PL210867B1 - Sposób oznaczania co najmniej 3 analitów - kwasów nukleinowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania co najmniej 3 analitów - kwasów nukleinowych.

Wynalazek dotyczy sposobów oznaczania co najmniej 3 analitów przy zastosowaniu specyficznych partnerów wiążących dla analitów, przy czym partnerzy wiążący są wyznakowani mniejszą liczbą różnych znaczników niż liczba zastosowanych różnych partnerów wiążących.

Oznaczenie analitu w próbce nabrało specjalnej wagi, szczególnie w dziedzinie opieki medycznej, wyżywienia i ekologii. W zależności od analitu można zastosować różne sposoby oznaczania. Małe cząsteczki, takie jak jony metali, monomery cukrów, aminokwasy często oznacza się na podstawie ich właściwości chemicznych albo fizycznych. Anality mające wyższą masę cząsteczkową, takie jak białka i polimery kwasów nukleinowych, można również oznaczyć przy zastosowaniu partnerów wiążących mających wobec nich swoiste powinowactwo. Przydatnymi parami wiążących się partnerów są przeciwciało-antygen, substrat-enzym, kwas nukleinowy-komplementarny kwas nukleinowy, cukier-lektyna. W przypadku, gdy zamierza się oznaczyć specyficzne białko, o którym wiadomo, że wykazuje właściwości antygenowe, do oznaczania można zastosować swoiste przeciwciało. Do oznaczania konkretnej sekwencji kwasu nukleinowego można użyć sondy - kwasu nukleinowego mającego komplementarną sekwencję. Takie testy wiązania i odpowiednie protokoły są dobrze znane w tej dziedzinie i wyczerpująco wyjaśnione w piśmiennictwie, patrz na przykład Sambrook i wsp., 1985, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Coldspring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames i S. J. Higgins, wyd. 1984) i seria Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

W celu umożliwienia wykrycia kompleksów swoisty partner wiążący-analit często znakuje się partnerów wiążących, dzięki czemu znaczniki te można wykrywać bezpośrednio albo pośrednio przy użyciu dodatkowych odczynników, które wiążą się z tymi znacznikami (na przykład stosując jako znacznik biotynę, którą można wykryć stosując koniugat awidyna-peroksydaza chrzanowa i odpowiednią reakcję enzym-substrat). Odpowiednie znaczniki są znane w tej dziedzinie.

W wielu przypadkach, a zwłaszcza w dziedzinie diagnostyki, niezbędne jest okreś lenie dwóch albo więcej analitów w celu uzyskania pełnego obrazu danej sytuacji. Na przykład, biorąc pod uwagę pacjenta, który może mieć infekcję Chlamydia trachomatis, lekarz normalnie będzie przeprowadzał badanie nie tylko pod kątem infekcji Chlamydia trachomatis, ale również Neisseria gonorrhoeae. Ponadto, gdy ustala się wzór HLA pacjenta, należy określić allele dla kilku różnych loci HLA.

Gdy przeprowadza się test wiązania wielu analitów należy zwrócić uwagę na stosowane znaczniki. W pierwszym przypadku ten sam znacznik jest używany dla każdego z różnych partnerów wiążących. W tym przypadku należy rozróżnić dwa alternatywne sposoby. Jeżeli wszystkie reakcje wiązania przeprowadza się razem w jednej reakcji, dodatni wynik pokazuje jedynie to, że w próbce obecny jest co najmniej jeden analit, ale nie wskazuje, który z nich. Jako alternatywę, można oddzielić każdą reakcję wiązania przez przeprowadzenie kolejnych reakcji albo zastosowanie trybów reakcji równoległych. Odpowiednimi trybami są, na przykład, testy na płytkach do mikromiareczkowania albo testy kroplowe. Sposoby stosowania takich trybów są dobrze znane w tej dziedzinie. Takie tryby są czasochłonne i wymagają wielu etapów manipulacji, co może zwiększać koszty i ryzyko zanieczyszczenia. Bardziej wyrafinowane metody z zastosowaniem biomikroprocesorów są bardzo kosztowne i trudne do przeprowadzenia ze względu na zanieczyszczenia, szczególnie w dziedzinie powielania kwasów nukleinowych.

