングされたcDNA配列を用いた形質転換による植物の特徴を修飾する成
功例は、科学技術文献に豊富に存在する。この技術領域における知識の例示に役
立つ選択された例には、下記のものが含まれる； 米国特許第5,451,514号（アンチセンスRNA及び共抑制を使用したリグニン合成
の修飾）； 米国特許第5,750,385号（センス及びアンチセンスの形質転換構築物を使用し
た、植物の光、種子、及び果実に特異的な遺伝子発現の修飾）； 米国特許第5,583,021号（プラスセンス非翻訳可能RNAの発現によるウイルス耐
性の修飾）； 米国特許第5,589,615号（修飾された2S貯蔵アルブミンの発現を介し栄養価の
増加したトランスジェニック植物の作製）； 米国特許第5,268,526号（トランスジェニック植物におけるフィトクロム発現
の修飾）； 米国特許第5,741,684号（アンチセンス発現の使用による、除草剤又は抗生物
質耐性植物の作製）； 米国特許第5,773,692号（クロロフィルa/b結合タンパク質対応アンチセンスメ
ッセージを用いた植物形質転換による、クロロフィルレベルの修飾）； 国際特許公開第96/13582号（シロイヌナズナFAEI遺伝子と共に過剰発現、共抑
制、及びアンチセンスRNAを使用した種子VLCFA組成物の修飾）

【００７６】 これらの例には、形質転換ベクターの選択、形質転換技術、及び導入核酸が過剰
発現するように設計された構築物の構築、並びにセンス抑制及びアンチセンス発
現のための技術の記載が含まれる。前記、及びシロイヌナズナのELF3 cDNA及びE
LF3遺伝子の配列の本明細書における提供を参照することにより、当業者であれ
ば、改変されたELF3活性を有する植物を作製するため、これらの核酸分子、又は
これらの分子のオルソログ、ホモログ、もしくは誘導体を植物へ導入することが
可能であろう。植物におけるELF3発現の操作は、改変された概日時計及び／又は
光周性の機能を与えるために有用であろう。植物におけるELF3タンパク質レベル
の改変は、例えば植物の発達パターン又は光周反応（例えば、花発達の時期）を
改変させるため、概日時計をリセット又はカスタマイズするために使用されうる
。

【００７７】 a. 植物の型 概日サイクルの存在は、普遍的であると考えられ、これまでに調査された全て
の植物のみならず、ショウジョウバエ（Hall,1990）を含む昆虫及びアカパンカ
ビ（Dunlap,1993）のような微生物にも存在する。分子レベルではELF3ホモログ
が多様な植物種に見出されている（下記実施例４を参照のこと）。従って、単子
葉植物及び双子葉植物を含む広範囲の高等植物に改変された概日時計及び／又は
光周性の機能を付与するために、ELF3タンパク質の発現を修飾することができる
。それらには、これらに限定されないが、シロイヌナズナ、ワタ、タバコ、トウ
モロコシ、コムギ、コメ、オオムギ、ダイズ、マメ一般、ナタネ／キャノーラ、
アルファルファ、アマ、ヒマワリ、ベニバナ、アブラナ属植物、ワタ、アマ、ラ
ッカセイ、クローバー；レタス、トマト、ウリ科植物、キャッサバ、ジャガイモ
、ニンジン、ハツカダイコン、エンドウ、ヒラマメ、キャベツ、カリフラワー、
ブロッコリー、芽キャベツ、コショウのような野菜；カンキツ類、リンゴ、ナシ
、モモ、アンズ、クルミのような木に実る果実；及びカーネーション及びバラの
ような花が含まれる。

【００７８】 b. ベクターの構築、プロモーターの選択 植物細胞の安定的な形質転換又はトランスジェニック植物の樹立に適当な組換
えベクターは、Pouwels ら,(1987)、Weissbach および Weissbach,(1989)、及び
Gelvin ら,(1990)に記載されたものを含め、多数記載されている。典型的には、
植物形質転換ベクターは、5'及び3'調節配列の転写調節下において、一つ又は複
数のクローニングされた植物遺伝子（又はcDNA）、並びに少なくとも一つの優性
選択可能マーカーを含む。そのような植物形質転換ベクターは、典型的には、プ
ロモーター調節領域（例えば、誘導可能もしくは構成性の、環境もしくは発達に
より制御される、又は細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転
写開始部位、リボソーム結合部位、RNAプロセシングシグナル、転写終結部位、
及び／又はポリアデニル化シグナルも含有する。

