DE60213256T2

DE60213256T2 - Verfahren zur bestimmung von mehrere analyten

Info

Publication number: DE60213256T2
Application number: DE60213256T
Authority: DE
Inventors: Kurt Weindel; Stefan Pleasanton KRAISS; Frank Bergmann; Hans-Peter Josel; Dieter Heindl
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2001-08-28
Filing date: 2002-08-24
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2022-08-25
Also published as: DE60213256D1; KR100653156B1; BR0212265A; DK1423541T3; EP1423541B1; WO2003020967A1; JP4559074B2; EP1288308A1; JP2005501564A; CN1575342A; BR0212265B1; KR20040029076A; PL210867B1; US20040191794A1; ES2269804T3; ATE333522T1; MXPA04001730A; AU2002361779B2; PL369239A1; EP1423541A1

Description

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung mehrfacher Analyte mittels analytspezifischer Bindungspartner, wobei die Bindungspartner mit weniger verschiedenen Markierungen markiert werden, als verschiedene Bindungspartner verwendet werden. Zudem betrifft diese Erfindung die Substanz-Zusammensetzungen, die diese verschieden markierten Bindungspartner enthalten, und die Verwendung dieser Zusammensetzungen zur Bestimmung mehrfacher Analyten, sowie geeignete Kits.
Stand der Technik
Die Bestimmung eines Analyten in einer Probe hat insbesondere auf dem Gebiet der medizinischen Versorgung, Ernährung und Ökologie besondere Bedeutung gewonnen. Je nach dem Analyt können verschiedene Verfahren zur Bestimmung verwendet werden. Kleine Moleküle, wie Metallionen, Zuckermonomere, Aminosäuren, werden oft über ihre chemischen oder physikalischen Eigenschaften bestimmt. Analyten mit einem höheren Molekulargewicht, wie Proteine und Nukleinsäurepolymere, können ebenfalls mit Bindungspartnern bestimmt werden, die ihnen gegenüber eine spezifische Affinität aufweisen. Geeignete Paare von Bindungspartnern sind Antikörper – Antigen, Substrat – Enzym, Nukleinsäure – komplementäre Nukleinsäure, Zucker – Lectin. Falls es beabsichtigt ist, ein spezifisches. Protein zu bestimmen, von dem man weiß, dass es Antigeneigenschaften aufweist, kann ein spezifischer Antikörper zur Bestimmung verwendet werden. Zur Bestimmung einer spezifischen Nukleinsäuresequenz kann eine Nukleinsäuresonde mit einer komplementären Sequenz verwendet werden. Solche Bindungsassays und geeignete Protokolle sind im Stand der Technik bekannt und werden vollständig in der Literatur erläutert, siehe beispielsweise Sambrook et al., 1985, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Coldspring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames und S.J. Higgins, Hrsg. 1984) und eine Reihe Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Zur Ermöglichung der Erfassung der spezifischen Bindungspartner-Analyt-Komplexe ist es sehr üblich, die Bindungspartner zu markieren, wodurch diese Markierungen direkt oder indirekt mittels zusätzlicher Reagenzien, die an diese Markierungen binden (beispielsweise mittels Biotin als Markierung, das mit einem Avidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat und einer geeigneten Enzym-Substrat-Nachweisreaktion erfasst werden kann), nachgewiesen werden können. Geeignete Markierungen sind Stand der Technik.
Für viele Fälle, insbesondere auf dem diagnostischen Gebiet, muss man zwei oder mehrere Analyten bestimmen, damit man ein vollständiges Bild über eine bestimmte Situation erhält. Bei einem Patienten, der eine Chlamydia-trachomatis-Infektion hat, überprüft der Arzt beispielsweise gewöhnlich nicht nur auf eine Chlamydia-trachomatis- sondern auch auf eine Neisseria gonorrhoeae-Infektion. Beim Erstellen des HLA-Musters eines Patienten muss man ebenfalls die Allele mehrerer verschiedener HLA-Loci bestimmen.
Bei der Durchführung eines mehrfachen Analytbindungsassays muss man auf die verwendeten Markierungen achten. Im ersten Fall wird die gleiche Markierung für sämtliche verschiedenen Bindungspartner verwendet. In diesem Fall müssen zwei alternative Formate unterschieden werden. Wenn sämtliche Bindungsreaktionen zusammen in einer Reaktion durchgeführt werden, zeigt ein positives Ergebnis nur, dass es mindestens einen Analyten in der Probe gibt, jedoch nicht, um welchen es sich handelt. Als Alternative kann man jede Bindungsreaktion trennen, indem aufeinanderfolgende Reaktionen durchgeführt werden oder indem parallele Reaktionsformate verwendet werden. Geeignete Formate sind beispielsweise Mikrotiterplatten- oder Dot-Blot-Assays. Verfahren, die solche Formate verwenden, sind Stand der Technik.
Solche Formate sind zeitraubend und erfordern einige Bearbeitungsschritte, die zu erhöhten Kosten und Kontaminationsgefahren führen können. Fortschrittlichere Verfahren, die Biochips verwenden, sind sehr teuer und lassen sich schwierig in Bezug auf die Kontaminationen auf dem Gebiet der Nukleinsäureamplifikation handhaben.
Zur Ermöglichung eines einzelnen Nachweises mehrerer Analyten in nur einer Bindungs- und/oder Nachweisreaktion können die verschiedenen spezifischen Bindungspartner mit verschiedenen Markierungen markiert werden, die gesondert nachgewiesen werden können. Solche Markierungen und verwendbare Erfassungsverfahren sind Stand der Technik. Man kann beispielsweise Markierungen verwenden, die durch ihr optisches Emissionsspektrum nachgewiesen werden können, wodurch jede Markierung ein anderes Emissionsspektrum aufweist. Es muss dennoch beachtet werden, dass diese Tests in der Realität auf die Bestimmung nur einiger weniger Analyten eingeschränkt sind, da es keine unbegrenzte Zahl geeigneter Markierungen gibt, die sich gesondert mit hoher Empfindlichkeit nachweisen lassen und die hinreichend stabil sind. Bei geeigneten Seltenerdmarkierungen sind teure und sehr fortschrittliche Detektoren für eine zeitaufgelöste Fluorimetrie notwendig. Diese Einschränkungen sind in Bezug auf homogene Nachweisverfahren von besonderer Bedeutung. Solche Formate leiden gewöhnlich an einem höheren Signalhintergrund aufgrund fehlender Waschschritte zur Eliminierung der Bindungspartner, die nicht spezifisch an einen Analyten gebunden sind, was die korrekte Interpretation der mehrfachen Nachweissignale erschwert.
Die Mehrfachmarkierung im Zusammenhang mit Detektoren, die eine Vielzahl optischer Kanäle aufweisen, wurde von vielen Forschern verwendet. Vet et al. (PNAS 96, 6394-6399 (1999)) verwenden beispielsweise eine Methodik, bei der 4 spezifische Sonden (Molecular Beacons, molekulare Leuchtsignale), die komplementär zu 4 verschiedenen Zielen sind, mit 4 verschiedenen Reporter-Farbstoffen, und zwar mit jeweils 1 Farbstoff, markiert werden. Das gesamte Fluoreszenz-Spektrum jedes Farbstoffs ist im Computer gespeichert und wird zur Interpretation komplexer Mehrfachergebnisse herangezogen. Daher bedarf es einer recht hoch entwickelten Software, damit man Coinfektionen über eine spektrale Verteilungsanalyse auflösen kann. Dies beinhaltet die Normalisierung von Fluoreszenzsignalen aus verschienenen Farbstoffen, und zwar einzeln für jeden bestimmten Farbstoff (optischen Kanal) bei Maximalverstärkung, d.h. eine Normalisierung der kanalspezifischen Wachstumskurven entsprechend dem jeweiligen Plateau, und nicht über verschiedene optische Kanäle an einem Referenzfarbstoff, so dass man die Signalverteilung auf einer gemeinsamen Basis analysieren kann. Andere Beispiele umfassen Josephsson et al. (J. Clin. Microbiol. 37/3, 490-496 (1999); bis zu 3 verschieden markierte Molecular Beacons für bis zu 3 Ziele pro Test) und Mercier et al. (J. Virol. Methods 77, 1-9 (1999); 2 verschieden markierte Sonden für 2 Ziele pro Test).
Zur Steigerung der Anzahl von Analyten, die mit einer eindeutigen Anzahl von Markierungen nachweisbar sind, können auch Markierungs-Kombinationen zur Markierung von Bindungspartnern verwendet werden. Neben den Bindungspartnern mit einer bestimmten gebundenen Markierung werden auch Bindungspartner verwendet, die mit zwei oder mehreren Markierungen gekoppelt sind, wobei die gleiche Art von Markierungen verwendet wird, die auch an die einzeln markierten Bindungspartner gekoppelt sind. Bei der Verwendung von beispielsweise 3 verschiedenen Markierungen sind 7 Kombinationen von Markierungen möglich, durch die ebenfalls 7 verschiedene Analyte nachgewiesen werden können. Ein In-situ-Hybridisierungsverfahren, das ein ähnliches Prinzip verwendet, wird von T. Ried et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 89, S. 1388-1392 (1992) beschrieben. Ein ähnliches Verfahren zur Bestimmung von 7 verschiedenen Human-Papillom-Virus-Typen in einer Probe mittels PCR und einem anschließenden Sondenhybridisierungstest ist beschrieben von Samiotaki et al., Analytical Biochemistry Bd. 253, S. 156-161 (1997). Aus diesem Grund werden die Oligonukleotide mit einer Anzahl von Chelator-Einheiten 5'-terminal modifiziert. Die einzelnen Chelat-Einheiten werden anschließend entweder mit ein und derselben Sorte von Seltenerdmetallionen aufgefüllt, oder einem genau eingestellten Gemisch mit bis zu 3 Seltenerdmetallionen. Wird somit >1 Sorte von Ionen durch Komplexbildung fixiert, werden mehrere fluoreszierende Seltenerdmetall-Chelate („Farbstoff-Gemische") an ein und dasselbe Sondenmolekül gekoppelt. Solche Sonden lassen sich nicht einfach synthetisieren und sie lassen sich schwer (wenn überhaupt) in homogenen Amplifikations-/Nachweisformaten anwenden.
Es gibt eine Reihe von anderen technologischen Ansätzen zur kombinatorischen Markierung. Ballard et al. ( US 5,759,781 ), Speicher et al., (Nat. Genetics 12, 368-375 (1996)) und Ried et al., (PNAS 89, 1388-1392 (1992)) haben Testformate entwickelt, in denen jede spezifische Sonde durch ihre Markierungssignatur bekannt ist, da alle Kopien einer bestimmten Sonde 1 oder mehrere bestimmte Fluorophore in einer kombinatorischen Weise tragen. Die Markierung erfolgt mit Hilfe von Nick-Translationen, die in Bezug auf die Anzahl der Markierungen, die je Sondenmolekül eingebaut wird, weniger genau ist als die chemische Oligonukleotid-Synthese, d.h. die Verfahren eignen sich nicht gut für eine genaue Analyse bestimmter Verteilungen. Daher verwendet der Fachmann solche Sonden bei Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren nicht, insbesondere nicht bei homogenen Amplifikationsverfahren.
