JPH0423991A - 流行性非a非b型肝炎ウイルス抗原ペプチドおよびこれをコードする核酸断片 - Google Patents
流行性非a非b型肝炎ウイルス抗原ペプチドおよびこれをコードする核酸断片Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、A型でもB型でもない流行性肝炎の原因ウィ
ルス(流行性流行性非Al1肝Bウィルス)のウィルス
抗原をコードする遺伝子断片、流行性非A非B型肝炎ウ
ィルス抗原ペプチド、およびこれら利用法に関する。
ルス(流行性流行性非Al1肝Bウィルス)のウィルス
抗原をコードする遺伝子断片、流行性非A非B型肝炎ウ
ィルス抗原ペプチド、およびこれら利用法に関する。
の 景および従来技術
ウィルス性肝炎にはA型肝炎(伝染性肝炎)とB型肝炎
(血清肝炎)の2種類があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
A型肝炎は経口感染で流行を起こし、B型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、A型肝炎ウィルスは1、ピコルナウィルスに属す
る、直径27nmのRNAウィルスであり[Fines
ton、S。
(血清肝炎)の2種類があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
A型肝炎は経口感染で流行を起こし、B型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、A型肝炎ウィルスは1、ピコルナウィルスに属す
る、直径27nmのRNAウィルスであり[Fines
ton、S。
M、 et ml、、 5cience 182 p1
026 (1973)]、一方B型肝炎ウィルスは、ヘ
パドナウィルスに属する直径42nmのエンベロープを
持つDNAウィルスであることが突き止められた。[D
ane、O,S、、 et &1゜Lancet、 I
p695 (1970)]また、現在では、これらの
肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方法が確立されるに至
っている。
026 (1973)]、一方B型肝炎ウィルスは、ヘ
パドナウィルスに属する直径42nmのエンベロープを
持つDNAウィルスであることが突き止められた。[D
ane、O,S、、 et &1゜Lancet、 I
p695 (1970)]また、現在では、これらの
肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方法が確立されるに至
っている。
これら2つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非A非B型肝炎の存在
が明らかになってきた[Pr1nce、A。
に従い、このいずれにも属さない非A非B型肝炎の存在
が明らかになってきた[Pr1nce、A。
帽、et al、、 Lancet、 1 p241
(1974)]。
(1974)]。
輸血後肝炎は、B型肝炎ウィルス表面抗原(HBsAg
)のスクリーニング法の導入により大幅に減少したがゼ
ロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、A型
、B型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このことか
ら、この肝炎は一般に非A非B型肝炎と呼ばれている。
)のスクリーニング法の導入により大幅に減少したがゼ
ロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、A型
、B型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このことか
ら、この肝炎は一般に非A非B型肝炎と呼ばれている。
この肝炎は、我国では散発性肝炎の約50%、輸血後肝
炎の90%以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の50%以上が非A非B型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。
炎の90%以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の50%以上が非A非B型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。
最近になって、この主に血液を介して感染する非A非B
型肝炎ウィルスに関して、HCV (C型肝炎ウィルス
)という呼称が定着しつつあり、HCvに関係した抗体
のスクリーニング方法も既に開発されているが、その詳
しいウィルス学的性状は未だ不明である[ Chooら
、5cience、 244.359−362(198
9)、Kuo ら、 5cience、244.36
2−364(1989) コ。
型肝炎ウィルスに関して、HCV (C型肝炎ウィルス
)という呼称が定着しつつあり、HCvに関係した抗体
のスクリーニング方法も既に開発されているが、その詳
しいウィルス学的性状は未だ不明である[ Chooら
、5cience、 244.359−362(198
9)、Kuo ら、 5cience、244.36
2−364(1989) コ。
これとは別に、インド、ミャンマー、アフガニスタン、
または、北アフリカなどで経口感染で流行する、第二の
ウィルス性非A非B型肝炎があることが明らかになった
[ )[huroo、 M、 S、 ^m、 J、
Hed、、 68 p818−824. (1980
)コ、これは、一般には水系、または流行性非A非B型
肝炎と呼ばれている。
または、北アフリカなどで経口感染で流行する、第二の
ウィルス性非A非B型肝炎があることが明らかになった
[ )[huroo、 M、 S、 ^m、 J、
Hed、、 68 p818−824. (1980
)コ、これは、一般には水系、または流行性非A非B型
肝炎と呼ばれている。
我国では、この肝炎の流行は見られていないが、渡航者
の流行地からの肝炎の輸入は若干見られるようである[
福原ら、第25回日本肝臓学会総会講演要旨集151頁
(1989) ]。
の流行地からの肝炎の輸入は若干見られるようである[
福原ら、第25回日本肝臓学会総会講演要旨集151頁
(1989) ]。
本発明は、上記で言う後者の、主に水を介して感染する