【００７９】 ELF3核酸分子の発現に有用な可能性のある構成的植物プロモーターの例には、
大部分の植物組織において構成的な高レベルの発現を与えるカリフラワーモザイ
クウイルス（CaMV）35Sプロモーター（例えば、Odel ら,1985; Dekeyser ら,199
0; Terada および Shimamoto,1990; Benfey および Chua,1990を参照のこと）、
ノパリンシンターゼプロモーター（An ら,1988）、及びオクトピンシンターゼプ
ロモーター（Fromm ら,1989）が含まれる。

【００８０】 多様な植物遺伝子プロモーターが、環境的、ホルモン的、化学的、及び／又は
発達的シグナルに反応して制御されており、植物細胞におけるcDNAの発現に使用
されうる。そのようなプロモーターには、例えば、（a）熱（Callis ら,1988; A
inley ら,1993; Gilmartin ら,1992）、（b）光（例えば、エンドウrbcS-3Aプロ
モーター（Kuhlemeier ら,1989）及びトウモロコシrbcSプロモーター（Schaffne
r および Sheen,1991））、（c）アブシジン酸のようなホルモン（Marcotte ら,
1989）、（d）創傷（例えば、wunI（Siebertz ら,1989））、及び（e）ジャスミ
ン酸メチル又はサリチル酸のような化学物質（Gatz ら,1997も参照のこと）によ
り調節されるものが含まれる。

【００８１】 又は、組織特異的（例えば、根、葉、花、又は種子）なプロモーター（Carpen
ter ら,1992; Denis ら,1993; Opperman ら,1993; Stockhause ら,1997; Roshal
ら,1987; Schernthaner ら,1988;及びBustos ら,1989）を、特異的な器官にお
けるタンパク質発現を得るため、コード配列と融合させてもよい。

【００８２】 概日サイクル反応性のプロモーターも、植物遺伝子発現ベクターにおいて使用
されうる。そのようなプロモーターには、本明細書に記載のような天然ELF3プロ
モーター及びクロロフィルa/b結合タンパク質のプロモーター（Millar ら,1992
）が含まれる。

【００８３】 植物形質転換ベクターは、トランスジーン内のORF配列の上流又は下流に位置
しうるRNAプロセシングシグナル、例えばイントロンも含みうる。さらに、発現
ベクターは、植物遺伝子の3'非翻訳領域由来の調節配列、例えばmRNAのmRNA安定
性を増加させるための3'ターミネーター領域、例えばジャガイモのP1-IIターミ
ネーター領域、又はアグロバクテリウム（Agrobacterium）のオクトピンシンタ
ーゼもしくはノパリンシンターゼの3'ターミネーター領域をさらに含みうる。EL
F3遺伝子の3'領域も、使用されうる。

【００８４】 最後に、前述のように、植物形質転換ベクターは、形質転換体の容易な選択を
可能にする優性選択可能マーカー遺伝子を含みうる。そのような遺伝子には、抗
生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン
、G418、ストレプトマイシン、又はスペクチノマイシンに対する耐性）及び除草
剤耐性遺伝子（例えば、ホスフィノトリシン（phosphinothricin）アセチルトラ
ンスフェラーゼ）をコードするものが含まれる。

【００８５】 c. ベクター内のELF3配列の配置 形質転換ベクター内のELF3配列の特定の配置は、所望の配列の発現の型に応じ
て選択される。

【００８６】 植物において増強されたELF3タンパク質活性が望まれる場合、ELF3 ORFを、Ca
MV 35Sプロモーターのような構成的高レベルプロモーターと機能的に連結させる
ことができる。前述のように、ELF3合成の修飾は、ELF3 cDNA又はELF3遺伝子の
異型を含有する形質転換ベクターを植物に導入することによっても達成されうる
。