Die sogenannten CFET-Sonden, die von Tong et al. (Nat. Biotechnology 19, 756-759 (2001)) beschrieben wurden, haben ein prinzipiell anderes Design und Anwendungsmodus. 1 bis 3 Farbstoffe werden 5'-terminal je Sondenmolekül gekoppelt, wobei Spacer-Einheiten mit einer genau eingestellten Anzahl dazwischen eingestreut sind. Die Oligonukleotid-Einheit folgt nach dem letzten Farbstoff oder Spacer zum 3'-Ende. Somit gibt es ein Gemisch aus verschiedenen Sondentypen, wie bei Ballard et al. Die Spacer wirken als Tuner für die Elektrophoresebeweglichkeit sowie für die Resonanz-Intensität. Letztere beeinflusst die Fluoreszenz-Signatur der jeweiligen Sonde. Die Sonden werden bei einer allgemeinen Wellenlänge angeregt, und das aufgezeichnete Signal wird durch die Position in dem Kapillarelektropherogramm und durch Überlagerung der vollständigen Emissionsspektren an einer bestimmten Position und Berechnung der relativen Beiträge von Komponenten der Markierung aufgelöst, die direkt als Digital-Verhältnisse eingestellt ist. Wiederum gibt es weder eine Signal-Verteilungsanalyse von korrigierten und normalisierten Signalen an sich, noch dynamisch entlang der Reaktionskoordinate, es gibt kein Oligonukleotid-Design mit "gleicher Sequenz/anderer Markierung" und keine Signalerzeugung als Folge einer die biochemische Reaktion verändernden Sondenkonfiguration oder ~Konstitution.
Die Markierung von Bindungspartnern mit mehr als einer Markierung pro Bindungspartnermolekül hat einige Nachteile. Die Synthese solcher mehrfach markierten Bindungspartner ist ziemlich anspruchsvoll (und teuer), und es kann eine sterische Hinderung der Markierungen auftreten, was die Effizienz der Bindung des Bindungspartners an seinen Analyten oder den Nachweis der gebundenen Markierungen senken kann. Es kann auch zu Wechselwirkungen zwischen den Markierungen kommen, die an den Bindungspartner gebunden sind, was zu falschen Ergebnissen führen könnte. Dies kann beispielsweise bei der Verwendung optischer Markierungen relevant sein. Es ist sicherlich von besonderer Bedeutung bei der Durchführung homogener Nachweisverfahren mittels Fluoreszenz-Energie-Übertragungs-Markierungen, wie sie beispielsweise bei TagMan-Tests verwendet werden ( US 5,210,015 , EP 0 543 942 ).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Verbesserung der Verfahren zur Bestimmung mehrerer Analyten, wobei alle oder ein Teil der Nachteile der bekannten Verfahren umgangen werden.
US 5,759,781 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von mehr als 3 Analyten, humanchromosomenspezifische Sequenzen, umfassend das Bereitstellen eines Gemischs, das diese Analyten und mehr als 3 Nukleinsäuresonden enthält, unter Bedingungen, die die spezifische Hybridisierung und die Bestimmung der Anwesenheit der Analyten mit diesen Signalintensitäten ermöglichen. In diesem Gemisch wird eine erste Sonde, die spezifisch für Chromosom 1 ist, an eine erste Markierung gekoppelt; eine zweite Sonde, die spezifisch für Chromosom 2 ist, wird an eine zweite Markierung gekoppelt. Eine erste Menge einer dritten Sonde, die spezifisch für Chromosom Y ist, wird an die gleiche Markierung wie die erste Sonde gekoppelt, wohingegen eine zweite Menge der dritten Sonde an die gleiche Markierung wie die zweite Sonde gekoppelt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung mehrfacher Analyten, wobei weniger Markierungen verwendet werden, als Analyten bestimmt werden. Dies wird erzielt durch Markieren der gesamten Gruppe spezifischer Sondenmoleküle für einige Ziele mit jeweils einem bestimmten Farbstoff, wohingegen für andere Ziele ein Teil der Gruppe spezifischer Sonden mit einem gegebenen Farbstoff markiert wird, wohingegen ein anderer Teil der Gruppe mit einem anderen Farbstoff markiert ist (Oligonukleotide mit gleicher Sequenz/anderer Markierung im Gemisch). Vorzugsweise durch Ausführen homogener (Lösungsphase) Echtzeit-Amplifikationstests (beispielsweise durch PCR oder TMA), Korrigieren des resultierenden Signals für alle Arten von relevantem Rauschen, und Normalisieren des Signals aus unterschiedlichen Markierungen auf einen Referenzfarbstoff, können Ziele aus der Verteilung des verarbeiteten Signals hergeleitet werden, die in einem Mehrkanal-Detektor erfasst werden. Aus diesem Grunde werden Kombinationen von Markierungen verwendet.
Bei der Bestimmung von 3 Analyten sind beispielsweise nur zwei verschiedene nachweisbare Markierungen notwendig. Eine erste Markierung ist an einem ersten Bindungspartner gebunden, der spezifisch für den ersten Analyten ist. Eine zweite Markierung ist an einen zweiten Bindungspartner gebunden, der spezifisch für den zweiten Analyten ist. Zur Markierung des dritten Bindungspartners, der spezifisch für den dritten Analyten ist, wird die gleiche Art von Markierungen verwendet, die an den ersten und zweiten Bindungspartner gekoppelt wurde. Eine Menge des dritten Bindungspartners ist an die erste Markierung gekoppelt. Im Fall von drei Analyten wird vorzugsweise eine Hälfte des dritten Bindungspartners auf diese Weise markiert. Ein weiterer Teil des dritten Bindungspartners wird an die zweite Markierung gekoppelt, was der Fall bei drei Analyten ist, und zwar vorzugsweise in der verbleibenden Hälfte des dritten Bindungspartners. Daher enthält jeder Bindungspartner, der für diesen Analyt spezifisch ist, eine erste Markierung oder eine zweite Markierung. Dies führt zu Bindungspartnermolekülen, die jeweils mit nur einer Markierung markiert sind, was vorzugsweise eine Mehrfarbenanalyse zum Auflösen von Mehrfach-Ergebnissen auf der Basis der Signalerzeugung ermöglicht, die von einer biochemischen Reaktion hergeleitet ist und somit Mittel zur Aufzeichnung der kinetischen Reaktion bereitstellt, während gleichzeitig einfache Probendesigns und eine Nachweis-Gerätschaft des Standes der Technik beibehalten werden. Im Gegensatz dazu werden Sonden in der Literatur beschrieben, bei denen mehrfache Markierungen an ein Sondenmolekül gebunden sind (Samiotaki, M, et al., Analytical Biochemistry 253, 156-161 (1997)). Solche Sonden sind verglichen mit den erfindungsgemäßen Bindungspartnern schwieriger zu synthetisieren.
Verschiedene Nachweiseffizienzen, die für die verschiedenen Markierungen auftreten können, die am dritten Bindungspartner gebunden sind, können auf zweierlei Weise kompensiert werden. Hat eine erste Markierung einen höheren Signalausgang als eine zweite Markierung, kann man diese Differenz entweder chemisch einstellen, indem man den dritten Bindungspartner, der an die erste Markierung gekoppelt ist, mit dem dritten Bindungspartner, der an die zweite Markierung gekoppelt ist, in einem definierten Nicht-l:l-Verhältnis mischt oder mathematisch über die Normalisierung des Signalausgangs zu einer bestimmten Markierung, die als Standard ausgewählt wurde. Solche verschiedenen Nachweiseffizienzen können auf den intrinsischen Eigenschaften der Markierungen beruhen, wie die Absorptionsfähigkeit oder Quantenausbeute, jedoch können sie auch von verschiedenen Kopplungseffizienzen resultieren, oder einer Anfälligkeit gegenüber Lösungsmittel-Effekten. Im letzteren Fall stellt das Mischen der verschiedenen Mengen des dritten Bindungspartners nach der Kopplungsreaktion eine gute Möglichkeit zur Anpassung dieser Diskrepanzen bereit.
Zudem wird eine mögliche Interferenz, die auftreten kann, wenn zwei oder mehrere nachweisbare Markierungen an einem Bindungspartnermolekül gebunden sind, vermieden. Daher sind die erfindungsgemäßen Bindungspartner mit einem breiten Spektrum von Markierungen kompatibel, die ebenfalls Fluorophore und Kombinationen von Fluorophoren umfassen, wie die klassischen Markierungen des Förster-Typs (Styer und Haugland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 719 (1967)), die beispielsweise in homogenen Nachweistests, wie dem TagMan-Verfahren zur Bestimmung niedrig konzentrierter Nukleinsäureanalyten, verwendet werden können.
Man beachte, dass auch eine erhöhte Anzahl von Analyten mit drei oder sogar noch mehr Markierungen bestimmt werden kann, die auf die gleiche Weise kombiniert werden können, wie für die beiden Markierungen gezeigt. Bei der Verwendung von drei Markierungen lassen sich bis zu sieben Analyten bestimmen. Mit vier verschiedenen Markierungen können sogar 15 Analyten nachgewiesen werden, wenn sie in einzelnen sowie in doppelten, dreifachen und vierfachen Kombinationen angewendet werden. Bei der Anwendung nur in einzelnen oder doppelten Kombinationen (was vom praktischen Standpunkt vorteilhaft sein könnte), können bis zu 10 verschiedene Analyten mit einem Satz von 4 Markierungen unterschieden werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung: Ein Verfahren zur Bestimmung von wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Bereitstellen eines Gemischs einer Probe, die die wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten enthält oder von der vermutet wird, dass sie einen oder mehrere der Nukleinsäureanalyten enthält
b) Bereitstellen von wenigstens 3 unterschiedlichen nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden c) Amplifizieren der Nukleinsäureanalyten
d) Wählen von Reaktionsbedingungen, die die spezifische Bindung der nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden an die amplifizierten Nukleinsäureanalyten fördern, wobei – eine erste der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen ersten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist und an eine erste Markierung gekoppelt ist, – eine zweite der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen zweiten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist und an eine zweite Markierung gekoppelt ist, welche getrennt von der an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelten Markierung nachweisbar ist, und – eine dritte der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen dritten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist, wodurch eine erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie die an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist und eine zweite Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelt ist und die erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde nicht an die gleiche Markierung wie die an die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist und die zweite Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde nicht an die gleiche Markierung wie die an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist,
e) Nachweisen der für die erste und die zweite Markierung bezeichnenden Signalintensitäten,
f) Bestimmen der in der Probe vorhandenen Nukleinsäureanalyten unter Verwendung der in Schritt e) nachgewiesenen Signalintensitäten.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Bestimmung von wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten, enthaltend in einem oder mehreren Behältern

