ES2454978T3 - Gen de nodulina precoz sensible a nitrógeno - Google Patents

Abstract

Una planta transgénica, una semilla de planta transgénica o una célula vegetal transgénica que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína OsENOD93 funcional, en el que el ácido nucleico recombinante comprende: a) una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 1; b) un ácido nucleico que hibrida específicamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridación rigurosas; c) una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 2; d) un ácido nucleico que hibrida específicamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones de hibridación rigurosas o e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteínas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

Description

Gen de nodulina precoz sensible a nitrogeno

5 REFERENCIAS CRUZADAS CON SOLICITUDES RELACIONADAS [0001] Se reivindica prioridad para la solicitud provisional de patente de EE. UU. N.D 61/099.954, presentada el 25 de septiembre de 2008, que se incorpora a este documento en su totalidad.

10 CAMPO DE LA INVENCION [0002] La presente invencion se refiere en general a procedimientos para modular las caracteristicas de las plantas como el uso eficiente del nitrogeno (UEN).

15 ANTECEDENTES DE LA INVENCION [0003] En los proximos 50 aros se ejercera una considerable presion sobre la produccion de cosechas a nivel mundial debido a una combinacion de factores como el aumento de la poblacion humana, un aumento en la utilizacion de las cosechas por persona y diversos problemas medioambientales. Teniendo en cuenta las tendencias

20 actuales, sera necesario duplicar aproximadamente los rendimientos a nivel mundial durante este periodo de tiempo y supondra un esfuerzo considerable cumplir este desafio de forma economica y medioambientalmente sostenible (Rothstein SJ Plant Cell 2007, 19: 2695-2699). El nitrogeno es un elemento fundamental para el crecimiento de las plantas y se considera que es el principal factor de control de la productividad vegetal despues de la deficiencia en agua (Lea PJ, Morot-Gaudry J-F Plant nitrogen, 2001, Springer, Berlin, Londres). La produccion de cosechas de alto

25 rendimiento se asocia con la aplicacion de grandes cantidades de fertilizantes nitrogenados. Estas grandes entradas de nitrogeno se estiman actualmente en 90 millones de toneladas metricas y se han convertido en el principal coste a nivel mundial en la produccion de las cosechas (Frink CR, y col., PNAS 1999, 96: 1175-1180). Sin embargo, el nitrogeno incorporado a las cosechas agricolas en raras ocasiones excede del 40% del nitrogeno aplicado, lo que indica una grave ineficacia en la utilizacion del nitrogeno (Raun WR, Johnson GV Agronomy Journal 1999, 91: 357

30 363; Glass ADM Critical Reviews in Plant Sciences 2003, 22: 453-470). Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar cosechas con un mejor uso eficiente del nitrogeno (UEN). [0004] Existen dos fases principales del uso del nitrogeno en el ciclo vital de las plantas. La primera es la fase vegetativa, en la que esta mas involucrada la asimilacion del nitrogeno. La segunda es la fase reproductiva, en la

35 que estan involucrados tanto la asimilacion como la movilizacion del nitrogeno. Para medir el UEN se han desarrollado a lo largo de los aros varias definiciones y procedimientos de evaluacion, siendo uno de estos el rendimiento de biomasa o de grano frente a la cantidad de nitrogeno suministrado (Good AG, y col., Trends Plant Sci 2004, 9: 597-605). En general, este UEN puede dividirse adicionalmente en dos partes, siendo una la eficacia de asimilacion y la otra la eficiencia de la utilizacion.

40 [0005] Para evaluar la base molecular de las respuestas de las plantas al nitrogeno e identificar los genes sensibles al nitrogeno, en varios estudios de respuesta al nitrogeno se ha empleado la obtencion de perfiles de expresion genica mediante micromatrices en Arabidopsis (Wang R., y col., Plant Cell 2000, 12: 1491-1509; Wang RC, y col., Plant Physiology 2003, 132: 556-567; Price J, y col., Plant Cell 2004, 16: 2128-2150; Scheible WR, y col.,

45 Plant Physiology 2004, 136: 2483-2499). En otros estudios se han investigado los genes sensibles al nitrogeno de Arabidopsis bajo estres cronico de nitrogeno, asi como el cambio transcripcional transitorio tras un aumento corto y prolongado de la disponibilidad de nitrogeno (Bi YM, y col., BMC Genomics 2007, 8: 281). Tambien se ha usado un sistema de crecimiento en suelo nitrogenado definido para Arabidopsis (Bi YM, y col., Plant Journal 2005, 44: 680692) para aislar el gen NLA, el cual controla la capacidad de adaptacion de Arabidopsis a la limitacion de nitrogeno,

50 e identificar genes adicionales implicados en la respuesta al nitrogeno (Peng M, y col., Plant J 2007, 50: 320-337; Peng MS, y col., Plant Molecular Biology 2007, 65: 775-797). Tambien se han realizado estudios sobre genes sensibles al nitrogeno en raices de tomate (Wang YH, y col., Plant Physiol 2001, 127: 345-359) y en plantulas de arroz (Lian X, y col., Plant Mol Biol 2006, 60: 617-631).

55 [0006] Aunque se han identificado muchos genes sensibles al nitrogeno a partir de los estudios anteriores, faltan publicaciones sobre como utilizar estos conocimientos para manipular la expresion genica de modo que esto permita que las plantas utilicen el nitrogeno de forma mas eficiente. Para cumplir esta necesidad, en la presente descripcion se proporciona un gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno (LOC Os06g05010), denominado OsENOD93 y plantas que sobreexpresan este gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno, que muestran un aumento del UEN, incluyendo un aumento del rendimiento de semillas, tolerancia al estres, niveles de nitrato y niveles de aminoacidos. Tambien se proporcionan los procedimientos para producir dichas plantas, o alternativamente, procedimientos para mimetizar el fenotipo de sobreexpresion usando un activador del gen de nodulina precoz sensible al nitrogeno. Tambien se proporcionan ademas acidos nucleicos y proteinas aislados utiles

5 en los procedimientos descritos.

RESUMEN DE LA INVENCION

[0007] La invencion es como se describe en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripcion

10 proporciona acidos nucleicos y proteinas OsENOD93 aislados, vectores y celulas que expresan los acidos nucleicos descritos y anticuerpos que se unen especificamente a la proteina descrita. Entre los acidos nucleicos OsENOD93 representativos de la invencion se incluyen acidos nucleicos que comprenden a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1; b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones rigurosas de hibridacion; c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID

15 NO: 2; d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas de hibridacion; e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3. Adicionalmente, entre los acidos nucleicos OsENOD93 representativos de la descripcion se incluyen acidos nucleicos que comprenden a) una secuencia de nucleotidos que es al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 1; b) una secuencia de nucleotidos que es

20 al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 2 y c) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 3. Entre las proteinas OsENOD93 representativas de la descripcion se incluyen proteinas que comprenden a) una secuencia de aminoacidos al menos el 80% identica a SEQ ID NO: 3 y b) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3.

25 [0008] Tambien se proporcionan plantas que sobreexpresan OsENOD93, incluyendo plantas monocotiledoneas y dicotiledoneas, y los procedimientos para producir dichas plantas usando las secuencias de nucleotidos del gen OsENOD93 descrito en este documento. Las plantas OsENOD93 se caracterizan por un aumento de la expresion de OsENOD93 y un aumento del uso eficiente del nitrogeno.

30 [0009] Adicionalmente se proporcionan procedimientos para identificar agentes y activadores que se unen a OsENOD93. En un aspecto de la invencion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la proteina OsENOD93 con uno o mas agentes de ensayo o con un agente de control en condiciones suficientes para la union; c) analizar la union de un agente de ensayo a la proteina OsENOD93 aislada y d) seleccionar un agente de ensayo que muestre una union especifica a la proteina

35 OsENOD93. En un aspecto adicional de la descripcion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una celula que exprese una proteina OsENOD93, b) poner en contacto la celula con uno o mas agentes de ensayo o un agente control; c) analizar la expresion del gen OsENOD93 y d) seleccionar un agente de ensayo que induce la elevacion de la expresion del gen cuando se pone en contacto con el agente de ensayo cuando se compara con el agente control. En otro aspecto de la descripcion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una planta

40 que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la planta con uno o mas agentes de ensayo o un agente control; c) analizar el contenido de nitrogeno, la captacion de nitrogeno, el crecimiento lateral de las raices, el contenido de aminoacidos, el rendimiento de semillas o la biomasa de la planta y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca un aumento del contenido de nitrato, aumento de la captacion de nitrato, aumento del crecimiento lateral de las raices, rendimiento de semillas y/o aumento de la biomasa cuando se pone en contacto

45 con el agente de ensayo en comparacion con el agente control.

[0010] Ademas tambien se proporcionan procedimientos de identificacion de potenciadores de OsENOD93 en una planta que comprende a) proporcionar una celula que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la celula con uno o mas agentes de ensayo o un agente control; c) analizar la expresion de un gen OsENOD93 diana y 50 d) seleccionar un agente de ensayo que induzca la elevacion de la expresion del gen, cuyo gen normalmente esta sometido a induccion por OsENOD93, cuando se pone en contacto con el agente de ensayo en comparacion con el agente control. En otro aspecto de la descripcion, el procedimiento puede comprender a) proporcionar una planta que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la planta con uno o mas agentes de ensayo o un agente de control; c) analizar el contenido de nitrogeno, la captacion de nitrogeno, el crecimiento lateral de las raices, el

55 contenido de aminoacidos, el rendimiento de semillas o la biomasa de la planta y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca un aumento del contenido de nitrato, aumento de la captacion de nitrato, aumento del crecimiento lateral de las raices, rendimiento de semillas y/o aumento de la biomasa cuando se pone en contacto con el agente de ensayo en comparacion con el agente de control.

[0011] Tambien se proporcionan procedimientos para mejorar el rendimiento de la planta usando agentes y activadores de union a OsENOD93 identificados segun los procedimientos descritos en este documento.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS 5

[0012]

En la figura 1A se muestra la media del peso seco de los brotes (± DT, n=3-5) en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

10 En la figura 1B se muestra la media del peso seco de la raiz (± DT, n=3-5) en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 1C se muestra la media de la relacion brote/raiz (± DT, n=3-5), medida en peso seco en plantas 15 silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 1D se muestra la media del contenido de clorofila (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

20 En la figura 1E se muestra la media del contenido de antocianina (± DT, n=3-5), expresado como unidades/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 2A se muestra la media del contenido de nitrato en los brotes (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

25 En la figura 2B se muestra la media del contenido de nitrato en las raices (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 2C se muestra la media de aminoacidos totales en los brotes (± DT, n=3-5), expresado como 30 micromoles/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 2D se muestra la media de aminoacidos totales en las raices (± DT, n=3-5), expresado como micromoles/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

35 En la figura 2E se muestra la media de proteina soluble total en los brotes (± DT, n=3-5), expresada como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 2F se muestra la media de proteina soluble total en las raices (± DT, n=3-5), expresada como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

40 En la figura 2G se muestra la media del contenido de nitrogeno en los brotes (± DT, n=3-5), expresado como porcentaje del peso seco de la planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

45 En la figura 2H se muestra la media del contenido de nitrogeno en las raices (± DT, n=3-5), expresado como porcentaje del peso seco de la planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM, 5 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 3A se muestra la media del contenido de nitrato en los brotes (± DT, n=3-5), expresado como mg/g 50 (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM durante 28 dias y plantas crecidas en nitrato 1 mM durante 28 dias seguido de 2 horas de crecimiento en nitrato 10 mM (induccion).

En la figura 3B se muestra la media del contenido de nitrato en las raices (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM durante 28 dias y plantas crecidas en nitrato 1 mM 55 durante 28 dias seguido de 2 horas de crecimiento en nitrato 10 mM (induccion).

En la figura 3C se muestra la media del contenido de nitrato en los brotes (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias y plantas crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias seguido de 2 horas de crecimiento en nitrato 1 mM (reduccion).

En la figura 3D se muestra la media del contenido de nitrato en las raices (± DT, n=3-5), expresado como mg/g (peso fresco) de planta, en plantas silvestres crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias y plantas crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias seguido de 2 horas de crecimiento en nitrato 1 mM (reduccion).

5 En la figura 4A se muestra la abundancia relativa de transcritos, determinado mediante el analisis de la expresion mediante micromatrices, de OsENOD93 en raices de plantas silvestres crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias y plantas crecidas en nitrato 10 mM durante 28 dias, nitrato 1 mM durante 28 dias, nitrato 10 mM durante 28 dias seguido de 2 horas de crecimiento en nitrato 1 mM (reduccion) y nitrato 1 mM durante 28 dias seguido de 2 horas en

10 nitrato 10 mM.

En la figura 4B se muestra la expresion del gen OsENOD93 en diferentes fases de crecimiento y en diferentes partes de la planta en plantas silvestre de arroz.

15 En la figura 4C se muestran los niveles relativos de expresion del gen OsENOD93 tanto en los brotes como en las raices de plantas silvestres crecidas en nitrato 1 mM y nitrato 10 mM durante 28 dias, determinado mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando actina como control interno. Los niveles de expresion se normalizaron con respecto a brotes silvestres crecidos en nitrato 1 mM.

20 En la figura 4D se muestran los niveles relativos de expresion del gen OsENOD93 tanto en los brotes como en las raices de plantas transgenicas que sobreexpresan el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 1 mM y nitrato 10 mM durante 28 dias, determinado mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando actina como control interno. Los niveles de expresion se normalizaron con respecto a brotes silvestres crecidos en nitrato 1 mM.

25 En la figura 5A se muestra la media de aminoacidos totales en las raices (± DT, n=3-5), expresada como moles/g (peso fresco) de planta, tanto en plantas silvestres como en plantas transgenicas que sobreexpresan el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 1 mM, 3 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la figura 5B se muestra la media del contenido de nitrogeno en las raices (± DT, n=3-5), expresada como

30 porcentaje del peso seco de la planta, tanto en plantas silvestres como en plantas transgenicas que sobreexpresan el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 1 mM, 3 mM y 10 mM durante 28 dias.

En la Figura 5C se muestra la media de aminoacidos totales en las raices (± DT, n=3-5), expresada como micromoles/g (peso fresco) de planta, tanto en plantas silvestres como en plantas transgenicas que sobreexpresan

35 el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 3 mM y 10 mM durante 60 dias.

En la figura 5D se muestra la media del contenido de nitrogeno en las raices (± DT, n=3-5), expresada como porcentaje del peso seco de la planta, tanto en plantas silvestres como en plantas transgenicas que sobreexpresan el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 3 mM y 10 mM durante 60 dias.

40 En la figura 6A se muestra la secuencia genomica del gen OsENOD93 (SEQ ID NO: 1).

En la figura 6B se muestra la secuencia del ADNc del gen OsENOD93 (SEQ ID NO: 2).

45 En la figura 6C se muestra la secuencia de aminoacidos predicha de la proteina codificada por el gen OsENOD93 (SEQ ID NO: 3).

En la figura 6D se muestra la localizacion de tres exones (subrayados) y dos intrones dentro de la secuencia genomica del gen OsENOD93.

50 En la figura 6E se muestra el dominio OsENOD93 (subrayado) en la secuencia de aminoacidos.

En la figura 7 se muestran los aminoacidos totales en la savia del xilema (± DT, n=3-5), expresado como micromoles/ml de sabia del xilema, tanto en plantas silvestres como en plantas transgenicas de arroz que

55 sobreexpresan el gen OsENOD93 crecidas en nitrato 1 mM, 3 mM y 10 mM durante 28 dias. Las barras con letras diferentes indican una diferencia significativa con p < 0,05 (prueba de diferencias minimas significativas de Fisher).

DESCRIPCION DETALLADA

I. Acidos nucleicos y proteinas OsENOD93

[0013] La presente descripcion proporciona acidos nucleicos y proteinas OsENOD93, sus variantes y sus activadores. En los acidos nucleicos y proteinas descritos previamente no se mostraba como utilizar dichas 5 moleculas para estimular el uso eficiente del nitrogeno en plantas, como se describe actualmente.

[0014] En la SEQ ID NO: 1 se muestra un acido nucleico OsENOD93 representativo que codifica la proteina OsENOD93 representativa de la SEQ ID NO: 3. Entre las variantes de OsENOD93 de la presente descripcion se incluyen proteinas variantes que tienen actividad OsENOD93.

10 [0015] En plantas de leguminosas los genes de nodulina precoz (ENOD) se expresan durante el desarrollo nodular y puede mediar en la organogenesis del nodulo (Mylona y col., 1995). Sin embargo, tambien se han postulado funciones diferenciales de los genes ENOD. Se ha demostrado que ENOD40 se expresa durante la fase precoz del inicio del nodulo (Kouchi y Hata, 1993; Yang y col., 1993) y esta proteina podria estar implicada en la

15 division celular cortical (Charon y col. 1997), en la diferenciacion de haces vasculares (Kouchi y col., 1999) y tambien tiene un posible papel en el transporte de fotosintatos (Kouchi y Hata, 1993; Yang y col., 1993). De manera similar, la expresion de GmENOD93 se ha encontrado en los nodulos de soja (Kouchi y Hata, 1993) y tiene un homologo en el arroz, el OsENOD93a (Reddy y col., 1998), aunque no se ha caracterizado su funcion. Una busqueda de homologia del gen OsENOD93 de la presente descripcion en arroz indica que existe una familia de al menos cinco

20 genes que tienen un dominio ENOD93 y que el gen OsENOD93 de la presente descripcion codifica una proteina que tiene aproximadamente el 98% de identidad de secuencia de aminoacidos con OsENOD93a.

[0016] El gen OsENOD93 de la presente descripcion consta de tres exones y dos intrones, y codifica una proteina de 116 aminoacidos con un peso molecular de 12.424 Da y un pI de 10,95 (figuras 6C-E y tabla 6).

