CZ2015140A3 - Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku - Google Patents
Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015140A3 CZ2015140A3 CZ2015-140A CZ2015140A CZ2015140A3 CZ 2015140 A3 CZ2015140 A3 CZ 2015140A3 CZ 2015140 A CZ2015140 A CZ 2015140A CZ 2015140 A3 CZ2015140 A3 CZ 2015140A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna
- strand
- raman spectroscopy
- product
- enhanced raman
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
Systém pro ověření pravosti výrobku, obsahující: první řetězce DNA, který v oblasti alespoň jednoho svého konce obsahuje navázanou první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a druhý řetězec DNA, který je modifikován tak, že v oblasti svého prvního konce obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a v oblasti svého druhého konce obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu, a přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a přičemž první řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou alespoň v části své délky vzájemně komplementární. Řešení dále poskytuje způsob pro ověření pravosti výrobku využívající popsaný systém.
Description
Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká systému a způsobu pro ověření pravosti výrobku s pomocí značení DNA sekvencemi s molekulami aktivními v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii.
Dosavadní stav techniky
Účinná kontrola autenticity komerčně dostupných výrobků představuje jeden ze základních pilířů ochrany práv výrobce a její důsledné zajištění může též vést i k ochraně spotřebitele před potenciálně nebezpečnými falsifíkáty, které v mnoha případech nemusejí splňovat přísné požadavky kladené na originál. Principiálně lze zajistit ochranu autenticity několika základními přístupy, které se liší nejen provedením, ale i úrovní poskytované ochrany. Výrobek lze například chránit pomocí ochranných znaků umístěných na jeho obalu, na základě jeho jedinečných fyzikálních vlastností či dle jeho jedinečného chemického složení. V ideálním případě se jedná o kombinaci výše zmíněných přístupů. Každý z nich má však svá omezení, která jeho využití výrazně omezují. Jedná se zejména o případy, kdy jsou falsifikátoři schopni vyrobit velmi věrné kopie obalů nebo velmi přesně napodobit fyzikální i chemické vlastnosti originálu tak, že nelze dvojici originál - falsifikát jednoznačně rozeznat a odhalit tím případné porušení platné legislativy a práv výrobce.
Další možností kontroly autenticity komerčních výrobků je cílené přidání vhodné značky, jejíž jedinečná vlastnost je následně při kontrole sledována. Kontrola autenticity založená na cíleném přídavku DNA do výrobku bývá jednou z velmi častých možností. Tento přístup je popsán například ve WO 2000/044891, kde autoři popisují inkoust značený pomocí molekuly DNA, která je následně detekována pomocí postupů molekulární biologie. Využití celé molekuly DNA má však své omezení, které spočívá především v existenci snadného postupu, jak takto označený produkt falsifikovat. Zlepšenou modifikací této metody je využití polymorfních fragmentů DNA (US 2003/0235836), kde je přístup jsou založen na využití klasických metod molekulární biologie. Nespornou výhodou výše zmíněné modifikace je možnost využití i více než jednoho polymorfního fragmentu, což výrazným způsobem znemožňuje odhalit strukturu použité značky.
Významným problémem rozšíření metod pro kontrolu autenticity založených na značení produktů pomocí fragmentů DNA je rychlost, jednoduchost a v neposlední řadě i mobilita metod, pomocí kterých jsou produkty kontrolovány. Velmi často využívané metody molekulární biologie, jejichž výčet zahrnuje také například PCR (polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce) nebo variabilní techniky plošné elektroforézy, jsou i přes svou velkou oblibu v mnoha případech nedostatečné. Byly tedy navrženy postupy, které jsou založeny na detekci DNA, fragmentu DNA nebo i více těchto fragmentů pomocí Ramanovy spektroskopie a v poslední době i povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie (SERS). Takové postupy jsou popsány zejména v US 2008/0189066, CN 1302905. Hlavními výhodami této techniky jsou bezesporu její rychlost, mobilita a velmi nízký limit detekce. V této oblasti již byly publikovány práce s limity detekce v jednotkách nanomolů (nmol.L IxlO^mol.L’1).
Využití Ramanovy spektroskopie se v této problematice se v minulosti omezovalo především na kontrolu chemického složení produktů a případné porovnání originálu s potenciálně falsifikovaným vzorkem. V US 2008/0189066 se využívá Ramanovy spektroskopie pro detekci značení produktů pomocí fragmentů DNA, které jsou následně analyzovány v jejich nezměněné podobě. Výraznou přidanou hodnotu má v této oblasti patent WO 2014/019099, který je založen na detekci fragmentů DNA získaných pomocí izolace DNA z libovolného organismu včetně lidského DNA, zvířecího, bakteriálního atd., imobilizovaných na nanočásticích kovů.