– eine für einen ersten Nukleinsäureanalyten spezifische, an eine erste Markierung gekoppelte erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde,
– eine für einen zweiten Nukleinsäureanalyten spezfische, an eine zweite Markierung gekoppelte zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde, wobei die Markierung getrennt von der an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelten Markierung nachweisbar ist,
– eine für einen dritten Nukleinsäureanalyten spezifische dritte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde, wodurch eine erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelt ist und eine zweite Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie an die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelt ist, und
– Reagenzien zur Nukleinsäureamplifikation.

Bevorzugte Analyten sind Nukleinsäureanalyten, die mit sequenzspezifischen Sonden bestimmt werden können. Solche Nukleinsäureanalyten können ebenfalls mit Nukleinsäuren amplifiziert werden, wobei eines von mehreren Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren des Standes der Technik verwendet wird, wie LCR (US-Patente Nr. 5,185,243, 5,679,524 und 5,573,907; EP 0 320 308 B1 ; WO 90/01069; WO 89/12696, und WO 89/09835), Cycling-Probe-Technik (US-Patente Nr. 5,011,769, 5,403,711, 5,660,988 und 4,876,187 und die veröffentlichten PCT-Anmeldungen WO 95/05480, WO 95/1416, und WO 95/00667), Invader TM-Technik (US-Patente Nr. 5,846,717; 5,614,402; 5,719,028; 5,541,311 und 5,843,669), Q-Beta-Replikase-Technik (US-Patent Nr. 4,786,600), NASBA (US-Patent Nr. 5,409,818; EP-0 329 822), TMA (US-Patente Nr. 5,399,491, 5,888,779, 5,705,365, 5,710,029), SDA (US-Patente Nr. 5,455,166 und 5,130,238) und PCR (US-A-4,683,202), wohingegen das PCR-Verfahren am stärksten bevorzugt ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Es zeigt:
1 ein mögliches Datenverarbeitungsschema für einen automatisierten multiplen Analytbestimmungstest mit den beschriebenen Bestimmungsverfahren. Siehe ebenfalls Beispiel 2.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Analyten lassen sich durch Bindungsassays des Standes der Technik nachweisen. Dies sind vorzugsweise Komponenten von Proben für medizinische Diagnostika oder andere biologische Analytika, d.h. insbesondere Inhaltsstoffe von Körperbestandteilen, wie Antigene, Antikörper, Zellen oder Nukleinsäuren. Solche Tests können beispielsweise zur Bestimmung von Erregern, wie Bakterien, beispielsweise Chlamydia, Neisseria, und Mycobakterien und Viren, wie HBV, HCV und HIV verwendet werden. Je nach dem Ziel eines Assays kann man die Menge eines Analyten in einer Probe sowie die Konfiguration eines Analyten bestimmen, beispielsweise kann ein Nukleinsäureanalyt auf seine Allelform analysiert werden oder es kann analysiert werden, ob ein Patient eine mutierte Form trägt.
Eine erfindungsgemäße Probe enthält den zu bestimmenden Analyten. In Bezug auf medizinische Diagnostika-Proben, die von Mensch oder Tier hergeleitet sind, werden vorzugsweise beispielsweise Vollblut, Gewebeschnitte, Urin, Sputum, Serum, Plasma, Leukozytenfilm und Abstriche verwendet. Je nach dem Analyten und der Probe kann es notwendig sein, die Probe vorher zu verarbeiten, damit eine Bestimmung des Analyten ermöglicht wird, beispielsweise müssen für die meisten Proben Nukleinsäuren in einem ersten Schritt extrahiert werden. Solche vorher verarbeiteten Proben sind ebenfalls erfindungsgemäße Proben.
Erfindungsgemäß werden mindestens drei Analyten bestimmt. Dies könnte beispielsweise ein Muster von Erregern in einem Patient sein, wie die Viren HIV, HBV und HCV, auf die jede Blutprobe in Blutbanken untersucht werden muss. Ein weiteres Beispiel kann die Bestimmung des Histokompatibilitäts-Locus-Antigenmusters sein, das aus mehreren Loci und bestimmten A1lelformen besteht.
Die Analyten sind an spezifische Bindungspartner gebunden. Je nach dem Analyten muss man spezifische Bindungspartner auswählen. Analyten mit Antigeneigenschaften können mit Hilfe spezifischer Antikörper gebunden werden. Antikörper in einer Probe können bestimmt werden, indem die spezifischen Antigene als Bindungspartner verwendet werden. Sollte ein Nukleinsäureanalyt bestimmt werden, kann man eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zum Analyten ist, als spezifische Sonde verwenden. Weitere spezifische Bindungspaare wie Substrat-Enzym oder Zucker-Lectin sind im Stand der Technik bekannt und können in den beschriebenen Verfahren geeignet sein.
Ein Nukleinsäureanalyt wird gewöhnlich in eine verfügbare Form gebracht, indem die ursprüngliche Probe mit einem von verschiedenen Verfahren verarbeitet wird. Dies umfasst zum Beispiel den Wechsel des pH-Wertes (alkalisch), Erwärmen, zyklische Änderungen der Temperatur (Gefrieren/Tauen), Änderung der physiologischen Wachstumsbedingungen, Verwendung von Detergenzien, chaotropen Salze oder Enzymen (beispielsweise Proteasen oder Lipasen), allein oder in Kombination. Man kann beispielsweise magnetische Glaspartikel verwenden, die eine Nukleinsäure unter spezifischen Bedingungen binden können. Geeignete Partikel und Protokolle sind in der WO 96/41811 und WO 01/37291 beschrieben.
Es ist wichtig, dass man Reaktionsbedingungen auswählt, die die spezifische Bindung der Bindungspartner an die Analyten fördern, die es ermöglichen, dass spezifische Bindungskomplexe auftreten, aber die die Bindung der Bindungspartner an nichtverwandte Reaktions- und Probenkomponenten, die zu einem gesteigerten Hintergrundsignal führt, minimieren. Solche Reaktionsbedingungen und geeignete Protokolle sind im Stand der Technik bekannt.
Ein spezifischer Nukleinsäurebindungspartner, ebenfalls als Sonde bezeichnet, zur Bestimmung eines Nukleinsäureanalyten oder eines amplifizierten Nukleinsäureanalyten ist vorzugsweise ein Oligonukleotid, jedoch können Analoga mit beispielsweise einem Peptid-Gerüst statt dem natürlichen Phosphat-Zuckergerüst (PNA, WO 92/20702) verwendet werden. Zur Ermöglichung einer spezifischen Bindung der Sonde an den Analyten sind die Sonden vorzugsweise länger als 10 Nukleotide, und noch bevorzugter sind sie 10 bis 40 Nukleotide lang. Zudem ist es erforderlich, dass die Sonde zur Analytsequenz hinreichend komplementär ist. Daher sind die Sonden vorzugsweise wenigstens zu 80% komplementär, stärker bevorzugt wenigstens zu 90% komplementär. Bei dem am stärksten bevorzugten Fall sind die Sonden vollständig komplementär zum Analyten. Die genaue Bestimmung der Komplementarität und der Homologie kann mit Computer-Programmen, wie FastA (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 85, S. 2444-2448 (88)) bestimmt werden.
Je nach der anfänglichen Konzentration des Nukleinsäureanalyten kann es nötig sein, den Analyten zu amplifizieren, damit er bestimmt werden kann. Aus diesem Grund gibt es im Stand der Technik mehrere Amplifikationsverfahren (wie vorstehend zitiert). Insbesondere bei der Verwendung von Amplifikationsverfahren auf Primerbasis ist eine spezifische Amplifikation eines Nukleinsäureanalyten möglich. In der Kombination mit einem Sondenbindungstest kann eine gesteigerte Spezifität eines Tests erzielt werden. Es gibt auch Verfahren im Stand der Technik, wie LCR, die markierte Primer verwenden, damit die Erfassung eines Analyten ermöglicht wird. Auch können solche Verfahren erfindungsgemäß modifiziert werden.
Ein erfindungsgemäßer Primer ist ein Molekül, das sich vorzugsweise mittels Enzymen verlängern oder modifizieren lässt, stärker bevorzugt durch eine Polymerase beispielsweise prokaryotischen Ursprungs, wenn er an einer Nukleinsäure-Matrize hybridisiert ist. Bei der Verwendung der PCR-Methodik sind thermostabile Polymerasen wie T. aquaticus oder T. thermophilus DNA-Polymerase bevorzugt. Diese verlängern die Primer durch Zugabe von Mononukleotid-Einheiten von Monodesoxyribonucleosidtriphosphaten an das 3'-OH-Ende der Primer. Die Gesamt-Länge und die Basensequenz eines Primers wird von der erforderlichen Spezifität der Amplifikationsreaktion bestimmt. Die bevorzugten Primerlängen zur Durchführung der PCR reichen von 10 bis 40, stärker bevorzugt von 15 bis 30 basenenthaltenden Untereinheiten, welche aus Mononukleotiden und/oder Nukleinsäureanalogmonomeren ausgewählt werden. Im allgemeinen eignen sich Primer dieser Länge auch für andere Amplifikationsverfahren.
Wird mehr als ein Primer zur Amplifikation verwendet, beispielsweise bei der Verwendung von PCR- und/oder bei der Amplifikation mehrerer Zielnukleotidsequenzen in einer Reaktion, werden vorzugsweise Primer verwendet, die nicht aneinander hybridisieren können, weil sie keinen Bereich mit mehr als 5 aufeinanderfolgenden komplementären Basen enthalten.
Dem Fachmann ist allgemein bekannt, dass Markierungen eine Gruppe sind, die sich zur Bestimmung in Gegenwart eines Analyten nachweisen lässt oder nachweisbar gemacht werden kann. Gut bekannte Markierungen sind Fluoreszenz-Markierungen, wie Fluoreszein- und Lanthanid-Chelate, elektrochemilumineszente Markierungen, wie Ruthenium-Komplexe, oder Einheiten, die durch eine andere Moleküleinheit erkannt werden können, wie Haptene, die durch einen Antikörper erkannt werden können, der gegen dieses Hapten hervorgerufen wurde, oder Einheiten, die immobilisiert werden können, wie Biotin, das beispielsweise an Streptavidin-beschichtete Festphasen gebunden werden kann, wie an Perlen oder Röhrchen. Die am stärksten bevorzugten Markierungen insbesondere in Bezug auf homogene Formate sind Chromophore. Diese Chromophore können allein oder in Kombination mit einem weiteren Chromophor oder beispielsweise mit einem nicht-fluoreszierenden Quencher verwendet werden.
Werden homogene Nachweisformate verwendet, insbesondere zum Nachweis der Nukleinsäureanalyten, sind mehrere Formate im Stand der Technik bekannt. Verfahren, wie der TagMan-Test (US-Patente Nr. 5,210,015 und 5,487,972) und der Kissing-Probe-Assay beruhen auf einer Fluoreszenzenergie-Übertragung fluoreszierender Farbstoffe (FET, Styer und Haughland Proc. Natl. Acad. Sci. USA Bd. 98, S. 719-(67)) . Nach Zusammenbringen in räumliche Nähe zueinander kann ein erster Fluorophor mit einem zweiten Fluorophor oder einem nicht-fluoreszierenden Quencher wechselwirken. Die elektromagnetische Emission oder die Vibrationsanregung eines ersten fluoreszierenden Farbstoffs kann beispielsweise die Resonanz in einem zweiten fluoreszierenden Farbstoff induzieren. Je nach dem verwendeten Format kann man beispielsweise eine abnehmende Lichtemission des ersten Fluoreszenzfarbstoffs oder eine ansteigende Lichtemission des zweiten Fluoreszenzfarbstoffs als Mittel für die Anwesenheit eines Analyten nachweisen. Kombinationen von fluoreszierenden Farbstoffen, die für diesen Zweck verwendet werden können, sind im Stand der Technik bekannt. Beispiele sind klassische Farbstoffe, die sich für die Resonanzenergieübertragung vom Förster-Typ eignen, wie Pentamethin-indodicarbocyanin (Cy5), in Kombination mit 6-Carboxyfluorescein (6-FAM).
In diesem Zusammenhang bedeutet Markierung eine signalerzeugende Einheit, die tatsächlich im erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen wird. In Bezug auf die beschriebenen homogenen Formate werden Fluorochrompaare verwendet, die miteinander in Resonanz kommen, und die in diesen Verfahren als einzelnes Nachweissignal nachgewiesen werden. Obwohl zwei einzelne Moleküle, beispielsweise zwei Fluorochrome, beteiligt sind, arbeiten sie als eine einzige Markierung. Zudem wird der Begriff Markierung so verstanden, dass er auch bedeuten kann, dass mehr als ein Markierungsmolekül einer bestimmten Markierung an ein Bindungspartnermolekül gekoppelt ist.
Je nach den verwendeten Markierungen müssen verschiedene Detektoren zum Messen der Signale der Markierungen verwendet werden. Unter anderem werden insbesondere Fluorimeter weithin für diesen Zweck verwendet. Fluoreszenzmarkierung ist am vorteilhaftesten in Zusammenhang mit homogener PCR, da im Gegensatz zu enzymatischen oder Chemilumineszenz-Markierungstechniken kein chemisches Trigger-Reagenz zur Signalerzeugung zugegeben werden muss. Dies ermöglicht ein Verfahren im geschlossenen Röhrchen, was der effizienteste Weg zur Vermeidung von Kreuzkontamination mit amplifiziertem Material ist. Bei der Bestimmung mehrerer Markierungssignale ist es wichtig, dass die Signale voneinander unterscheidbar sind. Zur Vermeidung eines solchen Cross-Talks ist bei der Verwendung optischer Markierungen bevorzugt, dass jede Markierung ein anderes Emissions- und/oder Extinktionsspektrum aufweist. Bei der Verwendung der meisten der kommerziell erhältlichen Markierungen bei Mehrfachanalytnachweistests kann trotzdem zumindest ein gewisser Cross-Talk nicht vermieden werden. Bei der Bestimmung von nur einigen wenigen Analyten kann dieser Cross-Talk durch Verarbeiten der gemessenen Signale mit Computerprogrammen oder unter Verwendung teurer Spektralfluorimeter statt Fluorimeter auf Filterbasis kompensiert werden. In Bezug auf homogene Formate insbesondere bei der Verwendung von Verfahren auf Fluoreszenzenergieübertragungsbasis steigert der Bedarf an zusätzlichen Chromophoren sogar die Möglichkeiten von Interferenzen. Daher ist in der Wirklichkeit die Anzahl der geeigneten Markierungen, die zusammen in einem Mehrfachtest verwendet werden können, eingeschränkt.
Erfindungsgemäß wird zumindest einer der verwendeten Bindungspartner an eine Kombination nachweisbarer Markierungen gekoppelt, wodurch jedes dieser Bindungspartnermoleküle nur an eine nachweisbare Markierung gekoppelt ist. Dagegen sind Sonden, wie sie von Samiotaki et al. (wie oben zitiert) beschrieben sind, mit mehreren Markierungen (beispielsweise 10 bis 20, am 5'-Ende jedes Oligonukleotids gekoppelt) markiert. Aufgrund der Nähe der nachweisbaren Markierungen, die an das gleiche Sondenmolekül gekoppelt sind, ist die Gefahr von Interferenz zwischen den Markierungen sehr hoch, und nicht alle Arten von Markierungen, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, können verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Bestimmung einer gesteigerten Anzahl von Analyten in einem Mehrfachanalytassay verwendet werden und sind mit einem breiten Bereich von Markierungen kompatibel.
Durch Senken der Anzahl von nötigen Markierungen in einem Mehrfach-Assay wird der Bedarf an exotischen Markierungen umgangen, und es können auch billigere Detektoren, wie Fluorimeter auf Filterbasis, anstelle von Spektralfluorimetern verwendet werden, die viel teurer sind. Dies ermöglicht ferner homogenere Formate, die in Bezug auf kommerzielle Diagnose-Assays aufgrund der eingeschränkten Kontaminationsgefahren und weniger Arbeitsschritte von herausragender Bedeutung sind.
Wie vorstehend erwähnt können drei Markierungen in verschiedenen Kombinationen mit bis zu sieben verschiedenen Bindungspartnern gekoppelt werden, was eine genaue Bestimmung von sechs verschiedenen Analyten ermöglicht. Dies wird in der nachstehenden Tabelle veranschaulicht. P steht für Parameter = Analyt, ein Kanal entspricht einem optischen Trakt als Teil eines Detektors, der an die Aufnahme des Signals einer bestimmten nachweisbaren Markierung optimiert ist. Die Tabelle zeigt die erwartete prozentuale Verteilung des Signals über alle drei Kanäle, die entweder chemisch oder mathematisch normalisiert werden. Es wird der Fall berücksichtigt, dass von den Analyten P1 bis P7 nur einer nach dem anderen in der Probe zugegen ist. Die Markierung der verschiedenen Bindungspartner sind Typ-P1-Markierung 1 (Signal in Kanal 1, P2-Markierung 2 (Signal in Kanal 2)), P3-Markierung 3 (Signal in Kanal 3), P4, halbe Menge Markierung 1, halbe Menge Markierung 2, P5-halbe Menge Markierung 1, halbe Menge Markierung 3, P6-halbe Menge Markierung 2, halbe Menge Markierung 3 und P7-1/3 Menge Markierung 1, 1/3 Menge Markierung 2, 1/3 Menge Markierung 3.
Kann ein Signal nur in einem Kanal gemessen werden, wird ein klares Anzeichen für die Anwesenheit von einem der Analyten der Parameter 1, 2 oder 3 angegeben (siehe Tabelle). Treten Signale in zwei Kanälen in einem 50:50-Verhältnis auf, gibt es ein starkes Anzeichen für einen Analyten der Parameter 4, 5 oder 6, wie in der Tabelle angegeben. Ein Signal-Verhältnis von 33:33:33 zeigt, dass ein P7-Analyt in der Probe zugegen ist. Dies spiegelt jedoch eine idealisierte Situation wider. Reale Signale können voneinander abweichen und müssen oft normalisiert werden, damit beispielsweise verschiedene Nachweiseffizienzen der Markierungen, Hintergrund- und Cross-Talk-Signale kompensiert werden.
Die verschiedenen Markierungen, die an die Bindungspartner gebunden sind, sollten die Bindungseffizienz eines Bindungspartners nicht ändern, was ebenfalls durch Variieren der Verhältnisse von Bindungspartner, der an der ersten Markierung gebunden ist, zu Bindungspartner, der an der zweiten Markierung gebunden ist, eingestellt werden kann. Auf diese Weise können auch verschiedene Nachweiseffizienzen eingestellt werden.
Ein 50:50 Signalverhältnis kann ebenfalls bei Vorhandensein von zwei Analyten auftreten. Dies ist jedoch äußerst selten, da dieses Ereignis entweder von einer 1:1-Coinfektion in Bezug auf die Anzahl der Ausgangsmoleküle abhängt und identische Extraktions-/Amplifikations-/Nachweiseffizienzen eine 50:50-Verteilung in 2 Kanälen ergeben, oder von einer unterschiedliche Anzahl von Ausgangsmolekülen in Zusammenhang mit Extraktions-/Amplifikations-/Nachweiseffizienzen, die genau die Unterschiede in Titer ausgleichen und wiederum eine 50:50-Verteilung ergeben. Somit sollten Coinfektionen von 2 Parametern, die durch eine einzelne markierte Sonde, beispielsweise P1 bzw. P2, angezeigt werden, eine ungleichmäßige Verteilung von ≫50:≪50:0 oder ≪50:≫50:0 ergeben, und so unterscheidbar von beispielsweise P4 sein, der durch ein gleichmäßiges Verteilungsverhältnis von 50:50:0 angezeigt ist. Solche Ergebnisse können jedoch aus Proben abgeleitet sein, die mit zwei Erregern, beispielsweise P4 und P1 coinfiziert sind.
Zur weiteren Senkung der Gefahr von unklaren Ergebnissen und möglichen Fehlern bei der Interpretation der gemessenen Signale kann man die Parameter derart anordnen, dass die Signale in zwei oder mehreren Kanälen eindeutig einer möglichen Analytverteilung in der Probe zugeordnet werden können, wie es in Beispiel 1 erläutert wird. Zudem kann man einen zusätzlichen Test durchführen, insbesondere beim Testen auf die restlichen möglichen Analytverteilungen, die in der Probe zugegen sein könnten. Ein solches nach und nach erfolgendes Verfahren ist sehr ökonomisch, da es die Bestimmung einer bestimmten Analytverteilung in den meisten Proben in einem ersten Lauf ermöglicht, wohingegen unklare Proben in einem zweiten Lauf beispielsweise mit einem Mehrfachanalytassay mit einer reduzierten Anzahl von Analyten (für die eine unzweideutige Eine Markierung-Ein Bindungspartner-Kombination möglich sein sollte) neu bewertet werden können. Berücksichtigt man darüber hinaus die Nukleinsäureanalyten und amplifizierte Nukleinsäureanalyten, kann man beispielsweise die Schmelzkurve der Analyt-Sonden-Hybridisierungskomplexe oder der amplifizierten Nukleinsäure bestimmen, die eine Unterscheidung verschiedener Analyten ermöglicht und die zu einem eindeutigen Ergebnis führt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Kits zur Bestimmung von wenigstens drei Analyten. Solche Kits enthalten in einem oder mehreren Behältern:

