JPH0423991A - 流行性非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドおよびこれをコードする核酸断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ａ型でもＢ型でもない流行性肝炎の原因ウィ
ルス（流行性流行性非Ａｌ１肝Ｂウィルス）のウィルス
抗原をコードする遺伝子断片、流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウ
ィルス抗原ペプチド、およびこれら利用法に関する。

の　景および従来技術 ウィルス性肝炎にはＡ型肝炎（伝染性肝炎）とＢ型肝炎
（血清肝炎）の２種類があることは古くから知られてい
た。これは主として感染経路の相違に基づいたもので、
Ａ型肝炎は経口感染で流行を起こし、Ｂ型肝炎は主とし
て血液を介して伝播されるものであることが確認されて
いた。これら二つの肝炎の起因ウィルスは既に分離同定
され、Ａ型肝炎ウィルスは１、ピコルナウィルスに属す
る、直径２７ｎｍのＲＮＡウィルスであり［Ｆｉｎｅｓ
ｔｏｎ、Ｓ。

Ｍ、　ｅｔ　ｍｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　１８２　ｐ１
０２６　（１９７３）］、一方Ｂ型肝炎ウィルスは、ヘ
パドナウィルスに属する直径４２ｎｍのエンベロープを
持つＤＮＡウィルスであることが突き止められた。［Ｄ
ａｎｅ、Ｏ，Ｓ、、　ｅｔ　＆１゜Ｌａｎｃｅｔ、　Ｉ
　ｐ６９５　（１９７０）］また、現在では、これらの
肝炎ウィルスの免疫血清学的診断方法が確立されるに至
っている。

これら２つの肝炎ウィルスの確定診断方法が確立される
に従い、このいずれにも属さない非Ａ非Ｂ型肝炎の存在
が明らかになってきた［Ｐｒ１ｎｃｅ、Ａ。

帽、ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　１　ｐ２４１　
（１９７４）］。

輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ
）のスクリーニング法の導入により大幅に減少したがゼ
ロにはならず、しかも、発生した肝炎患者からは、Ａ型
、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られなかった。このことか
ら、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型肝炎と呼ばれている。

この肝炎は、我国では散発性肝炎の約５０％、輸血後肝
炎の９０％以上にのぼり、更に慢性肝炎、肝硬変、肝癌
の５０％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に起因すると推定されて
おり、大きな社会問題となっている。

最近になって、この主に血液を介して感染する非Ａ非Ｂ
型肝炎ウィルスに関して、ＨＣＶ　（Ｃ型肝炎ウィルス
）という呼称が定着しつつあり、ＨＣｖに関係した抗体
のスクリーニング方法も既に開発されているが、その詳
しいウィルス学的性状は未だ不明である［　Ｃｈｏｏら
、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４４．３５９−３６２（１９８
９）、Ｋｕｏ　　ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４４．３６
２−３６４（１９８９）　　コ。

これとは別に、インド、ミャンマー、アフガニスタン、
または、北アフリカなどで経口感染で流行する、第二の
ウィルス性非Ａ非Ｂ型肝炎があることが明らかになった
［　）［ｈｕｒｏｏ、　Ｍ、　Ｓ、　　＾ｍ、　Ｊ、　
Ｈｅｄ、、　６８　ｐ８１８−８２４．　　（１９８０
）コ、これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。

我国では、この肝炎の流行は見られていないが、渡航者
の流行地からの肝炎の輸入は若干見られるようである［
福原ら、第２５回日本肝臓学会総会講演要旨集１５１頁
（１９８９）　］。

本発明は、上記で言う後者の、主に水を介して感染する
流行性非Ａ１１−Ｂ型肝炎ウィルスに関するものであり
、本明細書中では、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶでないこの
ウィルスを非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスと言う。

この非Ａ非Ｂ型肝炎についてはウィルス本体の分離同定
はされておらず、このため、この肝炎の診断方法、治療
法、予防法は確立されていない。

また、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。

即ち、患者の血清について、診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行い、これらの肝炎であること
を否定し、更に、全身感染の一部の症状として肝炎症状
を示す、ヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバーウ
ィルス感染の可能性を否定し、薬物性や、アルコール性
肝炎、自己免疫性肝炎を否定して非Ａ非Ｂ型肝炎として
診断されていた。