Principiálně je Ramanův spektroskop tvořen zdrojem světla (ve většině případů se jedná o laser), který je zaostřen na analyzovaný vzorek. Při ozáření dochází k efektu, jenž je označován jako neelastický rozptyl. Takto vzniklé záření je následně detekováno a převedeno soustavou elektronických prvků na elektrický signál, který je následně prezentován jako závislost intenzity záření dopadajícího na detektor na jeho vlnové délce, respektive jeho vlnočtu. K výraznému snížení limitu detekce této techniky se využívá jev zvaný povrchově zesílený Ramanův rozptyl (SERS, surface enhanced Raman scattering). Jedná se o jev, ke kterému dochází vlivem interakce sledované molekuly s nanočásticemi ušlechtilých kovů, především stříbra a zlata. Velikost a morfologie částic následně ovlivňuje celkovou míru zesílení detekovaného signálu. Ve většině případů se jedná o kulovité nanočástice o velikosti 5 až 200 nm.
Analýza fragmentů DNA metodou SERS umožňuje využití velmi nízkých koncentrací fragmentů. Při nízkých koncentracích je však třeba zajistit specificitu procedury pro odstranění rizika falešně pozitivních výsledků, a stále přetrvává potřeba zvýšení spolehlivosti a rychlosti postupu. Je třeba eliminovat vliv chemického složení značeného výrobku na výsledky ověření, a zároveň zavést mechanismus, který poskytne vnitřní kontrolu správné funkčnosti celého postupu.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je systém pro ověření pravosti (autenticity) výrobku, který obsahuje
- první řetězec DNA, který v oblasti alespoň jednoho svého konce obsahuje navázanou první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii (značka, klíč), a
- druhý řetězec DNA, který je modifikován tak, že v oblasti svého prvního konce obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a v oblasti svého druhého konce obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu (zámek), a přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a přičemž první řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou alespoň v části své délky vzájemně komplementární.
Ve výhodném provedení jsou nanočástice ušlechtilého kovu ve formě kompozitu obsahujícího alespoň jednu magnetickou částici (s výhodou nanočástici) a alespoň jednu nanočástici ušlechtilého kovu. Přítomnost magnetické částice dovoluje snadno oddělit kompozit s navázanými skupinami metodami magnetické separace. Vhodnými magnetickými částicemi jsou například nanočástice oxidů železa.
Molekulou aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii může být například Cy3, Cy5, Cy7, biotin, ROX, rhodamine 6G, HEX, FAM, TET, TAMRA. Molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii by měla být zvolena tak, aby její Ramanovo spektrum (SERS) bylo odlišné od spektra řetězce DNA. S výhodou je molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii vázána kovalentní vazbou k řetězci DNA.
......
Funkční skupina obsahující atom síry nebo dusíku zajišťuje vazbu druhého řetězce DNA na povrch nanočástic. Může se jednat zejména o funkční skupinu obsahující dithiolovou, thiolovou, karboxylovou, amino nebo nitro skupinu.
Ušlechtilým kovem je s výhodou zlato nebo stříbro.
Nanočástice ušlechtilého kovu mají s výhodou velikost 5 až 100 nm.
S výhodou, je-li druhý konec druhého řetězce DNA, na němž je navázána druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, 5'-konec, je první molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii navázána rovněž na 5 -konec prvního řetězce DNA. Obdobně, v dalším výhodném provedení, je-li druhý konec druhého řetězce DNA, na němž je navázána druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, 3 konec, je první molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii navázána rovněž na 3 '-konec prvního řetězce DNA.
Druhý řetězec DNA s výhodou obsahuje alespoň 20 nukleotidů.
První řetězec DNA s výhodou obsahuje alespoň 5 až 40 nukleotidů.
První řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou vzájemně komplementární alespoň v 5 % své délky, s výhodou alespoň v 20 % své délky, výhodněji alespoň v 50 % své délky.
Termín „v oblastí konce“ znamená, že příslušná molekula a/nebo funkční skupina jsou navázány k jednomu z posledních 5 nukleotidů na příslušném konci řetězce DNA, s výhodou k jednomu z posledních 3 nukleotidů, nejvýhodněji k poslednímu nukleotidu.