流行性非A11−B型肝炎ウィルスに関するものであり
、本明細書中では、HAV、HBV、HCVでないこの
ウィルスを非A非B型肝炎ウィルスと言う。
流行性非A11−B型肝炎ウィルスに関するものであり
、本明細書中では、HAV、HBV、HCVでないこの
ウィルスを非A非B型肝炎ウィルスと言う。
この非A非B型肝炎についてはウィルス本体の分離同定
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。
また、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。
即ち、患者の血清について、診断方法が確立されている
A型、B型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非A非B型肝炎として
診断されていた。
A型、B型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非A非B型肝炎として
診断されていた。
本発明の対象となる非A非B型肝炎は、インド、ネパー
ル、ミャンマー及び北アフリカ等をその主な流行地とし
ている。感染経路としては、飲料水や野菜を通じたもの
が主な経路であり、感染後の症状としては、通常一過性
の感染、即ち急性肝炎を起こすだけで持続感染は一般に
ないことが知られている。しかし゛ながら、妊婦がこの
ウィルスに感染すると死亡率が20%と非常に高いこと
が知られており[Tindonら、Indian J、
14ed、Res、 75)39−744<1982)
]、しばしば飲料水の汚染によって大流行を起こすこ
ともある。最近の例としては、1986年から1988
年にかけて中国のウルムチ自治区の西南部において12
万人の患者が発生するという大流行が報告されている[
現代科学、1987年7月号62−67、感染症学雑誌
、64.105−111 <1990> ] 、 従
って、このような流行地に渡航する人々にとって、有効
なワクチンの開発並びに抗体、抗原又はウィルスそのも
のの保有状態を容易に検出できる診断試薬の開発が望ま
れている。
ル、ミャンマー及び北アフリカ等をその主な流行地とし
ている。感染経路としては、飲料水や野菜を通じたもの
が主な経路であり、感染後の症状としては、通常一過性
の感染、即ち急性肝炎を起こすだけで持続感染は一般に
ないことが知られている。しかし゛ながら、妊婦がこの
ウィルスに感染すると死亡率が20%と非常に高いこと
が知られており[Tindonら、Indian J、
14ed、Res、 75)39−744<1982)
]、しばしば飲料水の汚染によって大流行を起こすこ
ともある。最近の例としては、1986年から1988
年にかけて中国のウルムチ自治区の西南部において12
万人の患者が発生するという大流行が報告されている[
現代科学、1987年7月号62−67、感染症学雑誌
、64.105−111 <1990> ] 、 従
って、このような流行地に渡航する人々にとって、有効
なワクチンの開発並びに抗体、抗原又はウィルスそのも
のの保有状態を容易に検出できる診断試薬の開発が望ま
れている。
これまでの報告によれば、免疫電−によるウィルス様粒
子の検出が報告されており[5reenivasanら
、J、Gen、Virol、、65.1995−100
7(1984) ]、さらにサルを用いた動物モデルに
おいて感染実験が成功したことが報告されている[ W
aneら、JAMA 252゜3140−3145(1
984) ]。
子の検出が報告されており[5reenivasanら
、J、Gen、Virol、、65.1995−100
7(1984) ]、さらにサルを用いた動物モデルに
おいて感染実験が成功したことが報告されている[ W
aneら、JAMA 252゜3140−3145(1
984) ]。
本発明者らにおいても、流行地における急性期患者の糞
便から調製したウィルス液をカニクイザルの静脈に接種
したところ感染が成立し、その継代感染にも成功した。
便から調製したウィルス液をカニクイザルの静脈に接種
したところ感染が成立し、その継代感染にも成功した。
又、感染したサルの糞便及びサル肝臓細胞中にウィルス
様粒子を検出した[ Soeら、Liver、9.13
5−145(1989) E、 さらにサル胆汁中に
多量のウィルス様粒子が検出されることを確認し[現代
科学、1987年7月号、62−67]、ウィルスcD
NA断片のクローニングに成功し特許出願した[特願平
2−64629号]。
様粒子を検出した[ Soeら、Liver、9.13
5−145(1989) E、 さらにサル胆汁中に
多量のウィルス様粒子が検出されることを確認し[現代
科学、1987年7月号、62−67]、ウィルスcD
NA断片のクローニングに成功し特許出願した[特願平
2−64629号]。
最近になって米国のGenelabs社が、非A非B型
肝炎ウィルスのcDNAをクローニングしたという報告
があったが[Reyesら、5cience、 247
.1335−1339<1990> 1、ウィルスその
ものの性状、ウィルス構成蛋白の性状などはまだ一切明
らかにされていない。
肝炎ウィルスのcDNAをクローニングしたという報告
があったが[Reyesら、5cience、 247
.1335−1339<1990> 1、ウィルスその
ものの性状、ウィルス構成蛋白の性状などはまだ一切明
らかにされていない。
翌jし旧1釣
このような状況のもとに、本発明者らは、非A非B型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、非A非B型肝炎
ウィルスの抗原ペプチド配列をコードしている遺伝子を
クローニングすることに成功した。さらに、本発明者ら
は、この遺伝子断片を遺伝子組換え技術を用いて発現さ
せ得られたペプチドが非All!B型肝炎患者血清と蛋
白レベルにおいても特異的に反応することを確認し、本
発明を完成するに至った。
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、非A非B型肝炎
ウィルスの抗原ペプチド配列をコードしている遺伝子を
クローニングすることに成功した。さらに、本発明者ら
は、この遺伝子断片を遺伝子組換え技術を用いて発現さ
せ得られたペプチドが非All!B型肝炎患者血清と蛋
白レベルにおいても特異的に反応することを確認し、本
発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、非A非B型肝炎感染カニクイザル胆