本発明の対象となる非Ａ非Ｂ型肝炎は、インド、ネパー
ル、ミャンマー及び北アフリカ等をその主な流行地とし
ている。感染経路としては、飲料水や野菜を通じたもの
が主な経路であり、感染後の症状としては、通常一過性
の感染、即ち急性肝炎を起こすだけで持続感染は一般に
ないことが知られている。しかし゛ながら、妊婦がこの
ウィルスに感染すると死亡率が２０％と非常に高いこと
が知られており［Ｔｉｎｄｏｎら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ、
１４ｅｄ、Ｒｅｓ、　７５）３９−７４４＜１９８２）
　］、しばしば飲料水の汚染によって大流行を起こすこ
ともある。最近の例としては、１９８６年から１９８８
年にかけて中国のウルムチ自治区の西南部において１２
万人の患者が発生するという大流行が報告されている［
現代科学、１９８７年７月号６２−６７、感染症学雑誌
、６４．１０５−１１１　＜１９９０＞　］　、　　従
って、このような流行地に渡航する人々にとって、有効
なワクチンの開発並びに抗体、抗原又はウィルスそのも
のの保有状態を容易に検出できる診断試薬の開発が望ま
れている。

これまでの報告によれば、免疫電−によるウィルス様粒
子の検出が報告されており［５ｒｅｅｎｉｖａｓａｎら
、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６５．１９９５−１００
７（１９８４）　］、さらにサルを用いた動物モデルに
おいて感染実験が成功したことが報告されている［　Ｗ
ａｎｅら、ＪＡＭＡ　２５２゜３１４０−３１４５（１
９８４）　］。

本発明者らにおいても、流行地における急性期患者の糞
便から調製したウィルス液をカニクイザルの静脈に接種
したところ感染が成立し、その継代感染にも成功した。

又、感染したサルの糞便及びサル肝臓細胞中にウィルス
様粒子を検出した［　Ｓｏｅら、Ｌｉｖｅｒ、９．１３
５−１４５（１９８９）　Ｅ、　　さらにサル胆汁中に
多量のウィルス様粒子が検出されることを確認し［現代
科学、１９８７年７月号、６２−６７］、ウィルスｃＤ
ＮＡ断片のクローニングに成功し特許出願した［特願平
２−６４６２９号］。

最近になって米国のＧｅｎｅｌａｂｓ社が、非Ａ非Ｂ型
肝炎ウィルスのｃＤＮＡをクローニングしたという報告
があったが［Ｒｅｙｅｓら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４７
．１３３５−１３３９＜１９９０＞　１、ウィルスその
ものの性状、ウィルス構成蛋白の性状などはまだ一切明
らかにされていない。

翌ｊし旧１釣 このような状況のもとに、本発明者らは、非Ａ非Ｂ型肝
炎の原因ウィルスもしくはそのウィルス遺伝子のクロー
ニングを目的として研究を重ねた結果、非Ａ非Ｂ型肝炎
ウィルスの抗原ペプチド配列をコードしている遺伝子を
クローニングすることに成功した。さらに、本発明者ら
は、この遺伝子断片を遺伝子組換え技術を用いて発現さ
せ得られたペプチドが非Ａｌｌ！Ｂ型肝炎患者血清と蛋
白レベルにおいても特異的に反応することを確認し、本
発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、非Ａ非Ｂ型肝炎感染カニクイザル胆
汁標品を用いて、従来の免疫血清学的方法とは違った新
しい分子遺伝学的手法を取り入れたイムノスクリーニン
グ法により得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスに特有なペ
プチド並びにこれをコードする遺伝子を提供するもので
ある。

智 本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子断片は、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス感染カニクイザルの胆汁から、抽出・
単離することが可能である。まず、胆汁を生理食塩水で
希釈し、低速遠心で組織片等を除く０次に２０χシヨ糖
を含む生理食塩水の上に重層し超遠心を行う、このこと
により沈渣にウィルス粒子を回収することができる。こ
のウィルス粒子をグアニジンチオシアネート処理するこ
とによってＲＮＡを抽出し、これを鋳型としてｃＤＮＡ
を合成する。このｃＤＮＡをλｇｔｌ　１ベクターに挿
入しｃＤＮＡライブラリーを作成する。