Ve výhodném provedení vytváří druhý řetězec DNA na povrchu nanočástic struktury ve tvaru smyčky, které začínají u povrchu nanočástice a končí rovněž na jejím povrchu, což umožňuje v nepřítomnosti prvního řetězce DNA interakci druhé molekuly aktivní v povrchově zesílene Ramanově spektroskopii s povrchem nanočástice.
• · fc · · · • * *
Je výhodné, jsou-li první a druhý řetězec DNA vybrány tak, že nejsou identické ani podobné s žádnou DNA vyskytující se ve zkoumaném výrobku.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob ověření pravosti (autenticity) výrobku, jehož podstata spočívá v tom, že
- do výrobku se v průběhu výroby nebo dodatečně přidá první řetězec DNA, který v oblastí alespoň jednoho svého konce obsahuje navázanou první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, s výhodou v koncentraci v rozsahu 1 fmol.L 1 až 1 pmol.L i
- při ověřování pravosti výrobku se do výrobku přidá druhý řetězec DNA, který v oblasti svého prvního konce obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a v oblasti svého druhého konce obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu, a přičemž první řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou alespoň v části své délky vzájemně komplementární,
- následně se izoluje hybridizační produkt vzniklý interakcí prvního a druhého řetězce DNA,
- a poté se změří spektrum izolovaného hybridizačního produktu metodou povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie.
Změřené spektrum izolovaného hybridizačního produktu se vyhodnotí srovnáním s referenčními spektry, což jsou s výhodou spektra samotného druhého řetězce DNA obsahujícího na svém prvním konci funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a na svém druhém konci obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a dále to mohou být spektra zkoumaného výrobku bez přidání prvního řetězce DNA s navázanou první molekulou aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii a spektra produktu obsahujícího tento první řetězec DNA s navázanou první molekulou aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii.
Pokud ve spektru izolovaného hybridizačního produktu dojde ke snížení intenzity Ramanova signálu zámku (tedy zejména druhé molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii) a zároveň se v tomto spektru objeví Ramanův signál klíče (tedy zejména první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii), pak je toto důkazem přítomnosti prvního řetězce DNA ve zkoumaném výrobku a tedy pravosti tohoto výrobku.
V jednom výhodném provedení jsou nanočástice ušlechtilého kovu ve formě kompozitu obsahujícího alespoň jednu magnetickou částici (s výhodou nanočástici) a alespoň jednu nanočástici ušlechtilého kovu, a izolace hybridizačního produktu se provede metodou magnetické izolace.
Ve výhodném provedení se po přidání druhého řetězce DNA do produktu před provedením kroku izolace hybridizačního produktu ponechá směs reagovat po dobu 1 až 7200 sekund.
Princip ověření pravosti výrobku s využitím systému a metody podle předkládaného vynálezu spočívá v tom, že ve výrobku je přítomno pouze velmi malé množství prvního řetězce DNA obsahujícího první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii (klíč). Při ověřování pravosti se přidá do vzorku výrobku druhý řetězec DNA, který na svém prvním konci obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a na svém druhém konci obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu (celý tento kompozit nazýváme zámek), přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii. Dokud není druhý řetězec DNA (zámek) v kontaktu s prvním řetězcem DNA (klíčem), druhé molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii mohou být v blízkosti nanočástic ušlechtilého kovu, a tedy je zachytitelný jejich Ramanův signál zesílený touto interakcí. Pravý výrobek se vyznačuje tím, že obsahuje první řetězec DNA s prvními molekulami aktivními v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii. Protože sekvence prvního a druhého řetězce DNA jsou vzájemně komplementární alespoň v části své délky, dostanou-li se do kontaktu, dojde kjejich hybridizaci, „napřímení“ druhého řetězce DNA, oddálení druhých molekul aktivních v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii od povrchu nanočástic ušlechtilého kovu, a naopak vlivem hybridizace k přiblížení prvních molekul aktivních v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii k povrchu nanočástic ušlechtilého kovu. Tím dojde ke snížení až vymizení Ramanova signálu zámku, tj. druhých molekul aktivních v povrchově • « • » · · « 0 · zesílené Ramanově spektroskopii (v závislosti na koncentračním poměru), a k objevení se
Ramanova signálu klíče, tj. prvních molekul aktivních v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii.