I.A. Acidos nucleicos OsENOD93

[0017] Los acidos nucleicos son desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos y polimeros de los mismos en forma de cadena sencilla, cadena doble o triplete. Siempre que no este especificamente limitado, el termino abarca acidos

30 nucleicos que contienen analogos conocidos de nucleotidos naturales que tienen propiedades similares a las del acido nucleico natural de referencia. Los terminos molecula de acido nucleico o acido nucleico tambien pueden usarse en lugar de gen, ADNc, ARNm o ARNc. Los acidos nucleicos pueden sintetizarse o pueden derivar de cualquier fuente biologica, incluido cualquier organismo.

35 [0018] Los acidos nucleicos representativos de la descripcion comprenden las secuencias de nucleotidos de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y sustancialmente secuencias identicas que codifican proteinas OsENOD93 con actividad sustancialmente identica, por ejemplo, secuencias al menos el 50% identicas a SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, como al menos el 55% identicas, o al menos el 60% identicas, o al menos el 65% identicas, como al menos el 70% identicas, o al menos el 75% identicas, o al menos el 80% identicas, o al menos el 85% identicas, o al menos el

40 90% identicas, o al menos el 91% identicas, o al menos el 92% identicas, o al menos el 93% identicas, o al menos el 94% identicas, o al menos el 95% identicas, o al menos el 96% identicas, o al menos el 97% identicas, o al menos el 98% identicas, o al menos el 99% identicas. Las secuencias se comparan para buscar correspondencia maxima usando un algoritmo de comparacion de secuencia que utiliza la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 como la secuencia problema, como se describe en este documento a continuacion, o mediante

45 inspeccion visual.

[0019] Las secuencias sustancialmente identicas pueden ser secuencias polimorficas, es decir, secuencias o alelos alternativos en una poblacion. Una diferencia alelica puede ser de tan solo un par de bases.

50 [0020] Las secuencias sustancialmente identicas tambien pueden comprender secuencias mutagenizadas, incluyendo secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutacion puede comprender uno o mas cambios de restos, una delecion de uno o mas restos, o una insercion de uno o mas restos adicionales.

[0021] Los acidos nucleicos sustancialmente identicos se identifican tambien como acidos nucleicos que

55 hibridan especificamente o hibridan sustancialmente con la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 en condiciones rigurosas. En el contexto de la hibridacion de acidos nucleicos, dos secuencias de acidos nucleicos que se estan comparando pueden denominarse sonda y diana. Una sonda es una molecula de acido nucleico de referencia y una diana es una molecula de acido nucleico problema, que a menudo se encuentran dentro de una poblacion heterogenea de moleculas de acido nucleico. Una secuencia diana es sinonimo de secuencia problema.

[0022] Una secuencia de nucleotidos en especial empleada para los estudios o ensayos de hibridacion incluye secuencias sonda que son complementarias a al menos una secuencia de aproximadamente 14 a 40 nucleotidos de una molecula de acido nucleico de la presente descripcion. Preferiblemente, las sondas comprenden de 14 a 20

5 nucleotidos, o incluso pueden ser mas largas si se desea, por ejemplo 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300 o 500 nucleotidos o hasta la longitud completa de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. Estos fragmentos pueden prepararse facilmente, por ejemplo, mediante sintesis quimica del fragmento, mediante la aplicacion de tecnologia de amplificacion de acidos nucleicos o introduciendo secuencias seleccionadas dentro de vectores recombinantes para la produccion recombinante.

10 [0023] El termino hibridacion especifica se refiere a la union, formacion de un duplex o hibridacion de una molecula solo con una secuencia de nucleotidos en particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia esta presente en una mezcla compleja de acidos nucleicos (p. ej., ADN o ARN celular total). La hibridacion especifica puede incluir faltas de coincidencia entre la sonda y la secuencia diana dependiendo de la rigurosidad de las

15 condiciones de hibridacion.

[0024] Condiciones de hibridacion rigurosas y condiciones de lavado de hibridacion rigurosas en el contexto de los experimentos de hibridacion de acidos nucleicos, como analisis de transferencia de ADN y ARN, son tanto dependientes de secuencias como del ambiente. Las secuencias mas largas hibridan especificamente a 20 temperaturas mas altas. En Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 1993, parte I, capitulo 2, Elsevier, Nueva York, Nueva York puede encontrarse una amplia guia para la hibridacion de acidos nucleicos. Generalmente, la hibridacion y las condiciones de lavado altamente rigurosas se seleccionan para que esten a aproximadamente 5DC por debajo del punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza ionica y pH definidos. Normalmente, en condiciones rigurosas una sonda

25 hibridara especificamente con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

[0025] La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza ionica y pH definidas) a la cual el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda con la que coincide a la perfeccion. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda en particular. Un ejemplo de condiciones de hibridacion 30 rigurosas para el analisis de transferencias de ADN y ARN de acidos nucleicos complementarios que tienen mas de aproximadamente 100 restos complementarios seria la hibridacion durante toda la noche en formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42DC. Un ejemplo de condiciones de lavado altamente rigurosas seria 15 minutos en citrato sodico salino (SSC) x0,1 a 65DC. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas seria 15 minutos en tampon SSC x0,2 a 65DC. Vease Sambrook y col., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory 35 Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, para una descripcion del tampon SSC. A menudo, un lavado altamente riguroso va precedido por un lavado poco riguroso para eliminar la seral de fondo de la sonda. Un ejemplo de condiciones de lavado de rigurosidad media para un duplex de mas de aproximadamente 100 nucleotidos seria 15 minutos en SSC x1 a 45DC. Un ejemplo de lavado de rigurosidad baja para un duplex de mas de aproximadamente 100 nucleotidos seria 15 minutos en SSC x4 a x6 a 40DC. Para sondas cortas (p. ej., aproximadamente 10 a 50 40 nucleotidos), las condiciones rigurosas normalmente suponen concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1M de ion Na+, normalmente aproximadamente 0,01 a 1 M de concentracion de ion Na+ (u otras sales) a pH 7,0-8,3 y la temperatura normalmente es de al menos aproximadamente 30DC. Las condiciones rigurosas tambien pueden conseguirse con la adicion de agentes desestabilizantes como formamida. En general, una seral con una proporcion con respecto al fondo de 2 veces (o mayor) que la observada para una sonda no

45 relacionada en el ensayo de hibridacion en particular indica la deteccion de una hibridacion especifica.

[0026] A continuacion aparecen ejemplos de condiciones de hibridacion y lavado que pueden usarse para identificar secuencias de nucleotidos que son sustancialmente identicas a las secuencias de nucleotidos de referencia de la presente descripcion: una secuencia de nucleotidos sonda hibrida preferiblemente con una 50 secuencia de nucleotidos diana en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50DC seguido del lavado en SSC x2, SDS al 0,1% a 50DC; mas preferiblemente, una sonda y una secuencia diana hibridan en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM al 50DC seguido del lavado en SSC x1, SDS al 0,1% a 50DC; mas preferiblemente, una sonda y una secuencia diana hibridan en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50DC seguido del lavado en SSC x0,5, SDS al 0,1% a 50DC; mas preferiblemente, una

55 sonda y secuencia diana hibridan en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50DC seguido del lavado en SSC x0,1, SDS al 0,1% a 50DC; mas preferiblemente, una sonda y una secuencia diana hibridan en dodecil sulfato sodico (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50DC seguido del lavado en SSC x0,1, SDS al 0,1% a 65DC.

[0027] Una indicacion adicional de que dos secuencias de acido nucleico son sustancialmente identicas es que las proteinas codificadas por los acidos nucleicos son sustancialmente identicas, comparten una estructura tridimensional global o son equivalentes biologicamente funcionales. Estos terminos se definen adicionalmente a continuacion en este documento. Las moleculas de acido nucleico que no hibridan entre si en condiciones rigurosas

5 siguen siendo sustancialmente identicas si las proteinas correspondientes son sustancialmente identicas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando dos secuencias de nucleotidos comprenden variantes sustituidos de forma conservadora segun permite el codigo genetico.

[0028] El termino variantes sustituidas de forma conservadora se refiere a secuencias de acido nucleico que

10 tienen sustituciones de codon degenerado en las que la tercera posicion de uno o mas codones seleccionados (o todos) se sustituye por restos con mezclas de bases y/o desoxiinosina. Vease Batzer y col., Nucleic Acids Res., 1991, 19:5081; Ohtsuka y col., J. Biol. Chem., 1985, 260:2605-2608 y Rossolini y col. Mol. Cell Probes, 1994, 8:91

98.

15 [0029] Los acidos nucleicos de la descripcion tambien comprenden acidos nucleicos complementarios a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2. Las secuencias complementarias son dos secuencias de nucleotidos que comprenden secuencias de nucleotidos antiparalelas capaces de aparearse con otra tras la formacion de enlaces de hidrogeno entre pares de bases. Segun se usa en este documento, el termino secuencias complementarias significa secuencias de nucleotidos que son sustancialmente complementarias segun puede evaluarse mediante los mismos

20 procedimientos de comparacion de nucleotidos establecidos a continuacion, o se define como ser capa de hibridar con el segmento de acido nucleico en cuestion en condiciones relativamente rigurosas, como las descritas en este documento. Un ejemplo particular de segmento de acido nucleico complementario es un oligonucleotido antisentido.

[0030] Los acidos nucleicos de la descripcion tambien comprenden acidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 y SEQ

25 ID NO: 2 que se han alterado para su expresion en organismos distintos a las plantas que explican las diferencias en el uso de codones entre las plantas y el otro organismo. Por ejemplo, el uso de codones especificos en plantas difiere del uso de codones especificos en determinados microorganismos. La comparacion del uso de codones dentro de un marco de lectura abierto (ORF, por sus siglas en ingles) microbiano clonado para el uso en genes vegetales (y en genes concretos de la planta diana) permitira una identificacion de los codones dentro del ORF que

30 deberian cambiarse especificamente. Normalmente, la evolucion vegetal ha tendido hacia una fuerte preferencia de los nucleotidos C y G en la posicion de la tercera base de las monocotiledoneas, mientras que en las dicotiledoneas a menudo se usan los nucleotidos A o T en esta posicion. Modificando un gen para incorporar el uso de codones especifico para una especie transgenica diana en particular se resolveran muchos de los problemas descritos a continuacion sobre el contenido GC/AT y el ayuste ilegitimo.

35 [0031] Los genes de plantas normalmente tienen un contenido GC de mas del 35%. Las secuencias ORF que son ricas en nucleotidos A y T pueden causar varios problemas en las plantas. En primer lugar, se cree que los motivos ATTTA causan desestabilizacion de los mensajeros y se encuentran en el extremo 3' de muchos ARNm de vida corta. En segundo lugar, se considera que la aparicion de serales de poliadenilacion como AATAAA en

40 posiciones inapropiadas dentro del mensajero causa un truncamiento prematuro de la transcripcion. Ademas, las monocotiledoneas pueden reconocer secuencias ricas en AT como sitios de ayuste (vease a continuacion).

[0032] El termino subsecuencia se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia de acido nucleico mas largo. Un ejemplo de subsecuencia es una sonda, descrita anteriormente en

45 este documento, o un cebador. El termino cebador segun se usa en este documento, se refiere a una secuencia contigua que comprende aproximadamente 8 o mas desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, preferiblemente de 10 a 20 nucleotidos y, mas preferiblemente, de 20 a 30 nucleotidos de una molecula de acido nucleico seleccionada. Los cebadores de la descripcion abarcan oligonucleotidos de longitud suficiente y secuencia apropiada de modo que se proporcione el inicio de la polimerizacion en una molecula de acido nucleico de la presente descripcion.

50 [0033] Entre los acidos nucleicos representativos de la descripcion tambien se incluyen acidos nucleicos que consisten esencialmente en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, en la medida en que los acidos nucleicos se aislan de, y no contienen, secuencias adicionales de nucleotidos con los que los acidos nucleicos se puedan asociar normalmente. Adicionalmente, el acido nucleico de la invencion puede expresarse en la planta completa o puede

55 expresarse de forma diferencial en partes especiales de la planta. Ademas, los acidos nucleicos de la invencion pueden expresarse en momentos diferentes durante el desarrollo de la planta, como por ejemplo, durante la fase reproductiva o la fase vegetativa del desarrollo de la planta (p. ej., las fases de desarrollo y las partes de la planta identificadas en la figura 4B).

[0034] Se proporcionan vectores que comprenden los acidos nucleicos descritos, incluyendo vectores para la expresion recombinante, en los que un acido nucleico de la invencion esta unido de forma operativa a un promotor funcional. Cuando se une operativamente a un acido nucleico, el promotor esta en combinacion funcional con el acido nucleico de modo que la transcripcion del acido nucleico esta controlada y regulada por la region promotora. El

5 termino vectores se refiere a acidos nucleicos capaces de replicarse en una celula huesped, como plasmidos, cosmidos y vectores viricos.

[0035] Los acidos nucleicos de la presente descripcion pueden haber sido clonados, sintetizados, alterados, sometidos a mutagenesis o pueden ser combinaciones de los mismos. Las tecnicas de ADN recombinante y 10 clonacion molecular usadas para aislar acidos nucleicos son conocidas en la tecnica. Tambien es conocida en la tecnica la mutagenesis especifica de sitio para crear cambios, deleciones o pequeras inserciones de pares de bases. Vease p. ej., Sambrook y col. (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Silhavy y col., Experiments with Gene Fusions, 1984, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Glover & Hames, DNA Cloning: A Practical

15 Approach, 2a ed., 1995, IRL Press at Oxford University Press, Oxford/Nueva York; Ausubel (ed.) Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., 1995, Wiley, Nueva York.

[0036] En otro aspecto de la descripcion, se proporciona un procedimiento para detectar una molecula de acido nucleico que codifica una proteina OsENOD93. Estos procedimientos pueden usarse para detectar variantes 20 del gen OsENOD93 o expresion genica alterada. Las secuencias detectadas mediante los procedimientos de la descripcion pueden ser detectadas, subclonadas, secuenciadas y evaluadas adicionalmente mediante cualquier medida bien conocida en la tecnica usando cualquier procedimiento normalmente aplicado a la deteccion de una secuencia de ADN especifica. Por tanto, los acidos nucleicos de la presente descripcion pueden usarse para clonar genes y ADN genomico que comprende las secuencias descritas. Alternativamente, los acidos nucleicos de la

25 presente descripcion pueden usarse para clonar genes y ADN genomico de secuencias relacionadas. Los niveles de una molecula de acido nucleico OsENOD93 pueden medirse, por ejemplo, usando un ensayo de RT-PCR. Vease Chiang, J. Chromatogr. A., 1998, 806:209-218 y las referencias citadas en este.

[0037] En otro aspecto de la descripcion pueden realizarse ensayos geneticos que usan acidos nucleicos

30 OsENOD93 para analisis de loci de caracter cuantitativo (QTL, por sus siglas en ingles) y para seleccionar variantes geneticas, por ejemplo, mediante analisis de sondas de oligonucleotido especifico de alelo (ASO) (Conner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80(1):278-282), ensayos de ligamiento de oligonucleotidos (OLA) (Nickerson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87(22):8923-8927), analisis de polimorfismo de conformacion de cadena sencilla (SSCP) (Orita y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 1989, 86(8):2766-2770), analisis de SSCP/heteroduplex, metodo de

35 rotura enzimatica, analisis directo de secuencia de exones amplificados (Kestila y col., Mol. Cell, 1998, 1(4):575-582; Yuan y col., Hum. Mutat., 1999, 14(5):440-446), hibridacion especifica de alelo (Stoneking y col., Am. J. Hum. Genet., 1991, 48(2):370-382) y analisis de restriccion de ADN genomico amplificado que contiene la mutacion especifica. Tambien pueden aplicarse procedimientos automaticos para la caracterizacion a gran escala de polimorfismos de un solo nucleotido (Wang y col., Am. J. Physiol., 1998, 274(4 Pt2):H1132-1140; Brookes, Gene,

40 1999, 234(2):177-186). Los procedimientos de deteccion preferidos son los no eletroforeticos como, por ejemplo, el ensayo de discriminacion alelica TAQMANTM, PCR-OLA, balizas moleculares, sondas circularizables y fluorescencia en pocillo. Vease Landegren y col., Genoma Res., 1998, 8:769-776 y las referencias citadas en el mismo.

I.B. Proteinas OsENOD93

45 [0038] La presente descripcion tambien proporciona polipeptidos OsENOD93 aislados. Los terminos polipeptidos y proteinas se refieren cada uno a un compuesto formado por una cadena sencilla de aminoacidos unidos mediante enlaces peptidicos. En la SEQ ID NO: 3 se muestra un polipeptido OsENOD93 representativo. Polipeptidos adicionales de la descripcion incluyen proteinas OsENOD93 con actividad sustancialmente identica, por

50 ejemplo, secuencias al menos el 50% identicas a la SEQ ID NO: 3, como al menos el 55% identicas, o al menos el 60% identicas, o al menos el 65% identicas, como al menos el 70% identicas o al menos el 75% identicas, o al menos el 80% identicas, o al menos el 85% identicas, o al menos el 90% identicas, o al menos el 91% identicas, o al menos el 92% identicas, o al menos el 93% identicas, o al menos el 94% identicas, o al menos el 95% identicas, o al menos el 96% identicas, o al menos el 97% identicas, o al menos el 98% identicas, o al menos el 99% identicas. Las

55 secuencias se comparan para buscar correspondencia maxima usando un algoritmo de comparacion de secuencias con la secuencia de longitud completa de SEQ ID NO: 3 como la secuencia problema, como se describe en este documento a continuacion, o mediante inspeccion visual. Entre las proteinas representativas de la invencion tambien se incluyen polipeptidos que consisten esencialmente en la SEQ ID NO: s, en la medida en que los polipeptidos se aislan de entre, y no contienen, secuencias adicionales de aminoacidos con las que los polipeptidos se pueden asociar normalmente. En este documento se describen polipeptidos codificados por uno cualquiera de los acidos nucleicos de la descripcion.