λファージを大腸直に感染させ、細菌培養プレートにま
き、４２℃で数時間培養する。その後ニトロセルロース
フィルター（ＮＣフィルター）をかぶせ数時間培養し、
ＮＣフィルターをはがしレプリカをとる。

このレプリカをブロッキング液で処理し、トリス緩衝生
理食塩水（ＴＢＳ）などで洗浄した後イムノスクリーニ
ングを行う、すなわち、レプリカを非Ａ非Ｂ型肝炎回復
期のカニクイザル血清と反応させ、ＴＢＳなどで洗浄後
、酵素標識抗ヒトＩｇＧと反応させ、洗浄後、基質溶液
と反応させて発色させる６発色したプラークに対応する
ファージを選び二次スクリーニングを行い、再現性のあ
るλフアージクローンを得た。

このクローンについて非Ａ非Ｂ型肝炎特異性を調べた。

非Ａ非Ｂ型肝炎回復期、および正常期のカニクイザル血
清を用いてプラークイムノアッセイを行った結果、非Ａ
非Ｂ型肝炎ウィルス感染に特異性の高いクローンを得る
ことができた。このクローンのファージＤＮＡを精製［
実験医学　臨時増刊号、遺伝子工学総集編５（１１）、
Ｐ３１−３２（１９８７）参照コし、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉで切断後ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、０
．２２Ｔｈｐの挿入断片（ＨＴ３−３）を確認した。こ
れを発現ベクターｐＵＥＸ２　　（アマジャム社製）に
サブクローニングしくＨＴ３−３Ａ）、大腸菌発現産物
が前述のカニクイザル血清と反応することを確認した。

カニクイザルの正常期及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期の肝臓
より染色体ＤＮＡを精製し、アガロースゲル電気泳動を
行った後、　　ｓｔｐ標識したＨＴ３３を用いてサザン
ハイブリダイゼーションを行った。ＨＴ３−３はいずれ
のＤＮＡとも反応せず、したがってＨＴ３−３は染色体
由来ＤＮＡでないと判明した。

本発明のＨＴ３−３ＡのＤＮＡ配列は、ジデオキシ法に
より決定された。その結果ＨＴ３−３Ａは非Ａ非Ｂ型肝
炎ウィルス遺伝子由来の計２１６ｂｐのｃＤＮ＾断片で
あり、その塩基配列は第１図に示される通りであった。

このＤＮＡ配列をアミノ酸に読み直し、λｇｔｌｌ及び
ｐＵＥＸ２の発現フレームに合致するフレームをオープ
ンリーディングフレームとした。この塩基配列とアミノ
酸配列をデータベース（Ｇｅｎｅｔｙｘ−ＣＤ　　ソフ
トウェア開発　１９９０　）で検索したところ、現在ま
で知られているウィルス、細菌、その他ホモロジーを示
すものはなかった。

このアミノ酸配列から、ＨＯＰＰ　＆　ＷＯＯＤらの手
法に基づき、ＨＴ３−３Ａがコードするペプチドの親水
性・疎水性のパターンを解析した。その結果、第３図に
示すような結果が得られ、このペプチド領域中には、特
に親水性の強い３つの領域が存在することが確認された
。

このように、本発明で得られたｃＤＮＡ断片が、非Ａ非
Ｂ型肝炎ウィルス抗原のうち親水性の強いペプチド領域
をコードするものであったことは、免疫学的見地からも
非常に意義深いものと思われた。また、このような親水
性のペプチドは取扱が容易になることから、実用性の面
からも非常に有用である。

本発明では、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドの好
ましい一例として、第２図に示すような７２個のアミノ
酸からなるペプチドを開示するのみならず、その中でも
特に非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの抗原性と深い関連がある
と考えられる、上記で述べた親水性の強い３つ或いはそ
れらを含む非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原エピトープをも
開示するものである。そのような抗原エピトープは、下
記の（Ａ＞〜（Ｃ）のアミノ酸配列である。