– einen für einen an eine erste Markierung gekoppelten ersten Analyten spezifischen ersten Bindungspartner,
– einen für einen an eine zweite Markierung gekoppelten zweiten Analyten spezifischen zweiten Bindungspartner, wobei die Markierung getrennt von der an den ersten Bindungspartner gekoppelten Markierung nachweisbar ist,
– einen für einen dritten Analyten spezifischen dritten Bindungspartner, wobei eine erste Menge des dritten Bindungspartners an die gleiche Markierung wie an den ersten Bindungspartner gekoppelt ist und eine zweite Menge des dritten Bindungspartners an die gleiche Markierung wie an den zweiten Bindungspartner gekoppelt ist, und die erste Menge des dritten Bindungspartners nicht an die gleiche Markierung wie an den zweiten Bindungspartner gekoppelt ist und die zweite Menge des dritten Bindungspartners nicht an die gleiche Markierung wie an den ersten Bindungspartner gekoppelt ist.

Solche Kits können auch Mittel zum spezifischen Binden der Bindungspartner an ihre Analyten enthalten, die Puffer, Blockierungsreagenzien, und andere Reaktionskomponenten umfassen können, die im Stand der Technik bekannt sind. Kits zur Bestimmung der Nukleinsäureanalyten können ebenfalls Reaktionskomponenten für Nukleinsäureamplifikationsverfahren wie oben beschrieben enthalten. Ein PCR-Reaktionskit kann auch beispielsweise eine Polymerase, Puffer, Nukleotidtriphosphate und/oder Primer enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Beispiele
Beispiel 1
Die erfindungsgemäße Mehrfarbenanalyse kann mit der Roche-Cobas-Tagman-Amplifikations/Nachweis-Technik und der 5'-Nukleasetesttechnik ( EP 0 543 942 und US 5,210,015 ), aufbauend auf "klassischen" Fluorochrom- Verbindungen und "klassischen" Resonanzenergieübertragungsprinzipien erfolgen. Ein Roche-Cobas-Taqman-Instrument ist mit bis zu 4 Filterpaaren ausgestattet (siehe auch EP 0 953 379 , EP 0 953 837 , US 6,134,000 und US 6,084,669 ). Ein mutmaßlicher Indikatorsatz kann aus 4 Reportern und vorzugsweise 1 oder vorzugsweise 2, gegebenenfalls nicht fluoreszierenden Quenchern bestehen. Kandidatenverbindungen, die den Spektralbereich überdecken, der von dem Cobas-Taqman-Detektor eingestellt ist, d.h. ca. 420 nm – ca. 710 nm, können umfassen:

– für Quencher (Q)-Farbstoffe mit Breitband-Absorptionsbereich im Roten, beispielsweise Polymethin-Cyanin-Farbstoffe (beispielsweise n = 5, d.h. 4 konjugierte olefinische Einheiten, die die Mesomerstruktur aufbauen), oder Rhodamin-Derivate an den Flanken, die symmetrisch mit den ungesättigten N-heterocyclischen Einheiten verschmolzen sind, die in dem konjugierten mesomeren π-e^(–)-System teilnehmen, und zwar jeweils als nicht-fluoreszierende Nitrophenyl-Derivate,
– für Reporter (R)-Farbstoffe fluoreszierende Moleküle, wie Kumarin-Farbstoffe, Fluoreszein-Farbstoffe, wie FAM oder chlorierte Derivates, Rhodamin-Farbstoffe, Oxazine oder Bodipy-Verbindungen. Drei davon werden Zielparametern zugeordnet, einer zum Überwachen von IC.