汁標品を用いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新
しい分子遺伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニン
グ法により得られた非A非B型肝炎ウィルスに特有なペ
プチド並びにこれをコードする遺伝子を提供するもので
ある。
汁標品を用いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新
しい分子遺伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニン
グ法により得られた非A非B型肝炎ウィルスに特有なペ
プチド並びにこれをコードする遺伝子を提供するもので
ある。
智
本発明の非A非B型肝炎ウィルス遺伝子断片は、非A非
B型肝炎ウィルス感染カニクイザルの胆汁から、抽出・
単離することが可能である。まず、胆汁を生理食塩水で
希釈し、低速遠心で組織片等を除く0次に20χシヨ糖
を含む生理食塩水の上に重層し超遠心を行う、このこと
により沈渣にウィルス粒子を回収することができる。こ
のウィルス粒子をグアニジンチオシアネート処理するこ
とによってRNAを抽出し、これを鋳型としてcDNA
を合成する。このcDNAをλgtl 1ベクターに挿
入しcDNAライブラリーを作成する。
B型肝炎ウィルス感染カニクイザルの胆汁から、抽出・
単離することが可能である。まず、胆汁を生理食塩水で
希釈し、低速遠心で組織片等を除く0次に20χシヨ糖
を含む生理食塩水の上に重層し超遠心を行う、このこと
により沈渣にウィルス粒子を回収することができる。こ
のウィルス粒子をグアニジンチオシアネート処理するこ
とによってRNAを抽出し、これを鋳型としてcDNA
を合成する。このcDNAをλgtl 1ベクターに挿
入しcDNAライブラリーを作成する。
λファージを大腸直に感染させ、細菌培養プレートにま
き、42℃で数時間培養する。その後ニトロセルロース
フィルター(NCフィルター)をかぶせ数時間培養し、
NCフィルターをはがしレプリカをとる。
き、42℃で数時間培養する。その後ニトロセルロース
フィルター(NCフィルター)をかぶせ数時間培養し、
NCフィルターをはがしレプリカをとる。
このレプリカをブロッキング液で処理し、トリス緩衝生
理食塩水(TBS)などで洗浄した後イムノスクリーニ
ングを行う、すなわち、レプリカを非A非B型肝炎回復
期のカニクイザル血清と反応させ、TBSなどで洗浄後
、酵素標識抗ヒトIgGと反応させ、洗浄後、基質溶液
と反応させて発色させる6発色したプラークに対応する
ファージを選び二次スクリーニングを行い、再現性のあ
るλフアージクローンを得た。
理食塩水(TBS)などで洗浄した後イムノスクリーニ
ングを行う、すなわち、レプリカを非A非B型肝炎回復
期のカニクイザル血清と反応させ、TBSなどで洗浄後
、酵素標識抗ヒトIgGと反応させ、洗浄後、基質溶液
と反応させて発色させる6発色したプラークに対応する
ファージを選び二次スクリーニングを行い、再現性のあ
るλフアージクローンを得た。
このクローンについて非A非B型肝炎特異性を調べた。
非A非B型肝炎回復期、および正常期のカニクイザル血
清を用いてプラークイムノアッセイを行った結果、非A
非B型肝炎ウィルス感染に特異性の高いクローンを得る
ことができた。このクローンのファージDNAを精製[
実験医学 臨時増刊号、遺伝子工学総集編5(11)、
P31−32(1987)参照コし、制限酵素EcoR
Iで切断後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、0
.22Thpの挿入断片(HT3−3)を確認した。こ
れを発現ベクターpUEX2 (アマジャム社製)に
サブクローニングしくHT3−3A)、大腸菌発現産物
が前述のカニクイザル血清と反応することを確認した。
清を用いてプラークイムノアッセイを行った結果、非A
非B型肝炎ウィルス感染に特異性の高いクローンを得る
ことができた。このクローンのファージDNAを精製[
実験医学 臨時増刊号、遺伝子工学総集編5(11)、
P31−32(1987)参照コし、制限酵素EcoR
Iで切断後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、0
.22Thpの挿入断片(HT3−3)を確認した。こ
れを発現ベクターpUEX2 (アマジャム社製)に
サブクローニングしくHT3−3A)、大腸菌発現産物
が前述のカニクイザル血清と反応することを確認した。
カニクイザルの正常期及び非A非B型肝炎急性期の肝臓
より染色体DNAを精製し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、 stp標識したHT33を用いてサザン
ハイブリダイゼーションを行った。HT3−3はいずれ
のDNAとも反応せず、したがってHT3−3は染色体
由来DNAでないと判明した。
より染色体DNAを精製し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、 stp標識したHT33を用いてサザン
ハイブリダイゼーションを行った。HT3−3はいずれ
のDNAとも反応せず、したがってHT3−3は染色体
由来DNAでないと判明した。
本発明のHT3−3AのDNA配列は、ジデオキシ法に
より決定された。その結果HT3−3Aは非A非B型肝
炎ウィルス遺伝子由来の計216bpのcDN^断片で
あり、その塩基配列は第1図に示される通りであった。
より決定された。その結果HT3−3Aは非A非B型肝
炎ウィルス遺伝子由来の計216bpのcDN^断片で
あり、その塩基配列は第1図に示される通りであった。
このDNA配列をアミノ酸に読み直し、λgtll及び
pUEX2の発現フレームに合致するフレームをオープ
ンリーディングフレームとした。この塩基配列とアミノ
酸配列をデータベース(Genetyx−CD ソフ
トウェア開発 1990 )で検索したところ、現在ま
で知られているウィルス、細菌、その他ホモロジーを示
すものはなかった。
pUEX2の発現フレームに合致するフレームをオープ
ンリーディングフレームとした。この塩基配列とアミノ
酸配列をデータベース(Genetyx−CD ソフ
トウェア開発 1990 )で検索したところ、現在ま
で知られているウィルス、細菌、その他ホモロジーを示
すものはなかった。