（Ａ）　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ（Ｂ）　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ
　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＡｒｇ　Ｐｒ。

（Ｃ）　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　＊本＊　　
Ａｒｇ　　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ（＊＊ネは任意のアミノ酸
） また、上記（Ａ＞及び（Ｂ）の抗原エピトープは、第２
図のアミノ酸配列の中でも極めて接近して存在するため
、（Ａ）及び（Ｂ）を含む下記の配列も重要なエピトー
プと考えられる。

Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＡＳｐ　Ｔ
ｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　ＡｌａＨｉｓ　Ｔｈｒ
　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ＡｒｇＰｒ。

第３図の解析パターンにも示されたとうり、上記のアミ
ノ酸配列のペプチド領域は、特に親水性の強いペプチド
であることが確認される。さらに非Ａ　１１−　Ｂ型肝
炎との関連性を確認するために、この遺伝子断片を大腸
菌の発現系に組み込み発現させることによって得られた
抗原を用い、多数の肝炎患者、正常人の血清を対象とし
てＨＴ３−３Ａに対するウェスタンプロットアッセイを
行った。

その結果、正常人、Ｂ型肝炎、その他の肝炎の群に比べ
非Ａ非Ｂ型肝炎患者で高率に抗体陽性者が検出され、イ
ムノアッセイによる蛋白レベルでも。

本発明のペプチドの非Ａ非Ｂ型肝炎に対する特異性が証
明された。

本発明の遺伝子配列は、これを適当な発現系を用いて発
現させ、非Ａ１１−Ｂ型肝炎ウィルスの抗体検査に使用
することができるし、また、発現した蛋白を動物に免疫
して抗体を作らせ、これを用いて非Ａ非Ｂ型肝炎感染患
者の肝組織中の非Ａ非Ｂ・型肝炎ウィルスまたは関連抗
原を検出することも可能である。

さらに、本発明で得られた非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連
抗原は、感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用
である。

また、遺伝子配列そのものは、非Ａ非Ｂ型肝炎のＤＮＡ
プローブ診断キットの開発に極めて有用である。

このような、本発明の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプ
チドをコードする核酸断片、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
原ペプチドおよびこれらを利用した非Ａ非Ｂ型肝炎ウィ
ルス関連抗原及び抗体の各種検出方法は、特に日本にお
ける非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスの検出において極めて有用
であると考えられる。

以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に説明する。

非Ａ非Ｂ型肝炎患者の急性期糞便より調製したウィルス
液を、カニクイザルの静脈に接種したところ感染が成立
した。さらに、感染したサルの糞便を用いての継代感染
も成立した［Ｌｉｖｅｒ　９．　ｐ１３５−１４５　　
（１９８９）コ。

感染したサルの胆汁を電子顕微鏡で観察したところ、直
径的２７ｎｍのウィルス粒子が検出されたく現代化学１
９８９年７月号、ｐ６２−６７　）、　　この胆汁的２
■ｌからウィルス粒子を精製し、以下の実験に用いた。

ス　　　　　　　　　　　　ロー 二じ仁グ。

（１）で得られたウィルス粒子を、５．５Ｍグアニジン
チオシアネートで処理し、ウィルスゲノム由来の核酸を
抽出した。　　ｃＤＮＡ合成システムプラス（アマジャ
ム社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行い、合成したｃＤＮ
ＡをｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔｌｌ　（アマ
ジャム社製）により＾ｇｔｌｌベクターにクローニング
した。　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングの結果、５
．７ｘｌＯ’プラークフオーミングユニツト（ＰＦＵ）
のライブラリーを得た。