Allgemeine Anforderungen, die an die Kandidatenfarbstoffe gestellt werden, umfassen: gute chemische Stabilität in Stammlösung und ebenfalls auf dem Gebrauchsniveau als Inhaltsstoffe in Mastermix-Reagenzien; stabil, wenn sie während der Synthese, Reinigung und Kit-Herstellung Umgebungslicht ausgesetzt sind; stabil, wenn sie mehrfachen Heiz- und Kühlzyklen (beispielsweise n = 60) in der PCR ausgesetzt sind; hinreichende Spektralüberlappung und effiziente Energieübertragung zwischen entsprechenden RQ- Resonanzpaaren; hohe Extinktionskoeffizienten (beispielsweise Absorptionsfähigkeit); und insbesondere für Reporter hohe Quantenausbeute in wässrigen Lösungen und in dem für Taqman-PCR eingesetzten pH-Wert-Bereich (beispielsweise pH-Wert 7-8,5).
Das neue Konzept ermöglicht die Messung der Verteilung von auf Cross-Talk und Hintergrund korrigierten normalisierten Signalen von 3 Reporterfarbstoffen und Doppelkombinationen davon über die entsprechenden 3 optischen Kanäle von Cobas Taqman anstatt einer festen Zuordnung eines bestimmten Farbstoffs, der einen bestimmten Testparameter darstellt, und eines entsprechenden Kanals. Das Prinzip stellt eine vollständige Auflösung (über Reporter R1, R2, R3, R1 + 2, R1 + 3, R2 + 3) eines positiven Ergebnisses dar, das mit einem 6-Parameter-Mehrfach-Test erhalten wurde, wobei die maximale Komplexität berücksichtigt wird.
Theoretisch wird in Fällen einer Einzelmarkierungsverwendung 100% des jeweils verarbeiteten Signals in einem bestimmten Kanal gefunden. In Fällen einer Doppelmarkierungsverwendung werden die verarbeiteten Signale gleichmäßig über 2 entsprechende Kanäle verteilt (50% + 50%).
Die Unterscheidung von positiven/negativen Pools (Spenden) kann auf der Basis eines optimierten Algorithmus zur Bestimmung von Schwellenzyklen erfolgen (Ct-Werte, d.h. der Punkt auf der Reaktionskoordinate, wo die Fluoreszenzsignalintensität signifikant über den Hintergrundspiegel sinkt), wobei das Steigungsprofil der Signal-Zeit-Kurven erfasst wird.
Die Auflösung der Art der Infektion (Testparameter, d.h. die Art des Pathogens, das ein erfassbares Produkt ergibt) kann über die Analyse der kanalspezifischen Beiträge zum Gesamtbereich unter den Signal/Zeitkurven (AUC) oder zu der normalisierten Gesamtplateausignalintensität erfolgen. Es gibt keine feste Dosisreaktions-Beziehung für Kriterien wie diese, die jedoch für qualitative Tests, wie sie zur Blutuntersuchung notwendig sind, nicht verbindlich sind.
Ein geeigneter 6-Parameter (P1 bis P6)-Mehrfach-Test kann die folgenden Sonden umfassen (Q = Quencher, R = Reporter und N_i = eines der vier Nukleotide):

Parameter 1 – Sonde = 5'-Q-(N_i)_g-R1-(N_i)_h-3'-PO₄ + 5'-Q-(N_i)_g-R2-(N_i)_h-3'-PO₄ jeweils 5 pmol/100 μl Reaktionsgemisch
Parameter 2 – Sonde = 5'-Q-(N_i)_a-R1-(N_i)_b-3'-PO₄ 10 pmol/100 μl Reaktionsgemisch
Parameter 3 – Sonde 5'-Q-(N_i)_c-R2-(N_i)_d-3'-PO₄ 10 pmol/100 μl Reaktionsgemisch
Parameter 4 – Sonde 5'-Q-(N_i)_e-R3-(N_i)_f-3'-PO₄ 10 pmol/100 μl Reaktionsgemisch
Parameter 5 – Sonde = 5'-Q-(N_i)_k-R1-(N_i)_l-3'-PO₄ + 5'-Q-(N_i)_k-R3-(N_i)_l-3'-PO₄ jeweils 5 pmol/100 μl Reaktionsgemisch
Parameter 6 – Sonde = 5'-Q-(N_i)_n-R2-(N_i)_m-3'-PO₄ + 5'-Q-(Ni)_n-R3-(N_i)_m-3'-PO₄ jeweils 5 pmol/100 μl Reaktionsgemisch

Mit anderen Worten:
in den Fällen 2 bis 4 werden ca 1 * 6¹² Moleküle der gleichförmig markierten Sonde (gleiches Oligonukleotid/gleicher Reporter) in die PCR je nach Parameter eingebracht,
in den Fällen 1, 5 und 6 werden wiederum ca. 1 6¹² Moleküle der markierten Sonde in die PCR je Parameter eingebracht, ca.½·6¹² Moleküle mit einer Markierungs-Sorte und ½·6¹² Moleküle mit der anderen Markierungs-Sorte (gleiches Oligonukleotid/andere Reporter), was statistisch ausgeglichen verbraucht werden kann.
In sämtlichen Fällen sind 10 pmol parameterspezifische Sonde verfügbar.
Betrachtet man die Gefahr von unklaren Ergebnissen und konzentriert sich lediglich auf die Verwendung einzelner Markierungen und Doppelkombinationen, kann man argumentieren, dass unklare Ergebnisse möglicherweise im Fall von Coinfektionen von 2 Parametern äußerst selten sind, was durch jeweils eine einzelne markierte Sonde angezeigt wird, beispielsweise P2 ⇔ R1 + P4 ⇔ R3. Die Möglichkeit von entweder einer 1:1-Coinfektion in Bezug auf die Anzahl der Ausgangsmoleküle und identische Extraktions-/Amplifikations-/Nachweiseffizienzen, die eine 50:50 Signalverteilung in 2 Kanälen ergeben, oder von verschiedenen Zahlen an Ausgangsmolekülen in Zusammenhang mit den Extraktions-/Amplifikations-/Nachweiseffizienzen, die genau die Unterschiede im Titer ausgleichen und wiederum eine 50:50-Verteilung ergeben, wird als vernachlässigbar klein angesehen. Somit ergibt sich eine ungleichmäßige Verteilung von > (>) 50: < (<) 50:0 oder < (<) 50; > (>) 50:0 (Fall I) und ist somit unterscheidbar von beispielsweise P5 ⇔ R1R3, das durch eine gleichmäßige Verteilung von 50:0:50 veranschaulicht wird.
Die Coinfektion durch 2 Parameter, angezeigt durch 1:1-Gemische von 2 doppeltmarkierten Sonden (Fall II), beispielsweise P1 ⇔ R1R2 und P5 ⇔ R1R3 sollte aufgrund der Signalverteilung in 3 Kanälen (beispielsweise ca. 50:25:25, unter der Annahme vergleichbarer Extraktions-/Amplifikations-/Nachweis-Effizienzen) immer offensichtlich sein.
Die Coinfektion durch 2 Parameter, einer repräsentiert durch 1 Reporter und der andere durch 2, sollte aufgrund der Signalverteilung in 3 Kanälen erkannt werden, ≈33:33:33 (Fall III, beispielsweise R1R2 + R3) oder ein ≈75: ≈25:0-Muster ergeben (Fall IV, beispielsweise R1R2 + R1), und zwar wiederum unter der Annahme vergleichbarer Extraktions-/Amplifikations-/Nachweis-Effizienzen. Für den Fall II und III ist das gemeinsame Merkmal, dass es keinen optischen Kanal gibt, der mit im Wesentlichen "Null Signal" auf das Ziel bezogen ist. Mit anderen Worten ist die "Null + x"-Schwelle zur Unterscheidung gegen "wahres Null" wichtig. In Fall IV, möglicherweise dem entscheidensten, hängt die Auflösung von der Gesamteffizienz des Tests ab, was bestimmt, ob die resultierende Verteilung sich im Wesentlichen von einer 50:50-Situation unterscheidet oder nicht. Am wahrscheinlichsten müssen zusätzliche mathematische Kriterien berücksichtigt werden, damit Unklarheiten, insbesondere der letzteren Art aufgelöst werden. Vorteilhafterweise bietet Echtzeit Taqman-PCR auch "Helfer-Arithmetiken". Dieser Punkt wird nachstehend eingehender beschrieben.
Das seltene Auftreten von Unklarheit, d.h. das Ereignis einer 50:50-Signalverteilung, die von einer Coinfektion herrührt, kann weiter minimiert werden, indem äußerst selten gefundene und weniger effizient amplifizierte Parameter auf einzelne markierte Sonden minimiert werden, was durch die Berücksichtigung der geographischen Verteilungen komplementiert werden kann.
Eine mutmaßliche Zuordnung von Reportern (R = Markierung) und Tests zur Bestimmung von HIV-1-M, HIV-1-O, HIV-2, HCV, HBV und HAV könnte folgendermaßen sein:

IC (Interne Kontrolle) ⇔ R4.

Aus Sicherheitsgründen und insbesondere in Bezug auf einen kommerziellen Test kann man ebenfalls eine interne Kontrolle hinzufügen, die sich beispielsweise mit einer Sonde nachweisen lässt, die an eine vierte Markierung (R4) gekoppelt ist.
Hier sollte die Coinfektion von HIV-1-O und HIV-2 sehr unwahrscheinlich sein, da beide jeweils sehr selten sind und geographisch gut voneinander getrennt (was sich jedoch über die Jahre ändern kann), und das Gesamtergebnis wäre "HIV-positiv" selbst in einem Fall eines solchen unerwarteten Ereignisses.
Coinfektionen von HIV-1-O und HCV oder HIV-2 und HCV sollten dagegen bei den gegebenen derzeitigen Amplifikationseffizienzen (niedrig für HIV-1-O und HIV-2) nicht zu einer gleichmäßigen Verteilung von 50:0:50 oder 0:50:50 führen und nicht mit HBV- bzw. HAV-Einzelinfektionen verwechselt werden. Somit kann man ein Standard-Vierkanal-Fluorimeter zum Durchführen eines Sechsparametertests durchführen, einschließlich einer internen Kontrolle, die separat nachgewiesen wird, was beispielsweise in einem Roche-Cobas TaqMan-Instrument verwendet wird.
Somit erfordert dieses Konzept für eine vollständige Auflösung eines 6-Parametermehrfachtests hinsichtlich der Testparameter mäßige zusätzliche Anstrengungen verglichen mit der vorliegenden chemischen System- und Instrumentenplattform. Die Anforderungen in Bezug auf eine modernere Analyse-Software sind nicht sehr anspruchsvoll, wie es durch die nachstehend aufgeführten Überlegungen gezeigt ist. Dies umfasst in Einzelheiten:

– doppelt logistische Spurverfolgung für 3 Sonden (gleiches Oligonukleotid, andere Fluoreszenzmarkierungen)
– standardisiertes Verfahren zur Entwicklung von Signalausgängen für einzelne Reporter aus einzeln markierten Sonden und Ausarbeitung von Normalisierungsfaktoren (unter der Berücksichtigung der Einwirkung der Sequenzumgebung in den jeweiligen Oligonukleotiden, Grad der Reinigung, wie beispielsweise durch Em(R/Q)-Verhältnisse, wellenlängenabhängigem Energieinhalt und Spektralempfindlichkeit von CTM ASICS gezeigt)
– Ausarbeitung des verlässlichsten Ausgangskriteriums oder Satzes von Ausgangskriterien, die als 100%-Wert dienen sollen, Bestimmung der Varianz der Verteilungsmuster und Einstellen der Akzeptanz-Bereichsgrenzen für erwartete Werte
– Entwicklung eines Software-Algorithmus für die Analyse der Verteilung der korrigierten normalisierten Signale in 3 Zielkanälen, die alle vorstehend genannten Parameter enthalten.

Beispiel 2
In Bezug auf ein Testprotokoll für automatische Testvorrichtungen wie das Roche Cobas TaqMan^TM-Gerät ist ein geeignetes Verfahrensschema nachstehend angegeben (siehe ebenfalls 1).
Bei gegebener Verfügbarkeit neuer Reagenzien, könnte die prinzipielle Datenerfassung und das Datenverarbeitungsschema eines automatischen Tests wie folgt sein:
Vorzugsweise erfolgen alle Schritte gesondert für die optischen Kanäle 1, 2, 3 und 4 auf dem Cobas Taqman-Gerät.
– Datenverarbeitung:

1) Für jeden Kanal und als Signal-Zeit-Schaubild, wird {TFI_f(t) – {(DM·DD_f(t) + BG]}·XT·NF_Ri = NFI berechnet, d.h. kanalspezifische normalisierte korrigierte Fluoreszenzintensitäten
2) wenn die Kanäle 1, 2, 3 Reporterfarbstoffen entsprechen und Kanal 4 dem IC-Farbstoff, dann ist: NFI₄ = 100% IC-Reaktionsintensität NFI₁₊₂₊₃ = 100% Zielreaktionsintensität,
3) was hinsichtlich der Verteilung über diese Kanäle analysiert werden soll, d.h. x% in Kanal 1, y% in Kanal 2 und z% in Kanal 3.