【００８７】 対照的に、ELF3 cDNA又はELF3遺伝子の配列に基づくアンチセンス構築物を植
物へ導入することにより、トランスジェニック植物におけるELF3活性の減少を得
ることができる。アンチセンス発現の場合には、ELF3 cDNA又はELF3遺伝子は、
形質転換ベクター内でプロモーター配列と逆の方向に配置される。導入配列は、
全長ELF3 cDNA又はELF3遺伝子である必要はなく、形質転換される植物型におい
て天然に見出されるELF3 cDNA又はELF3遺伝子と正確に相同である必要はない。
しかし、一般的に、導入配列の長さが比較的短い場合には、効率的なアンチセン
ス抑制のため、天然ELF3配列と比較的高度な相同性が必要となろう。ベクター内
に導入されたアンチセンス配列は、一般的に、少なくとも30ヌクレオチド長であ
り、典型的には、アンチセンス配列の長さの増加に伴いアンチセンス抑制の改善
が観察されるであろう。好ましくは、ベクター内のアンチセンス配列の長さは、
100ヌクレオチド超であろう。記載されたようなアンチセンス構築物の転写によ
り、植物細胞において内因性ELF3遺伝子から転写されるmRNA分子の逆相補配列で
あるRNA分子が産生される。アンチセンスRNA分子が遺伝子発現を妨害するメカニ
ズムは正確には解明されていないが、アンチセンスRNA分子は、内因性mRNA分子
と結合し、それにより内因性mRNAの翻訳を阻害すると考えられている。アンチセ
ンス構築物の作製及び使用は、例えば米国特許第5,773,692号（植物クロロフィ
ル含量を減少させるため、クロロフィルa/b結合タンパク質に対するアンチセン
スRNAをコードする構築物の使用）及び第5,741,684号（花粉の発達又は機能に関
与する遺伝子に対するアンチセンスRNAの使用による、様々な植物における花粉
の稔性の制御）に開示されている。

【００８８】 内因性ELF3遺伝子発現の抑制は、リボザイムを使用しても達成されうる。リボ
ザイムとは、高度に特異的なエンドリボヌクレアーゼ活性を有する合成RNA分子
である。リボザイムの作製及び使用は、Cechの米国特許第4,987,071号及びHasel
hoffの米国特許第5,543,508号に開示されている。アンチセンスRNA内にリボザイ
ム配列を含ませることは、アンチセンスRNAに結合する内因性mRNA分子が分解さ
れ、内因性遺伝子発現が、増強されたアンチセンス阻害をもたらすよう、アンチ
センスRNAへRNA分解活性を与えるために使用されうる。

【００８９】 ELF3 cDNA又はELF3遺伝子（又はそれらの異型）が過剰発現されている構築物
も、Jorgensenの米国特許第5,231,021号に記載のようにして、内因性ELF3遺伝子
の共抑制を得るために使用されうる。そのような共抑制（センス抑制とも呼ばれ
る）は、完全なELF3 cDNA又はELF3遺伝子が植物細胞へ導入されることを必要と
せず、また導入配列が内因性ELF3遺伝子と正確に同一であることも必要としない
。しかし、アンチセンス抑制の場合と同様に、抑制効率は、（1）導入配列の長
さが長くなるほど、そして（2）導入配列と内因性ELF3遺伝子との配列類似性が
増加するほど、増強されると考えられる。

【００９０】 ELF3 mRNA非翻訳可能型を発現する構築物も、内因性ELF3活性発現抑制に使用
されうる。そのような構築物の作製方法は、Doughertyらの米国特許第5,583,021
号に記載されている。好ましくは、そのような構築物は、早熟終止コドンをELF3
ORFへ導入することにより作成される。

【００９１】 最後に、開示された配列のドミナントネガティブ変異型が、内因性ELF3活性を
遮断するために使用されうる。そのような変異体は、ELF3と同一の分子と相互作
用するが、ELF3活性を有しないELF3タンパク質の変異型の作製を必要とする。

【００９２】 d. 形質転換及び再生の技術 単子葉及び双子葉植物細胞の形質転換及び再生は、現在では日常的なものとな
っており、最も適当な形質転換技術は実務者により決定されよう。方法の選択は
、形質転換される植物の型により変わり、当業者は、特定の方法のある植物型へ
の妥当性を認識しているであろう。そのような方法は、これらに限定されないが
、植物プロトプラストのエレクトロポレーション、リポソーム媒介形質転換、ポ
リエチレングリコール（PEG）媒介形質転換、ウイルスを使用した形質転換、植
物細胞のマイクロインジェクション、植物細胞の微小発射体衝撃（micro-projec
tile bombardment）、真空浸透、及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（
Agrobacterium tumefasiens）(AT）媒介形質転換が含まれる。植物の形質転換及
び再生のための典型的な手法は、このセクションの最初に挙げられた特許文書に
記載されている。