Nejedná-li se o pravý výrobek, nejsou vněm přítomny první řetězce DNA sprvními molekulami aktivními v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a tedy nedojde k uvedeným změnám ve spektru, změřeno bude opět spektrum druhých molekul aktivních v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii (tedy spektrum zámku).
V případě, že nanočástice ušlechtilého kovu jsou součástí kompozitu s magnetickými částicemi, je postup usnadněn tím, že hybridizační produkt (nebo v případě nepravého výrobku samotný zámek) se snadno separuje magnetickými metodami, čímž se při měření předejde nespecifickým interakcím složek vzorku výrobku se zámkem.
Přehled vyobrazení
Obr. 1 graficky znázorňuje princip značení produktu klíčem (prvním řetězcem DNA) a analýzy pomocí zámku (druhého řetězce DNA).
Obr. 2 znázorňuje příklad spektra získaného analýzou výrobku (destilované vody) bez přídavku značky (plná čára) a s přídavkem značky (tečkovaná čára) podle příkladu 2.
Obr. 3 znázorňuje příklad spektra získaného analýzou výrobku (whisky) bez přídavku značky (plná čára) a s přídavkem značky (tečkovaná čára) podle příkladu 3.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1 - Osvětlení principu vynálezu s pomocí schematického znázornění
Obr. 1 schematicky znázorňuje princip značení produktu klíčem (prvním řetězcem DNA) a analýzy pomocí zámku (druhého řetězce DNA).
Obrázek a) znázorňuje samotný zámek před interakcí s klíčem. Zámek obsahuje druhý řetězec DNA 2 nesoucí v oblasti svého prvního konce druhou molekulu 21 aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii. V oblasti svého druhého konce je prostřednictvím funkční skupiny (neznázorněno) navázána na nanočástici 4 ušlechtilého kovu. Nanočástice 4 ušlechtilého kovu jsou v podobě kompozicu s magnetickými nanočásticemi 5. Druhé řetězce
..····
DNA 2 tvoří smyčky, takže druhé molekuly 21 jsou v interakci s nanočásticemi 4 ušlechtilého kovu, a proto se při měření zámku získá SERS spektrum molekul 21.. Obrázek b) znázorňuje výrobek 3, v němž jsou obsaženy klíče - tedy první řetězce DNA 1 obsahující v oblasti jednoho konce molekuly 11 aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii. Zámky se přidají do vzorku výrobku 3 obsahujícího klíče, a vznikne hybridizační produkt znázorněný na obrázku c). Dojde k hybridizaci prvních a druhých řetězců DNA 1 a 2, tím se oddálí druhé molekuly 21 aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii od nanočástic 4 ušlechtilého kovu a dojde tak k utlumení jejich SERS signálu, a naopak se do kontaktu s nanočásticemi 4 ušlechtilého kovu dostanou první molekuly 11 aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a tedy je při měření hybridizačního produktu získáno spektrum prvních molekul 11.
Příklad 2 - Příprava nanokompozitu zámku, klíče, interakce zámku a klíče, měření SERS spekter
Čistý nanokompozit nanočástic ušlechtilého kovu a magnetických nanočástic Ag/FesCU byl připraven na základě postupu Markové a kol (Marková, Z., Šišková, K., Filip, J., Šafářová,
K., Prucek, R., Panáček, A., Zbořil, R. et al. (2012). Chitosan-based synthesis of magnetically-driven nanocomposites with biogenic magnetite core, controlled silver size, and high antimicrobial activity. Green Chemistry, 14(9), 2550). Vzorek nanokompozitu byl 5x zředěn a změřen pomocí Ramanovy spektroskopie. Do 20 pL roztoku nanokompozitu bylo postupně přidáno 70 pL destilované vody a 10 pL DNA zámku (tj. druhého řetězce DNA nesoucího funkční skupinu a druhou molekulu aktivní v SERS) o sekvenci 5'\DTP AjAAAAAGGGl ATACACACCAGGTAACACACACATAATAGCC[Cy3]-3DTPA = diethylentriaminpentaoctová kyselina, funkční skupina nesoucí aminové skupiny. Výsledná koncentrace DNA použité pro modifikaci byla 10 nmol/L. Systém byl následně udržován 10 minut při laboratorní teplotě pro vytvoření struktury zámku a následně použit pro provedení kontroly autenticity.