Die resultierende Zahlen für die Signalverteilung werden dann mit den vorstehend angegebenen vorberechneten Werten verglichen, und die Identität des nachgewiesenen Pathogens wird von der Korrelation der optischen kanalspezifischen Zunahme und den entsprechenden Reporterfarbstoffen, plus Hilfsfaktoren, hergeleitet.
Somit wird mit anderen Worten der Test nicht in Bezug auf den Zieltiter kalibriert (d.h. es ist noch ein qualitativer Screening-Test, der ein pos/neg Ergebnis als geeignet ergibt, beispielsweise für Screening-Anwendungen in Blutbanken), sondern in Bezug auf den Signalausgang der parameterspezifischen Sonden bei einer gegebenen Konzentration (zur Identifizierung der Ursache für das positive Ergebnis einer Mehrfach-Amplifikation).
Die einzelne Probenanalyse kann wie in der 1 gezeigt verlaufen.
Die Logik dieses Verarbeitungsalgorithmus lässt sich unter Berücksichtigung der zugrundeliegenden Testprinzipien verstehen.
Bei der 5'-Nuklease-Technologie (Taqman-PCR, die bevorzugte Ausführungsform für die hier offenbarte Erfindung) sind Amplifikations- und Nachweisreaktionen eng miteinander verstrickt. Aus diesem Grunde werden die Nachweissonden mit 2 bestimmten chemischen Modifikationen zu dem PCR-Mastermix gegeben. Eine dieser Modifikationen ist eine fluorogene Reportergruppe (R, beispielsweise ein Derivat von 6-Carboxyfluorescein), die kovalent am Gerüst der Sonde gebunden ist, die andere ist ein Farbstoff, beispielsweise ein Polymethin-Cyanin-Derivat, das das Fluoreszenzlicht des Reporters absorbieren kann und es quenchen kann (Quencher, Q). Der Quencher ist gewöhnlich an dem Sondengerüst am 5'-Ende gebunden, wohingegen sich der Reporter innerhalb der Oligosequenz befindet und von dem Quencher durch eine Zahl von Nukleotid-Bausteinen beabstandet ist. Sonden binden an die Ziel-Nukleinsäuren (Sense- oder Antisense-Strang) nahe dem 3'-Ende eines Primers (rückwärts oder vorwärts). Sobald der Primer an das Ziel hybridisiert ist, und die DNA-Polymerase an den Primer gebunden wird, beginnt die Verlängerung des Zielhybrids. Aufgrund der 5'-Nuklease-Aktivität des Enzyms wird gleichzeitig mit der Kopienstrangsynthese die Sonde gespalten, sobald die Polymerase die Probenbindungsstelle erreicht, Reporter und Quencher werden getrennt, und das Fluoreszenzsignal wird messbar. Dieses Verfahren wird mit jedem Cyclus wiederholt, und immer mehr fluoreszierender Reporter sammelt sich in der Lösung an, bis das Reagenz am Ende der Umsetzung verbraucht ist. So werden in einem Signal-Zeit-Plot, sigmoidale Wachstumskurven erzeugt. Der Punkt der Zeitachse, an dem die willkürliche Fluoreszenzintensität (AFI, ebenfalls als relative Lichteinheiten RLU bezeichnet) signifikant vom Hintergrundsignal unterschieden werden kann, wird als Schwellenzyklus (ct) bezeichnet. ct ist ein Maß für den Analyt-Titer: je kleiner der ct-Wert, desto höher die Anzahl der Ausgangsmoleküle und/oder desto besser die Extraktions- oder Amplifikations-/Nachweiseffizienz. ct-Werte können mit Hilfe verschiedener mathematischer Operationen berechnet werden. Es können beispielsweise Cut-Off-Ansätze (mittlere Hintergrundsignalintensität, multipliziert mit einem konstanten Faktor, ergibt eine Cut-Off-Signalintensität, mit der man negativ von positiv unterscheidet), oder Ansätze, bei denen die Stelle des Maximums von dem ersten oder zweiten Derivat der Signal-Zeitkurve (d.h. das Steilheits- oder Steigungs-Profil) nach dem Anpassen der Kurve erfasst wird, verwendet werden. Der Steigungsprofilansatz ist im Gegensatz zum Signal-Schwellenansatz im Wesentlichen unabhängig von der Hintergrundintensitätsmenge und somit für Mehrfach-Assays mit kumuliertem Hintergrund aus allen Sonden, die im Reaktionsgemisch vorhanden sind, sehr interessant.
Auf der Basis dieser Prinzipien und gemäß dem vorstehend gezeigten Verarbeitungsschema setzt man verschiedene Mittel zur Erzeugung des primären Ergebnisses (d.h. positiv oder negativ?) und des sekundären Ergebnisses (d.h. welche Art der Infektion macht die Probe positiv?) ein.
Verglichen mit der Durchführung eines Mehrfach-Tests mit einer gemeinsamen Markierung gibt es einen potentiellen Verlust der Empfindlichkeit aufgrund der Verdünnung des Signals in mehrere optische Kanäle und somit reduzierte spezifische Signalwachstumskurven in bestimmten Kanälen. Daher arbeitet man zur Erzeugung des primären Ergebnisses gegebenenfalls mit zusammengesetzten Signal-Zeitkurven. Dadurch wird die gesamte spezifische Signalausbeute in einer Signal-Zeitkurve erfasst, die dann zur Bestimmung des Schwellenzyklus (ct) und des prinzipiellen Status der Probe (pos./neg.) verwendet wird. Mit Hilfe des Steigungsprofilansatzes ist die Addition der Hintergrundintensität nicht schädlich, und man kann den potentiellen Vorteil der Erfassung der ausgeprägteren Wachstumseigenschaften der spezifischen Signalzunahme ausschöpfen.
Zur Erzeugung der sekundären Ergebnisse zieht man dagegen die kanalspezifische Verteilung des normalisierten Signals (NFI-Intensitäten) heran, und leitet die Art der Infektion durch Vergleich der resultierenden Verteilungsmuster mit der oben genannten vorberechneten Matrix von Mustern ab. Zudem und zur Steigerung der Unterscheidungsleistung können auch nicht normalisierte spezifische Signalintensitäten zur Analyse von ca. 50:ca. 50 oder ca. 75:ca. 25 Verteilungen von normalisiertem Signal, d.h. den wirklich entscheidenden, herangezogen werden.

– Im Fall einer Monoinfektion, die durch ein 1:1-Gemisch von Sonden. veranschaulicht wird, ist das resultierende Verhältnis nicht-normalisierter aber dennoch auf den Hintergrund korrigierter Signale R1/R2 über das gesamte Amplifikations-/Nachweisverfahren konstant, beispielsweise 40/50. Dies muss genau äquivalent zu dem Wert des Normalisierungsfaktors (0,80) sein, der mit gleichen Mengen an gereinigtem Farbstoff erhalten wird, weil beide Sorten der markierten Sonde (gleiche Oligonukleotid-Sequenz!) mit identischen Raten gespalten werden. Hintergrund (BG)-Korrektur ist nötig, da mit einem auflösenden 6-Parameter-Mehrfach-Test gemäß dem hier vorgestellten Konzept jeder kanalspezifische Hintergrund von dem Signalausgang von 3 verschiedenen Sonden erzeugt wird, die mit der gleichen 'Markierung versehen sind. Daher ist die BG-Intensität nicht nur eine Funktion der optischen Eigenschaften der Markierung, sondern auch der Struktureigenschaften der Sonde, d.h. linear oder haarnadelförmig oder (allgemeiner) durch den Grad der Selbstkomplementarität und von der Temperatur bei den Messungen, die die Konformationsgleichgewichte der Sekundärstrukturen beeinflusst. So muss die Sekundärstruktur der unhybridisierten Sonde in Bezug auf die BG-Intensität berücksichtigt werden und Hilfsberechnungen müssen auf der Basis der spezifischen Fluoreszenzintensitäten SFI beruhen, d.h. SFI = TFIf(t) – [DM·DDf(t) + BG]·XTi = AFI – BG
Das spezifische Signal wird dagegen durch die 5'-Nukleaseaktivität der Polymerase erzeugt, und zwar in Abhängigkeit von einer im Wesentlichen perfekten Hybridisierung der Sonde an das Ziel, d.h. Linearisierung des Sondenoligonukleotids und somit im Wesentlichen unabhängig von der Sondenstruktur. Dies betrifft auch die verkürzte Sonde nach dem Spalten und Abdissoziieren vom Zielstrang aufgrund des begleitenden Abfalls von Tm (Schmelztemperatur). Kurze interne Hybride in dem restlichen Sondenoligomer sollten bei den erhöhten Temperaturen, die zur Hybridisierung bzw. zur Verlängerung in der PCR verwendet werden, nicht stabil sein. Nach der Normalisierung, die die Unterschiede der Quantenausbeute oder die Anfälligkeit gegenüber Lösungsmittel-Effekten kompensiert, ist die Signalverteilung in Kanal 1 und 2 50:50. Das Auffinden von NFI- und SFI-Verhältnissen ist erwartungsgemäß ein Doppelbeweis für eine Monoinfektion.
– Im Falle einer Doppelinfektion, die über zwei spezifische Sonden angezeigt wird, die als R1 bzw. R2 (Fall I) markiert sind, ist es sehr wahrscheinlich, dass sich die Signaldynamiken (d.h. das Wachstum als Funktion der Zeit) für die beiden verschiedenen Tests unterscheiden, da entweder der Anfangs-Analyttiter oder die Gesamtassayeffizienz oder beide möglicherweise verschieden sind. Neben der Möglichkeit einer >50:<50-Situation auf dem NFI-Niveau, muss auch das SFI-Verhältnis von R1/R2 für ziemlich frühe, zentrale und späte Phasen der Reaktion verschieden sein, d.h. das SFI-Verhältnis ist variabel. Die Verhältnisse haben einen gewissen Trend und unterscheiden sich von dem jeweiligen Normalisierungsfaktor, der mit äquivalenten Gemischen an gereinigtem Farbstoff erhalten wird, der vorzugsweise an eine Modellsonde (um unvermeidbare Mikroumgebungsfaktoren zu berücksichtigen, beispielsweise Linker, lokale Ladungen), beispielsweise ein T₃-R-T₁₆-Oligonukleotid gekoppelt ist, das den Signalausgang durch seine Strukturkonfiguration nicht moduliert.
– Im Falle einer Doppelinfektion, dargestellt durch R1 und R1R2 (Fall IV), und im Wesentlichen verschiedener Gesamtausbeuten für die 2 Assays, kann eine normalisierte Signalverteilung, die sich nicht sehr von 50:50 unterscheidet, beispielsweise 55:45, in Kanal 1 und 2 beobachtet werden. Ausgedrückt als nicht normalisierte Signalintensitäten, ist das Verhältnis R1/R2 jedoch 44/50 (0,88), d.h. größer als der Normalisierungsfaktor. Somit zeigt die Doppelabweichung von "mehr als erwartet" sowohl auf dem normalisierten als auch dem nicht normalisierten Niveau eine Doppelinfektion an. Das beispielsweise über AUC aufgespürte Verhältnis R1/R2 ist außerdem höchstwahrscheinlich nicht über den ganzen Test konstant, und zwar aufgrund von verschiedenen Signaldynamiken, die sich aus verschiedenen Amplifikationseffizienzen ergeben, was die Unterscheidung steigert.
– Im Falle einer Doppelinfektion haben beide Assays gleiche Effizienz und beginnen entweder von im Wesentlichen verschiedenen oder ca. gleichen Analyttitern, und es wird mit entweder einer R1 + R2- oder einer R1 + R1R2-Markierung (Fall 1 ODER Fall IV?) ein 75:25:0-NFI-Muster angestrebt oder sogar überschritten. Hier kann die Unterscheidung zwischen einem Fall IV und einer stark abweichenden Coinfektion des Fall I-Typs mit absolut spezifischen Signalintensitäten (R1-Intensität sollte viel geringer in einer Fall-I-Situation eins) oder absoluten Unterschieden von kanalspezifischen gegebenenfalls berichtigten SFI-Werten erzielt werden. Die Ergebnisse können in einigen Fällen aber dennoch nicht vollständig eindeutig sein.