【００９３】 e. 形質転換された植物の選抜 形質転換ベクターを有する植物の形質転換及び再生に続き、通常、形質転換ベ
クターへ取り込まれた優性選択可能マーカーを使用して、形質転換植物を選抜す
る。典型的には、そのようなマーカーにより、形質転換植物の実生に抗生物質耐
性が与えられ、適当な濃度の抗生物質へ実生を曝すことにより形質転換体の選抜
を達成することができる。

【００９４】 形質転換植物を選抜し、成熟するまで生育させた後、形質転換植物の概日サイ
クル又は光周性が、導入トランスジーンの結果として改変されているか否かを決
定するため、本明細書記載の方法を使用してそれらをアッセイすることができる
。

【００９５】 IV. 異種発現系における組換えELF3タンパク質の産生 多くの異なる発現系が、クローニングされた核酸分子を発現させるため利用可
能である。実験室において日常的に使用されている原核生物及び真核生物の発現
系の例は、Sambrook ら（1989）の第16〜17章に記載されている。そのような系
は、タンパク質精製を容易にするため、高レベルでELF3を発現させるために使用
されうる。精製ELF3タンパク質は、様々な目的に使用されうる。例えば、精製組
換え酵素は、抗ELF3抗体作製の免疫原として使用されうる。そのような抗体は、
研究用試薬（植物の概日時計及び光周性メカニズムの研究など）としても有用で
あるし、農業又はその他の使用のため開発中の植物におけるタンパク質発現レベ
ルを決定するため診断的にも有用である。従って、抗体は、非トランスジェニッ
ク植物変種、及びELF3タンパク質を過剰発現又は過少発現するよう設計されたト
ランスジェニック変種の両方において、ELF3タンパク質レベルの定量に使用され
うる。そのような定量は、例えばHarlow & Lane(1988)に記載されたELISA及びイ
ンサイチュー免疫蛍光検査法等のような、標準的な免疫測定技術を使用して実施
されうる。

【００９６】 例えば、例にすぎないが、ELF3タンパク質の高レベル発現は、pYES2酵母発現
ベクター（INVITROGEN、Carlsbad、CA）を使用した、酵母細胞におけるELF3 cDN
Aのクローニング及び発現により達成されうる。又は、組換えELF3タンパク質が
酵母細胞から増殖培地へ分泌されるように遺伝子構築物を作製することもできる
。この手法は、ELF3タンパク質の精製が必要である場合、その精製を容易にする
であろう。酵母細胞からの組換えタンパク質の分泌は、酵母シグナル配列をELF3
コード領域と隣接させることにより達成されうる。酵母インベルターゼのシグナ
ル配列を含む、多数の酵母シグナル配列が特徴決定されている。この配列は、ヒ
トインターフェロン（Chang ら,1986）、ヒトラクトフェリン（Liang および Ri
chardson,1993）、及びプロキモシン（Smith ら,1985）のようなタンパク質を含
む異種タンパク質を、酵母細胞から分泌させるために使用され成功している。

【００９７】 又は、酵素は、Sambrook ら,（1989）に記載のように、大腸菌のような原核生
物発現系において高レベルに発現されうる。市販されている原核生物発現系には
、pBAD発現系及びチオフュージョン（ThioFusion）発現系（INVITROGEN、Carlsb
ad、CA）が含まれる。

【００９８】 V. ELF3プロモーター ELF3遺伝子の5'調節領域も、本明細書において提供されている（配列番号：５
）。この調節領域は、それが機能的に連結したオープンリーディングフレームに
ELF3様概日リズム型発現を与える。約4kbのELF3 5'調節領域が配列番号：５に提
供されている。この完全な約4kbの制御配列も使用されうるが、当業者であれば
、この完全配列よりも短い配列が、ELF3様概日リズム発現を与えるのに十分であ
る場合もあることを理解するであろう。例えば、配列番号：５のヌクレオチド1
〜4071又はそれよりも短い配列、例えばヌクレオチド500〜4071、1000〜4071、1
500〜4071、2000〜4071、2500〜4071、3000〜4071、3500〜4071、及び4000〜407
1に相当する配列が使用されうる。この5'調節領域内の50又は100ヌクレオチドの
ような短い配列も、使用されうる。開示された配列の特定のサブ領域が、特定の
系において効率的なELF3様概日リズム発現を与えるよう機能するか否かの決定（
構築物が導入される植物種、必要な発現レベル等を考慮する）は、既知の方法を
使用して実施されよう。これらには、例えば、プロモーターのサブ領域をマーカ
ー遺伝子（例えば、GUS又はルシフェラーゼ）と機能的に連結させること、その
ような構築物を植物へ導入すること、及びマーカー遺伝子の発現レベルを決定す
ることが含まれる。