このアミノ酸配列から、HOPP & WOODらの手
法に基づき、HT3−3Aがコードするペプチドの親水
性・疎水性のパターンを解析した。その結果、第3図に
示すような結果が得られ、このペプチド領域中には、特
に親水性の強い3つの領域が存在することが確認された
。
法に基づき、HT3−3Aがコードするペプチドの親水
性・疎水性のパターンを解析した。その結果、第3図に
示すような結果が得られ、このペプチド領域中には、特
に親水性の強い3つの領域が存在することが確認された
。
このように、本発明で得られたcDNA断片が、非A非
B型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプチド領域
をコードするものであったことは、免疫学的見地からも
非常に意義深いものと思われた。また、このような親水
性のペプチドは取扱が容易になることから、実用性の面
からも非常に有用である。
B型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプチド領域
をコードするものであったことは、免疫学的見地からも
非常に意義深いものと思われた。また、このような親水
性のペプチドは取扱が容易になることから、実用性の面
からも非常に有用である。
本発明では、非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチドの好
ましい一例として、第2図に示すような72個のアミノ
酸からなるペプチドを開示するのみならず、その中でも
特に非A非B型肝炎ウィルスの抗原性と深い関連がある
と考えられる、上記で述べた親水性の強い3つ或いはそ
れらを含む非A非B型肝炎ウィルス抗原エピトープをも
開示するものである。そのような抗原エピトープは、下
記の(A>〜(C)のアミノ酸配列である。
ましい一例として、第2図に示すような72個のアミノ
酸からなるペプチドを開示するのみならず、その中でも
特に非A非B型肝炎ウィルスの抗原性と深い関連がある
と考えられる、上記で述べた親水性の強い3つ或いはそ
れらを含む非A非B型肝炎ウィルス抗原エピトープをも
開示するものである。そのような抗原エピトープは、下
記の(A>〜(C)のアミノ酸配列である。
(A) Leu Glu Asp Thr Leu A
sp(B) Thr Phe Asp Asp Phe
Cys Pro Glu CysArg Pr。
sp(B) Thr Phe Asp Asp Phe
Cys Pro Glu CysArg Pr。
(C) Ala Leu Arg *本*
Arg Trp Val(**ネは任意のアミノ酸
) また、上記(A>及び(B)の抗原エピトープは、第2
図のアミノ酸配列の中でも極めて接近して存在するため
、(A)及び(B)を含む下記の配列も重要なエピトー
プと考えられる。
Arg Trp Val(**ネは任意のアミノ酸
) また、上記(A>及び(B)の抗原エピトープは、第2
図のアミノ酸配列の中でも極めて接近して存在するため
、(A)及び(B)を含む下記の配列も重要なエピトー
プと考えられる。
Leu Glu Asp Thr Leu ASp T
yr Pro Ala Cys AlaHis Thr
Phe Asp Asp Phe Cys Pro
Glu Cys ArgPr。
yr Pro Ala Cys AlaHis Thr
Phe Asp Asp Phe Cys Pro
Glu Cys ArgPr。
第3図の解析パターンにも示されたとうり、上記のアミ
ノ酸配列のペプチド領域は、特に親水性の強いペプチド
であることが確認される。さらに非A 11− B型肝
炎との関連性を確認するために、この遺伝子断片を大腸
菌の発現系に組み込み発現させることによって得られた
抗原を用い、多数の肝炎患者、正常人の血清を対象とし
てHT3−3Aに対するウェスタンプロットアッセイを
行った。
ノ酸配列のペプチド領域は、特に親水性の強いペプチド
であることが確認される。さらに非A 11− B型肝
炎との関連性を確認するために、この遺伝子断片を大腸
菌の発現系に組み込み発現させることによって得られた
抗原を用い、多数の肝炎患者、正常人の血清を対象とし
てHT3−3Aに対するウェスタンプロットアッセイを
行った。
その結果、正常人、B型肝炎、その他の肝炎の群に比べ
非A非B型肝炎患者で高率に抗体陽性者が検出され、イ
ムノアッセイによる蛋白レベルでも。
非A非B型肝炎患者で高率に抗体陽性者が検出され、イ
ムノアッセイによる蛋白レベルでも。
本発明のペプチドの非A非B型肝炎に対する特異性が証
明された。
明された。
本発明の遺伝子配列は、これを適当な発現系を用いて発
現させ、非A11−B型肝炎ウィルスの抗体検査に使用
することができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫
して抗体を作らせ、これを用いて非A非B型肝炎感染患
者の肝組織中の非A非B・型肝炎ウィルスまたは関連抗
原を検出することも可能である。
現させ、非A11−B型肝炎ウィルスの抗体検査に使用
することができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫
して抗体を作らせ、これを用いて非A非B型肝炎感染患
者の肝組織中の非A非B・型肝炎ウィルスまたは関連抗
原を検出することも可能である。
さらに、本発明で得られた非A非B型肝炎ウィルス関連
抗原は、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用
である。
抗原は、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用
である。
また、遺伝子配列そのものは、非A非B型肝炎のDNA
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。
このような、本発明の非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプ
チドをコードする核酸断片、非A非B型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非A非B型肝炎ウィ
ルス関連抗原及び抗体の各種検出方法は、特に日本にお
ける非A非B型肝炎ウィルスの検出において極めて有用
であると考えられる。
チドをコードする核酸断片、非A非B型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非A非B型肝炎ウィ