[0039] Los polipeptidos de la descripcion pueden comprender aminoacidos naturales, aminoacidos sinteticos, 5 aminoacidos geneticamente codificados, aminoacidos no geneticamente codificados y combinaciones de los mismos. Los polipeptidos pueden incluir tanto aminoacidos de forma L como de forma D.

[0040] Entre los aminoacidos no geneticamente codificados representativos se incluyen, pero sin limitaciones, acido 2-amionadipico, acido 3-aminoadipico, acido �-aminopropionico, acido 2-aminobutirico, acido 4-aminobutirico

10 (acido piperidinico), acido 6-aminocaproico, acido 2-aminoheptanoico, acido 2-aminoisobutirico, acido 3aminoisobutirico, acido 2- aminopimelico; acido 2,4-diaminobutirico, desmosina, acido 2,2'-diaminopimelico, acido 2,3-diaminopropionico, N-etilglicina; N-etilasparagina; hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina (sarcosina), N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina.

15 [0041] Entre los aminoacidos derivatizados representativos se incluyen, por ejemplo, aquellas moleculas en las que los grupos amino libres se han derivatizados para formar clorhidratos de amina, grupos p-toluensulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo y grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, esteres de metilo y etilo u otros tipos de esteres o hidrazidas. Los grupos

20 hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrogeno imidazol de la histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina.

[0042] La presente descripcion tambien proporcionar fragmentos funcionales de un polipeptido OsENOD93, por ejemplo, fragmentos que tienen una actividad similar a la de una proteina OsENOD93 de longitud completa.

25 Tambien se proporcionan secuencias polipeptidicas funcionales que son mas largas que las secuencias descritas. Por ejemplo, pueden aradirse uno o mas aminoacidos al extremo N-terminal o C-terminal de un polipeptido. Estos aminoacidos adicionales pueden emplearse en diversas aplicaciones, incluyendo, pero sin limitaciones, aplicaciones de purificacion. Los procedimientos para la preparacion de proteinas elongadas son conocidos en la tecnica.

30 [0043] Entre las proteinas OsENOD93 de la descripcion se incluyen proteinas que comprenden aminoacidos que son variantes sustituidas de forma conservadora de la SEQ ID NO: 3. La expresion una variante sustituida de forma conservadora se refiere a un polipeptido que comprende un aminoacido en el que se han sustituido de forma conservadora uno o mas restos por un resto funcionalmente similar.

35 [0044] Entre los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen la sustitucion de un resto no polar (hidrofobo) como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitucion de un resto polar (hidrofilo) por otro como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina; la sustitucion de un resto basico como lisina, arginina o histidina por otro; o la sustitucion de un resto acido, como acido aspartico o acido glutamico por otro.

40 [0045] Los polipeptidos aislados de la descripcion pueden purificarse y caracterizarse usando diversas tecnicas convencionales que son conocidas por los expertos. Veanse, por ejemplo, Schroder y col., The Peptides, 1965, Academic Press, Nueva York; Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 2a ed. rev. 1993, Springer-Verlag, Berlin/Nueva York; Ausubel (ed.) Short Protocolos in Molecular Biology, 3a ed., 1995, Wiley, Nueva York.

45 [0046] La presente descripcion ademas proporciona procedimientos para detectar un polipeptido OsENOD93. Los procedimientos descritos pueden usarse, por ejemplo, para determinar los niveles alterados de la proteina OsENOD93, por ejemplo, niveles inducidos de proteina OsENOD93.

50 [0047] Por ejemplo, el procedimiento puede suponer realizar una reaccion inmunoquimica con un anticuerpo que reconozca especificamente una proteina OsENOD93. Las tecnicas para detectar estos conjugados o complejos antigeno-anticuerpo con conocidas en la tecnica e incluyen, pero sin limitaciones, centrifugacion, cromatografia de afinidad y otros procedimientos inmunoquimicos. Vease, por ejemplo, Ishikawa Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, 1999, Elsevier, Amsterdam/Nueva York, Estados Unidos de America; Law, Immunoassay: A Practical

55 Guide, 1996, Taylor & Francis, London/Bristol, Pennsylvania, Estados Unidos de America; Liddell y col., Antibody Technology, 1995, Bios Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido y las referencias citadas en ellos.

I.C. Comparaciones de secuencias de nucleotidos y aminoacidos [0048] Los terminos identico o porcentaje de identidad en el contexto de dos o mas secuencias de nucleotidos

o proteina, referido a dos o mas secuencias o subsecuencias que son la misma o tienen un porcentaje especificado de nucleotidos o restos aminoacidicos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para una correspondencia maxima, medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparacion de secuencias descritos

5 en este documento o mediante inspeccion visual.

[0049] El termino sustancialmente identico con respecto a una secuencia de nucleotidos o de proteina significa que una secuencia en particular varia con respecto a la secuencia de una secuencia natural en una o mas deleciones, sustituciones o adiciones, cuyo efecto neto es retener la funcion biologica de un acido nucleico o

10 proteina ENOD93.

[0050] Para la comparacion de dos o mas secuencias, una secuencia normalmente actua como secuencia de referencia con la que se compara una o mas secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparacion de secuencias se introducen en un ordenador las secuencias problema y de referencia, se diseran coordenadas de

15 subsecuencia si es necesario y se seleccionan parametros para el programa de algoritmo de secuencias. A continuacion, el algoritmo de comparacion de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias problema designadas con respecto a la secuencia de referencia, en funcion de los parametros especificados en el programa.

20 [0051] El alineamiento optimo de secuencias para la comparacion puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math, 1981, 2:482-489, mediante el algoritmo de alineamiento de homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 1970, 48:443-453, mediante la busqueda del procedimiento de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:2444-2448, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics

25 Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) o mediante inspeccion visual. Vease, en general, Ausubel (ed.), Short Protocols in Molecular Biology, 3a ed., 1995,Wiley, Nueva York.

[0052] Un algoritmo preferido para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215:403-410. El software 30 para realizar los analisis BLAST esta a disposicion publica a traves del National Center for Biotechnology Information (direccion de Internet ncbi.nlm.nih.gov/). Los parametros del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. Para la comparacion de dos secuencias de nucleotidos, los parametros predeterminados de BLASTn se establecen como W=11 (longitud de palabra) y E=10 (valor esperado) y tambien incluyen el uso de un filtro de complejidad baja para enmascarar los restos de la secuencia problema que tiene baja complejidad de

35 composicion. Para la comparacion de dos secuencias de aminoacidos, los parametros predeterminados del programa BLASTp se establecen como W=3 (longitud de palabra), E=10 (valor esperado), uso de la matriz de valoracion BLOSUM62, penalizacion por creacion=11 y extension=11 de hueco, y uso de un filtro de baja complejidad para enmascarar los restos de la secuencia problema que tiene baja complejidad de composicion.

40 II. Sistema para la expresion recombinante de una proteina OsENOD93

[0053] En la presente descripcion ademas se proporciona un sistema para la expresion de una proteina OsENOD93 recombinante. Este sistema puede usarse para la posterior purificacion y/o caracterizacion de una proteina OsENOD93. Tambien puede usarse un sistema para la expresion recombinante de una proteina 45 OsENOD93 para la identificacion de activadores, o dianas de una proteina OsENOD93, como se describe adicionalmente a continuacion en este documento. Un sistema de expresion se refiere a una celula huesped que comprende un acido nucleico heterologo y la proteina codificada por el acido nucleico heterologo. Por ejemplo, un sistema de expresion heterologo puede comprender una celula huesped transfectada con una construccion que comprende un acido nucleico OsENOD93 que codifica una proteina OsENOD93 unida de forma operativa a un

50 promotor, o una linea celular obtenida introduciendo acidos nucleicos OsENOD93 dentro del genoma de la celula huesped. El sistema de expresion puede comprender ademas uno o mas acidos nucleicos heterologos adicionales importantes para la funcion de OsENOD93, como dianas de la actividad de OsENOD93. Estos acidos nucleicos adicionales pueden expresarse como una unica construccion o multiples construcciones.

55 [0054] Las proteinas aisladas y las proteinas producidas mediante tecnologia recombinante pueden purificarse y caracterizarse usando diversas tecnicas convencionales que son conocidas para los expertos. Veanse por ejemplo, Schroder y col., The Peptides, 1965, Academic Press, Nueva York; Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, 2a ed. rev. 1993, Springer-Verlag, Berlin/Nueva York; Ausubel (ed.), Short Protocolos in Molecular Biology, 3a ed., 1995,Wiley, Nueva York.

II.A. Construcciones de expresion

[0055] Una construccion de expresion de una proteina OsENOD93 puede incluir una secuencia vector y una

5 secuencia de nucleotidos OsENOD93, en la que la secuencia de nucleotidos OsENOD93 esta unida de forma operativa a una secuencia promotor. Una construccion para la expresion de OsENOD93 recombinante tambien puede comprender serales de terminacion de la transcripcion y secuencias requeridas para la traduccion adecuada de la secuencia de nucleotidos. La preparacion de una construccion de expresion, incluyendo la adicion de secuencias seral de traduccion y terminacion, es conocida para los expertos en la materia.

10 [0056] El promotor puede ser cualquier secuencia polinucleotidica que muestre actividad transcripcional en las celulas vegetales, partes de la planta o plantas elegidas. El promotor puede ser nativo o analogo, o extraro o heterologo, a la planta huesped y/o a la secuencia de ADN de la invencion. Que el promotor sea nativo o endogeno para la planta huesped significa que dicho promotor se encuentra en la planta nativa dentro de la que se introduce el

15 promotor. Que el promotor sea extraro o heterologo para la secuencia de ADN de la invencion significa que el promotor no es el promotor nativo o natural para la secuencia de ADN unida de forma operativa de la invencion. El promotor puede ser inducible o constitutivo. Puede ser natural, puede estar compuesto por partes de diversos promotores naturales o puede ser total o parcialmente sintetico. Las directrices para el disero de promotores se proporcionan en los estudios de estructura de promotores, como el de Harley y col., Nucleic Acids Res., 1987,

20 15:2343-61. Tambien, puede optimizarse la localizacion del promotor con respecto al inicio de la transcripcion. Vease, por ejemplo., Roberts y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, 76:760-4. Muchos promotores adecuados para su uso en plantas son bien conocidos en la tecnica.

[0057] Por ejemplo, entre los promotores constitutivos adecuados para su uso en plantas se incluyen los

25 promotores de virus vegetales, como el promotor del caulimovirus del rayado clorotico del cacahuete (PC1SV) (patente de EE. UU. N.D 5.850.019); el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell y col., Nature, 1985, 313:810-812); promotores de los genes de la metiltransferasa del virus de Chlorella (patente de EE. UU. N.D 5.563.328) y el promotor transcripto de longitud completa del virus del mosaico del pasto setaria (FMV) (patente de EE. UU. N.D 5.378.619); los promotores de genes como la actina de arroz (McElroy y col. (1990) Plant Cell 2:163

30 171); ubiquitina (Christensen y col., Plant Mol. Biol., 1989, 12:619-632 y Christensen y col., Plant Mol. Biol., 1992, 18:675-689); pEMU (Last y col., Theor. Appl. Genet., 1991, 81:581-588); MAS (Velten y col., EMBO J., 1984, 3:27232730); histona H3 del maiz (Lepetit y col., Mol. Gen. Genet., 1992, 231:276-285 y Atanassova y col., Plant J., 1992, 2(3):291-300); ALS3 de Brassica napus (publicacion internacional PCT N.D WO 97/41228) y promotores de diversos genes de Agrobacterium (veanse las patentes de EE. UU. N.D 4.771.002; 5.102.796; 5.182.200 y 5.428.147).

35 [0058] Entre los promotores inducibles adecuados para su uso en plantas se incluyen el promotor del sistema ACE1 que responde al cobre (Mett y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:4567-4571); el promotor del gen In2 del maiz que responde a fitoprotectores del herbicida bencenosulfonamida (Hershey y col., Mol. Gen. Genetics, 1991, 227:229-237 y Gatz y col., Mol. Gen. Genetics, 1994, 243:32-38) y el promotor del represor Tet de Tn10 (Gatz

40 y col., Mol. Gen. Genet., 1991, 227:229-237). Otro promotor inducible para su uso en plantas es aquel que responde a un agente de induccion al que las plantas normalmente no responden. Un ejemplo de promotor inducible de este tipo es el promotor inducible de un gen de hormona esteroidea, cuya actividad transcripcional se induce mediante una hormona glucocorticoesteroide (Schena y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:10421) o la reciente aplicacion del activador de transcripcion quimerico XVE para su uso en un sistema de expresion en plantas inducible

45 basado en el receptor de estrogenos que se activa mediante estradiol (Zuo y col., Plant J., 2000, 24:265-273). Otros promotores inducibles para su uso en plantas se describen en el documento EP 332104 y en las publicaciones internacionales PCT N.D WO 93/21334 y WO 97/06269. Tambien pueden utilizarse promotores compuestos por porciones de otros promotores u otros promotores parcial o totalmente sinteticos. Veanse, por ejemplo, Ni y col., Plant J., 1995, 7:661-676 y la publicacion internacional PCT N.D WO 95/14098 en las que se describen estos

50 promotores para su uso en plantas.

[0059] El promotor puede incluir, o modificarse para incluir, uno o mas elementos potenciadores que proporcionen de este modo niveles de transcripcion mas altos. Entre los elementos potenciadores adecuados para su uso en plantas se incluyen el elemento potenciador PC1SV (patente de EE. UU. N.D 5.850.019), el elemento

55 potenciador 35S del CaMV (patentes de EE. UU. N.D 5.106.739 y 5.164.316) y el elemento potenciador de FMV (Maiti y col., Transgenic Res., 1997, 6:143-156). Vease tambien la publicacion internacional PCT N.D WO 96/23898.

[0060] Estas construcciones pueden contener una «secuencia seralD o «secuencia liderD para facilitar el transporte cotraduccional o postraduccional del peptido de interes hasta determinadas estructuras intracelulares

como el cloroplasto (u otro plastido), el reticulo endoplasmico o el aparato de Golgi, o para ser secretado. Por ejemplo, la construccion puede manipularse geneticamente para que contenga un peptido seral que facilite la transferencia del peptido al reticulo endoplasmico. Es sabido, o se supone, que una secuencia seral tiene como resultado el transporte cotraduccional o postraduccional del peptido a traves de la membrana celular. En eucariotas, 5 esto implica normalmente la secrecion dentro del aparato de Golgi, con cierto grado de glucosilacion. Una secuencia lider se refiere a cualquier secuencia que, cuando se traduce, tiene como resultado una secuencia de aminoacidos suficiente para desencadenar el transporte cotraduccional de la cadena peptidica hasta un organulo subcelular. Por tanto, esto incluye secuencias lider que dirigen el transporte y/o la glucosilacion pasando a traves del reticulo endoplasmico, paso a las vacuolas, plastidos incluyendo cloroplastos, mitocondrias y similares. Los casetes de

10 expresion en plantas tambien pueden contener un intron, de modo que se requiere el procesamiento del ARNm del intron para su expresion.

[0061] Estas construcciones tambien pueden contener regiones 5' y 3' no traducidas. Una region 3' no traducida es un polinucleotido localizado despues del extremo 3' de una secuencia codificadora. Las secuencias

15 seral de poliadenilacion y otras secuencias que codifican serales reguladoras capaces de afectar a la adicion de extensiones de acido poliadenilico al extremo 3' del ARNm precursor son regiones 3' no traducidas. Una region 5' no traducida es un polinucleotido localizado antes del extremo 5' de una secuencia codificadora.

[0062] La region de terminacion puede ser nativa con respecto a la region de inicio de la transcripcion, puede

20 ser nativa con respecto a la secuencia de la presente invencion o puede derivar de otra fuente. Las regiones de terminacion convenientes estan disponibles a partir del plasmido Ti de A. tumefaciens, como las regiones de terminacion de la octopina sintetasa y de la nopalina sintetasa. Veanse tambien Guerineau y col., Mol. Gen. Genet., 1991, 262:141-144; Proudfoot, Cell, 1991, 64:671-674; Sanfacon y col., Genes Dev. 1991, 5:141-149; Mogen y col., Plant Cell, 1990, 2:1261-1272; Munroe y col., Genes, 1990, 91:151-158; Ballas y col., Nucleic Acids Res., 1989,

25 17:7891-7903 y Joshi y col., Nucleic Acid Res., 1987, 15:9627-9639.

[0063] Cuando sea apropiado, el vector y las secuencias de OsENOD93 pueden optimizarse para aumentar su expresion en la celula huesped transformada. Es decir, las secuencias pueden sintetizarse usando codones preferidos por la celula huesped para mejorar su expresion o pueden sintetizarse usando codones a una frecuencia

30 de uso de codon preferida por el huesped. En general, el contenido en GC del polinucleotido aumentara. Veanse, por ejemplo, Campbell y col., Plant Physiol., 1990, 92:1-11 para una discusion sobre el uso de codones preferido por el huesped. En la tecnica se conocen procedimientos para sintetizar polinucleotidos preferidos por el huesped. Veanse por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.D 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831 y 5.436.391, solicitudes publicadas de EE. UU. N.D 20040005600 y 20010003849, y Murray y col., Nucleic Acids Res., 1989, 17:477-498.

35 [0064] Por ejemplo, pueden dirigirse los polinucleotidos de interes para su expresion en el cloroplasto. De esta forma, donde el polinucleotido de interes no este insertado directamente en el cloroplasto, el casete de expresion puede contener adicionalmente un polinucleotido que codifique un peptido de transito para dirigir el nucleotido de interes hacia los cloroplastos. Estos peptidos de transito son conocidos en la tecnica. Veanse, por ejemplo, Von

40 Heijne y col., Plant Mol. Biol. Rep., 1991, 9:104-126; Clark y col., J. Biol. Chem., 1989, 264:17544-17550; Della-Cioppa y col., Plant Physiol., 1987, 84:965-968; Romer y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, 196:14141421 y Shah y col., Science, 1986, 233:478-481. Se puede optimizar la expresion en el cloroplasto de los polinucleotidos de interes que se dirigen al cloroplasto para explicar las diferencias en el uso de codones entre el nucleo de la planta y este organulo. De esta forma pueden sintetizarse los polinucleotidos de interes usando

45 codones preferidos por los cloroplastos. Vease por ejemplo, la patente de EE. UU. N.D 5.380.831.