【００９９】 従って、本発明は、オープンリーディングフレームのような核酸配列と機能的
に連結したこのプロモーター配列を含む核酸分子の、標準的な分子生物学的技術
による作製を容易にする。適当なオープンリーディングフレームには、ELF3様概
日リズム発現が望まれる任意のタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームが含まれる。

【０１００】 実施例 実施例１：シロイヌナズナELF3のクローニング マップ・ベースド・ポジショナル・クローニングにより、ELF3遺伝子を単離し
た。ランダム断片長多型(random fargment length polymorphism)（RFLP）分析
により、ELF3遺伝子と強く連鎖した分子マーカーを同定し、遺伝子座の高分解能
遺伝子地図を構築した。単一の細菌人工染色体（BAC）に含まれる30kbへ、ELF3
遺伝子を含有する領域を限定した。このBACをシーケンシングし、BAC内の配列と
相同性を有するcDNAを、多様なcDNAライブラリーから単離した。BAC内に含まれ
る10kbのサブクローニングされた断片に対する相補実験により、ELF3配列の位置
をさらに限定した。サブクローニングされた断片内の適当な遺伝子の同定を、様
々なシロイヌナズナelf3変異体由来のelf3対立遺伝子の単離及びシーケンシング
により確認した。

【０１０１】 単離されたELF3遺伝子（配列番号：３）は、他のDNA配列又はタンパク質配列
と有意な配列類似性を有していなかった。しかし、公開されているEST（GenBank
# N96569；Newman ら,1994）は、対応するcDNA（配列番号：１）のヌクレオチ
ド1235〜2501に重複している。ELF3は、4個のエキソンを有し、シロイヌナズナ
の実生及び成熟葉において約2.4kbのmRNAとして転写される。ELF3 ORF（配列番
号：４）によりコードされる推定タンパク質（配列番号：２）は、695アミノ酸
長であり、およそ80kDaという予測分子量を有する。

【０１０２】 実施例２：ELF3表現型の分析 シロイヌナズナにおける概日リズム反応を測定するための感受性アッセイが、
開発されている（Millar および Kay,1991; Millar ら,1992）。一つのアッセイ
系は、クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子CAB2の転写が、24時間周期で循環
するという観察に基づいている。CAB2プロモーターからの転写は、本質的に夜明
け前に増加し、午前中の遅い時間にピークに達し、その日の遅くに低レベルに減
少する（Millar および Kay,1991）。CAB mRNAのサイクルは、一定の光条件下で
継続する。インビボの発現を追跡するため、CAB2プロモーターをホタルルシフェ
ラーゼ（luc）をコードする遺伝子と融合し、この融合体を野生型シロイヌナズ
ナに形質転換した（Millar ら,1992）。CAB2-luc融合構築物からの転写発現が、
低光（low-light）ビデオカメラ及び光子計数画像処理機を使用した、単一のト
ランスジェニック実生のイメージングにより測定され、CAB2-luc融合体のイメー
ジングからの結果は、内因性CAB2遺伝子の転写発現と匹敵している。このシステ
ムを用いて、30分毎に100個超の各実生のイメージングが可能であり、従って、1
週間未満で数千のデータポイントを収集することが可能である。この極めて強力
なシステムは、いくつかの既知の光形態形成シロイヌナズナ変異体を特徴決定す
るため（Millar ら,1995a）、及びシロイヌナズナの短周期変異体を単離するた
め（Millar ら,1995b）、最近使用された。このシステムを使用して調査されたe
lf3変異体は、概日調節を受けるCAB2転写に欠陥を有する（Hicks ら,1996）。