Do vzorku destilované vody (reprezentujícího vzorek výrobku) byl přidán klíč - první řetězec DNA nesoucí první molekulu aktivní v SERS. Sekvence klíče byla: 5’TATGTGTGTGTTACCTGGTGTGTCCGTGAAAAA - biotin-3’. Výsledná koncentrace DNA klíče byla 10 nmol.L’1. Kurzívou jsou v obou sekvencích označeny komplementární části.
Do 1 mL produktu bylo následně přidáno 10 pL směsi obsahující zámek. Po promíchání byl výsledný hybridizační produkt magneticky izolován a třikrát promyt destilovanou vodou. Následná detekce klíče je založena na spektrální analýze izolovaného hybridizačního produktu pomocí povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie a statistickým porovnáním (metodou diskriminační analýzy) spektra hybridizačního produktu se spektrem získaným analýzou čistého zámku.
Nastavení experimentálních parametrů SERS měření je závislé na vlastnostech použitého přístroje a jeho konfiguraci. V uvedeném příkladu byl vzorek ozařován laserem o vlnové délce 532 nm, jehož výkon na vzorek byl pomocí vsazených optických prvků nastaven na 10 mW. Doba expozice byla nastavena na 1 vteřinu a bylo provedeno celkem 32 měření, jejichž zprůměrováním bylo získáno výsledné spektrum.
V případě, že je klíč ve výrobku přítomen (výrobek je pravý), dojde k zeslabení spektra DNA zámku a zároveň k objevení signálu klíče (označen symbolem *, detail je znázorněn ve výřezu). Příklad výsledných spekter je znázorněn na obrázku 2. V případě, že kontrolovaný výrobek pravý není (neobsahuje klíč), nebude výsledné spektrum obsahovat signál klíče a signál zámku zůstává beze změny.
Příklad 3 - Využití postupu vynálezu u reálného vzorku výrobku (whisky)
Zámek a klíč měly stejnou strukturu jako v Příkladu 2. Do vzorku whisky byl přidán klíč ve výsledné koncentraci 10 nmol/L.
Do 1 mL vzorku whisky bylo následně přidáno 10 pL směsi obsahující zámek. Po důkladném promíchání byl hybridizační produkt magneticky izolován a třikrát promyt destilovanou vodou.
Detekce klíče byla založena na spektrální analýze izolovaného hybridizačního produktu pomocí povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie a statistickým porovnáním (metodou diskriminační analýzy) spektra hybridizačního produktu se spektrem získaným analýzou čistého zámku.
Magneticky izolovaný a promytý hybridizační produkt byl podroben spektrální analýze pomocí techniky Ramanovy spektroskopie. Nastavení experimentálních parametrů SERS měření je závislé na vlastnostech použitého přístroje a jeho konfiguraci. V uvedeném příkladu byl vzorek ozařován laserem o vlnové délce 532 nm, jehož výkon na vzorek byl pomocí
.. ..· ···· * · · · · * vsazených optických prvků nastaven na 10 mW. Doba expozice byla nastavena na 1 vteřinu a bylo provedeno celkem 32 měření, jejichž zprůměrováním bylo získáno výsledné spektrum.
V případě, že je klíč ve výrobku přítomen (výrobek je pravý), dojde k zeslabení spektra DNA zámku a zároveň k objevení signálu klíče (označen symbolem *). Příklad výsledných spekter je znázorněn na obrázku 3. V případě, že kontrolovaný výrobek pravý není (neobsahuje klíč), nebude výsledné spektrum obsahovat signál klíče a signál zámku zůstává beze změny.
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Systém pro ověření pravosti výrobku, vyznačený tím, že obsahuje- první řetězec DNA, který v oblasti alespoň jednoho svého konce obsahuje navázanou první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a- druhý řetězec DNA, který je modifikován tak, že v oblasti svého prvního konce obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a v oblasti svého druhého konce obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu, a přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, a přičemž první řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou alespoň v části své délky vzájemně komplementární.
- 2. Systém podle nároku 1, vyznačený tím, že nanočástice ušlechtilého kovu jsou ve formě kompozitu obsahujícího alespoň jednu magnetickou částici, s výhodou nanočástici, a alespoň jednu nanočástici ušlechtilého kovu.
- 3. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že funkční skupina dithiolovou, thiolovou, karboxylovou, amino nebo nitro skupinu.
- 4. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že ušlechtilým kovem je zlato nebo stříbro.
- 5. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že nanočástice ušlechtilého kovu mají velikost v rozmezí 5 až 100 nm.