[0065] Un casete de expresion en plantas (es decir, un marco de lectura abierto de OsENOD93 unido de forma operativa a un promotor) puede insertarse en un vector de transformacion de plantas, que permite la transformacion del ADN dentro de una celula. Esta molecula puede constar de uno o mas casetes de expresion y

50 puede estar organizada en mas de una moleculas de ADN vector. Por ejemplo, los vectores binarios son vectores de transformacion de plantas que utilizan dos vectores de ADN no contiguos para codificar todas las funciones de activacion en cis y trans requeridas para la transformacion de las celulas vegetales (Hellens y col., Trends in Plant Science, 2000, 5:446-451).

55 [0066] Un vector de transformacion de plantas comprende uno o mas vectores de ADN para conseguir la transformacion de la planta. Por ejemplo, es una practica habitual en la tecnica utilizar vectores de transformacion de plantas que comprendan mas de un segmento de ADN contiguo. A menudo, estos vectores se denominan en la tecnica vectores binarios. Los vectores binarios, al igual que los vectores con plasmidos auxiliares, se utilizan mas frecuentemente para la transformacion mediada por Agrobacterium, donde el tamaro y la complejidad de los

segmentos que necesitan una transformacion eficaz es bastante grande, y supone una ventaja para separar funciones en moleculas de ADN independientes. Normalmente los vectores binarios contiene un vector plasmidico que contiene las secuencias que actuan en cis necesarias para transferir el ADN-T (como los bordes izquierdo y derecho), un marcador seleccionable que se manipula geneticamente para que sea capaz de expresarse en una 5 celula vegetal, y un polinucleotido de interes (es decir, un polinucleotido manipulado geneticamente para que sea capaz de expresarse en una celula vegetal para la que se desea la generacion de plantas transgenicas). Tambien se encuentran en este vector plasmidico las secuencias necesarias para la replicacion bacteriana. Las secuencias que actuan en cis se disponen de forma que permitan la transferencia eficaz dentro de las celulas vegetales y su expresion en las mismas. Por ejemplo, la secuencia del marcador seleccionable y la secuencia de interes se 10 localizan entre los bordes izquierdo y derecho. A menudo un segundo vector plasmidico contiene los factores que actuan en trans que median en la transferencia del ADN-T desde Agrobacterium a las celulas vegetales. Este plasmido a menudo contiene las funciones de virulencia (genes Vir) que permiten la infeccion de las celulas vegetales por Agrobacterium y la transferencia del ADN mediante la escision de las secuencias bordes y la transferencia de ADN mediada por vir, como se conoce en la materia (Hellens y col., 2000). Pueden usarse varios

15 tipos de cepas de Agrobacterium (p. ej., LBA4404, GV3101, EHA101, EHA105, etc.) para la transformacion de plantas. El segundo vector plasmidico no es necesario para la introduccion de polinucleotidos dentro de las plantas por otros procedimientos como microproyeccion, microinyecccion, electroporacion, polietilenglicol, etc.

II.B. Celulas huesped

20 [0067] Las celulas huesped son celulas en las que puede introducirse una molecula de acido nucleico heterologo. Entre las celulas huesped eucariotas representativas se incluyen celulas de levadura y vegetales, asi como huespedes procariotas como E. coli y Bacillus subtilis. Las celulas huesped preferidas para ensayos funcionales carecen sustancial o completamente de expresion endogena de una proteina OsENOD93.

25 [0068] Puede elegirse una cepa de celula huesped que lleve a cabo la expresion de la secuencia recombinante, o modifique y procese el producto genico de forma especifica. Por ejemplo, diferentes celulas huesped tienen mecanismos caracteristicos y especificos para el procesamiento y modificacion traduccional y postraduccional (p. ej., glucosilacion, fosforilacion de proteinas, etc). Pueden elegirse lineas celulares o celulas

30 huesped apropiadas para asegurar la modificacion deseada y el procesamiento de la proteina extrara expresada. Por ejemplo, puede usarse la expresion en un sistema bacteriano para producir un producto proteico central sin glucosilar y la expresion en levaduras producira un producto glucosilado.

[0069] La presente invencion ademas abarca la expresion recombinante de una proteina OsENOD93 en una

35 linea celular estable. Los procedimientos para generar una linea celular estable tras la transformacion de una construccion heterologa en una celula huesped son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Joyner, Gene Targeting: A Practical Approach, 1993, Oxford University Press, Oxford/Nueva York. Por tanto, se entiende que celulas, tejidos y plantas transformados abarcan no solo el producto final de un proceso de transformacion sino tambien a su progenie transgenica o formas propagadas.

III. Plantas que sobreexpresan OsENOD93

[0070] La presente invencion tambien proporciona plantas que sobreexpresan OsENOD93 que comprende un acido nucleico o proteina OsENOD93 sobreexpresada. La presente invencion tambien proporciona la generacion de

45 plantas con expresion condicionada o inducible de OsENOD93.

[0071] Pueden prepararse plantas que sobreexpresen OsENOD93 tanto a partir de plantas monocotiledoneas como dicotiledoneas, por ejemplo, en maiz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodon, arroz, soja, remolacha azucarera, cara de azucar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo,

50 alazor, cacahuetes, boniato, mandioca, cafe, coco, pira, arboles de citricos, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, nueces de macadamia, almendras, avena, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Entre las verduras representativas se incluyen tomate, lechuga, judias verdes, frijoles, guisantes, batata, cebolla y miembros del genero Curcumis como pepino, melon y sandia. Entre las plantas ornamentales se incluyen, pero sin limitaciones, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias,

55 clavel, flor de pascua y crisantemo. Segun se usa en este documento, el termino planta se refiere a una planta completa, un organo de una planta (p. ej., hojas, tallos, raices, etc), una semilla, una celula vegetal, un propagulo, un embrion y la progenie de la misma. Las celulas vegetales pueden estar diferenciadas o indiferenciadas (p. ej., callo, celulas en cultivo en suspension, protoplastos, celulas de la hoja, celulas de la raiz, celulas de floema, polen, etc.).

[0072] Las plantas que sobreexpresan OsENOD93 pueden estar modificadas adicionalmente en un locus diferente al de OsENOD93 para conferirle un aumento en el uso eficiente del nitrogeno u otra caracteristica de interes. Entre las caracteristicas deseadas representativas se incluyen la mejora del rendimiento de las cosechas, aumento del rendimiento de semillas, aumento del contenido de aminoacidos, aumento del contenido de nitrato, 5 aumento de la tolerancia al estres, resistencia a insectos, tolerancia a herbicidas de amplio espectro, resistencia a enfermedades causadas por virus, bacterias, hongos y helmintos, y potenciamiento de los mecanismo de proteccion frente a presiones medioambientales como calor, frio, sequia y alta concentracion salina. Entre las caracteristicas deseadas adicionales se incluyen caracteristicas fenotipicas que benefician a los consumidores, por ejemplo, alimentos nutricionalmente enriquecidos que contienen mas almidon o proteina, mas vitaminas, mas antioxidantes 10 y/o menos acidos grasos trans; alimentos con mejor sabor, aumento de la durabilidad y mejores caracteristicas de maduracion; arboles que facilitan la produccion de papel con menos perjuicio para el medio ambiente, tabaco sin nicotina, flores ornamentales con nuevos colores, fragancias y aumento de su duracion, etc. Aun adicionalmente, entre las caracteristicas deseadas que pueden utilizarse segun la descripcion se incluyen productos genicos producidos en plantas como medio de fabricacion, por ejemplo, de proteinas terapeuticas para el tratamiento de 15 enfermedades y vacunas; fibras textiles; plasticos biodegradables, aceites utilizados en pinturas, detergentes y lubricantes, etc. En el caso de las modificaciones geneticas que confieren caracteristicas asociadas con una alteracion de la expresion genica, el contenido de nitrato, contenido de aminoacidos, captacion de nitrato, crecimiento lateral de las raices o biomasa de la planta, la combinacion de una planta que sobreexpresa OsENOD93 y una segunda modificacion genetica puede producir un efecto sinergico, es decir, un cambio en la expresion genica,

20 el contenido de nitrato, contenido de aminoacidos, captacion de nitrato, crecimiento lateral de las raices o biomasa de la planta que sea mayor que el cambio inducido por cada modificacion genetica por separado.

[0073] Para la preparacion de una planta que sobreexpresa OsENOD93, la introduccion de un polinucleotido en celulas vegetales se consigue mediante una de las diversas tecnicas conocidas en la materia incluyendo, pero

25 sin limitaciones, electroporacion o transformacion quimica (vease, por ejemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, Indiana. Los marcadores que confieren resistencia a sustancias toxicas son utiles para identificar celulas transformadas (que ha captado y expresado la secuencia polinucleotidica problema) de celulas no transformadas (aquellas que no contienen ni expresan la secuencia polinucleotidica problema). En un aspecto de la invencion, los genes son utiles como marcadores para

30 evaluar la introduccion de ADN dentro de las celulas vegetales. Plantas transgenicas, plantas transformadas o plantas transformadas de forma estable, o celulas, tejidos o semillas de cualquiera de las anteriores, se refiere a plantas que han incorporado o integrado polinucleotidos exogenos en sus celulas. El termino transformacion estable se refiere a la introduccion de una construccion polinucleotidica en una planta, de modo que esta se integre en el genoma de la planta y sea capaz de ser heredada por su progenie.

35 [0074] En general, los procedimientos de transformacion de plantas suponen transferir a las celulas de la planta diana ADN heterologo (p. ej., embriones inmaduros o maduros, cultivos en suspension, callos indiferenciados, protoplastos, etc.), seguido de la aplicacion de un nivel de umbral maximo de seleccion adecuada (dependiendo del gen marcador seleccionable) para recuperar las celulas vegetales transformadas a partir de un grupo de masa

40 celular no transformada. Normalmente los explantes se transfieren al mismo medio recien preparado y se cultivan de forma rutinaria. Posteriormente, las celulas transformadas se diferencian en brotes despues de colocarlas en medio de regeneracion suplementado con un nivel umbral maximo del agente de seleccion (es decir, temperatura y/o herbicida). A continuacion, los brotes se transfieren a un medio de enraizamiento selectivo para recuperar los brotes

o plantulas con raices. Despues la plantula transgenica se convierte en una planta madura y produce semillas

45 fertiles (p. ej., Hiei y col., Plant J., 1994, 6:271-282; Ishida y col., Nat. Biotechnol., 1996, 14:745-750). Una descripcion general de las tecnicas y procedimientos para la generacion de plantas transgenicas se encuentra en Ayres y col., CRC Crit. Rev. Plant Sci., 1994. 13:219-239 y Bommineni y col., Maydica, 1997, 42:107-120. Puesto que el material transformado contiene muchas celulas, en cualquier fragmento de callo diana en cuestion o tejido o grupo de celulas aparecen tanto celulas transformadas como no transformadas. La capacidad para eliminar celulas

50 no transformadas y permitir que las celulas transformadas proliferen tiene como resultado cultivos de plantas transformadas. A menudo la capacidad para eliminar celulas no transformadas es una limitacion para la rapida recuperacion de celulas vegetales transformadas y para la generacion con exito de plantas transgenicas. A continuacion pueden usarse procedimientos moleculares y bioquimicos para confirmar la presencia de los nucleotidos de interes integrados en el genoma de la planta transgenica.

55 [0075] La generacion de plantas transgenicas puede realizarse mediante uno de los diversos procedimientos entre los que se incluyen, pero sin limitaciones, la introduccion de ADN heterologo mediante Agrobacterium en las celulas vegetales (transformacion mediada por Agrobacterium), bombardeo de las celulas vegetales con ADN heterologo extraro adherido a particulas y diversos otros procedimientos directos no mediados por particulas (p.

ej., Hiei y col., Plant J., 1994, 6:271-282; Ishida y col., Nat. Biotechnol., 1996, 14:745-750; Ayres y col., CRC Crit. Rev. Plant Sci., 1994, 13:219-239; Bommineni y col., Maydica, 1997, 42:107-120) para transferir el ADN.

[0076] Existe tres procedimientos habituales para transformar celulas vegetales con Agrobacterium. El primer

5 procedimiento es el cocultivo de Agrobacterium con protoplastos aislados cultivados. Este procedimiento requiere un sistema de cultivo establecido que permite cultivar protoplastos y la regeneracion de plantas a partir de protoplastos cultivados. El segundo procedimiento es la transformacion de celulas o tejidos con Agrobacterium. Este procedimiento requiere a) que las celulas o tejidos vegetales puedan transformarse con Agrobacterium y b) que pueda inducirse a las celulas o tejidos transformados a regenerarse en plantas completas. El tercer procedimiento es

10 la transformacion de semillas, apices o meristemas con Agrobacterium. Este procedimiento requiere de micropropagacion.

[0077] La eficiencia de la transformacion mediante Agrobacterium puede potenciarse usando varios procedimientos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se ha demostrado que la inclusion de una molecula natural de

15 respuesta a heridas como la acetosiringona (AS) en el medio de cultivo de Agrobacterium potencia la eficacia de la transformacion con Agrobacterium tumefaciens (Shahla y col, Plant Molec. Biol, 1987, 8:291-298). Alternativamente, la eficiencia de transformacion puede potenciarse lacerando el tejido diana que se va a transformar. La laceracion del tejido vegetal puede conseguirse, por ejemplo, mediante perforacion, maceracion, bombardeo con microproyectiles, etc. Vease, por ejemplo, Bidney y col., Plant Molec. Biol, 1992, 18:301-313.

20 [0078] En otro aspecto de la invencion, las celulas vegetales se transfectan con vectores mediante bombardeo de particulas (es decir, con una pistola de genes). Los procedimientos de transferencia de genes mediada por particulas son conocidos en la tecnica, estan disponibles en el mercado e incluyen, pero sin limitaciones, el apartado de administracion de genes dirigido por gas descrito en la patente de EE. UU. N.D 5.584.807. Este procedimiento

25 supone recubrir particulas de metal pesado con la secuencia polinucleotidica y acelerar las particulas recubiertas mediante la presion de gas comprimido para su administracion al tejido diana.

[0079] Tambien estan disponibles otros procedimientos de bombardeo de particulas para la introduccion de secuencias polinucleotidicas heterologas en las celulas de la planta. En general, estos procedimientos suponen el 30 deposito de la secuencia polinucleotidica de interes sobre la superficie de particulas pequeras y densas de un material como oro, platino o tungsteno. A continuacion, las particulas recubiertas se colocan recubriendo ellas mismas una superficie rigida, como una placa metalica o una lamina portadora hecha de un material fragil como el tereftalato de polietileno. La lamina recubierta se acelera despues hacia el tejido biologico diana. El uso de la lamina plana genera una propagacion uniforme de las particulas aceleradas que maximiza el numero de celulas que reciben

35 particulas en condiciones uniformes, lo que tiene como resultado la introduccion de la muestra de polinucleotido en el tejido diana.

[0080] Tambien pueden usarse serales de iniciacion especificas para lograr una traduccion mas eficaz de las secuencias que codifican el polipeptido de interes. Estas serales incluyen el codon de iniciacion ATG y secuencias 40 adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican el polipeptido de interes, su codon de iniciacion y las secuencias antes del extremo 5' estan insertadas en el vector de expresion adecuado, puede que no se necesiten serales de control de la transcripcion o de la traduccion adicionales. Sin embargo, en los casos en los que solo se inserta la secuencia codificadora, o una porcion de la misma, deberan proporcionarse serales exogenas de control de la traduccion, incluyendo el codon de iniciacion ATG. Ademas, el codon de iniciacion deberia estar en el

45 marco de lectura correcto para asegurar la traduccion de la insercion completa. Los elementos exogenos de traduccion y los codones de iniciacion pueden ser de diversos origenes, tanto naturales como sinteticos. La eficacia de la expresion puede potenciarse mediante la inclusion de potenciadores que sean apropiados para el sistema celular en particular que se usa, como los descritos en la literatura (Scharf y col., Results Probl. Cell Differ., 1994, 20:125).

50 [0081] En otro aspecto de la presente invencion se modifica al menos una copia genomica correspondiente a una secuencia nucleotidica de la presente invencion en el genoma de la planta mediante recombinacion homologa como se muestra con mas detalle en Paszkowski y col., EMBO Journal 1988, 7:4021-26. Esta tecnica utiliza la propiedad de las secuencias homologas para reconocerse entre si e intercambiar secuencias de nucleotidos entre

55 cada una mediante un proceso conocidos en la tecnica como recombinacion homologa. La recombinacion homologa puede producirse entre la copia cromosomica de una secuencia de nucleotidos en una celula y una copia entrante de la secuencia de nucleotidos introducida en la celula mediante transformacion. Por tanto, se introducen modificaciones especificas con exactitud en la copia cromosomica de la secuencia de nucleotidos. En un aspecto, los elementos reguladores de la secuencia de nucleotidos de la presente invencion estan modificados. Estos elementos reguladores se obtienen facilmente mediante analisis de una biblioteca genomica usando la secuencia de nucleotidos de la presente invencion, o una porcion de la misma, como sonda. Los elementos reguladores existentes se sustituyen por elementos reguladores diferentes alterando de este modo la expresion de la secuencia de nucleotidos.