【０１０３】 概日制御を受ける第二の過程、葉の運動を測定するためにも、自動ビデオイメ
ージングシステムが使用されうる（Millar および Kay,1991）。植物の葉は、概
日的に、日中は下を向き（開）、夜間は上を向く（閉）。シロイヌナズナの実生
は、一定の光においてこの概日的な葉の運動を示し、これは、比較的安価なビデ
オ及びコンピュータのシステムを使用してアッセイ及び定量されうる（Millar
および Kay,1991）。葉の運動の分析は、概日リズム変異体の可能性を評価する
ための、独立した概日調節を受ける過程を提供する（例えば、シロイヌナズナに
おけるlate elongated hypocotyl（lhy）変異体における概日サイクル破壊を分
析するため葉の運動を使用したSchaffer ら1998を参照のこと）。elf3変異体も
、概日調節を受ける葉の運動に欠陥を有する。

【０１０４】 これらのアッセイは、（例えば、ELF3のアンチセンス構築物又はセンス構築物
の植物への導入による）ELF3タンパク質発現レベルの修飾が、植物の表現型に対
して有する効果を査定するために使用されうる。

【０１０５】 実施例３：ELF3配列の植物への導入 プラスミド構築 シロイヌナズナELF3 cDNA配列（配列番号：１）及び全長ゲノム配列（配列番
号：３）を、過剰発現ベクター及びアンチセンスベクターの構築に使用した。こ
れらの配列を、センス方向及びアンチセンス方向の両方で、CaMV 35S（構成的）
プロモーターと機能的に連結させ、標準的な分子生物学的技術を使用してpSJL4
（Jone ら1992）へクローニングした。

【０１０６】 前記ベクターから過剰発現及びアンチセンス発現カセットを取り出し、アグロ
バクテリウム媒介植物形質転換のためpMON505へ挿入した。

【０１０７】 植物の形質転換 野生型及びelf3変異型のシロイヌナズナ植物（コロンビア生態型）を、標準的
なインプランタ（in planta）アグロバクテリウム媒介技術（Chang ら1994; Kat
avic ら1994）を使用して形質転換した。形質転換種子を、カナマイシン上で選
抜し、KanＲ実生を土壌に移し、さらなる分析のため生育させた。

【０１０８】 トランスジーンとしてELF3ゲノム遺伝子配列を含むelf3変異型植物におけるEL
F3タンパク質の過剰発現により、いくつかの形質転換植物において、elf3変異体
の表現型が完全に補足された。いくつかの例においては、野生型植物におけるcD
NA型トランスジーンからのELF3タンパク質の過剰発現により、elf3変異体様植物
又は中間の表現型を有する植物が産生された。これは、おそらく共抑制の結果で
ある。野生型植物における全長ELF3 cDNAのアンチセンス発現により、elf3変異
体様表現型を有するいくつかの形質転換体が生じた。

【０１０９】 実施例４：ELF3オルソログ 前述のように、ELF3のオルソログは、トウモロコシ、トマト、及びタバコを含
む多数の植物種に存在する。これらの配列の存在は、サザンブロッティングのよ
うなハイブリダイゼーション技術により証明されうる。完全なELF3 cDNA配列（
配列番号：１）に基づくプローブを使用して、ハイブリダイゼーションを実施し
た。このプローブを、シロイヌナズナ、コナミドリムシ、アメリカ=トガサワラ
、トウモロコシ、コメ、ポプラ、タバコ、及びトマト由来のゲノムDNAとハイブ
リダイズさせた。55℃において、6×SSC、5×デンハルト溶液、0.1％SDS、及び1
00μgの切断されたサケ精子DNA中で高ストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ンを実施し、続いて55℃における、2×SSC、0.1％SDS、次に1×SSC、0.1％SDS、
最後に0.2×SSC、0.1％SDSでの連続的な15〜30分間の洗浄を行った。シロイヌナ
ズナ、コメ、及びタバコのゲノムDNA調製物において、サザンブロット上に単一
の明確なハイブリダイゼーションバンドが観察された。

【０１１０】 関連性の低いELF3ホモログを検出するため、比較的低ストリンジェンシーのハ
イブリダイゼーション条件を使用した。そのようなハイブリダイゼーションは、
50℃において24時間、前記のハイブリダイゼーション溶液中で実施され、続いて
50℃において3時間、2×SSC、0.1％SDSで、洗浄溶液を5回連続し交換して洗浄を
行った。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下での全長cDNAプロ
ーブのハイブリダイゼーションにより、シロイヌナズナ、コナミドリムシ、アメ
リカ=トガサワラ、トウモロコシ、コメ、ポプラ、タバコ、及びトマト及びその
他の植物種において、ELF3ホモログが検出された（サザン上の一つ又は複数のバ
ンドにより示された）。