- 6. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že první i druhá aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii jsou navázány buď obě na 5 -konce anebo obě na 3 '-konce prvního a druhého řetězce DNA.
- 7. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že druhý řetězec DNA obsahuje alespoň 20 nukleotidů a první řetězec DNA obsahuje 5 až 40 nukleotidů.
- 8. Systém podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že druhý řetězec DNA na povrchu nanočástic struktury je uspořádán tak, že může vytvářet smyčky, které začínají u povrchu nanočástice a končí rovněž na jejím povrchu.
- 9. Způsob ověření pravosti výrobku s použitím systému podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že- do výrobku se v průběhu výroby nebo dodatečně přidá první řetězec DNA, který v oblasti alespoň jednoho svého konce obsahuje navázanou první molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, s výhodou v koncentraci v rozsahu 1 fmol.L 1 až 1 pmol.L i- při ověřování pravosti výrobku se do vzorku výrobku přidá druhý řetězec DNA, který v oblasti svého prvního konce obsahuje funkční skupinu obsahující atom síry nebo dusíku a v oblasti svého druhého konce obsahuje navázanou druhou molekulu aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhá molekula aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii je odlišná od první molekuly aktivní v povrchově zesílené Ramanově spektroskopii, přičemž druhý řetězec DNA je prostřednictvím funkční skupiny obsahující atom síry nebo dusíku navázán na povrch nanočástice ušlechtilého kovu, a přičemž první řetězec DNA a druhý řetězec DNA jsou alespoň v části své délky vzájemně komplementární,- následně se izoluje hybridizační produkt vzniklý interakcí prvního a druhého řetězce DNA,- a poté se změří spektrum izolovaného hybridizačního produktu metodou povrchově zesílené Ramanovy spektroskopie.
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačený tím, že nanočástice ušlechtilého kovu jsou ve formě kompozitu obsahujícího alespoň jednu magnetickou částici, s výhodou nanočástici, a alespoň jednu nanočástici ušlechtilého kovu, a izolace hybridizačního produktu se provede metodou magnetické izolace.
- 11. Způsob podle nároku 9 nebo 10, vyznačený tím, že se po přidání druhého řetězce DNA do produktu před provedením kroku izolace hybridizačního produktu ponechá směs reagovat po dobu v rozmezí 1 až 7200 sekund.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-140A CZ2015140A3 (cs) | 2015-02-26 | 2015-02-26 | Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku |
| PCT/CZ2015/050015 WO2016134680A1 (en) | 2015-02-26 | 2015-12-16 | System and method for verification of product authenticity |
| EP15823584.6A EP3262184B1 (en) | 2015-02-26 | 2015-12-16 | Method for verification of product authenticity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-140A CZ2015140A3 (cs) | 2015-02-26 | 2015-02-26 | Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2015140A3 true CZ2015140A3 (cs) | 2016-09-07 |
Family
ID=55135174
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-140A CZ2015140A3 (cs) | 2015-02-26 | 2015-02-26 | Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3262184B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2015140A3 (cs) |
| WO (1) | WO2016134680A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114509421B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-04-09 | 电子科技大学 | 一种密接有序的表面增强拉曼基底及其制备方法 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9517955D0 (en) * | 1995-07-25 | 1995-11-08 | Univ Strathclyde | Nucleotide sequence detection and analysis |
| KR100294374B1 (ko) | 1999-01-30 | 2001-07-03 | 김재종 | Ｄｎａ 함유 잉크 및 그의 제조방법 |
| CN1302905A (zh) | 2000-12-22 | 2001-07-11 | 天津南开戈德集团有限公司 | 含脱氧核糖核酸类物质防伪识别材料的制作方法 |
| AR037006A1 (es) | 2002-06-20 | 2004-10-20 | S I G Sist S De Identificacion | Marcador de objetos a identificar consistente en al menos un fragmento de adn. |
| US8420400B2 (en) * | 2003-04-16 | 2013-04-16 | APDN (B.V.I.), Inc. | System and method for authenticating tablets |
| EP1948829A4 (en) * | 2005-11-15 | 2009-08-26 | Becton Dickinson Co | SERS-BASED PROCEDURES FOR THE DETECTION OF BIOLOGICAL SUBSTANCES |
| US8078420B2 (en) | 2006-11-15 | 2011-12-13 | Miller Gary L | Raman spectrometry authentication |