■ （２）で構築したｃＤＮ＾ライブラリーから、−枚のＬ
Ｂプレート［１，５％Ａｇａｒ、１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎｅ、０．５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　ｅｘ
ｔｒａｃｔ　、１％ＮａＣ１ｐＨ７，５，５０ｕｇ／■
ｌアンピシリンの入った細菌培養用プレート（栄研社製
；８２■−φ）］当り１０００　ＰＦＵのファージをと
り、別々に挿入断片のないファージと共に大腸菌Ｙ１０
９０に３７℃で１５分間感染させて、Ｔｏｐ　Ａｇａｒ
４ｍｌ（０，７％Ａｇａｒ、１％Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐ
ｔｏｎｅ、０５％Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ　　ｅｘｔｒ
ａｃｔ　、　　１％ＮａＣ１，ｐＨ７，５、５０ｕｇ／
ｍｌアンピシリン）と共にまき、４２℃で３時間培養し
た。その後、１０■Ｍ　ＩＰＴＧ　　（シグマ社製）を
染みこませたニトロセルロースフィルター（ＮＣフィル
ター：ＳＡ３社製、Ｃｏｄｅ　Ｂ＾８５．８２−■φ）
をかぶせ、さらに３７℃で培養を続けた。３時間後ＮＣ
フィルターをプレートからはがし、０．０５Ｘ　Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＴＢＳ　（ＴＢＳ−Ｔ）で洗い、ブロッ
キング液（５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ溶液）に
浸し、４℃で一夜放置した。

Ｂ　　　　　ス　　■　−二ゝ ブロッキング液中で一夜漬したレプリカフィルターをＴ
ＢＳ−Ｔで洗浄後、ブロッキング液で５０倍に希釈した
正常期及び非Ａ非Ｂ型肝炎回復期のカニクイザル血清に
浸し、３７℃で振盪しながら反応させた。１時間後、Ｔ
ＢＳ−Ｔで、−回につき１０分間、計３回レプリカフィ
ルターを洗浄の後、各々１０００倍希釈したペルオキシ
ダーゼ標識抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（Ｂｉｏ園ａｋｏｒ社
製〉の入ったブロッキング液に浸し、３７℃で振盪しな
がら反応させた。１時ＩＷＩ後、ＴＢＳ−Ｔで一回につ
き１０分間、計３回、そのｔｊｉＴＢｓで１０分間洗浄
後、発色液［０，６６／ｍｌ　４−ｃｈｌｏｒｏ−１ｎ
ａｐｈｔｈｏ１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、２０Ｘ１４ｅ
ＯＨ１０，０６％Ｈ２Ｏ２］に浸し発色させた。　　Ｎ
Ｃフィルター上で発色したプラークに対応する一ファー
ジを選び、二次スクリーニングを行った。即ち、−次ス
クリーニングで選択した各ファージを別々に挿入断片の
ないファージと共に大腸菌Ｙ１０９０に感染させ、８２
ｍｍシャーレ（栄研社製）のＬＢプレートにまき直し、
レプリカフィルターを作製した。これらを上述の方法で
抗体スクリーニングし、非Ａ非Ｂ型肝炎回復期のカニク
イザル血清と再現性よく反応するファージを４クローン
（ＨＴ３−１．２，３．５　）得た。これらのクローン
のファージＤＮＡを精製［実験医学　臨時増刊号、遺伝
子工学総集編５（１１）、Ｐ３１−３２　（１９８７）
参照コし、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断後ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動に供し、０．３１Ｋｂｐ（ＨＴ３−１
＞、　０．３ｋｂｐ（ＦＩＴ３−２）　、　０．２２ｋ
ｂｐ（ＨＴ３−３．５＞の挿入断片を確認した。

Ｈ−いた　　１　口　　　　。

下記のとうり、ＨＴ３−１．２．３．５を用いたサザン
プロット分析を行った。カニクイザルの正常及び非Ａ非
Ｂ型肝炎急性期の肝臓より染色体ＤＮＡを精製し、各々
１０ｕｇをＥｃ　ｏＲＩで切断後、電気泳動で１％アガ
ロースゲルに展開し、ナイロンフィルターに転写した。

このフィルターにマルチプライム法で［３２−Ｐ］標識
した各クローンをプローブとし、サザンハイブリダイゼ
ーションを行った（第４図）。

各プローブは正常及び非Ａ非Ｂ型肝炎急性期のカニクイ
ザルの染色体ＤＮＡとは反応せず、このことから、ＩＩ
ＩＴ３−１．２．３．５はカニクイザルの染色体ＤＮＡ
由来のクローンではなく、ウィルス等の外来性の核酸由
来のものであると考えられる。