ルス関連抗原及び抗体の各種検出方法は、特に日本にお
ける非A非B型肝炎ウィルスの検出において極めて有用
であると考えられる。
以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。
非A非B型肝炎患者の急性期糞便より調製したウィルス
液を、カニクイザルの静脈に接種したところ感染が成立
した。さらに、感染したサルの糞便を用いての継代感染
も成立した[Liver 9. p135−145
(1989)コ。
液を、カニクイザルの静脈に接種したところ感染が成立
した。さらに、感染したサルの糞便を用いての継代感染
も成立した[Liver 9. p135−145
(1989)コ。
感染したサルの胆汁を電子顕微鏡で観察したところ、直
径的27nmのウィルス粒子が検出されたく現代化学1
989年7月号、p62−67 )、 この胆汁的2
■lからウィルス粒子を精製し、以下の実験に用いた。
径的27nmのウィルス粒子が検出されたく現代化学1
989年7月号、p62−67 )、 この胆汁的2
■lからウィルス粒子を精製し、以下の実験に用いた。
ス ロー
二じ仁グ。
(1)で得られたウィルス粒子を、5.5Mグアニジン
チオシアネートで処理し、ウィルスゲノム由来の核酸を
抽出した。 cDNA合成システムプラス(アマジャ
ム社製)を用いてcDNA合成を行い、合成したcDN
AをcDNAクローニングシステムλgtll (アマ
ジャム社製)により^gtllベクターにクローニング
した。 in vitroパッケージングの結果、5
.7xlO’プラークフオーミングユニツト(PFU)
のライブラリーを得た。
チオシアネートで処理し、ウィルスゲノム由来の核酸を
抽出した。 cDNA合成システムプラス(アマジャ
ム社製)を用いてcDNA合成を行い、合成したcDN
AをcDNAクローニングシステムλgtll (アマ
ジャム社製)により^gtllベクターにクローニング
した。 in vitroパッケージングの結果、5
.7xlO’プラークフオーミングユニツト(PFU)
のライブラリーを得た。
■
(2)で構築したcDN^ライブラリーから、−枚のL
Bプレート[1,5%Agar、1%Bacto−tr
yptone、0.5%Bacto−yeast ex
tract 、1%NaC1pH7,5,50ug/■
lアンピシリンの入った細菌培養用プレート(栄研社製
;82■−φ)]当り1000 PFUのファージをと
り、別々に挿入断片のないファージと共に大腸菌Y10
90に37℃で15分間感染させて、Top Agar
4ml(0,7%Agar、1%Bacto−tryp
tone、05%Bacto−yeast extr
act 、 1%NaC1,pH7,5、50ug/
mlアンピシリン)と共にまき、42℃で3時間培養し
た。その後、10■M IPTG (シグマ社製)を
染みこませたニトロセルロースフィルター(NCフィル
ター:SA3社製、Code B^85.82−■φ)
をかぶせ、さらに37℃で培養を続けた。3時間後NC
フィルターをプレートからはがし、0.05X Twe
en20を含むTBS (TBS−T)で洗い、ブロッ
キング液(5%スキムミルクを含むTBS−T溶液)に
浸し、4℃で一夜放置した。
Bプレート[1,5%Agar、1%Bacto−tr
yptone、0.5%Bacto−yeast ex
tract 、1%NaC1pH7,5,50ug/■
lアンピシリンの入った細菌培養用プレート(栄研社製
;82■−φ)]当り1000 PFUのファージをと
り、別々に挿入断片のないファージと共に大腸菌Y10
90に37℃で15分間感染させて、Top Agar
4ml(0,7%Agar、1%Bacto−tryp
tone、05%Bacto−yeast extr
act 、 1%NaC1,pH7,5、50ug/
mlアンピシリン)と共にまき、42℃で3時間培養し
た。その後、10■M IPTG (シグマ社製)を
染みこませたニトロセルロースフィルター(NCフィル
ター:SA3社製、Code B^85.82−■φ)
をかぶせ、さらに37℃で培養を続けた。3時間後NC
フィルターをプレートからはがし、0.05X Twe
en20を含むTBS (TBS−T)で洗い、ブロッ
キング液(5%スキムミルクを含むTBS−T溶液)に
浸し、4℃で一夜放置した。
B ス ■ −二ゝ
ブロッキング液中で一夜漬したレプリカフィルターをT
BS−Tで洗浄後、ブロッキング液で50倍に希釈した
正常期及び非A非B型肝炎回復期のカニクイザル血清に
浸し、37℃で振盪しながら反応させた。1時間後、T
BS−Tで、−回につき10分間、計3回レプリカフィ
ルターを洗浄の後、各々1000倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトIgGヤギ抗体(Bio園akor社
製〉の入ったブロッキング液に浸し、37℃で振盪しな
がら反応させた。1時IWI後、TBS−Tで一回につ
き10分間、計3回、そのtjiTBsで10分間洗浄
後、発色液[0,66/ml 4−chloro−1n
aphtho1(Bio−Rad社製)、20X14e
OH10,06%H2O2]に浸し発色させた。 N
Cフィルター上で発色したプラークに対応する一ファー
ジを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次ス
クリーニングで選択した各ファージを別々に挿入断片の
ないファージと共に大腸菌Y1090に感染させ、82
mmシャーレ(栄研社製)のLBプレートにまき直し、
レプリカフィルターを作製した。これらを上述の方法で
抗体スクリーニングし、非A非B型肝炎回復期のカニク
イザル血清と再現性よく反応するファージを4クローン
(HT3−1.2,3.5 )得た。これらのクローン
のファージDNAを精製[実験医学 臨時増刊号、遺伝
子工学総集編5(11)、P31−32 (1987)
参照コし、制限酵素EcoRIで切断後ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、0.31Kbp(HT3−1
>、 0.3kbp(FIT3−2) 、 0.22k
bp(HT3−3.5>の挿入断片を確認した。
BS−Tで洗浄後、ブロッキング液で50倍に希釈した
正常期及び非A非B型肝炎回復期のカニクイザル血清に
浸し、37℃で振盪しながら反応させた。1時間後、T
BS−Tで、−回につき10分間、計3回レプリカフィ