W celu umożliwienia wykrywania kilku odrębnych analitów tylko w jednej reakcji wiązania i/lub wykrywania różnych swoistych partnerów wiążących można przeprowadzić znakowanie przy użyciu różnych znaczników, które można oddzielnie wykrywać. Takie znaczniki i przydatne sposoby wykrywania są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, można zastosować znacznik, który można wykryć przez jego spektrum emisji optycznej, gdzie każdy znacznik ma różne spektrum emisji. Jednakże należy odnotować, że takie testy są w praktyce ograniczone do określenia jedynie kilku analitów, ponieważ nie ma nieograniczonej liczby odpowiednich znaczników, które są możliwe do wykrycia oddzielnie z dużą czułością i dostatecznie stabilne. W przypadku odpowiednich znaczników będących metalami ziem rzadkich, niezbędne są drogie i wysoce skomplikowane detektory do fluorymetrii czasu zaniku (TRF). Ograniczenia te mają szczególne znaczenie w odniesieniu do homogennych sposobów wykrywania. Wadą takich trybów jest wysoki sygnał tła na skutek pominięcia etapów płukania w celu wyeliminowania partnerów wiązania, którzy nie wiążą się swoiście z analitem, co utrudnia prawidłową interpretację wielu wykrywanych sygnałów.

PL 210 867 B1

Wielokrotne znakowanie w połączeniu z detektorami wykorzystującymi liczne kanały optyczne jest stosowane przez wielu badaczy. Na przykład, Vet i wsp. (PNAS 96,6394-6399 (1999)) wykorzystują metodologię, w której 4 specyficzne sondy (Molecular Beacons) komplementarne do 4 różnych celów są wyznakowane 4 różnymi barwnikami wskaźnikowymi, każda jednym barwnikiem. Całe spektrum fluorescencji każdego barwnika jest przechowywane w komputerze i stosowane do interpretacji złożonych multipleksowych wyników. To podejście wymaga dość złożonego oprogramowania w celu sprostania wymaganiom zdolności wykrywania jednoczesnej infekcji (koinfekcji) analizą spektralną. Obejmuje to normalizację sygnałów fluorescencyjnych z różnych barwników indywidualnie dla poszczególnych barwników (kanału optycznego) przy maksymalnym wzmocnieniu tj. normalizację specyficzną dla kanału krzywych wzrostu związanych z odpowiadającym im plateau, a nie w poprzek różnych kanałów optycznych dla barwnika referencyjnego, aby móc analizować rozkład sygnału na wspólnej podstawie. Inne przykłady obejmują Josephsson i wsp. (J. Clin. Microbiol. 37/3, 490-496 (1999); do 3 różnie wyznakowanych Molecular Beacons dla do 3 celów na oznaczenie) oraz Mercier i wsp. (J. Virol. Methods 77, 1-9 (1999); 2 ró żnie wyznakowane sondy dla 2 celów na oznaczenie).

W celu zwiększenia liczby analitów wykrywalnych przy uż yciu wielu odrębnych znaczników można również zastosować kombinację znaczników do znakowania partnerów wiążących. Poza partnerami wiążącymi mającymi przyłączony jeden odrębny znacznik, stosuje się również partnerów wiążących, połączonych z dwoma albo większą liczbą znaczników przy wykorzystaniu tych samych rodzajów znaczników połączonych również z pojedynczo wyznakowanymi partnerami wiążącymi. Stosując na przykład 3 różne znaczniki możliwych jest 7 kombinacji znaczników, dzięki którym można wykryć również 7 różnych analitów. Metoda hybrydyzacji in situ wykorzystująca podobną zasadę jest opisana przez T. Ried i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, tom. 89, str. 1388-1392 (1992). Podobna metoda określenia 7 różnych typów ludzkiego wirusa brodawczaka (Human Papilloma Virus) w próbce przy użyciu PCR, a następnie oznaczenia przez hybrydyzację sondy jest opisana przez Samiotaki i wsp., Analytical Biochemistry tom. 253, str. 156-161 (1997). Dla tego celu, oligonukleotydy modyfikowane są na końcu 5' przy użyciu wielu grup chelatowych. Poszczególne jednostki chelatowe wypełnia się albo jednym i tego samego rodzaju jonem ziem rzadkich, bądź precyzyjnie dopasowaną mieszaniną do 3 jonów ziem rzadkich. A zatem, w przypadku > 1 rodzaju jonu związanego przez kompleksowanie, wiele fluorescencyjnych chelatów ziem rzadkich („mieszaninę barwników”) wiąże się z jedną i tą samą czą steczką sondy. Takie sondy nie s ą ł atwe do zsyntetyzowania i są rzadko stosowane (jeśli w ogóle) w homogennych trybach amplifikacji/wykrywania.