| WO2011116402A2 (en) * | 2010-03-19 | 2011-09-22 | University Of Wyoming, An Institution Of Higher Education Of The State Of Wyoming | Surface enhanced raman spectroscopy |
| BR112015002287A2 (pt) | 2012-07-31 | 2017-07-04 | Joaquin Lopez | processo para obtenção e detecção de um marcador de objetos a serem identificados, o marcador, método para autenticação e método para verificação |
| US9810659B2 (en) * | 2013-02-08 | 2017-11-07 | Board Of Trustees Of Michigan State Univeristy | Nanoparticle-serialized oligonucleotide methods, compositions, and articles |
-
2015
- 2015-02-26 CZ CZ2015-140A patent/CZ2015140A3/cs unknown
- 2015-12-16 EP EP15823584.6A patent/EP3262184B1/en active Active
- 2015-12-16 WO PCT/CZ2015/050015 patent/WO2016134680A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3262184B1 (en) | 2019-10-02 |
| EP3262184A1 (en) | 2018-01-03 |
| WO2016134680A1 (en) | 2016-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jamil et al. | Rapid detection of TNT in aqueous media by selective label free surface enhanced Raman spectroscopy | |
| Kim et al. | Bioinspired colorimetric detection of calcium (II) ions in serum using calsequestrin‐functionalized gold nanoparticles | |
| Tian et al. | Study of the interaction of kaempferol with bovine serum albumin | |
| Liu et al. | Hybrid material for enrofloxacin sensing based on aptamer-functionalized magnetic nanoparticle conjugated with upconversion nanoprobes | |
| Li et al. | In vivo imaging of mitochondrial DNA mutations using an integrated nano Cas12a sensor | |
| Beier et al. | Application of surface-enhanced Raman spectroscopy for detection of beta amyloid using nanoshells | |
| EP2949759B1 (en) | Multiplexed homogeneous oligonucleotide detection | |
| Wang et al. | A persistent luminescence resonance energy transfer-based molecular beacon probe for the highly sensitive detection of microRNA in biological samples | |
| WO2014019099A1 (es) | Procedimiento para obtener y detectar un marcador de objetos a identificar, el marcador, método para la autenticación y método para la verificación | |
| Yüce et al. | Exploiting Stokes and anti‐Stokes type emission profiles of aptamer‐functionalized luminescent nanoprobes for multiplex sensing applications | |
| CN107430107A (zh) | 通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测 | |
| Zhang et al. | Label-free detection of DNA methylation by surface-enhanced Raman spectroscopy using zirconium-modified silver nanoparticles | |
| Li et al. | An ultrasensitive fluorescence aptasensor for carcino-embryonic antigen detection based on fluorescence resonance energy transfer from upconversion phosphors to Au nanoparticles | |
| Zhou et al. | Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-catalyzed homo-nucleotides-constituted ssDNA: inducing tunable-size nanogap for core-shell plasmonic metal nanostructure and acting as Raman reporters for detection of Escherichia coli O157: H7 | |
| Effah et al. | A SERS bioassay based on vancomycin-modified PEI-interlayered nanocomposite and aptamer-functionalized SERS tags for synchronous detection of Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae | |
| Raichlin et al. | Electron-transfer quenching of nucleic acid-functionalized CdSe/ZnS quantum dots by doxorubicin: A versatile system for the optical detection of DNA, aptamer–substrate complexes and telomerase activity | |
| Chen et al. | Detection of Ag+ ions and cysteine based on chelation actions between Ag+ ions and guanine bases | |
| Moscetti et al. | Probing direct interaction of oncomiR-21-3p with the tumor suppressor p53 by fluorescence, FRET and atomic force spectroscopy | |
| Brouard et al. | PCR‐free blood group genotyping using a nanobiosensor | |
| Kim et al. | On-chip detection of protein glycosylation based on energy transfer between nanoparticles | |
| Ali et al. | Nanobioprobe for the determination of pork adulteration in burger formulations | |
| He et al. | A fast, sensitive and stable fluorescent fiber-optic chemosensor for quantitative detection of Fe3+ in real water and HepG2 living cells | |
| Öztürk et al. | N-Doped carbon quantum dot–based ratiometric fluorescent nanosensor platforms for detection of gastric cancer-associated Helicobacter pylori genes | |
| Ali et al. | Spiropyran as a potential molecular diagnostic tool for double-stranded RNA detection | |
| CZ2015140A3 (cs) | Systém a způsob pro ověření pravosti výrobku |