ルターを洗浄の後、各々1000倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトIgGヤギ抗体(Bio園akor社
製〉の入ったブロッキング液に浸し、37℃で振盪しな
がら反応させた。1時IWI後、TBS−Tで一回につ
き10分間、計3回、そのtjiTBsで10分間洗浄
後、発色液[0,66/ml 4−chloro−1n
aphtho1(Bio−Rad社製)、20X14e
OH10,06%H2O2]に浸し発色させた。 N
Cフィルター上で発色したプラークに対応する一ファー
ジを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次ス
クリーニングで選択した各ファージを別々に挿入断片の
ないファージと共に大腸菌Y1090に感染させ、82
mmシャーレ(栄研社製)のLBプレートにまき直し、
レプリカフィルターを作製した。これらを上述の方法で
抗体スクリーニングし、非A非B型肝炎回復期のカニク
イザル血清と再現性よく反応するファージを4クローン
(HT3−1.2,3.5 )得た。これらのクローン
のファージDNAを精製[実験医学 臨時増刊号、遺伝
子工学総集編5(11)、P31−32 (1987)
参照コし、制限酵素EcoRIで切断後ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、0.31Kbp(HT3−1
>、 0.3kbp(FIT3−2) 、 0.22k
bp(HT3−3.5>の挿入断片を確認した。
H−いた 1 口 。
下記のとうり、HT3−1.2.3.5を用いたサザン
プロット分析を行った。カニクイザルの正常及び非A非
B型肝炎急性期の肝臓より染色体DNAを精製し、各々
10ugをEc oRIで切断後、電気泳動で1%アガ
ロースゲルに展開し、ナイロンフィルターに転写した。
プロット分析を行った。カニクイザルの正常及び非A非
B型肝炎急性期の肝臓より染色体DNAを精製し、各々
10ugをEc oRIで切断後、電気泳動で1%アガ
ロースゲルに展開し、ナイロンフィルターに転写した。
このフィルターにマルチプライム法で[32−P]標識
した各クローンをプローブとし、サザンハイブリダイゼ
ーションを行った(第4図)。
した各クローンをプローブとし、サザンハイブリダイゼ
ーションを行った(第4図)。
各プローブは正常及び非A非B型肝炎急性期のカニクイ
ザルの染色体DNAとは反応せず、このことから、II
IT3−1.2.3.5はカニクイザルの染色体DNA
由来のクローンではなく、ウィルス等の外来性の核酸由
来のものであると考えられる。
ザルの染色体DNAとは反応せず、このことから、II
IT3−1.2.3.5はカニクイザルの染色体DNA
由来のクローンではなく、ウィルス等の外来性の核酸由
来のものであると考えられる。
HT−ローニン :
(3) (B)で得られたクローンのファージDNAを
精製[実験医学 臨時増刊号、遺伝子工学総集編5(1
1)、P31−32 (1987)参照コし、制限酵素
EcoRIで切断後pUEX2ベクター(アマジャム社
製)のEcoR1部位に挿入し、サブクローニングを行
い、夫々のサブクローンl’1T3−IB、 2E、
3A、 5^を得た。
精製[実験医学 臨時増刊号、遺伝子工学総集編5(1
1)、P31−32 (1987)参照コし、制限酵素
EcoRIで切断後pUEX2ベクター(アマジャム社
製)のEcoR1部位に挿入し、サブクローニングを行
い、夫々のサブクローンl’1T3−IB、 2E、
3A、 5^を得た。
■ −BE ^ ^ ≧ノ列:
ART−BEAA ロー
(5)で得られたプラスミドDNAを鋳型とし、 [α
−”S] dCTP (1000Ci/ mmol )
及び5equenasev2.0キツト(USB社製)
を用い、ジデオキシ法により反応を行った。6%のポリ
アクリルアミド8Mウレアゲルを用いて、3時間220
θVで電気泳動し16時間感光した。
−”S] dCTP (1000Ci/ mmol )
及び5equenasev2.0キツト(USB社製)
を用い、ジデオキシ法により反応を行った。6%のポリ
アクリルアミド8Mウレアゲルを用いて、3時間220
θVで電気泳動し16時間感光した。
上記の結果、E!T3−IB、 2B、 3A、 5A
は互いに重複しており1つの連続した配列が得られた。
は互いに重複しており1つの連続した配列が得られた。
HT3−3Aの配列及び予測されるアミノ酸配列の
解読の結果をそれぞれ第1図、第2図に示した。
解読の結果をそれぞれ第1図、第2図に示した。
予測されるアミノ酸配列の親水性/疎水性プロフィール
を第3図に示す。
を第3図に示す。
得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース(前
述)で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはながった。
述)で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはながった。
HT−AAB
討:
^ セー
(5)で得られたプラスミド及び挿入断片のないpUE
X2を夫々別々に大腸菌■旧o1株に感染させ、組換体
を作製した。この大腸菌をLB培地にて30℃において
培養し、その対数増殖期に42℃にて温度誘導を行い発
現を誘導し、2時間後に集菌した。菌体は粗遠心にて沈
渣とし、1■M PMSFを含むTBS−T及びガラス
ピーズを添加し、15分間激しく撹拌し菌体を破砕した
。これを3000回転で10分間遠心し、沈渣を10m
M EDT^を含む50■間トリス塩酸緩衝液(pH8
,0)に懸濁し大腸菌ライセードとした。
X2を夫々別々に大腸菌■旧o1株に感染させ、組換体
を作製した。この大腸菌をLB培地にて30℃において
培養し、その対数増殖期に42℃にて温度誘導を行い発
現を誘導し、2時間後に集菌した。菌体は粗遠心にて沈
渣とし、1■M PMSFを含むTBS−T及びガラス
ピーズを添加し、15分間激しく撹拌し菌体を破砕した
。これを3000回転で10分間遠心し、沈渣を10m
M EDT^を含む50■間トリス塩酸緩衝液(pH8
,0)に懸濁し大腸菌ライセードとした。
B ニス ン ロ セ(7) (
B)で得られた大腸菌ライセードを5DS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、これをニトロセルロース