5 [0082] Las celulas que han sido transformadas pueden crecer en plantas segun maneras convencionales. Vease, por ejemplo, McCormick y col., Plant Cell Rep., 1986, 5:81-84. Estas plantas pueden crecer a continuacion y pueden polinizarse con la misma variedad transformada o con variedades diferentes, y el hibrido resultante tendra la expresion constitutiva de la caracteristica fenotipica deseada identificada. Pueden crecerse dos o mas generaciones

10 para confirmar que la expresion de la caracteristica fenotipica deseada se mantiene y se hereda de forma estable y, a continuacion, se recolectan las semillas para confirmar que se ha conseguido la expresion de la caracteristica fenotipica deseada. De esta forma, la presente invencion proporciona semillas transformadas (denominadas tambien semillas transgenicas) que tienen un polinucleotido de la descripcion, por ejemplo, un casete de expresion de la descripcion, incorporado de forma estable en su genoma.

15 [0083] Las plantas transgenicas de la invencion pueden ser homocigotas para los polinucleotidos aradidos, es decir, una planta transgenica que contiene dos secuencias aradidas, una secuencia en el mismo locus de cada cromosoma de una pareja de cromosomas. Una planta transgenica homocigota puede obtener mediante apareamiento sexual (autopolinizacion) de una planta transgenica segregadora independiente que contiene las

20 secuencias aradidas segun la invencion, germinacion de algunas de las semillas producidas y analisis de las plantas resultantes para potenciar la actividad enzimatica (es decir, resistencia a herbicidas) y/o aumento del rendimiento de la planta en relacion con un control (nativo, no transgenico) o una planta transgenica segregadora independiente.

[0084] Se entendera que tambien pueden aparearse dos plantas transgenicas diferentes para obtener

25 descendencia que contenga dos polinucleotidos exogenos aradidos que se segreguen independientemente. La autopolinizacion de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas para todos los polinucleotidos exogenos aradidos que codifican un polipeptido de la presente descripcion. Tambien se contemplan el retrocruzamiento con una planta parental y la alofecundacion con una planta no transgenica.

30 [0085] Tras la introduccion del ADN en las celulas vegetales, la transformacion o integracion del polinucleotido en el genoma de la planta se confirma mediante diversos procedimientos como el analisis de polinucleotidos, polipeptidos y metabolitos asociados con la secuencia integrada.

IV. Ligandos de union y activadores de OsENOD93

35 [0086] La presente descripcion ademas describe ensayos para identificar los ligandos de union a OsENOD93 y activadores de OsENOD93. Los activadores de OsENOD93 son agentes que alteran las actividades o propiedades quimicas y biologicas de una proteina OsENOD93. Entre estas actividades y propiedades quimicas y biologicas se pueden incluir, pero sin limitaciones, los niveles de expresion de acidos nucleicos OsENOD93 y los niveles de

40 expresion de acidos nucleicos sujetos a regulacion de OsENOD93. Los procedimientos de identificacion de activadores implican analizar un nivel o cualidad potenciada de la funcion de OsENOD93 en presencia de uno o mas agentes de ensayo. Entre los activadores de OsENOD93 representativos se incluyen moleculas pequeras como entidades biologicas, como se describe a continuacion en este documento.

45 [0087] Un nivel o atributo control de la actividad de OsENOD93 se refiere a un nivel o atributo de la actividad OsENOD93 de tipo silvestre, por ejemplo, cuando se usa un sistema de expresion recombinante que comprende la expresion de la SEQ ID NO: 3. Cuando se evalua la capacidad activadora de un agente de ensayo, un nivel o atributo control de la actividad OsENOD93 comprende un nivel o cualidad de la actividad en ausencia del agente de ensayo.

50 [0088] Cambio significativo en la actividad de una proteina OsENOD93 se refiere a un cambio cuantificable en un atributo mensurable que es mayor que el margen de error inherente en la tecnica de medicion. Por ejemplo, inhibicion significativa se refiere a la actividad OsENOD93 que se reduce en aproximadamente 2 veces o mas en relacion con una medicion control o una reduccion de 5 veces o mas, o una reduccion de aproximadamente 10

55 veces o mas. Una inhibicion significativa se refiere a la actividad OsENOD93 que aumenta en aproximadamente 2 veces o mas en relacion con una medicion control o una reduccion de 5 veces o mas, o una reduccion de aproximadamente 10 veces o mas.

[0089] Un ensayo de la funcion de OsENOD93 puede comprender determinar el nivel de expresion genica de

OsENOD93, determinar la actividad de union a ADN de una proteina OsENOD93 expresada mediante tecnologia recombinante, determinar una conformacion activa de una proteina OsENOD93 o determinar la activacion de los eventos de seralizacion en respuesta a la union de un activador de OsENOD93 (p. ej., aumento de la expresion de transportadores de nitrato, aumento del contenido de nitrato, aumento del contenido de aminoacidos, aumento de la 5 captacion de nitrato, aumento de la germinacion de las raices laterales y/o aumento de la biomasa). Por ejemplo, un procedimiento de identificacion de un activador de OsENOD93 comprende a) proporcionar una celula que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la celula con uno o mas agentes de ensayo o un agente de control; c) analizar la expresion de un acido nucleico que codifique la proteina OsENOD93 y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca la elevacion de la expresion del acido nucleico cuando se pone en contacto con el agente de

10 ensayo cuando se compara con el agente de control.

[0090] Segun la presente descripcion tambien se proporciona un procedimiento de seleccion rapido y de alto rendimiento que depende de los procedimientos descritos en este documento. Este procedimiento de seleccion comprende poner en contacto independientemente una proteina OsENOD93 con diversos agentes de ensayo. En

15 este procedimiento de ensayo la diversidad de los agentes de ensayo puede comprende mas de aproximadamente 104 muestras o mas de aproximadamente 105 muestras, o mas de aproximadamente 106 muestras.

[0091] Los ensayos in vitro y celulares de la descripcion puede comprender ensayos solubles o puede comprender adicionalmente un sustrato en fase solida para inmovilizar uno o mas componentes del ensayo. Por

20 ejemplo, una proteina OsENOD93, o una celula que exprese una proteina OsENOD93, puede estar unida directamente a un componente en estado solido a traves de un enlace covalente o no covalente. Opcionalmente, la union puede incluir una molecula enlazadora o una etiqueta que medie en la union indirecta de una proteina OsENOD93 a un sustrato.

25 IV.A. Agentes de ensayo

[0092] La expresion agente de ensayo se refiere a cualquier agente que potencialmente interacciona con un acido nucleico o proteina OsENOD93, incluyendo cualquier producto sintetico, recombinante o natural. Un agente de ensayo que se sospecha interacciona con una proteina puede evaluarse usando los procedimientos descritos en

30 este documento.

[0093] Entre los agentes de ensayo representativos se incluyen, pero sin limitaciones peptidos, proteinas, acidos nucleicos, moleculas pequeras (p. ej., compuestos quimicos organicos e inorganicos), anticuerpos o fragmentos de los mismos, moleculas de fusion acido nucleico-proteina, cualquier otro agente de afinidad y sus

35 combinaciones. Un agente de ensayo que se va a analizar puede ser una molecula purificada, una muestra homogenea o una mezcla de moleculas o compuestos.

[0094] La expresion una molecula pequera se refiere a un compuesto, por ejemplo un compuesto organico, con un peso molecular menor de aproximadamente 1.000 daltons, mas preferiblemente menor de aproximadamente

40 750 daltons, aun mas preferiblemente menor de aproximadamente 600 daltons y aun mas preferiblemente menor de aproximadamente 500 daltons. Una molecula pequera tambien tiene preferiblemente un coeficiente de reparto octanol-agua registrado en el intervalo de aproximadamente -4 a aproximadamente +14, mas preferiblemente en el intervalo de aproximadamente -2 a aproximadamente +7,5.

45 [0095] Los agentes de ensayo pueden obtenerse o prepararse como una biblioteca o coleccion de moleculas. Una biblioteca puede contener algunas o una gran cantidad de moleculas diferentes, variando de aproximadamente 10 molecula a varios miles de millones de moleculas o mas. Una molecula puede comprender una molecula natural, una molecula recombinante o una molecula sintetica. Los diversos agentes de ensayo de una biblioteca puede analizarse simultaneamente. De forma opcional, los agentes de ensayo derivados de diferentes bibliotecas pueden

50 agruparse para una evaluacion simultanea.

[0096] Entre las bibliotecas representativas se incluyen, pero sin limitaciones, una biblioteca de peptidos (patentes de EE. UU. N.D 6.156.511, 6.107.059, 5.922.545 y 5.223.409), una biblioteca de oligomeros (patentes de EE. UU. N.D 5.650.489 y 5.858.670), una biblioteca de aptameros (patentes de EE. UU. N.D 7.338.762; 7.329.742;

55 6.949.379; 6.180.348 y 5.756.291), una biblioteca de moleculas pequeras (patentes de EE. UU. N.D 6.168.912 y 5.738.996), una biblioteca de anticuerpos o de fragmentos de anticuerpo (patentes de EE. UU. N.D 6.174.708, 6.057.098, 5.922.254, 5.840.479, 5.780.225, 5.702.892 y 5.667.988), una biblioteca de moleculas de fusion acido nucleico-proteina (patente de EE. UU. N.D 6.214.553) y una biblioteca de cualquier otro agente de afinidad que pueda unirse potencialmente a una proteina OsENOD93.

[0097] Una biblioteca puede comprender una coleccion aleatoria de moleculas. Alternativamente, una biblioteca puede comprender una coleccion de moleculas que tienen una preferencia por una secuencia, estructura o conformacion en particular, por ejemplo, por acidos nucleicos inhibidores. Veanse por ejemplo las patentes de EE.

5 UU. N.D 5.264.563 y 5.824.483. Se conocen en la tecnica procedimientos para preparar bibliotecas que contengan poblaciones diversas de diversos tipos de moleculas, por ejemplo como se describe en las patentes de EE. UU. citadas anteriormente en este documento. Muchas bibliotecas tambien estan disponibles en el mercado.

IV.B. Ensayos de union

10 [0098] En otro aspecto de la descripcion, un procedimiento de identificacion de un activador de OsENOD93 comprende determinar la union especifica de un agente de ensayo a una proteina OsENOD93. Por ejemplo, un procedimiento de identificacion de ligando de union de OsENOD93 puede comprender: a) proporcionar una proteina OsENOD93 de SEQ ID NO: 3; b) poner en contacto la proteina OsENOD93 con uno o mas agentes de ensayo en

15 condiciones suficientes para la union, c) analizar la union de un agente de ensayo a la proteina OsENOD93 aislada y d) seleccionar un agente de ensayo que muestre una union especifica a la proteina OsENOD93. La union especifica tambien puede abarcar una cualidad o estado de accion mutua de modo que la union de un agente de ensayo a la proteina OsENOD93 sea inhibitoria o inductora.

20 [0099] El termino union especifica se refiere a una reaccion de union que es determinante de la presencia de la proteina en una poblacion heterogenea de proteinas y de otros materiales biologicos. La union de un agente de ensayo a una proteina OsENOD93 puede considerarse especifica si la afinidad de union es de aproximadamente 1x104 M-1 a aproximadamente 1x106 M-1 o superior. Union especifica tambien hace referencia a una union saturable. Para demostrar la union saturable de un agente de ensayo a una proteina OsENOD93, puede realizarse un analisis

25 de Scatchard como se describe, por ejemplo, en Mak y col., J. Biol. Chem., 1989, 264:21613-21618

[0100] Pueden usarse varias tecnicas para detectar las interacciones entre una proteina OsENOD93 y un agente de ensayo sin emplear un inhibidor competitivo conocido. Entre los procedimientos representativos se incluyen, pero sin limitaciones, espectroscopia de correlacion de fluorescencia, desorcion/ionizacion laser inducida

30 en superficie, espectroscopia de tiempo de vuelo y tecnologia BIACORE®, descrita cada una de ellas a continuacion en este documento. Estos procedimientos puede adaptarse a un analisis automatico de alto rendimiento.

[0101] La espectroscopia de correlacion de fluorescencia (FCS, por sus siglas en ingles) mide la tasa de difusion media de una molecula fluorescente dentro de un pequero volumen de muestra. El tamaro de la muestra 35 puede ser de tan solo 103 moleculas fluorescentes y el volumen de muestra de tan solo el citoplasma de una unica bacteria. La tasa de difusion es una funcion de la masa de la molecula y disminuye cuando la masa aumenta. Por tanto, la FCS puede aplicarse al analisis de la interaccion proteina-ligando midiendo el cambio en la masa y, en consecuencia, en la tasa de difusion de una molecula tras la union. En un experimento tipico, la diana analizada (p. ej., una proteina OsENOD93) se expresa como una proteina recombinante con una secuencia etiqueta, como una 40 secuencia polihistidina, insertada en el extremo N-terminal o C-terminal. La expresion esta mediada en una celula huesped, como E. coli, levadura, oocitos de Xenopus o celulas de mamifero. La proteina se purifica utilizado procedimientos cromatograficos. Por ejemplo, puede utilizarse la etiqueta de polihistidina para unir la proteina expresada a una columna con un metal quelante como Ni2+ quelado sobre una agarosa con acido iminodiacetico. A continuacion, la proteina se marca con una etiqueta fluorescente como carboxitetrametilrodamina o reactivo

45 BODIPYTM (disponible en Molecular Probes de Eugene, Oregon). Despues, la proteina se expone en solucion al posible ligando y se determina su tasa de difusion mediante FCS usando la instrumentacion disponible de Carl Zeiss, Inc. (Thomwood of New York, Nueva York). La union al ligando se determina por los cambios en la tasa de difusion de la proteina.

50 [0102] La desorcion/ionizacion por laser inducida en superficie (SELDI) fue desarrollada por Hutchens y Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1993, 7:576-580. Cuando se acopla a un espectro de masa de tiempo de vuelo (TOF), SELDI proporciona una tecnica para analizar rapidamente las moleculas retenidas en un chip. Puede aplicarse al analisis de la interaccion ligando-proteina mediante la union covalente a la proteina diana, o a una porcion de la misma, sobre el chip y analizar mediante espectrometria de masa las moleculas pequeras que se

55 unen a esta proteina (Worrall y col., Anal Chem., 1998, 70(4):750-756). En un experimento tipico, se expresa de forma recombinante y se purifica una proteina diana (p. ej., una proteina OsENOD93). La proteina diana se une a un chip de SELDI utilizando una etiqueta polihistidina o mediante otra interaccion como intercambio ionico o interaccion hidrofoba. Un chip preparado de este modo, se expone a continuacion al posible ligando a traves, por ejemplo, de un sistema de administracion capaz de pipetear los ligandos de forma secuencial (automuestreador). Despues el chip se lava en soluciones de rigurosidad creciente, por ejemplo, una serie de lavados con soluciones tampon de fuerza ionica creciente. Tras cada lavado, el material unido se analiza enviando el chip al SELDI-TOF. Los ligandos unidos especificamente a una proteina diana se identifican mediante la rigurosidad del lavado necesaria para eluirlos.

5 [0103] BIACORE® depende de los cambios en el indice de refraccion de la capa superficial tras la union de un ligando a una proteina diana (p. ej., una proteina OsENOD93) inmovilizada sobre la capa. En este sistema se inyecta de forma secuencial una serie de pequeros ligandos en una celula de 2-5 microlitros, en la que la proteina diana esta inmovilizada dentro de la celula. La union se detecta mediante resonancia de plasmon superficial (SPR) registrando la refraccion de la luz laser a partir de la superficie. En general, el cambio del indice de refraccion para

10 un cambio determinado de concentracion de masa en la capa superficial es practicamente la misma para todas las proteinas y peptidos, lo que permite que un unico procedimiento puede aplicarse a cualquier proteina. En un experimento tipico, una proteina diana se expresa mediante tecnologia recombinante, se purifica y se une a un chip BIACORE®. La union puede facilitarse utilizando una etiqueta de polihistidina o mediante otra interaccion, como intercambio ionico o interaccion hidrofoba. A continuacion, un chip preparado de este modo se expone a uno o mas

15 posibles ligandos mediante el sistema de administracion incorporado en los instrumentos comercializados por Biacore (Uppsala, Suecia) para pipetear los ligandos de forma secuencial (automuestreador). La seral SPR del chip se registra y los cambios en el indice de refraccion indican una interaccion entre la diana inmovilizada y el ligando. El analisis de la cinetica de la seral de asociacion y disociacion permiten la discriminacion entre una interaccion especifica e inespecifica. Vease tambien Homola y col., Sensors and Actuators, 1999, 54:3-15 y las referencias

20 incluidas en ese documento.

IV:C. Ensayo conformacional

[0104] La presente descripcion tambien proporciona procedimientos para identificar ligandos de union y

25 activadores de OsENOD93 que dependen de un cambio conformacional de una proteina OsENOD93 cuando se une, o interacciona de cualquier otra forma, con una agente de ensayo. Por ejemplo, la aplicacion del dicroismo circular a las soluciones de macromoleculas muestra los estados conformacionales de estas macromoleculas. La tecnica puede distinguir entre los estados conformacionales de plegamiento aleatorio, helice alfa y cadena beta.

30 [0105] Para identificar parejas de union y activadores de una proteina OsENOD93, puede realizarse un analisis de dicroismo circular usando una proteina ENOD93 expresada de forma recombinante. Una proteina OsENOD93 se purifica, por ejemplo, mediante intercambio ionico y cromatografia de exclusion molecular y se mezcla con un agente de ensayo. La mezcla se somete a dicroismo circular. La conformacion de una proteina OsENOD93 en presencia de un agente de ensayo se compara con la conformacion de una proteina OsENOD93 en

35 ausencia del agente de ensayo. Un cambio en el estado conformacional de una proteina OsENOD93 en presencia de un agente de ensayo identifica un ligando de union o activador de OsENOD93. En las patentes de EE. UU. N.D

5.776.859 y 5.780.242 se describen procedimientos representativos. La actividad del ligando de union o activador puede evaluarse usando ensayos funcionales; entre estos ensayos se incluyen contenido de nitrato, captacion de nitrato, crecimiento lateral de las raices, rendimiento de semillas, contenido de aminoacidos o biomasa de la planta

40 como se describe en este documento.