【０１１１】 植物種においてELF3ハイブリダイゼーションバンドを検出後、ELF3プローブを
用いた植物由来cDNAライブラリー又はゲノムライブラリーのスクリーニングのよ
うな標準的な技術を使用することができる。又は、前記のようにして作製された
抗ELF3抗体のようなELF3タンパク質特異的結合剤を使用して、問題とする植物由
来の発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、ELF3ホモログが単離さ
れうる。改変された概日リズム及び／又は光周性の表現型を生じるため、前記の
方法を使用して、そのようなホモログを植物に導入することができる。

【０１１２】 オルソログ核酸配列を増幅するため、シロイヌナズナELF3配列と相補的なプラ
イマーを使用することも可能である。例えば、、ELF3オルソログが以下のPCR増
幅プライマーを使用してタネツケバナゲノムDNA調製物から単離されている。

【０１１３】 前記実施例は、例示のためにのみ提供されている。当業者であれば、ELF3遺伝
子、対応するタンパク質、及びプロモーター領域を作成し使用するために、前記
の生物学的分子及び方法に対する多数のバリエーションを使用することができる
ことを理解するであろう。そのような主題は全て、下記の特許請求の範囲の範囲
及び本旨に含まれることを、本発明者らは主張する。

【０１１４】

【０１１５】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒックス カレン エー． アメリカ合衆国 オハイオ州 ギャンビエ ピー．オー．ボックス 485 (72)発明者 スペンス ミッチェル ゼット． アメリカ合衆国 ワシントン州 オリンピ ア グラベリー ビーチ ロード エヌ． ダブリュ． 5147 (72)発明者 アルバートソン ティナ エム． アメリカ合衆国 オレゴン州 テュアラテ ィン エス．ダブリュ． フューラー ド ライブ 21820 (72)発明者 フォス ヘンリエット アメリカ合衆国 オレゴン州 ユージーン (72)発明者 プリッジ マイケル アメリカ合衆国 ミシガン州 セント ポ ール サミット アベニュー 271 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD21 4B024 AA08 BA79 CA01 CA09 DA01 FA02 GA11 GA17 4B065 AA88X AA89Y AB01 AC09 BA02 CA24 CA53 4H045 AA10 AA30 BA10 CA30 EA05 FA74