膜に転写しく3)に準じてブロッキング反応から発色反
応を行った。但し、急性期患者血清については、2次抗
体として、抗ヒトIgMヤギ抗体を用いた。ウェスタン
プロットアッセイの結果を表1、表2、表3に示した。
B)で得られた大腸菌ライセードを5DS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、これをニトロセルロース
膜に転写しく3)に準じてブロッキング反応から発色反
応を行った。但し、急性期患者血清については、2次抗
体として、抗ヒトIgMヤギ抗体を用いた。ウェスタン
プロットアッセイの結果を表1、表2、表3に示した。
血清
1、感染後0日
17日
21日
28日
42日
56日
2、感染後0日
21日
28日
35日
42日
HT3
A
UEX2
(以
下
余
白)
表2 ミャンマー非A非B型肝炎患者血清との反応血清
HT3−3A pUEX2患者A
急性期 回復期1 ± 回復期2 + 患者B 急性期 + 回復期1 十 回復期2 ± 患者C急性期 士 回復期1 十 回復期2 + 患者D 急性期 十 回復期1 + 回復期2 (以下余白) 表3 正常カニクイザル、正常人、B型肝炎患者、その他の肝
炎患者血清との反応 血清 T3 3^ UEX2 正常カニクイザル−1 正常人 B型肝炎患者−1 =3 その他の肝炎患者−1 FIT3−3A由来蛋白は非A ll:B型肝炎感染カ
ニクイザル経時血清及びミャンマー非A非B型肝炎患者
血清と非常に良く反応し、挿入断片のないpUEX2由
来ライセードはこれら血清と全く反応しなかった。また
、正常カニクイザル血清、正常人血清、B型肝炎患者血
清及びその他の肝炎患者血清はIT3−3A由来蛋白と
全く反応しなかった。
HT3−3A pUEX2患者A
急性期 回復期1 ± 回復期2 + 患者B 急性期 + 回復期1 十 回復期2 ± 患者C急性期 士 回復期1 十 回復期2 + 患者D 急性期 十 回復期1 + 回復期2 (以下余白) 表3 正常カニクイザル、正常人、B型肝炎患者、その他の肝
炎患者血清との反応 血清 T3 3^ UEX2 正常カニクイザル−1 正常人 B型肝炎患者−1 =3 その他の肝炎患者−1 FIT3−3A由来蛋白は非A ll:B型肝炎感染カ
ニクイザル経時血清及びミャンマー非A非B型肝炎患者
血清と非常に良く反応し、挿入断片のないpUEX2由
来ライセードはこれら血清と全く反応しなかった。また
、正常カニクイザル血清、正常人血清、B型肝炎患者血
清及びその他の肝炎患者血清はIT3−3A由来蛋白と
全く反応しなかった。
以上のように、本発明のHT3−3Aクローンが非A非
B型肝炎特異的であることが示された。
B型肝炎特異的であることが示された。
第1図は、本発明でクローニングしたFIT3−3^の
塩基配列を示す。 第2図は、本発明でクローニングしたHT3−3^がコ
ードする全アミノ酸配列を示す。 第3図は、アミノ酸配列を基にした、HT3−3Aがコ
ードするペプチドの親水性・疎水性プロフィールを示す
。 第4図は、本発明でクローニングしたHT3−123.
5とカニクイザル染色体DNAとのサザンハイブリダイ
ゼーションの模式図である。 特許出願人 財団法人 化学及血清療法研究所TTGC
TTGAGG CTTTTGATGA CCAGGGTGCG GCCTTAAGAX TATCTGCTTG ATTTCTGTTC ATACCTTGGA TTTCTGCCCA CTTTCCAGTC XXAGGTGGGT TGCCCCCCTT GCGCT CTACCCTGCC GAGTGCCGCC TACTGTCGCT AAAACTCGGG CTTTCTGTTG TGCGCCCATA CTCTTGGCCT GAGCTTCAGC AGTTATAGTT CTTATTTCTT (Xは任意の核酸) 第1 図 Leu Cys lu Leu Ala Ser Leu 人rg Leu Ala Cys Ser Leu Tyr Ser Ala lu i s rg Ser rg Ser Val Asp hr Pr。 Leu *** Leu Ala hr Phe Leu Leu rg Ser Tyr L6u Asp Asp Asp Gay Leu Ser Leu Trp Val Ali Cys Plle Leu Tyr Pr。 Phe Cys Gin Gly Ser Phe Lys Leu Ala Pr。 Phe Leu Ala。 Pr。 Ala Ser 1y Leu Phe (***は任意のアミノ酸) 第 図 7°u−7’ :HT3−1 T3−2 T3 T3−5 レーン1: 正常カニクイザル肝臓より抽出した NA 非A非B型肝炎急性期カニクイザル 肝臓より抽出したDNA T3−I tT3−2 T3−3 [IT3−5 フラグメント フラグメント フラグメント フラグメント 第 図 *ネ*0:O Arg(R) :0 Trp(W) :O Va+(V) :○ Lys (K) Leu(L) Gly(G) Ser(S) Tyr (Y) Ser(S) Leu(L) Set(S) Ala(A) Cys (C) Ala(A) Pro (P) Leu(L) +−−−−−−−−一+−Leu(L) Ser (S) Vat (+/) Alt(A〉 Tyr(Y) : :*Phe(F)
; ;*Leu(L) :
* Phe(F) :* Leu (L) Phe (F) Arg(R) Ala(A) +−−−−−−m−−+−−−−−−−−−+−−−−
疎水性← ○: 親水性領域 第3図 ネ * −−−−−+−−−−−−−−−+−−一−−−−−−
÷−−−−+→親水性 0.160000 0.220000 0.220000 −0.140000 −0.740000 o、ooooo。 50−0.160000 0.700000 0.700000 −0.640000 0.800000 0.540000 −0.700000 −0.340000 0.760000 1.020000 60−0.760000 0.960000 1.060000 1.160000 1.300000 −1.720000 −1.920000 −2.180000 2.220000 1.120000 70−0.860000 o、ooooo。 o、ooooo。 (林*は任意のアミノ酸)
塩基配列を示す。 第2図は、本発明でクローニングしたHT3−3^がコ
ードする全アミノ酸配列を示す。 第3図は、アミノ酸配列を基にした、HT3−3Aがコ
ードするペプチドの親水性・疎水性プロフィールを示す
。 第4図は、本発明でクローニングしたHT3−123.