IV.D. Ensayos funcionales

[0106] En otro aspecto de la descripcion, el procedimiento de identificacion de un activador de OsENOD93

45 emplea una proteina OsENOD93 funcional como se muestra, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 2. Entre los procedimientos representativos para determinar la funcion de OsENOD93 se incluyen ensayos de cambios fisiologicos inducidos por la actividad OsENOD93, por ejemplo, potenciacion del crecimiento lateral de las raices, aumento de la captacion de nitrato, aumento del contenido de nitrato, aumento del rendimiento de semillas, aumento del contenido de aminoacidos y/o aumento de la biomasa de la planta (veanse los ejemplos 1, 3-6, 10 y 12).

50 [0107] Por ejemplo, un procedimiento de identificacion de un activador de OsENOD93 puede comprender a) proporcionar una celula que exprese una proteina OsENOD93, b) poner en contacto la celula con uno o mas agentes de ensayo o un agente de control; c) analizar la expresion de un gen OsENOD93 diana y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca la elevacion de la expresion del gen diana OsENOD93, cuyo gen normalmente esta

55 sometido a induccion por OsENOD93 (p. ej., genes del metabolismo del nitrogeno, genes del metabolismo del carbono y genes transportadores de fosfosintetasas) cuando se pone en contacto con el agente de ensayo en comparacion con el agente de control. Segun los procedimientos descritos, las celulas que expresan OsENOD93 pueden proporcionarse en forma de kit util para realizar un ensayo de funcion de OsENOD93. Por ejemplo, un kit de ensayo para detectar un activador de OsENOD93 puede incluir celulas transfectadas con ADN que codifique una proteina OsENOD93 de longitud completa y un medio para el crecimiento de las celulas.

[0108] El ensayo de actividad de OsENOD93 que emplea celulas transfectadas de forma transitoria puede incluir un marcador que distinga entre las celulas transfectadas y las no transfectadas. El marcador puede estar

5 codificado por, o asociado de cualquier otra forma, con una construccion para la expresion de OsENOD93, de modo que las celulas se transfecten de forma simultanea con una molecula de acido nucleico que codifica OsENOD93 y el marcador. Entre las moleculas detectables representativas que son utiles como marcadores se incluyen, pero sin limitaciones, un acido nucleico heterologo, una proteina codificada por una construccion transfectada (p. ej., una enzima o una proteina fluorescente), una proteina de union y un antigeno.

10 [0109] Un procedimiento para identificar un activador de OsENOD93 tambien puede incluir a) proporcionar una planta que exprese una proteina OsENOD93; b) poner en contacto la planta con uno o mas agentes de ensayo

o un agente de control; c) analizar i) el contenido de nitrato, ii) la captacion de nitrato, iii) el contenido de aminoacidos, iv) el rendimiento de semilla o v) la biomasa y d) seleccionar un agente de ensayo que induzca i)

15 aumento del contenido de nitrato, ii) aumento de la captacion de nitrato, iii) aumento del contenido de aminoacidos, iv) aumento del rendimiento de semillas o v) aumento de la biomasa.

[0110] En los ensayos que emplean celulas que expresan OsENOD93 recombinante o plantas que expresan OsENOD93 pueden emplearse adicionalmente celulas o plantas control que carezcan sustancialmente de 20 OsENOD93 nativa y, opcionalmente, de proteinas sustancialmente similares a una proteina OsENOD93. Cuando se usan celulas transfectadas de forma transitoria, una celula control puede comprender, por ejemplo, una celula huesped no transfectada. Cuando se usa una linea celular estable que expresa una proteina OsENOD93, una celula control puede comprender, por ejemplo, la linea celular parental usada para derivar la linea celular que expresa OsENOD93. Cuando se utilizan plantas, una planta control puede incluir una planta que sobreexpresa OsENOD93.

25 En este cado, un activador de OsENOD93 muestra induce un fenotipo similar a una planta que sobreexpresa OsENOD93.

IV.E. Disero racional

30 [0111] El conocimiento de la estructura de una proteina OsENOD93 nativa proporciona una estrategia para el disero racional de activadores de OsENOD93. Brevemente, la estructura de una proteina OsENOD93 puede determinarse mediante cristalografia de rayos X y/o algoritmos informaticos que generan representaciones tridimensionales. Vease Saqi y col., Bioinformatics, 1999, 15:521-522; Huang y col., Pac. Symp. Biocomput, 2000, 230-241 y la publicacion internacional PCT N.D WO 99/26966. Alternativamente, un modelo de trabajo de la

35 estructura de una proteina ENOD93 puede derivarse mediante modelado por homologia (Maalouf y col., J. Biomol. Struct. Dyn., 1998, 158(5):841-851). Los modelos de ordenador pueden ademas predecir la union de una estructura proteica de diversas moleculas sustrato que pueden sintetizarse y probarse usando los ensayos descritos anteriormente en este documento. En las patentes de EE. UU. N.D 5.834.228 y 5.872.011 se describen tecnicas de disero de compuestos adicionales .

40 [0112] Una proteina OsENOD93 es una proteina soluble que puede purificarse y concentrarse mediante cristalizacion. La proteina OsENOD93 purificada puede cristalizarse en condiciones variables de al menos una de entre las siguientes: pH, tipo de tampon, concentracion de tampon, tipo de sal, tipo de polimero, concentracion de polimero, otros ligando precipitantes y concentracion de OsENOD93 purificada. Los procedimientos para generar

45 una proteina cristalina se conocen en la tecnica y puede adaptarse razonablemente para la determinacion de una proteina OsENOD93 segun se describe en este documento. Vease por ejemplo, Deisenhofer y col., J. Mol. Biol., 1984, 180:385-398; Weiss y col., FEBS Lett., 1990, 267:268-272 o los procedimientos proporcionados en un kit comercial, como el kit CRYSTAL SCREENT (disponible en Hampton Research of Riverside, California, EE. UU.).

50 [0113] En una proteina OsENOD93 cristalizada puede analizarse su actividad funcional y la idoneidad de cristales con diferentes tamaros y formas puede analizarse adicionalmente mediante difraccion de rayos X. En general, los cristales mas grandes proporcionar una mejor cristalografia que los mas pequeros, y los cristales mas gruesos proporcionan una mejor cristalografia que los mas delgados. Preferiblemente, el tamaro de los cristales deOsENOD93 oscila de 0,1 a 1,5 mm. Estos cristales difractan los rayos X a una resolucion de al menos 10 A, como

55 por ejemplo entre 1,5 y 10,0 A o cualquier intervalo de valores entre estos, como 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9; 2,0; 2,1; 2,2;2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5 o 3, prefiriendose 3,5 A o menos para la resolucion mas alta.

IV.F. Anticuerpos OsENOD93 [0114] En otro aspecto de la descripcion, se proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo que se una especificamente a una proteina OsENOD93. Segun el procedimiento, se formula una proteina OsENOD93 recombinante de longitud completa de modo que pueda utilizarse como inmunogeno eficaz y se usa para inmunizar

5 a un animal de manera que se genere una respuesta inmune en el animal. La respuesta inmune se caracteriza por la produccion de anticuerpos que pueden obtenerse a partir del suero sanguineo del animal.

[0115] Un anticuerpo es una proteina inmunoglobulina, o fragmentos de anticuerpo que contienen un sitio de union al antigeno (p. ej., fragmentos Fab, Fab modificados, Fab', F(ab')2 o Fv, o una proteina que tiene al menos una

10 region variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina o al menos una region de la cadena pesada de la inmunoglobulina). Entre los anticuerpos de la descripcion se incluyen dianticuerpos, anticuerpos tetramericos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos tetravalentes, anticuerpos multiespecificos (p. ej., anticuerpos biespecificos) y anticuerpos especificos de dominio que reconocen un epitopo en particular. Las lineas celulares que producen anticuerpos frente a OsENOD93 tambien estan incluidas en la descripcion.

15 [0116] La union especifica de un anticuerpo a una proteina OsENOD93 se refiere a la union preferencial por una proteina OsENOD93 en una muestra heterogenea que comprende multiples antigenos diferentes. El termino carencia sustancial de union describe la union de un anticuerpo a una proteina o muestra control, es decir, un nivel de union caracterizado por union inespecifica o de fondo. La union de un anticuerpo a un antigeno es especifica si la

20 afinidad de union es de al menos aproximadamente 10-7 M o superior, tal como al menos aproximadamente 10-8 M o superior, incluyendo al menos aproximadamente 10-9 M o superior, al menos aproximadamente 10-11 M o superior, o al menos aproximadamente 10-12 M o superior.

[0117] Los anticuerpos frente a OsENOD93 preparados como se describe en este documento pueden usarse

25 en procedimientos conocidos en la tecnica relacionados con la expresion y actividad de las proteinas OsENOD93, por ejemplo, para la clonacion de acidos nucleicos que codifican una proteina OsENOD93, inmunopurificacion de una proteina OsENOD93 y para detectar una proteina OsENOD93 en una muestra de la planta y medir los niveles de una proteina OsENOD93 en muestras de la planta. Para realizar estos procedimientos, un anticuerpo de la presente descripcion puede ademas comprender un marcaje detectable, incluyendo, pero sin limitaciones, un

30 marcaje radioactivo, un marcaje fluorescente, un marcaje de epitopo y un marcaje que pueda detectarse in vivo. Los procedimientos para la seleccion de un marcaje adecuado para una tecnica de deteccion en particular y los procedimientos para conjugar o asociar de cualquier otro modo un marcador detectable con un anticuerpo son conocidos por el experto en la materia.

35 V. Sobreexpresion de OsENOD93

[0118] Los ligandos de union de OsENOD93 y los activadores de OsENOD93 son utiles tanto para aplicaciones in vitro como in vitro relacionadas en general con la evaluacion de respuestas a los niveles de nitrogeno y para favorecer el uso eficiente del nitrogeno. En particular, pueden usarse activadores de OsENOD93 para inducir

40 la transcripcion de OsENOD93, para aumentar el contenido de nitrato en las plantas, para aumentar la captacion de nitrato a traves de las raices de la planta, para aumentar el rendimiento de semillas en plantas, para aumentar el contenido de aminoacidos en plantas y para aumentar la biomasa de plantas.

[0119] La presente descripcion proporciona que se administre una cantidad eficaz de un activador de

45 OsENOD93 a una planta, es decir, una cantidad suficiente para obtener una respuesta biologica deseada. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un activador de OsENOD93 puede comprender una cantidad suficiente para inducir una expresion elevada de OsENOD93, los genes normalmente sometidos a la induccion de OsENOD93 (p. ej., genes del metabolismo del nitrogeno, genes del metabolismo del carbono y genes transportadores de fosfosintetasas), aumento del contenido de nitrato en las raices de la planta, aumento de la captacion de nitrato en

50 las raices de la planta, aumento de la germinacion de la raices laterales, aumento del rendimiento de semillas, aumento del contenido de aminoacidos y aumento de la biomasa.

[0120] Entre las plantas que pueden beneficiarse de la activacion de OsENOD93 se incluyen, pero sin limitaciones, maiz, sorgo, trigo, girasol, tomate, cruciferas, pimientos, patata, algodon, arroz, soja, remolacha 55 azucarera, cara de azucar, tabaco, cebada y colza, Brassica sp., alfalfa, centeno, mijo, alazor, cacahuetes, boniato, mandioca, cafe, coco, pira, arboles de citricos, cacao, te, platano, aguacate, higo, guayaba, mango, aceituna, papaya, anacardo, nueces de macadamia, almendras, avena, verduras, plantas ornamentales y coniferas. Entre los vegetales representativos se incluyen tomates, lechuga, judias verdes, frijoles, guisantes, batata, cebolla y miembros del genero Curcumis como pepino, melon y sandia. Entre las plantas ornamentales representativas se incluyen, pero

sin limitaciones, azalea, hortensia, hibisco, rosas, tulipanes, narcisos, petunias, clavel, flor de pascua y crisantemo. Cualquier de las plantas mencionadas anteriormente puede ser de tipo silvestre, endogamica o transgenica, por ejemplo, variedades de plantas y plantas modificadas geneticamente como las que se utilizan en la agricultura.

5 [0121] Las plantas tratadas con un activador de OsENOD93 pueden ser transgenicas, es decir, geneticamente modificadas en OsENOD93 o en un locus diferente a OsENOD93, para conferir una mejora del uso eficiente del nitrogeno u otra caracteristica de interes. Entre las caracteristicas deseadas representativas se incluyen la mejora del rendimiento de las cosechas, mejora del rendimiento de semillas, aumento del contenido de aminoacidos, aumento del contenido de nitrato, aumento de la tolerancia al estres, resistencia a insectos, tolerancia a herbicidas

10 de amplio espectro, resistencia a enfermedades causadas por virus, bacterias, hongos y helmintos, y potenciamiento de los mecanismos de proteccion frente a presiones medioambientales como calor, frio, sequia y alta concentracion salina. Entre las caracteristicas deseadas adicionales se incluyen caracteristicas fenotipicas que benefician a los consumidores, por ejemplo, alimentos nutricionalmente enriquecidos que contiene mas almidon o proteinas, mas vitaminas, mas antioxidantes y/o menos acidos grasos trans; alimentos con mejor sabor, aumento de la durabilidad y

15 mejores caracteristicas de maduracion; arboles que facilitan la produccion de papel con menos perjuicio para el medio ambiente, tabaco sin nicotina, flores ornamentales con nuevos colores, fragancias y aumento de su duracion, etc. Aun adicionalmente, entre las caracteristicas deseadas que pueden utilizarse segun la descripcion se incluyen productos genicos producidos en plantas como medio de fabricacion, por ejemplo, de proteinas terapeuticas para el tratamiento de enfermedades y de vacunas; fibras textiles; plasticos biodegradables, aceites utilizados en pinturas,

20 detergentes y lubricantes, etc. En el caso de las modificaciones geneticas que confieren caracteristicas asociadas con una alteracion de la expresion genica, el contenido de nitrato, captacion de nitrato, crecimiento lateral de las raices, rendimiento de semillas, contenido de aminoacidos o biomasa de la planta, la combinacion de tratamiento con un activador de OsENOD93 y una modificacion genetica puede producir un efecto sinergico, es decir, un cambio en la expresion genica, el contenido de nitrato, la captacion de nitrato, el crecimiento lateral de las raices, el

25 rendimiento de semillas, el contenido de aminoacidos o la biomasa de la planta que sea mayor que el cambio inducido por cada modificacion genetica por separado.

EJEMPLOS

30 [0122] Los ejemplos siguientes se han incluido para ilustrar los modos de la invencion. Determinados aspectos de los ejemplos siguientes se describen en terminos de tecnicas y procedimientos encontrados o contemplados por los presentes coinventores para trabajar bien en la practica de la invencion. A la vista de la presente descripcion y el nivel general de destreza en la tecnica, los expertos apreciaran que los siguientes ejemplos pretenden ser tan solo eso y que pueden emplearse numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin

35 apartarse del alcance de la invencion.

Ejemplo 1. Cambios en la biomasa de plantas expuestas a diferentes niveles de nitrogeno.

[0123] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre en una mezcla de musgo

40 de turbera y vermiculita (1:4) (SunGro Horticulture Canada Ltd. BC, Canada) con la adicion de una solucion de nutrientes con una cantidad diferente de nitrato una vez a la semana hasta su recoleccion. La solucion de nutrientes contenia MgSO4 4 mM, KCl 5 mM, CaCl2 5 mM, KH2PO4 1 mM, Fe-EDTA 0,1 mM, MES 0,5 mM (pH 6,0), MnSO4 9 !M,ZnSO4 0,7 !M, CuSO4 0,3 !M, NaB4O7 46 !M y (NH4)6Mo7O20,2 !M.Se uso nitrato 10 mMcomo condicion de concentracion alta de nitrogeno, nitrato 5 mM como concentracion media de nitrogeno y nitrato 1 mM como

45 concentracion baja de nitrogeno. Las plantas se cultivaron en una sala de cultivo con 16 horas de luz (-400 !molm2s-1) a 28-30DC y 8 horas de oscuridad a 22-24DC durante cuatro semanas. Los brotes y las raices se recogieron por separado y se evaluaron las diferencias de biomasa como marcador de crecimiento.

[0124] Con una concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) el crecimiento de la planta medido por la

50 biomasa de los brotes se redujo aproximadamente al 70% del de la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) (73% del peso seco) y con la concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM), adicionalmente, el crecimiento de la planta medido por la biomasa de los brotes se redujo aproximadamente al 30% del de la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) (33% del peso seco) (figura 1A). La reduccion de la biomasa de las raices en las dos concentraciones de nitrogeno limitantes era ligeramente mayor que la de los brotes, ya que era del 69% y el 25% del

55 peso seco, respectivamente (figura 1B), lo que daba lugar a un aumento de la relacion brote/raiz con un aumento en el estres de nitrogeno (figura 1C).

Ejemplo 2. Respuesta a la deficiencia de nitrogeno

[0125] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. La clorosis de las hojas y la presencia del flavonoide purpura antocianina son algunas de las respuestas tipicas que las plantas tienen ante la deficiencia de N (Diaz U., y col., Plant and Cell Physiology, 2006, 47: 74-83). El contenido relativo de antocianina se analizo segun el procedimiento descrito por Neff y Chory (Neff MM y Chory J, 5 Plant Physiol, 1998, 118: 27-35). La clorofila total se midio usando el medidor de clorofila SPAD 502DL de Minolta (Tokio, Japon) o se extrajo con etanol y se midio en el espectrofotometro segun Kirk (Kirk, JTO, Planta, Berl., 1968, 78:200). Tanto los niveles de clorofila como los de antocianina en las hojas eran similares en las condiciones de concentraciones alta y media de nitrogeno. En condiciones de concentracion baja de nitrogeno no era tan obvio el color amarillo o purpura en las plantas aunque la reduccion de la clorofila y el aumento de la antocianina eran

10 significativos cuando se comparaba con las condiciones de concentracion alta y media de nitrogeno (figuras 1D y 1E).