Daneben können die zusammengesetzten AFI/t-Kurven bezüglich der Kurvenformeigenschaften analysiert werden. Bei einer Monoinfektion erwartet man eine monosigmoidale Kurve mit 1 Wendepunkt. Bei einer Doppelinfektion ist es jedoch höchstwahrscheinlich, dass die 2 Wachstumskurven, die aus jeder der 2 Arten von den aus den beiden Erregern extrahierten Nukleinsäure-Zielen erzeugt werden, in Bezug auf ct (d.h. den Punkt auf der Zeitachse, an dem sich die Kurve nach oben biegt und über den Hintergrund und das Abweichungsniveau steigt), in Bezug auf die Form und die spezifische Signalintensität nicht identisch sind. Somit kann eine bisigmoidale Kurvenform mit 2 Wendepunkten erzeugt werden. So können mono- oder bisigmoidale Kurvenformen die in der untersuchten Probe vorhandenen Mono- oder Bi-Infektionen anzeigen. In ungünstigen Fällen kann jedoch eine Überlagerung von 2 oder mehr Kurven zu unregelmäßigen Formen ohne eindeutiges Steigungsmaximum führen und wobei das Rauschen (d.h. die Grobheit der Kurve) erhöht ist. Eine weitere Möglichkeit ist eine zusammengesetzte Kurve mit 1 Wendepunkt, wenn 2 nahezu identische Kurven überlagert werden.
Zusammengefasst gibt es eine Reihe verfügbarer mathematischer Mittel, mit der die Auflösung eines positiven Mahrfach-Testergebnisses in Bezug auf den Infektionstyp erzielt wird. Diese umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf:

Grundlegende Maßnahmen – Referenz-NFI-Verteilungsmuster, und Art der Abweichung, entweder in Situationen mit signifikanter Signalintensität in 2 oder in 3 zielbezogenen optischen Kanälen. Der akzeptierte Bereich der Abweichungen vom Referenzmuster kann durch absolute Zahlen, % Banden relativ zu dem erwarteten NFI-Wert, auf der Basis von Präzisionsdaten, oder eine Kombination davon eingestellt werden.
Hilfsmittel – Analyse von NFI- und SFI-Verhältnissen, die bestimmten optischen Kanälen entsprechen, auf eine gemeinsame Abweichung; Analyse von NFI- oder SFI-Verhältnissen als Funktion der Zyklenzahl, d.h. dynamisch entlang der Reaktionskoordinate (Konstante oder Variable); Beziehung von NFI-Verhältnissen und entsprechenden absoluten SFI-Werten, oder absoluten SFI-Unterschieden zwischen 2 beliebigen optischen Kanälen (die gegebenenfalls durch Bezug auf eine Standard-Dosisdifferenz berichtigt werden), wobei bekannte assayspezifische Gesamteffizienzen (Extraktion/Amplifikation/Nachweis) für die verschiedenen untersuchten Erreger berücksichtigt werden; Analyse der Formen der zusammengesetzten AFI-Zeitkurven (wenn zutreffend).