ＨＴ−ローニン　： （３）　（Ｂ）で得られたクローンのファージＤＮＡを
精製［実験医学　臨時増刊号、遺伝子工学総集編５（１
１）、Ｐ３１−３２　（１９８７）参照コし、制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断後ｐＵＥＸ２ベクター（アマジャム社
製）のＥｃｏＲ１部位に挿入し、サブクローニングを行
い、夫々のサブクローンｌ’１Ｔ３−ＩＢ、　２Ｅ、　
３Ａ、　５＾を得た。

■　−ＢＥ　　＾　＾　　　　　　　　≧ノ列： ＡＲＴ−ＢＥＡＡ　　ロー （５）で得られたプラスミドＤＮＡを鋳型とし、　［α
−”Ｓ］　ｄＣＴＰ　（１０００Ｃｉ／　ｍｍｏｌ　）
及び５ｅｑｕｅｎａｓｅｖ２．０キツト（ＵＳＢ社製）
を用い、ジデオキシ法により反応を行った。６％のポリ
アクリルアミド８Ｍウレアゲルを用いて、３時間２２０
θＶで電気泳動し１６時間感光した。

上記の結果、Ｅ！Ｔ３−ＩＢ、　２Ｂ、　３Ａ、　５Ａ
は互いに重複しており１つの連続した配列が得られた。

　　ＨＴ３−３Ａの配列及び予測されるアミノ酸配列の
解読の結果をそれぞれ第１図、第２図に示した。

予測されるアミノ酸配列の親水性／疎水性プロフィール
を第３図に示す。

得られた塩基配列及びアミノ酸配列をデータベース（前
述）で検索した結果、ウィルス、細菌その他高いホモロ
ジーを示すものはながった。

ＨＴ−ＡＡＢ 討： ＾　　　　　　セー （５）で得られたプラスミド及び挿入断片のないｐＵＥ
Ｘ２を夫々別々に大腸菌■旧ｏ１株に感染させ、組換体
を作製した。この大腸菌をＬＢ培地にて３０℃において
培養し、その対数増殖期に４２℃にて温度誘導を行い発
現を誘導し、２時間後に集菌した。菌体は粗遠心にて沈
渣とし、１■Ｍ　ＰＭＳＦを含むＴＢＳ−Ｔ及びガラス
ピーズを添加し、１５分間激しく撹拌し菌体を破砕した
。これを３０００回転で１０分間遠心し、沈渣を１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴ＾を含む５０■間トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に懸濁し大腸菌ライセードとした。

Ｂ　　　ニス　　ン　　ロ　　　　　　　セ（７）　（
Ｂ）で得られた大腸菌ライセードを５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動に供し、これをニトロセルロース
膜に転写しく３）に準じてブロッキング反応から発色反
応を行った。但し、急性期患者血清については、２次抗
体として、抗ヒトＩｇＭヤギ抗体を用いた。ウェスタン
プロットアッセイの結果を表１、表２、表３に示した。

血清 １、感染後０日 １７日 ２１日 ２８日 ４２日 ５６日 ２、感染後０日 ２１日 ２８日 ３５日 ４２日 ＨＴ３ Ａ ＵＥＸ２ （以 下 余 白） 表２　ミャンマー非Ａ非Ｂ型肝炎患者血清との反応血清
　　　　　ＨＴ３−３Ａ　　　　　　ｐＵＥＸ２患者Ａ
　急性期 回復期１　　　± 回復期２　　　＋ 患者Ｂ　急性期　　　　＋ 回復期１　　　十 回復期２　　　± 患者Ｃ急性期　　　　士 回復期１　　　十 回復期２　　　＋ 患者Ｄ　急性期　　　　十 回復期１　　　＋ 回復期２ （以下余白） 表３ 正常カニクイザル、正常人、Ｂ型肝炎患者、その他の肝
炎患者血清との反応 血清 Ｔ３ ３＾ ＵＥＸ２ 正常カニクイザル−１ 正常人 Ｂ型肝炎患者−１ ＝３ その他の肝炎患者−１ ＦＩＴ３−３Ａ由来蛋白は非Ａ　ｌｌ：Ｂ型肝炎感染カ
ニクイザル経時血清及びミャンマー非Ａ非Ｂ型肝炎患者
血清と非常に良く反応し、挿入断片のないｐＵＥＸ２由
来ライセードはこれら血清と全く反応しなかった。また
、正常カニクイザル血清、正常人血清、Ｂ型肝炎患者血
清及びその他の肝炎患者血清はＩＴ３−３Ａ由来蛋白と
全く反応しなかった。