Ejemplo 3. Cambios en el contenido de nitrato libre en plantas expuestas a diferentes concentraciones de nitrogeno

15 [0126] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. Se usaron tejidos de brotes y de raiz congelados para determinar las diferencias en el contenido de nitrato en las diferentes condiciones de nitrogeno. El contenido de nitrato se analizo mediante ensayo colorimetrico segun Cataldo DA, y col., Commun. Soil Sci. Plant Anal 1975, 6: 71-80.

20 [0127] El contenido de nitrato libre en los brotes con una concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) se redujo al 70% del de la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) (3,35 mg/g de peso congelado (PC) frente a 4,55 mg/g de PC) y no se observo mucha mas reduccion con la concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) (2,85 mg/g de PC frente a 4,55 mg/g de PC) (figura 2A). El contenido de nitrato libre en las raices se redujo

25 aproximadamente a la mitad (4,8 mg/g de PC frente a 9,9 mg/g de PC) con concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) en comparacion con concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) y se observo una reduccion de al menos 20 veces a la concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) (0,45 mg/g de PC frente a 9,9 mg/g de PC) en comparacion con la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) (figura 2B).

30 Ejemplo 4. Cambios en el contenido de aminoacidos en plantas expuestas a diferentes concentraciones de nitrogeno

[0128] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. Se usaron tejidos de brotes y de raiz congelados para determinar las diferencias en el contenido de

35 aminoacidos en las diferentes condiciones de nitrogeno. Los aminoacidos totales se extrajeron sucesivamente con etanol al 80%, 50% y 0% en tampon HEPES-KOH 10 mM (pH 7,4), los sobrenadantes se agruparon y el contenido de aminoacidos totales se analizo segun Rosen H, Arch. Biochem. Biophys. 1957, 67: 10-15.

[0129] El contenido total de aminoacidos en los brotes a la concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM)

40 se redujo al 77% del de la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) y a la concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) se redujo al 35% del de la concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) (figura 2C). Se observo una reduccion similar en las raices (figura 2D).

Ejemplo 5. Cambios en el contenido de proteina soluble en plantas expuestas a diferentes concentraciones 45 de nitrogeno

[0130] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. Se usaron tejidos de brotes y de raiz congelados para determinar las diferencias en el contenido de proteina soluble en las diferentes condiciones de nitrogeno. La proteina soluble total se extrajo con tampon que

50 contenia HEPES-KOH 100 mM, pH 7,5 y Triton X-100 al 0,1% y se analizo usando el kit de ensayo de proteinas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc. California, EE. UU.).

[0131] El contenido de proteina total soluble en los brotes con la concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) era similar al nivel observado en los brotes de plantas crecidas con concentracion alta de nitrogeno (10 mM) 55 aunque era significativamente inferior al observado con la concentracion baja de nitrogeno (1 mM) (figura 2E). Se observo un resultado similar en las raices crecidas en las mismas condiciones (figura 2F).

Ejemplo 6. Cambios en el contenido de nitrogeno total en plantas expuestas a diferentes concentraciones de nitrogeno

[0132] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. Se usaron tejidos de brotes y de raiz congelados para determinar las diferencias en el contenido de nitrogeno total en las diferentes condiciones de nitrogeno. El porcentaje de nitrogeno total en los tejidos secos se

5 midio mediante el procedimiento de analisis de combustion de Micro-Dumas usando un analizador NA1500 C/N de Carlo Erba (Carlo Erba Strumentazione, Milan, Italia).

[0133] El porcentaje de nitrogeno total en los brotes con la concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) era similar al nivel observado en los brotes de plantas crecidas con concentracion alta de nitrogeno (10 mM), aunque

10 era significativamente inferior al observado con concentracion baja de nitrogeno (1 mM) (figura 2G). Se observo un resultado similar en las raices crecidas en las mismas condiciones (figura 2H).

Ejemplo 7. Identificacion de genes expresados de forma diferencial en plantas expuestas a diferentes concentraciones de nitrogeno

15 [0134] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el ejemplo 1. Se recogieron brotes y raices de plantas silvestres de arroz de 4 semanas cultivadas con concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM), concentracion media de nitrogeno (nitrato 5 mM) y concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) para comparar los niveles de expresion genica basales a concentraciones diferentes pero estables de

20 nitrogeno. Se hicieron tres replicados biologicos para cada concentracion de nitrogeno. Adicionalmente, 2 horas antes de la recogida, se transfirieron algunas plantas cultivadas con concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) a concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) para evaluar los cambios en la expresion genica en respuesta a 2 horas de induccion con nitrogeno. Otras plantas cultivadas con concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) se transfirieron a concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) para evaluar los cambios en la expresion genica en

25 respuesta a 2 horas de reduccion de nitrogeno. Todas las muestras se obtuvieron a mitad del dia para minimizar los cambios diurnos en el metabolismo del carbono y del nitrogeno. Se obtuvieron tres replicados biologicos para cada punto temporal.

[0135] Se usaron 5 !g de ARN total de cada muestra para sintetizar ADNc de cadena doble. El ARN

30 complementario marcado, sintetizado a partir del ADNc se hibrido con una matriz de genoma completo GENECHIP® de arroz con disero personalizado (Zhu T, Current Opinion in Plant Biology 2003, 6: 418-425). La seral de hibridacion de la matriz se adquirio mediante el escaner 3000 de GENECHIP® y se cuantifico mediante MAS 5.0 (Affymetrix, California, EE. UU.). La medida del conjunto de sondas se resumio como valor de la media ponderada de todas las sondas en un conjunto, restando el 5% de fondo de la intensidad media de la matriz completa usando

35 un algoritmo personalizado. La intensidad global de todos los conjuntos de sondas de cada matriz se elevo ademas a una intensidad objetivo de 100 para poder realizar una comparacion directa.

[0136] Se realizaron 8 comparaciones entre las muestras siguientes (cuatro de cada para brotes y raices): 1) concentracion alta de nitrogeno frente a concentracion media de nitrogeno (nitrato 10 mM a nitrato 5 mM); 2)

40 concentracion alta de nitrogeno frente a concentracion baja de nitrogeno (nitrato 10 mM a nitrato 1 mM); 3) concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) frente a concentracion de baja a alta de nitrogeno (induccion de nitrogeno de 2 horas) y 4) concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) frente a concentracion de alta a baja de nitrogeno (reduccion de nitrogeno de 2 horas).

45 [0137] Los datos recogidos se analizaron usando GeneSpring (Agilent, California, EE. UU.). Los datos se normalizaron usando la configuracion predeterminada del programa, seguido del filtrado de genes, lo que requeria que cada gen deberia tener una etiqueta «PD o «MD en los tres replicados de la muestra. A esto le siguio un segundo paso de filtrado que requeria que al menos una de las tres muestras tuviera una etiqueta «PD. Esto garantizaba esencialmente que cada gen que permaneciera en un grupo pudiera ser «PMMD, «PPMD o «PPPD entre

50 los tres replicados. Para las comparaciones de los grupos por pares, se identificaron en primer lugar genes que se expresaban el doble y, a continuacion, se uso ANOVA para identificar genes significativos (punto de corte del valor de p de la prueba de la t de Welch: 0,05).

[0138] Para confirmar los resultados del analisis de micromatrices, la expresion de ocho genes significativos a

55 partir de diferentes grupos de comparacion se analizo mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se aislo el ARN total de los tejidos de la planta usando reactivo TRIZOL (Invitrogen, California, EE. UU.). Para eliminar cualquier ADN genomico residual, el ARN total se trato con ADNasa sin ARNasa RQ1 (Promega, Wisconsin, EE. UU.). El ADNc de la primera cadena se sintetizo a partir de ARN total usando el kit del Sistema de Transcripcion Inversa (Promega). El software PRIMER EXPRESS® 2.0 (Applied Biosystems, California, EE. UU.) se uso para diserar los cebadores. La PCR en tiempo real se realizo esencialmente segun Kant S, y col., Plant Cell Environ., 2006, 29: 1220-1234. Los valores de cuantificacion relativa (CR) para cada gen diana se calcularon mediante el procedimiento

2-M

MCT (Livak KJ, Schmittgen TD, Methods, 2001, 25: 402-408) usando ACTlN2 como gen de referencia interna para comparar los datos de los diferentes procedimientos de PCR o muestras de ADNc. Para confirmar la validez del 5 procedimiento 2-MMCT, se usaron diluciones seriadas 1:2 de ADNc de plantas control de Thellungiella y Arabidopsis para crear curvas patron y se demostro que las eficiencias de la amplificacion de los genes diana y de referencia eran aproximadamente iguales (Livak y Schmittgen, 2001). Los resultados del nivel relativo de expresion concordaban bastante con los datos de la micromatriz. Los niveles de expresion basales de todos los genes permanecieron similares entre las muestras crecidas con concentraciones altas y medias, tanto en el caso de los 10 brotes como en el de las raices (tabla 1). Sin embargo, el cambio transcripcional entre raices y brotes con concentracion baja de nitrogeno era diferentes ya que 59 genes significativos eran identicos en las muestras de raices (27 regulados por incremento y 32 regulados por disminucion) pero ninguno en la muestra de brotes (tabla 1).

Tabla 1 15

Tratamiento con nitrogeno

Brote Raiz

Incremento

Disminucion Incremento Disminucion

Alta frente a media

0 0 0 0

Alta frente a baja

0 0 27 32

Baja frente a induccion

0 0 273 22

Alta frente a reduccion

0 0 339 62

Ejemplo 8. Respuesta en plantas sometidas a cambios transitorios en las concentraciones de nitrogeno

[0139] Se crecieron plantas de Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin de tipo silvestre como se describe en el

20 ejemplo 1 y se sometieron a cambios transitorios en la concentracion de nitrogeno descrito en el ejemplo 7, es decir, una induccion con nitrogeno de 2 horas (concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) a concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 nM) y una reduccion de nitrogeno de 2 horas (concentracion alta de nitrogeno (nitrato 10 mM) a concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM)). El contenido de nitrato se determino en raices y brotes como se describe en el ejemplo 3 y la expresion genica diferencial se determino como se describe en el ejemplo 7.

25 [0140] Despues de 2 horas de induccion con nitrogeno, los niveles de nitrato en los brotes aumentaron de 2,85 mg/g de PC a 32 mg/g de PC, un cambio del 11% (figura 3A) y no se detectaron diferencias significativas en los niveles de expresion de diversos genes. En las raices, los niveles de nitrato aumentaron de 0,45 mg/g de PC a 0,85 mg/g de PC despues de una induccion con nitrogeno de 2 horas, un cambio de aproximadamente el 90% (figura 3B)

30 y se identificaron 295 genes significativos (273 regulados por incremento y 22 regulados por disminucion) (tabla 2).

[0141] Despues de 2 horas de reduccion de nitrogeno, los niveles de nitrato en los brotes disminuyeron de 4,55 mg/g de PC a 3,95 mg/g de PC, un cambio del 12% (figura 3C) y no se detectaron diferencias significativas en los niveles de expresion de diversos genes. En las raices, los niveles de nitrato disminuyeron de 9,9 mg/g de PC a

35 8,2 mg/g de PC despues de una reduccion de nitrogeno de 2 horas, un cambio de aproximadamente el 18% (figura 3D) y se identificaron 401 genes significativos (339 regulados por incremento y 62 regulados por disminucion) (tabla 2).

[0142] Entre los 295 genes que respondian a la induccion con nitrogeno y los 401 genes que respondian a la

40 reduccion de nitrogeno, 170 genes eran solapantes, 125 genes respondieron especificamente a la induccion con nitrogeno y 231 genes respondieron especificamente a la reduccion de nitrogeno. De los 125 genes que respondieron a la induccion con nitrogeno, 107 estaban regulados por incremento y 18 regulados por disminucion. De los 231 genes que respondieron especificamente a la reduccion de nitrogeno, 174 estaban regulados por incremento y 57 regulados por disminucion.

45 Ejemplo 9. Generacion y seleccion de plantas transgenicas de arroz que sobreexpresan genes candidatos para UEN

[0143] Los genes que se identificaron en los ejemplos 7 y 8 como regulados por incremento y disminucion se

50 clasificaron funcionalmente y se seleccionaron aproximadamente 50 genes que respondia a una concentracion baja de nitrogeno estable, a la induccion con nitrogeno, a la reduccion de nitrogeno o tanto a la induccion como a la reduccion como genes candidatos para UEN. La mayoria de los genes seleccionados pertenecian a tres grupos funcionales principales: metabolismo del nitrogeno, metabolismo del carbono y aquellos con posibles funciones reguladoras (factores de transcripcion y proteina quinasas). Los ADNc de longitud completa de todos los genes seleccionados se amplificaron y clonaron en un vector binario. Las plantas transgenicas de arroz se generaron mediante transformacion mediada por Agrobacterium de Oryza sativa «JavanicaD transformable que pertenece a la especie Japonica para sobreexpresar constitutivamente estos genes UEN. Se generaron de 5 a 10 eventos

5 independientes para cada construccion. Los niveles de expresion de transgenes se analizaron mediante RT-PCR semicuantitativa usando tubulina como control interno.

[0144] Las plantas transgenicas se crecieron en una mezcla de musgo de turbera y vermiculita (1:4) (SunGro Horticulture Canada Ltd. BC, Canada) con la adicion de una solucion de nutrientes con una cantidad diferente de 10 nitrato una vez a la semana. La solucion de nutrientes contenia MgSO4 4 mM, KCl 5 mM, CaCl2 5 mM, KH2PO4 1 mM, Fe-EDTA 0,1 mM, MES 0,5 mM (pH 6,0), MnSO4 9 !M, ZnSO4 0,7 !M, CuSO4 0,3 !M, NaB4O7 46 !M y (NH4)6Mo7O2 0,2 !M. Para el analisis durante la fase vegetativa, se uso la concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) una vez a la semana durante 4 semanas. Para el analisis al final de la fase reproductiva, se uso una concentracion baja-media de nitrogeno (nitrato 3 mM) una vez a la semana hasta la recogida. Las plantas se

15 crecieron en una sala de cultivo con 16 h de luz (aproximadamente 400 !molm-2s-1) a 28-30DC y 8 h de oscuridad a 22-24DC durante las primeras cuatro semanas, despues, una semana de tratamiento de dia corto (10 h de luz/14 h de oscuridad) para promover la floracion y, a continuacion, de vuelta a dia largo hasta la recogida.

[0145] La generacion de plantas T1 se analizaron obteniendo 5 eventos transgenicos por construccion y

20 aproximadamente 16 plantas por evento. Se usaron las pruebas de la fosfomanosa isomerasa (PMI) para realizar el genotipado para detectar el marcador PMI seleccionable (Negrotto D, y col., Plant Cell Reports, 2000, 19: 798-803; Reed J, y col., In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant 2001, 37: 127-132; Wright M, y col., Plant Cell Reports, 2001, 20: 429-436). Brevemente, las muestras de hojas se molieron en 300 !l de tampon de muestra TraitCheck (Strategic Diagnostics Inc., Delaware, EE. UU.) y se colocaron en un tubo eppendorf. Se inserto una tira

25 reactiva SeedCheck PMI (Strategic Diagnostics Inc. Part, Delaware, EE. UU.) en el tubo de eppendorf durante aproximadamente 15 minutos, tiempo durante el cual las lineas marcadoras de la tira reactiva se aclararon. La aparicion de una linea roja (control) en la tira indica un resultado negativo. La aparicion de dos lineas rojas (control y problema) en la tira indica un resultado positivo. Los datos de las plantas PMI positivas se promediaron para compararlos con los datos de plantas PMI negativas, asi como con las plantas control de tipo silvestre.

30 [0146] El analisis del fenotipo de las plantas de la generacion T1 supuso evaluar el UEN. El UEN puede dividirse en dos partes, siendo una la asimilacion eficiente que se produce principalmente en la fase vegetativa; mientras que la otra es la utilizacion eficiente que supone principalmente el reciclaje del nitrogeno en la fase reproductiva (Good AG, y col., Trends Plant Sci., 2004, 9: 597-605). Para el analisis de las plantas en la fase

35 vegetativa, estas se crecieron con concentracion baja de nitrogeno (nitrato 1 mM) durante 4 semanas para examinar la tasa de crecimiento, la biomasa de brotes y raices de las lineas transgenicas y las plantas control de tipo silvestre. Para el analisis de las plantas en la fase reproductiva, estas se crecieron con concentracion baja-media de nitrogeno (nitrato 3 mM) hasta el final de la fase reproductiva para evaluar el numero de hijuelos y paniculas, la biomasa de los brotes y el rendimiento de semillas. Las construcciones con al menos dos eventos a partir de la generacion T1 que

40 mostraban una mejora en el fenotipo UEN se seleccionaron para un analisis adicional en la generacion T2. Aproximadamente el 6% de estas construcciones se seleccionaron para analisis adicionales a partir de cada tipo de la seleccion; sin ningun solapamiento. De estos, aproximadamente el 50% mostraron el mismo fenotipo en la generacion T2 como habian mostrado en la generacion T1.