Ein mutmaßlicher Anwendungsmodus für diesen Satz an Kriterien ist in der 1 + 2 gezeigt.
Zur Überwachung des gesamten Verfahrens kann außerdem ein künstliches Nukleinsäure-Konstrukt zu sämtlichen Proben gegeben werden, das vorzugsweise in einem modifizierten Viruspartikel verpackt (bewaffnet) ist und das mit dem natürlichen Ziel gemeinsam extrahiert und amplifiziert wird. Diese interne Kontrolle (IC) liefert einen einzigartigen Sondenbindungsbereich für eine IC-Nachweissonde, die sich von den zielspezifischen Sonden durch eine andere Reportergruppe mit unterscheidbaren Emissionseigenschaften unterscheidet. Somit kann ein IC-Signal von dem Zielsignal unterschieden werden, und da die IC bekanntlich in der Probe zugegen ist, arbeitet sie als Überwachungsmittel. Ist keine IC-Antwort vorhanden, muss die jeweilige Reaktion als ungültig angesehen werden und wiederholt werden.
Zusätzlich zur der co-extrahierten/-amplifizierten/-nachgewiesenen internen Kontrolle (IC), die zu sämtlichen zu verarbeitenden Proben gegeben wird (d.h. sowohl unbekannte als auch externe Kontrollen oder Kalibratoren) und die als R4 bezeichnet wird, sind externe positive Kontrollen Teil des Assays. Dies sind "bekannte Faktoren", die im Gegensatz zu den "unbekannten Faktoren" für positiv befunden werden, und sie können als gemischte Kontrollproben ausgelegt werden, die in sämtlichen zielbezogenen optischen Kanälen ein Signal hervorrufen. In Kombination mit der IC wird die Tauglichkeit des gesamten optischen Systems dann zusätzlich zu der Funktionalität des vollständigen Extraktions-/Amplifikations-/Nachweisverfahrens überwacht. Für Screening-Anwendungen auf Nukleinsäure-Basis in Blutbanken ist beispielsweise ein hochempfindlicher aber dennoch qualitativer Test erforderlich, um jede positive Blutspende zu identifizieren, soweit es technisch möglich ist. Daher werden die Titer der externen positiven Kontrollen in einem unteren Konzentrationsbereich eingestellt.
Beispiel 3
Auf der Basis der in Beispiel 1 angegebenen Parameterliste wird die nachstehend gezeigte Signalverteilungsliste analysiert. Für jeden der 6 untersuchten Parameter gibt es ein Referenzmuster der Signalverteilung über die 3 optischen Kanäle, die der Zielerfassung zugeteilt sind. Jedes Referenzmuster wird durch einen begleitenden akzeptierten Bereich komplementiert, beispielsweise
NFI-Referenzmuster
Mutmaßliche 10%/20% versetzte Banden, die 100% und 50%-Mittelwerten entsprechen, und 5X-Mehrfache von Werten nahe Null, welche sich zu dem folgenden akzeptierten Bereich fur das Referenzmuster umrechnen:
Anerkannte Bereiche für die Abweichung können berechnet werden, beispielsweise als Prozentwerte (%), absolute Zahlen, Vielfache einer einfachen Standardweichung oder Kombinationen davon.
Für jede Probe (Parameter) wird die Signalverteilung in Kanal 1 (Reporter R1), Kanal 2 (Reporter R2) und Kanal 3 (Reporter R3) durch 6 parallele simulierte Datensätze auf der jeweiligen Basis von 6fach-Bestimmungen wie in der Tabelle (auf der rechten Seite) gezeigt angegeben. Auf der linken Seite sind die nachfolgenden Schritte zur Bewertung der Signaldaten gezeigt.
In Bezug auf P5 wird eine Verteilung von Ch1:CH2:Ch3 von etwa 50:0:50 gefunden, wobei sowohl die Mittelwerte als auch die Streuung in den akzeptierten Bereichen liegen. Dies führt zu dem Ergebnis "P5-positiv", was eine Monoinfektion mit HBV bedeutet.
Beispiel 4
Wie vorstehend im Verlauf der prinzipiellen Überlegungen in Beispiel 1 und 2 angegeben, können 50:50-Verteilungen nicht immer ein gültiges Anzeichen für Monoinfektionen sein. Es muss zwar erwähnt werden, dass es mehrere Anwendungen gibt, bei denen solche unklaren Ergebnisse nicht auftreten, in vielen anderen Fällen, insbesondere für Diagnoseanwendungen eine weitere Analyse oft erwünscht ist. Zur Ermöglichung einer weiteren Analyse kann beispielsweise eine weitere Kurveneigenschaft in homogenen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Dies wird in dem in 5 gezeigten Schema widergespiegelt, wo zusätzliche Kurveneigenschaften, wie die absoluten SFI-Mengen der Ry-Farbstoffs und der NFI-Spurenmerkmale (NFI-Verhältnisse konstant/variabel; früh/spät Annäherung der endgültigen Verteilung; Abweichung <1/>1 usw.) eingesetzt werden, um den oder die Infektionsparameter aufzulösen.
Aus diesen Beispielen geht hervor, dass die Auflösung durch Analyse der Echtzeit-Assaydaten dynamisch entlang der Reaktionskoordinate anstelle der Berücksichtigung von nur den Endpunktbedingungen signifikant verstärkt werden sollte. Insbesondere für die Proben S4-S6 erzeugt eine reine Endpunktanalyse die Gefahr der Diagnose von Monoinfektionen, während der umfangreiche Satz von Analysewerkzeugen genauere Zuordnungen ermöglicht. Im Falle von S5 beispielsweise täuscht die Endpunkt-NFI-Verteilung eine HBV-Monoinfektion wie in Beispiel 3 vor, während durch die Analyse von NFI-Verteilungen dynamisch entlang der Reaktionskoordinate die falsche Zuordnung "HBV-Monoinfektion" leicht verworfen werden kann, und durch die korrekte Zuordnung "Coinfektion HIV-1-O + HCV" ersetzt werden kann, da HCV, das effizient amplifiziert und durch R3 repräsentiert wird, viel früher als HIV-1-O eine spezifische Fluoreszenzintensität (SFI) erzeugt, weniger effizient amplifiziert wird, und durch R1 repräsentiert wird. Somit fällt das R1/R3-Schaubild rasch unter die 50:50-Grundlinie, setzt sich mit einer positiven Abweichung fort, was der endgültigen Verteilung nahekommt.
Beispiel 5
Experimentelle Daten mit HBV-Monoinfektionen
Genomisches Ziel (HBV-Subtyp A), das in der Dosis von 25 bis 5000 Kopien/ml variiert und interne Kontrollkonstrukte wurden aus Plasmaproben mittels Magnetglaspartikeltechnologie wie in PCT/EP00/11459 beschrieben extrahiert. Eluierte Nukleinsäuren wurden spezifisch amplifiziert und in einer homogenen Echtzeit-Taqman-PCR auf einem COBAS TaqMan^TM-Gerät erfasst, das unter der AmpliLink^®-Version 2.1 (Roche Molecular Systems) arbeitet. Für die hier beschriebenen Basisstudien wurde eine HBV-spezifische Sonde (Code JW144) aufgetragen @ 7,5 pmol/100 ml, markiert mit FAM (λ_EX ≈ 494 nm; λ_EM ≈ 518 nm) und @ 7, 5 pmol/100 μl, markiert mit JA274 (λ_EX ≈ 580 nm; λ_EM ≈ 609 nm). Die Ergebnisse wurden zur MS Excel^®-Version 7.0 für eine weitere Datenanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung exportiert (beispielsweise die Berechnung des gültigen Zyklusbereichs [SFI≫AFI-BG-Rauschen], der spezifischen Signal-Zunahme, normalisierten Signalintensitäten, NFI-Verhältnissen und NFI-Spuren längs der Reaktionskoordinate, Klassifizierung der NFI-Spuren-Schaubilder zu einer Konstanten/Versetzung/Variablen mit positiver Steigung/Variabler mit negativer Steigung und ebenso für eine graphische Veranschaulichung der Ergebnisse).
Homogene Mehrfach-PCR-Reaktionen wurden unter Standard-PCR-Bedingungen mittels Primerpaaren und Sonden durchgeführt, die spezifisch für HIV-1M, HIV-1O, HIV-2, HCV und HBV sind.
Wie in den 3a-3d gezeigt, verhalten sich FAM- und JA274-Signale, die von ein und derselben biochemischen Reaktion erzeugt werden (d.h. Extraktion und Amplifikation von HBV-DNA) in einer gekoppelten Weise gemäß dem erfindungsgemäßen Konzept, d.h. sie schwingen zur 50:50-Verteilungslinie, sobald die SFI-Niveaus signifikant über den Hintergrund steigen. Je höher die HBV-Dosis ist, desto früher wird dies erreicht und bleibt konstant, bis der Endpunkt der Reaktion erreicht wurde. Dies ist am beachtenswertesten, da der Signalausgang, wie er auf dem COBAS-TaqMan^TM gemessen wird, für FAM und JA274 sehr unterschiedlich ist, was zu einem Normalisierungsfaktor NF_(JA274/FAM) von ca. 11,5:1 führt. Dies wird wiederum umgerechnet in eine gesteigerte Analyseempfindlichkeit von Reaktionen, die durch JA274 angezeigt werden, verglichen mit einer ähnlichen Reaktion, die durch FAM angezeigt wird, d.h. am unteren Ende der nachweisbaren HBV-Dosen ist das Erzielen einer 50:50-NFI-Verteilung bei der Verwendung dieses Farbstoffpaars entscheidend ("Modell des schlimmsten Falls")! Bei der Umrechnung von SFI in NFI mit den experimentell etablierten NF_(JA274/FAM) ergeben diese Farbstoffe – gekoppelt durch Erzeugung aus einer allgemeinen chemischen Reaktion – 50:50-Verteilungen mit bemerkenswerter Präzision (siehe ebenfalls 4b).
Beispiel 6
Experimentelle Daten mit verschiedenen Coinfektionen (Typ I & Typ IV)
Verfahren und Reagenzsätze waren wie für Beispiel 5 beschrieben, außer dass hier abhängig von den Zielen, die aus den coinfizierten Proben extrahiert wurden, die Sonden, die spezifisch für HBV, HCV oder HIV-1-O sind, in der Amplifikations-/Nachweisreaktion verbraucht wurden. Die HBV-Sonde wurde als Gemisch gleicher Mengen von FAM- oder JA274-markierten Oligonukleotiden eingesetzt, die HCV-Sonde war vollständig FAM-markiert, und die HIV-1-O-Sonde war vollständig JA274-markiert. HBV- + HCV-markierte Plasmaproben und HBV- + HIV-1-O-positive Plasmaproben sind Coinfektionen des Typs IV, HCV + HIV-1-O-positiv ist eine Coinfection des Typs I. Man beachte: Für HIV-1-O sind die Titer in X-fachen Verdünnungen eines Kulturüberstandes angegeben; für alle anderen Parameter war genau quantifiziertes [cp/ml] und standardisiertes Material verfügbar.
Aus den graphischen Darstellungen der 4a-4d sind die NFI-Verteilung an sich und die NFI-Spuren entlang der Reaktionskoordinate sehr verschieden von solchen, die aus Monoinfektionen hervorgehen. In 4a weisen die Reaktionen #1-12 niedrige und etwa äquivalente Titer von HBV (sie werden sehr gut amplifiziert; und es ist kein reverser Transkriptionsschritt beteiligt) und HCV auf (wird gut amplifiziert, jedoch etwas langsamer als HBV, über reverse Transkriptions-PCR; HCV-Ziele sind aufgrund ausgerpägter Sekundärstrukturen nicht leicht zugänglich). Folglich werden bald nach dem Beginn der spezifischen Reaktion SFI_(FAM) und SFI_(JA274) über eine HBV-Reaktion in erheblichen Mengen produziert und die NFI_(JA274/FAM)-Verhältnisse neigen dazu, dass die 50:50-Verteilunglinie erreicht wird (=1). Mit fortschreitenden Zyklen reagiert jedoch HCV mit einer kleinen Verzögerung, und es wird zusätzliches SFI_(FAM) erzeugt, wobei das NFI_(JA274/FAM)-Verhältnis unter die Gleichheitslinie gedrückt wird, wobei das Schaubild eine negative Steigung hat. Die Reaktionen #13-24 in der 4a weisen eine niedrige HBV-Infektionsdosis plus einen 100fachen Überschuss an HCV-Dosis auf, was zu einer Verschiebung des gültigen Zyklusbereichs zu einem früheren Beginn führt, ein NFI_(JA274/FAM)-Verhältnis-Schaubild, das schnell weit unter die Gleichheitslinie fällt, und dann langsam mit einer positiven Steigung ansteigt, da SFI_(FAM) aus der Hochdosis-HCV-Reaktion vor der "gekoppelten" Erzeugung von SFI_(FAM) und SFI_(JA274) aus der niedrigen HBV-Dosis-Reaktion erzeugt wird, was allmählich das Verhältnis von NFI_(JA274/FAM) steigert.
Durch Anwenden der in Beispiel 2 (S. 25 bis 26) angewendeten Kriterien in einer geordneten Reihenfolge, wie in 1 + 2 gezeigt, ergibt die Analyse "Coinfektion von HBV + HCV". Dies bewahrheitet sich für die meisten Reaktionen mit einer Kombination von hoher HBV-Dosis und niedriger HCV-Dosis (hohe Mengen von SFI_(FAM) und SFI_(JA274) plus wenig zusätzliches SFI_(FAM) allein, siehe 4d) oder aus einer hohen HBV-Dosis und einer niedrigen HIV-1-O-Dosis (hohe Mengen von SFI_(FAM) und SFI_(JA274) plus sehr wenig zusätzliches SFI_(JA274) allein, siehe 4c; Reaktionen #7-24). In wenigen Fällen, insbesondere mit der letzteren Einstellung, sind die Formen der optisch untersuchten NFI-Kurven und der vorläufigen mathematischen Deskriptoren (NFI-Endpunkt-Verhältnisse, NFI-Spuren-Eigenschaften, absolute SFI-Mengen, usw.) recht nahe zu denen, die eine Monoinfektion anzeigen. Dies kann jedoch mit Hilfe von chemischen (Verwendung von Farbstoffen mit ca. ähnlichen Emissionsintensitäten, d.h. die NFI-Verhältnisse, sind von der Zieldosis und von begleitenden Mengen der absoluten Signalerzeugung stabiler unabhängig), mathematischen (differenzierteren Statistikwerkzeugen, die auf die Analyse der primären Wachstums- bzw. sekundären NFI-Kurven angewendet werden), sowie technischen Mitteln (TC-Block und Arbeitsschritte, die mit Hilfe von Softwarekonfiguration spezifisch an rasche Zyklen angepasst sind, wie bei dem hier verwendeten TC-Profil; dies unterstützt ein Glätten der primären Wachstumskurven, was wiederum die NFI-Verhältnis-Spuren-Schaubilder stabilisiert) verbessert werden.
Außerdem zeigen die 4b (Reaktionen #13-24) und 4c (Reaktionen #1-6) Beispiele der Typ-I-Coinfektion, d.h. HCV plus HIV-1-O in diesem Fall, was zu einer "nicht-gekoppelten" Erzeugung von SFI_(FAM) und SFI_(JA274) führt. Folglich läuft und bleibt das NFI-Verhältnis-Spuren-Schaubild weit unter der Gleichheitslinie, da HCV viel besser als HIV-1-O amplifiziert wird (eine Folge unter anderem der Polymorphismen, die die Primer/Sonden-Bindungsstellen beeinflussen). Außerdem ist auch die JA274-spezifische Signalintensität, erzeugt von HIV-1-O allein, erheblich niedriger als diejenige, die bei HBV-Monoinfektionen erzeugt wird, was wiederum der Theorie entspricht. Dies unterstützt eine weitere Unterscheidung zwischen Coinfektion und Monoinfektion.
Allgemein ausgedrückt sind die Typ-I-Coinfektionen schwieriger von Monoinfektionen zu unterscheiden, insbesondere wenn hohe Dosen der Parameter 5 (was hohe SFI-Mengen für R1 [Ry] und R3 [Rx] erzeugt) kombiniert werden mit sehr niedrigen Dosen von Parameter 2 (was nur wenig zusätzliches R1 erzeugt), aber in den meisten Fällen ist dies sogar möglich wenn ziemlich einfache mathematische Kriterien, wie in diesem vorläufigen Testsystem, und ein Farbstoffpaar nach einem "Modell des schlimmsten Falls" verwendet werden. Die Kombination von 2 gut amplifizierten Zielen in einer Typ-IV-Coinfektion, beispielsweise Parameter 5 [angezeigt durch R1 + R3] und Parameter 4 [angezeigt durch R3], ergeben viel weniger Unklarheit, da erhebliche Mengen der R3-Intensität asynchron und asymmetrisch zugegeben werden. Auch wenn die relative Abundanz der Parameter 4 gegen Parameter 5 vernachlässigbar wird, werden ähnliche Grenzen der Auflösung beobachtet. Im Gegensatz zu der Typ-IV-Conifektion, die die Parameter 2 beinhaltet (und wie erwartet), werden die Typ-I-Coinfektionen recht leicht von Monoinfektionen unterschieden, die durch das gleiche, aber biochemisch gekoppelte Farbstoffpaar angezeigt werden. Dies wird auch auf dem Niveau der Endpunkt-NFI-Verhältnisse und der NFI-Spuren entlang der Reaktionskoordinate, und auch aus den signifikant niedrigeren Signalintensitäten des R1[Ry]-Farbstofffes ersichtlich. Dies beruht auf der Tatsache, dass eine erhebliche R3-Intensität durch Parameter 4 selbst bei niedrigen Dosen erzeugt wird, wohingegen die R1-Intensität, die aus der Spaltung von Parameter 2-spezifischen Sonden erzeugt wird, prinzipiell niedrig ist und ziemlich spät im Verlauf von 60 Zyklen erzeugt wird. So ist es aufgrund der fast unvermeidbaren Unterschiede im Anfangstiter oder der Extraktions-/Flutions-/Amplifikations-Effizienz, höchst unwahrscheinlich, dass eine 50:50-Verteilung des Signals im Verlauf der Reaktion erhalten wird.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten, das die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellen eines Gemischs einer Probe, die die wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten enthält oder von der vermutet wird, dass sie einen oder mehrere der Nukleinsäureanalyten enthält b) Bereitstellen von wenigstens 3 unterschiedlichen nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden c) Amplifizieren der Nukleinsäureanalyten d) Wählen von Reaktionsbedingungen, die die spezifische Bindung der nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden an die amplifizierten Nukleinsäureanalyten fördern, wobei – eine erste der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen ersten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist und an eine erste Markierung gekoppelt ist, – eine zweite der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen zweiten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist und an eine zweite Markierung gekoppelt ist, welche getrennt von der an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelten Markierung nachweisbar ist, und – eine dritte der wenigstens 3 nukleinsäuresequenzspezifischen Sonden für einen dritten der wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten spezifisch ist, wodurch eine erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie die an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist und eine zweite Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelt ist und die erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde nicht an die gleiche Markierung wie die an die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist und die zweite Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde nicht an die gleiche Markierung wie die an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist, e) Nachweisen der für die erste und die zweite Markierung bezeichnenden Signalintensitäten, f) Bestimmen der in der Probe vorhandenen Nukleinsäureanalyten unter Verwendung der in Schritt e) nachgewiesenen Signalintensitäten.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuren mittels PCR amplifiziert wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen homogen nachgewiesen wurden.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen mit Fluoreszenzenergietransfer nachgewiesen wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste der ersten, zweiten und dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde spezifisch für HIV, eine zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HCV und eine dritte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HBV ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HIV-1-M, eine zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HIV-1-O, eine dritte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HIV-2, eine vierte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HCV, eine fünfte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HBV und eine sechste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde spezifisch für HAV ist.
Kit zur Bestimmung von wenigstens 3 Nukleinsäureanalyten, enthaltend in einem oder mehreren Behältern – eine für einen ersten Nukleinsäureanalyten spezifische, an eine erste Markierung gekoppelte erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde, – eine für einen zweiten Nukleinsäureanalyten spezifische, an eine zweite Markierung gekoppelte zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde, wobei die Markierung getrennt von der an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelten Markierung nachweisbar ist, – eine für einen dritten Nukleinsäureanalyten spezifische dritte nukleinsäuresequenzspezifische Sonde, wodurch eine erste Menge der dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde an die gleiche Markierung wie die an die erste nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelte Markierung gekoppelt ist und eine zweite Menge der an die gleiche Markierung wie die zweite nukleinsäuresequenzspezifische Sonde gekoppelten dritten nukleinsäuresequenzspezifischen Sonde, und – Reagentien zur Nukleinsäureamplifikation.