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ELF3タンパク質の生物学的活性を有し、 （ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列； （ｂ）一つ又は複数の保存的アミノ酸置換により配列番号：２と異なるアミノ酸
   配列；及び （ｃ）（ａ）又は（ｂ）に記載された配列と少なくとも６０％の配列同一性を有
   するアミノ酸配列 からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、精製されたタンパク質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
3. 【請求項３】 （ａ）配列番号：１； （ｂ）配列番号：３；及び （ｃ）配列番号：４ からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子である、請求項２に
   記載の核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の核酸分子と機能的に連結したプロモーター
   配列を含む組換え核酸分子。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換え核酸分子で形質転換された細胞。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の組換え核酸分子を含むトランスジェニック
   植物。
7. 【請求項７】 シロイヌナズナ（Arabidopsis）、コショウ、トマト、タバ
   コ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ
   、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクル
   ミからなる群より選択される、請求項６に記載のトランスジェニック植物。
8. 【請求項８】 （ａ）配列番号：１に示された配列のヌクレオチド１〜１１
   ３５又は２５０２〜２５１８の少なくとも１５個の連続するヌクレオチド； （ｂ）配列番号：３に示された配列のヌクレオチド１〜１６３９の少なくとも１
   ５個の連続するヌクレオチド；及び （ｃ）配列番号：４に示された配列のヌクレオチド１〜８５２の少なくとも１５
   個の連続するヌクレオチド からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 （ａ）配列番号：１に示された配列の少なくとも２０個の連
   続するヌクレオチド； （ｂ）配列番号：３に示された配列の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド
   ；及び （ｃ）配列番号：４に示された配列の少なくとも２０個の連続するヌクレオチド
   からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸分子。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の核酸配列と機能的に連結したプロモータ
    ーを含む組換え核酸分子。
11. 【請求項１１】 核酸配列がプロモーター配列に対してアンチセンス方向で
    存在する、請求項１０に記載の組換え核酸分子。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の組換え核酸分子で形質転換された細胞
    。
13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の組換え核酸分子を含むトランスジェニ
    ック植物。
14. 【請求項１４】 シロイヌナズナ、コショウ、トマト、タバコ、ブロッコリ
    ー、カリフラワー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ、トウモロコシ
    、コムギ、オオムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクルミからなる群よ
    り選択される、請求項１３に記載のトランスジェニック植物。
15. 【請求項１５】 （ａ）55℃、0.2×SSC及び0.1％SDS、１時間という洗浄条
    件下で配列番号：１に示された配列を含む核酸プローブとハイブリダイズし；か
    つ （ｂ）ELF3タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離さ
    れた核酸分子。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の核酸配列と機能的に連結したプロモー
    ター配列を含む、組換え核酸分子。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組換え核酸分子で形質転換された細胞
    。
18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の組換え核酸分子を含むトランスジェニ
    ック植物。
19. 【請求項１９】 シロイヌナズナ、コショウ、トマト、タバコ、ブロッコリ
    ー、カリフラワー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ、トウモロコシ
    、コムギ、オオムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクルミからなる群よ
    り選択される、請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
20. 【請求項２０】 （ａ）50℃、2×SSC、0.1％、3時間という洗浄条件下で配
    列番号：１に示された配列を含む核酸プローブとハイブリダイズし；かつ （ｂ）ELF3タンパク質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、単離さ
    れた核酸分子。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の核酸配列と機能的に連結したプロモー
    ター配列を含む、組換え核酸分子。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の組換え核酸分子で形質転換された細胞
    。
23. 【請求項２３】 請求項２１に記載の組換え核酸分子を含むトランスジェニ
    ック植物。
24. 【請求項２４】 シロイヌナズナ、コショウ、トマト、タバコ、ブロッコリ
    ー、カリフラワー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ、トウモロコシ
    、コムギ、オオムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクルミからなる群よ
    り選択される、請求項２３に記載のトランスジェニック植物。
25. 【請求項２５】 植物ELF3タンパク質をコードする単離された核酸分子。
26. 【請求項２６】 請求項２５に記載の核酸配列と機能的に連結したプロモー
    ター配列を含む、組換え核酸分子。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の組換え核酸分子で形質転換された細胞
    。
28. 【請求項２８】 請求項２６に記載の組換え核酸分子を含むトランスジェニ
    ック植物。
29. 【請求項２９】 シロイヌナズナ、コショウ、トマト、タバコ、ブロッコリ
    ー、カリフラワー、キャベツ、キャノーラ、マメ、ダイズ、コメ、トウモロコシ
    、コムギ、オオムギ、カンキツ類、ワタ、キャッサバ、及びクルミからなる群よ
    り選択される、請求項２７に記載のトランスジェニック植物。
30. 【請求項３０】 オープンリーディングフレームと機能的に連結したプロモ
    ーターを含む組換え核酸分子であって、プロモーターがELF3プロモーターである
    、組換え核酸分子。
31. 【請求項３１】 プロモーターが、 （ａ）配列番号：５； （ｂ）配列番号：５のヌクレオチド５００〜４０７１； （ｃ）配列番号：５のヌクレオチド１０００〜４０７１； （ｄ）配列番号：５のヌクレオチド１５００〜４０７１； （ｅ）配列番号：５のヌクレオチド２０００〜４０７１； （ｆ）配列番号：５のヌクレオチド２５００〜４０７１； （ｇ）配列番号：５のヌクレオチド３５００〜４０７１；及び （ｈ）配列番号：５のヌクレオチド４０００〜４０７１ からなる群より選択される配列を含む、請求項３０の核酸分子。
32. 【請求項３２】 核酸分子と機能的に連結したプロモーターを含む組換え遺
    伝子構築物を植物において発現させることを含む、植物におけるELF3タンパク質
    の発現レベルを修飾する方法であって、核酸分子が配列番号：４に示された配列
    の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む、方法。
33. 【請求項３３】 核酸分子がプロモーターに対してアンチセンス方向で存在
    する、請求項３２の方法。