5とカニクイザル染色体DNAとのサザンハイブリダイ
ゼーションの模式図である。 特許出願人 財団法人 化学及血清療法研究所TTGC
TTGAGG CTTTTGATGA CCAGGGTGCG GCCTTAAGAX TATCTGCTTG ATTTCTGTTC ATACCTTGGA TTTCTGCCCA CTTTCCAGTC XXAGGTGGGT TGCCCCCCTT GCGCT CTACCCTGCC GAGTGCCGCC TACTGTCGCT AAAACTCGGG CTTTCTGTTG TGCGCCCATA CTCTTGGCCT GAGCTTCAGC AGTTATAGTT CTTATTTCTT (Xは任意の核酸) 第1 図 Leu Cys lu Leu Ala Ser Leu 人rg Leu Ala Cys Ser Leu Tyr Ser Ala lu i s rg Ser rg Ser Val Asp hr Pr。 Leu *** Leu Ala hr Phe Leu Leu rg Ser Tyr L6u Asp Asp Asp Gay Leu Ser Leu Trp Val Ali Cys Plle Leu Tyr Pr。 Phe Cys Gin Gly Ser Phe Lys Leu Ala Pr。 Phe Leu Ala。 Pr。 Ala Ser 1y Leu Phe (***は任意のアミノ酸) 第 図 7°u−7’ :HT3−1 T3−2 T3 T3−5 レーン1: 正常カニクイザル肝臓より抽出した NA 非A非B型肝炎急性期カニクイザル 肝臓より抽出したDNA T3−I tT3−2 T3−3 [IT3−5 フラグメント フラグメント フラグメント フラグメント 第 図 *ネ*0:O Arg(R) :0 Trp(W) :O Va+(V) :○ Lys (K) Leu(L) Gly(G) Ser(S) Tyr (Y) Ser(S) Leu(L) Set(S) Ala(A) Cys (C) Ala(A) Pro (P) Leu(L) +−−−−−−−−一+−Leu(L) Ser (S) Vat (+/) Alt(A〉 Tyr(Y) : :*Phe(F)
; ;*Leu(L) :
* Phe(F) :* Leu (L) Phe (F) Arg(R) Ala(A) +−−−−−−m−−+−−−−−−−−−+−−−−
疎水性← ○: 親水性領域 第3図 ネ * −−−−−+−−−−−−−−−+−−一−−−−−−
÷−−−−+→親水性 0.160000 0.220000 0.220000 −0.140000 −0.740000 o、ooooo。 50−0.160000 0.700000 0.700000 −0.640000 0.800000 0.540000 −0.700000 −0.340000 0.760000 1.020000 60−0.760000 0.960000 1.060000 1.160000 1.300000 −1.720000 −1.920000 −2.180000 2.220000 1.120000 70−0.860000 o、ooooo。 o、ooooo。 (林*は任意のアミノ酸)
Claims (17)
- (1)流行性非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチドをコ
ードする核酸断片。 - (2)前記非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
記の(A)から(C)のアミノ酸配列からなる群から選
ばれる少なくともひとつのアミノ酸配列を含むペプチド
である前記第(1)項記載の核酸断片。 (A)【遺伝子配列があります】 (B)【遺伝子配列があります】 (C)【遺伝子配列があります】 (***は任意のアミノ酸) - (3)前記非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
記のアミノ酸配列を含むペプチドである前記第(2)項
記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 - (4)下記の(A)〜(C)の核酸配列からなる群から
選ばれる核酸配列を少なくともひとつ含む前記第(2)
項記載の核酸断片。 (A)【遺伝子配列があります】 (B)【遺伝子配列があります】 (C)【遺伝子配列があります】 (Xは任意の核酸) - (5)下記の塩基配列を含む上記第(3)項記載の核酸
断片。 【遺伝子配列があります】 - (6)前記非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
記のアミノ酸配列を含むペプチドである前記第(2)項
記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 (***は任意のアミノ酸) - (7)下記の塩基配列を含む上記第(6)項記載の核酸
断片。 【遺伝子配列があります】 (Xは任意の核酸) - (8)下記の(A)から(C)のアミノ酸配列からなる
群から選ばれるアミノ酸配列を少なくともひとつ含む流
行性非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 (A)【遺伝子配列があります】 (B)【遺伝子配列があります】 (C)【遺伝子配列があります】 (***は任意のアミノ酸) - (9)下記のアミノ酸配列を含む前記第(8)項記載の
非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 - (10)下記のアミノ酸配列を含む前記第(8)項記載
の非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 (***は任意のアミノ酸) - (11)該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドで
ある前記第(8)項に記載の非A非B型肝炎ウィルス抗
原ペプチド。 - (12)該ペプチドが、前記第(1)項の核酸断片を適
当な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞内で発現
させることにより得られるペプチドである前記第(8)
項記載の非A非B型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 - (13)前記第(8)項記載のペプチドを抗原として用
いることを特徴とする流行性非A非B型肝炎ウィルス関
連抗体の免疫学的検出方法。 - (14)下記の塩基配列に含まれる少なくとも10塩基
以上の核酸断片からなることを特徴とする流行性非A非
B型肝炎ウィルス遺伝子検出用核酸プローブ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 (Xは任意の核酸) - (15)上記第(14)項の核酸プローブを用いて、対
象となるサンプルのDNAまたはRNAとハイブリダイ
ゼーションさせることを特徴とする流行性非A非B型肝
炎ウィルスの検出方法。 - (16)上記第(8)項記載のペプチドを抗原として調
製される流行性非A非B型肝炎ウィルス関連抗体。 - (17)上記第(16)項記載の抗体を用いることを特
徴とする流行性非A非B型肝炎ウィルス及び関連抗原の
免疫学的検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12856990A JP3110437B2 (ja) | 1990-05-17 | 1990-05-17 | 流行性非a非b型肝炎ウイルス抗原ペプチドおよびこれをコードする核酸断片 |
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US10704037B2 (en) | 2005-07-29 | 2020-07-07 | Abbott Products Gmbh | Processes for the manufacture and use of pancreatin |
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-
1990
- 1990-05-17 JP JP12856990A patent/JP3110437B2/ja not_active Expired - Fee Related
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