45 Ejemplo 10. Arroz transgenico que sobreexpresa un gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010), mayor numero de paniculas mostradas, biomasa seca de los brotes y rendimiento de semillas en condiciones limitantes de nitrogeno

[0147] Se genero una planta de arroz transgenica que sobreexpresa un gen de nodulina precoz

50 (LOC Os06g05010) y se selecciono como se establece en el ejemplo 9. El gen de nodulina precoz respondia a la induccion de nitrogeno o a la reduccion de nitrogeno en un experimento de perfil de expresion en micromatrices, como se describe en el ejemplo 7 (fig. 4a). Los cinco eventos de la generacion T1 de este arroz transgenico mostraron un rendimiento de semillas mayor en plantas PMI positivas en comparacion con las plantas PMI negativas. Se analizo en cuatro lineas de la generacion T2 (a partir de dos eventos diferentes) el UEN tanto en la

55 fase vegetativa como en la reproductiva cultivadas en las condiciones descritas en el ejemplo 9 (se analizaron un total de 10 plantas para cada linea de la generacion T2 y los resultados presentados son los valores medios de dias tras la siembra). Las plantas transgenicas de arroz no mostraron diferencias significativas en la fase vegetativa en comparacion con las plantas de arroz de tipo silvestre. Parecia que las plantas transgenicas crecian ligeramente mas despacio que las plantas de tipo silvestre 21 dias despues de la siembra, pero parecia que crecian mas

rapidamente a los 35 dias y tenian un numero de hojas y de retoros ligeramente superior que las plantas de tipo silvestre 42 dias despues de la siembra (tabla 2). Al final de la fase reproductiva, las plantas transgenicas tenian un numero similar de retoros, pero con un aumento de la biomasa seca de los brotes, aumento del numero de espigas y espiguillas, y un aumento en el rendimiento de semillas en comparacion con el tipo silvestre (tabla 3). Estas plantas 5 progenie se sometieron a una prueba de generacion T3 en condiciones tanto de concentracion limitante de nitrogeno (3 mM) como de concentracion alta de nitrogeno (10 mM). Se observo la misma tendencia para estas plantas T3, ya que las plantas transgenicas presentaron un aumento de la biomasa seca de los brotes, del numero de espigas y espiguillas y del rendimiento de semillas en comparacion con el tipo silvestre, no solo a la concentracion limitante de nitrogeno sino tambien a la concentracion alta de nitrogeno (tabla 4) (los datos representan la media ± DT (n = 10

10 plantas)).

Tabla 2

Numero de hojas 21 dias 28 dias

35 dias 42 dias Numero de retoros 21 dias 28 dias 35 dias 42 dias

OX-02N.D3 OX-02N.D15 OX-03N.D2 OX-03N.D3 Tipo silvestre

15,8 12,7 13,5 13 16 20 17,5 19 19,5 20 24,8 23,2 23,2 22,4 22,2 26,8 25,6 26,4 25,5 25,3 3 4 3,2 3,1 3,5 4,5 4 4,2 4,3 4,5 5,3 5 5,4 5,4 5,2 6 5,5 5,8 5,7 5,4

15

Tabla 3

OX-02N.D3 OX-02N.D15 OX-03N.D2 OX-03N.D3 Tipo silvestre

Retoros totales 6,8 7 6,9 7 6,9 Peso seco brotes (g) 9,9 9,9 10 10,1 9,1 de Espigas 5 4,7 5 4,9 4 Espiguillas 510 502 484 476 403 Rendimiento de semillas (g) 8,9 8,6 8,8 8,7 7,9

Tabla 4

Nitrato 3 mM

Retoros totales Peso seco brotes (g) de Espigas Espiguillas Rendimiento de semillas (g)

OX-1 OX-2 Tipo silvestre Nitrato 10 mM

5,5 ± 0,4 5,5 ± 0,4 5,2 ± 0,5 5,1 ± 0,6 5,1 ± 0,6 4,4 ± 0,4 3,2 ± 0,2 3,1 ± 0,3 2,7 ± 0,2 203 ± 23 197 ± 18 173 ± 18 3,8 ± 0,4 3,7 ± 0,3 3,1 ± 0,4

Ejemplo 11. El gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (Osenod93) codifica una proteina que se expresa en raices a un nivel mas alto que en los brotes yresponde a la concentracion de nitrogeno

OX-1

7,0 ± 0,6 10 ± 0,9 4,8 ± 0,4 465 ± 41 8,7 ± 0,9

OX-2

6,9 ± 0,5 9,8 ± 1,0 4,9 ± 0,5 475 ± 44 8,8 ± 0,8

Tipo silvestre

6,7 ± 0,6 8,9 ± 1,1 4,1 ± 0,5 395 ± 32 7,7 ± 0,8

20

[0148] El gen de nodulina precoz (LOC-Os06g05010) asi como otros genes que muestran similitud de

25 secuencia en arroz se han denominado nodulina precoz 93 de expresion putativa (anotacion del genoma del arroz en la base de datos TIGR). En el genoma del arroz existen 5 genes nodulina precoz 93 mas localizados en la misma region, con un peso molecular y pI similares y se preve que todos ellos esten localizados en la mitocondria excepto Os06g04940 (tabla 5). Este gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (OsENOD93) consta de tres exones y dos intrones y codifica una proteina de 116 aminoacidos (figuras 6C, 6D y 6E) con un peso molecular de 12.424 Da y un

30 pI de 10,95 (Tabla 5). La expresion de este gen de nodulina precoz en diferentes partes de la planta en las diferentes fases de crecimiento se determino como se describe en el ejemplo 7. El perfil de expresion en diferentes partes de la planta en las diversas fases de crecimiento muestra que este gen de nodulina precoz se expresa a alto nivel en raices, especialmente en la fase de aparicion de paniculas (figura 4B). Tambien, el nivel de expresion de este gen de nodulina precoz en las raices de plantas de tipo silvestre de 4 semanas era 50 veces superior al observado en los brotes (figura 4C). Las plantas transgenicas que sobreexpresaban de forma constitutiva este gen de nodulina precoz tenian niveles de transcriptos varias veces superiores a las plantas de tipo silvestre, con niveles de transcriptos practicamente similares en brotes y raices (figura 4D). Las plantas cultivadas a concentraciones mas altas de nitrogeno mostraron un aumento de la expresion de este gen de nodulina precoz en comparacion con las

5 plantas cultivadas a concentraciones mas bajas de nitrogeno (figuras 4C y 4D).

[0149] La expresion del gen de nodulina precoz a diferentes concentraciones de nitrogeno se examino a 30 y 60 dias despues de la siembra mediante PCR cuantitativa en tiempo real como se describe en el ejemplo 7, normalizandose la expresion genica para cada tratamiento de nitrato con respecto a los brotes de tipo silvestre 10 cultivados en nitrato 1 mM, 30 dias despues de la siembra. Los resultados muestran que el gen de nodulina precoz en plantas de tipo silvestre se expresa en la raiz a niveles mas altos que en otras partes de la planta y que tanto en plantas de tipo silvestre como transgenicas, el nivel de expresion del gen de nodulina precoz aumenta con el aumento de la concentracion de nitrogeno (tabla 6). Aunque las plantas transgenicas presentaban un alto nivel de expresion en las hojas, el estado de N en los brotes era similar entre las plantas de tipo silvestre y transgenicas

15 (datos no mostrados), lo que sugeria que probablemente son necesarios otros ligandos en los brotes para completar la funcion de OsENOD93.

Tabla 5

Gen Similitud con proteina Aminoacidos Masa molecular pI

Localizaciona Dominio ENOD93b

Os06g05010 ENOD93 116 12.424 10,95 Os06g04990 ENOD93 115 12.307 10,95 Os06g05020 ENOD93 115 12.277 10,95 Os06g04950 ENOD93 115 12.233 10,29 Os06g05000 ENOD93 115 12.167 10,35

Mitocondria Mitocondria Mitocondria Mitocondria Mitocondria 12....90 11....89 11....89 11....89 11....89 3....113

Os06g04940 ENOD93 139 14.897 9,98

Cloroplasto

aPSORT (Horton y col., Nucleic Acids �es., 2007, 35:W585-W587)/TargetP1.1 (Emanuelsson y col., J. Mol. Biol., 2000, 300:1005-16).bPfam 22.0 (Finn y col., Nucleic Acids Res., 2008, Database Issue 36:D281-D288).

Tabla 6

30 dias despues de la siembra 60 dias despues de la siembra

Hoja Nitrato 1 mM TS 1 OXa 2.050 Nitrato 3 mM

Raiz 50 1.245 Infloresce5,7 292 ncia Hoja bandera 3,8 2.496 Hoja 1,6 3.674 Tallo 8,2 395 Raiz 105 2.648

TS 1,5 OXa 3.640 Nitrato 10 mM

92 2.217 9,5 368 6,3 4.125 2,7 5.163 15,6 504 218 3.441

TS OXa

2,8 5.100 145 3.142 21 456 9,7 6.184 3,9 6.842 34,4 595 342 4.217

aplanta transgenica que sobreexpresa el gen de nodulina precoz

Ejemplo 12. Las raices de plantas transgenicas que sobreexpresan el gen de nodulina precoz 25 (LOC Os06g05010) presentan un aumento del contenido de aminoacidos y de nitrogeno total

[0150] Se cultivaron plantas transgenicas que sobreexpresaban el gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (OsENOD93) como se describe en el ejemplo 9 y se determino el contenido de aminoacidos y el contenido total de nitrogeno de las raices y brotes como se describe en los ejemplos 4 y 6. Las raices de plantas

30 transgenicas que sobreexpresaban el gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (OsENOD93) presentaban un contenido de aminoacidos totales (figura 5A) y de nitrogeno total (figura 5B) mayor que las plantas de tipo silvestre, especificamente cuando el nitrogeno era limitante. Los contenidos de aminoacidos y nitrogeno en los brotes eran similares entre plantas silvestres y transgenicas. El contenido de nitrato tanto en brotes como en raices era similar en plantas transgenicas y de tipo silvestre.

Ejemplo 13. El aumento en el contenido de aminoacidos totales y de nitrogeno total observado a los 30 dias despues de la siembra (DDS) era mas pronunciado a los 60 DDS

5 [0151] Se cultivaron plantas transgenicas que sobreexpresaban el gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (OsENOD93) como se describe en el ejemplo 9 y se determino el contenido de aminoacidos totales y el contenido de nitrogeno total de las raices como se describe en los ejemplos 4 y 6. Las raices de plantas transgenicas que sobreexpresaban el gen de nodulina precoz (LOC Os06g05010) (OsENOD93) presentaban un contenido de aminoacidos totales (figura 5C) y de nitrogeno total (figura 5B) mayor que las plantas de tipo silvestre,

10 especificamente cuando el nitrogeno era limitante. Este contenido de aminoacidos totales y de nitrogeno total mas alto era mas pronunciado a los 60 DDS (figuras 5C y 5D) que a los 30 DDS (figuras 5A y 5B).

Ejemplo 14. Las plantas de arroz transgenicas que sobreexpresaban el gen OsENOD93 mostraron un aumento en el contenido de aminoacidos en las raices y la sabia del xilema en condiciones limitantes de

15 nitrogeno

[0152] Se generaron plantas transgenicas de arroz y se seleccionaron a traves de transformacion mediada por Agrobacterium como se describe en el ejemplo 9. Debido a que la expresion de OsENOD93 era alta, y la acumulacion de aminoacidos era mayor en las raices transgenicas, se determino el contenido de aminoacidos en la

20 sabia del xilema. La sabia del xilema se obtuvo segun Shi, y col. (Shi y col., The Plant Cell, 2002, 14: 465-477. Dicha sabia se diluyo con agua destilada y los aminoacidos totales se analizaron segun Rosen (Rosen, Biochemistry and Biophysics, 1957, 67: 10-15). Se determino que las plantas transgenicas que sobreexpresaban el gen OsENOD93 presentaban un contenido de aminoacidos totales aproximadamente el 15% superior en la sabia del xilema en comparacion con el tipo silvestre, especificamente cuando el nitrogeno era limitante. (Vease la figura 7).

25 Ejemplo 15. El gen de nodulina precoz (OsENOD93) codifica un transcripto que se expresa en haces vasculares, epidermis y endodermis

[0153] Para caracterizar adicionalmente la expresion de OsENOD93, se analizo la abundancia de su

30 transcripto mediante hibridacion in situ. Para los analisis de hibridacion in situ, se obtuvieron muestras a partir de raices de arroz de tipo silvestre de 4 semanas. Estas muestras se cortaron en secciones de 0,5 a 1,0 cm y se fijaron en formaldehido al 4%. A continuacion, los tejidos se deshidrataron e incluyeron en parafina. Los cortes de tejido de 8 micras de espesor se obtuvieron usando un microtomo y se montaron sobre portas para microscopio recubiertos de polilisina (Biolabs). Tras el tratamiento con xileno para eliminar la parafina, los cortes se trataron durante treinta

35 minutos con proteinasa K (10 microgramos/mililitro). La hibridacion in situ se realizo como se describio previamente (Komminoth, Diagnostic Molecular Pathology, 1992, 1: 142-150), usando sondas de ARN sentido y complementarias especificas de OsENOD93 marcadas con digoxigenina (Roche Diagnostics, Penzenberg, Alemania). Los cortes se fotografiaron usando un microscopio DMIR2 (Leica, Alemania) y una camara DC500 (Leica, Alemania). La expresion, determinada mediante la presencia de transcriptos, se detecto en los haces vasculares, la epidermis y la

40 endodermis. El patron de expresion de OsENOD93 sugiere su participacion en el transporte de compuestos, incluso de las raices a los brotes.

Ejemplo 16. La generacion y seleccion de cebollas transgenicas que expresan la proteina OsENOD demuestra que OsENOD93 se localiza conjuntamente con una conocida proteina marcador mitocondrial

45 [0154] Para entender mejor la localizacion subcelular de la proteina OsENOD93, se amplifico mediante PCR un polinucleotido que codifica OsENOD93 y se clono en un vector pEarlyGate 101 compatible con la tecnologia Gateway con el gen indicador de la proteina fluorescente amarilla (YFP, por sus siglas en ingles) C-terminal (Earley, y col., The Plant Journal, 2006, 45: 616-629). Las construcciones de la proteina de fusion OsENOD93-YFP y el

50 control �-ATPasa-RFP (N.D de acceso a Genbank: P17614) se transformaron mediante biobalistica en celulas epidermicas de cebolla. Las imagenes de las celulas que contenian proteina fluorescente se obtuvieron veinte horas despues del bombardeo mediante un microscopio de epifluorescencia. Despues de un periodo de tiempo suficiente para la expresion genica y la clasificacion de las celulas, las imagenes obtenidas confirmaron una localizacion conjunta clara de OsENOD93 con -ATPasa-RFP, una conocida proteina marcador mitocondrial. Las localizaciones

55 conjuntas de las proteinas, si se producian, aparecian como una seral naranja debido al solapamiento de los dos fluoroforos (rojo y verde) en la misma celula. Como se muestra en la tabla 5, el genoma del arroz contiene cinco de estos genes ENOD93 localizados en la misma region del cromosoma. Estos genes ENOD93 del arroz tienen pesos moleculares similares, pI similares, se preve que contienen dos dominios transmembrana asi como que esten localizados en la membrana mitocondrial.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0155]

5 <110� UNIVERSIDAD DE GUELPH SYNGENTA PARTICIPATIONS AG Bi, Yong-Mei Rothstein, Steven

10 Kant, Surya Clarke, Joseph

<120� GEN DE NODULINA PRECOZ SENSIBLE A NITROGENO

15 <130� 072377-0382384

<160� 3

<170� PatentIn version 3.5

20 <210� 1 <211� 575 <212� ADN <213� Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin

25 <400� 1

30 <210� 2

<211� 351

<212� ADN

<213� Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin

35 <400� 2

<210� 3 <211� 116 5 <212� PROT <213� Oryza sativa var. Japonica cv. Donjin

<400� 3

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una planta transgenica, una semilla de planta transgenica o una celula vegetal transgenica que

   comprenden un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional, en el que el acido 5 nucleico recombinante comprende:

   a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

   b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones 10 de hibridacion rigurosas;

   c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

   d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones 15 de hibridacion rigurosas o

   e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

   20 2. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 1, en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es una monocotiledonea.
2. 3. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 2,

   en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es maiz. 25
3. 4. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 2, en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es arroz.
4. 5. La planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica de la reivindicacion 1, 30 en la que la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica es una dicotiledonea.
5. 6. Un procedimiento para producir una celula vegetal transgenica, que comprende: introducir un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional en una celula vegetal para

   35 producir una celula de una planta transgenica, en el que el acido nucleico recombinante comprende:

   a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

   b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones

   40 de hibridacion rigurosas;

   c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

   d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones

   45 de hibridacion rigurosas o e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.

   50 7. Un procedimiento para producir una planta transgenica, que comprende:

   producir una celula vegetal transgenica segun el procedimiento de la reivindicacion 6, y regenerar la planta transgenica a partir de la celula vegetal transgenica.

   55 8. Un procedimiento para aumentar o mejorar el uso eficiente del nitrogeno, los niveles de nitrato, el crecimiento lateral de las raices, el rendimiento de semillas, la tolerancia al estres, los niveles de aminoacidos y/o biomasas en una planta transgenica, una semilla de planta transgenica o una celula vegetal transgenica, que comprende:

   expresar en la planta transgenica, semilla de planta transgenica o celula vegetal transgenica un acido nucleico recombinante que codifica una proteina OsENOD93 funcional, en el que el acido nucleico recombinante comprende:

   a) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 1;

   5 b) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 1 en condiciones de hibridacion rigurosas;

   c) una secuencia de nucleotidos mostrada como SEQ ID NO: 2;

   10 d) un acido nucleico que hibrida especificamente con la secuencia complementaria de SEQ ID NO: 2 en condiciones de hibridacion rigurosas o

   e) una secuencia de nucleotidos que codifica una proteinas OsENOD93 que comprende una secuencia de 15 aminoacidos mostrada como SEQ ID NO: 3.
6. 9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el acido nucleico recombinante se expresa de forma constitutiva en la planta transgenica, semilla de la planta transgenica o celula de la planta transgenica.
7. 10. El procedimiento de la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula de la planta transgenica muestra un aumento del rendimiento de semillas, de los niveles de aminoacidos o/y de la biomasa.

   25 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica muestra un aumento del uso eficiente del nitrogeno.
8. 12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la planta transgenica, la

   semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es una monocotiledonea. 30
9. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es maiz.
10. 14. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que la planta transgenica, la semilla de planta 35 transgenica o la celula vegetal transgenica es arroz.
11. 15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la planta transgenica, la semilla de planta transgenica o la celula vegetal transgenica es una dicotiledonea.