以上のように、本発明のＨＴ３−３Ａクローンが非Ａ非
Ｂ型肝炎特異的であることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明でクローニングしたＦＩＴ３−３＾の
塩基配列を示す。 第２図は、本発明でクローニングしたＨＴ３−３＾がコ
ードする全アミノ酸配列を示す。 第３図は、アミノ酸配列を基にした、ＨＴ３−３Ａがコ
ードするペプチドの親水性・疎水性プロフィールを示す
。 第４図は、本発明でクローニングしたＨＴ３−１２３．
５とカニクイザル染色体ＤＮＡとのサザンハイブリダイ
ゼーションの模式図である。 特許出願人　財団法人　化学及血清療法研究所ＴＴＧＣ
ＴＴＧＡＧＧ ＣＴＴＴＴＧＡＴＧＡ ＣＣＡＧＧＧＴＧＣＧ ＧＣＣＴＴＡＡＧＡＸ ＴＡＴＣＴＧＣＴＴＧ ＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣ ＡＴＡＣＣＴＴＧＧＡ ＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡ ＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣ ＸＸＡＧＧＴＧＧＧＴ ＴＧＣＣＣＣＣＣＴＴ ＧＣＧＣＴ ＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣ ＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣ ＴＡＣＴＧＴＣＧＣＴ ＡＡＡＡＣＴＣＧＧＧ ＣＴＴＴＣＴＧＴＴＧ ＴＧＣＧＣＣＣＡＴＡ ＣＴＣＴＴＧＧＣＣＴ ＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣ ＡＧＴＴＡＴＡＧＴＴ ＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴ （Ｘは任意の核酸） 第１ 図 Ｌｅｕ Ｃｙｓ ｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ 人ｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｌａ ｌｕ 　ｉ　ｓ ｒｇ Ｓｅｒ ｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｓｐ ｈｒ Ｐｒ。 Ｌｅｕ ＊＊＊ Ｌｅｕ Ａｌａ ｈｒ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ｒｇ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌ６ｕ　　Ａｓｐ Ａｓｐ　　Ａｓｐ Ｇａｙ　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ｔｒｐ　Ｖａｌ Ａｌｉ　Ｃｙｓ Ｐｌｌｅ　　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　Ｐｒ。 Ｐｈｅ　Ｃｙｓ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ Ａｌａ　Ｐｒ。 Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ Ａｌａ。 Ｐｒ。 Ａｌａ Ｓｅｒ １ｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ （＊＊＊は任意のアミノ酸） 第 図 ７°ｕ−７’　：ＨＴ３−１ Ｔ３−２ Ｔ３ Ｔ３−５ レーン１： 正常カニクイザル肝臓より抽出した ＮＡ 非Ａ非Ｂ型肝炎急性期カニクイザル 肝臓より抽出したＤＮＡ Ｔ３−Ｉ ｔＴ３−２ Ｔ３−３ ［ＩＴ３−５ フラグメント フラグメント フラグメント フラグメント 第 図 ＊ネ＊０：Ｏ Ａｒｇ（Ｒ）　　：０ Ｔｒｐ（Ｗ）　　：Ｏ Ｖａ＋（Ｖ）　　：○ Ｌｙｓ　（Ｋ） Ｌｅｕ（Ｌ） Ｇｌｙ（Ｇ） Ｓｅｒ（Ｓ） Ｔｙｒ　（Ｙ） Ｓｅｒ（Ｓ） Ｌｅｕ（Ｌ） Ｓｅｔ（Ｓ） Ａｌａ（Ａ） Ｃｙｓ　（Ｃ） Ａｌａ（Ａ） Ｐｒｏ　（Ｐ） Ｌｅｕ（Ｌ）　＋−−−−−−−−一＋−Ｌｅｕ（Ｌ） Ｓｅｒ　（Ｓ） Ｖａｔ　（＋／） Ａｌｔ（Ａ〉 Ｔｙｒ（Ｙ）　　：　　　　　　　：＊Ｐｈｅ（Ｆ）　
　；　　　　　　　；＊Ｌｅｕ（Ｌ）　　：　　　　　
＊ Ｐｈｅ（Ｆ）　　：＊ Ｌｅｕ　（Ｌ） Ｐｈｅ　（Ｆ） Ａｒｇ（Ｒ） Ａｌａ（Ａ） ＋−−−−−−ｍ−−＋−−−−−−−−−＋−−−−
疎水性← ○： 親水性領域 第３図 ネ ＊ −−−−−＋−−−−−−−−−＋−−一−−−−−−
÷−−−−＋→親水性 ０．１６００００ ０．２２００００ ０．２２００００ −０．１４００００ −０．７４００００ ｏ、ｏｏｏｏｏ。 ５０−０．１６００００ ０．７０００００ ０．７０００００ −０．６４００００ ０．８０００００ ０．５４００００ −０．７０００００ −０．３４００００ ０．７６００００ １．０２００００ ６０−０．７６００００ ０．９６００００ １．０６００００ １．１６００００ １．３０００００ −１．７２００００ −１．９２００００ −２．１８００００ ２．２２００００ １．１２００００ ７０−０．８６００００ ｏ、ｏｏｏｏｏ。 ｏ、ｏｏｏｏｏ。 （林＊は任意のアミノ酸）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. （１）流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドをコ
   ードする核酸断片。
2. （２）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
   記の（Ａ）から（Ｃ）のアミノ酸配列からなる群から選
   ばれる少なくともひとつのアミノ酸配列を含むペプチド
   である前記第（１）項記載の核酸断片。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （＊＊＊は任意のアミノ酸）
3. （３）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
   記のアミノ酸配列を含むペプチドである前記第（２）項
   記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】
4. （４）下記の（Ａ）〜（Ｃ）の核酸配列からなる群から
   選ばれる核酸配列を少なくともひとつ含む前記第（２）
   項記載の核酸断片。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （Ｘは任意の核酸）
5. （５）下記の塩基配列を含む上記第（３）項記載の核酸
   断片。 【遺伝子配列があります】
6. （６）前記非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチドが、下
   記のアミノ酸配列を含むペプチドである前記第（２）項
   記載の核酸断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （＊＊＊は任意のアミノ酸）
7. （７）下記の塩基配列を含む上記第（６）項記載の核酸
   断片。 【遺伝子配列があります】 （Ｘは任意の核酸）
8. （８）下記の（Ａ）から（Ｃ）のアミノ酸配列からなる
   群から選ばれるアミノ酸配列を少なくともひとつ含む流
   行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 （Ａ）【遺伝子配列があります】 （Ｂ）【遺伝子配列があります】 （Ｃ）【遺伝子配列があります】 （＊＊＊は任意のアミノ酸）
9. （９）下記のアミノ酸配列を含む前記第（８）項記載の
   非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】
10. （１０）下記のアミノ酸配列を含む前記第（８）項記載
    の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。 【遺伝子配列があります】 （＊＊＊は任意のアミノ酸）
11. （１１）該ペプチドが、化学的に合成されたペプチドで
    ある前記第（８）項に記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗
    原ペプチド。
12. （１２）該ペプチドが、前記第（１）項の核酸断片を適
    当な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞内で発現
    させることにより得られるペプチドである前記第（８）
    項記載の非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス抗原ペプチド。
13. （１３）前記第（８）項記載のペプチドを抗原として用
    いることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関
    連抗体の免疫学的検出方法。
14. （１４）下記の塩基配列に含まれる少なくとも１０塩基
    以上の核酸断片からなることを特徴とする流行性非Ａ非
    Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子検出用核酸プローブ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （Ｘは任意の核酸）
15. （１５）上記第（１４）項の核酸プローブを用いて、対
    象となるサンプルのＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイ
    ゼーションさせることを特徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝
    炎ウィルスの検出方法。
16. （１６）上記第（８）項記載のペプチドを抗原として調
    製される流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス関連抗体。
17. （１７）上記第（１６）項記載の抗体を用いることを特
    徴とする流行性非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルス及び関連抗原の
    免疫学的検出方法。