Istnieje wiele innych podejść technologicznych do kombinatorycznego znakowania. Ballard i wsp. (opis patentowy USA nr 5 759 781), Speicher i wsp. (Nat. Genetics 12, 368-375 (1996)) i Ried I wsp. (PNAS 89, 1388-1392 (1992)) opracowali tryby testów, w których każ da specyficzna sonda jest rozpoznawana przez swoiste oznakowanie, ponieważ wszystkie kopie danej sondy niosą 1 albo większą liczbę odrębnych fluoroforów w sposób kombinatoryczny. Znakowania dokonuje się metodą przemieszczania pęknięć (ang. nick translation), która jest mniej dokładna z punktu widzenia liczby znaczników włączonych do jednej cząsteczki sondy niż chemiczna synteza oligonukleotydów, tj. metoda nie nadaje się dobrze do dokładnego analizowania odrębnych rozkładów. Zatem ekspert nie będzie mógł zastosować takich sond w metodach amplifikacji kwasów nukleinowych, a zwłaszcza nie w homogennych metodach amplifikacji.

Tak zwane sondy CFET opisane przez Tong i wsp. (Nat. Biotechnology 19, 756-759 (2001)) mają zasadniczo inny wzór i sposób stosowania. 1 do 3 barwników przyłącza się na końcu 5' cząsteczki sondy, z jednostkami rozdzielającymi w precyzyjnie dobranych odstępach. Reszta oligonukleotydowa następuje za ostatnim barwnikiem lub częścią rozdzielającą w stronę końca 3'. Zatem, jest tu mieszanina różnych typów sond, jak w przypadku Ballard i wsp. Jednostki rozdzielające działają jako dostrajacze dla ruchliwości elektroforetycznej, jak również dla intensywności rezonansu. Ten ostatni wpływa na fluorescencyjne oznakowanie danej sondy. Sondy wzbudza się wspólną długością fali, a odbierany sygnał jest rozdzielny na podstawie pozycji w elekroforogramie kapilarnym i przez nałożenie pełnego spektrum emisji w danej pozycji i obliczenia względnych wkładów na podstawie składników zestawu znaczników, bezpośrednio jako stosunki liczbowe. Ponownie, nie ma analizy rozkładu sygnału skorygowanych i znormalizowanych sygnałów per se, ani dynamicznie wzdłuż współrzędnych reakcji, ani w przypadku wzoru oligonukleotydu „ta sama sekwencja/różny znacznik” i nie ma wytwarzania sygnału jako konsekwencji reakcji biologicznej zmieniającej konfigurację albo stan sondy.

Znakowanie partnerów wiążących więcej niż jednym znacznikiem na cząsteczkę partnera wiążącego jest obarczone pewnymi wadami. Tacy wielokrotnie wyznakowani partnerzy wiążący są raczej

PL 210 867 B1 wymagający (i kosztowni) w syntezie i może mieć miejsce zawada przestrzenna znaczników, która może zmniejszyć wydajność wiązania partnera wiążącego ze swoim analitem albo wykrywanie przyłączonych znaczników. Również mogą wystąpić oddziaływania między znacznikami przyłączonymi do partnera wiążącego, które mogłyby prowadzić do błędnych wyników. To mogłoby mieć miejsce, na przykład, przy stosowaniu znaczników optycznych. Jest to z pewnością szczególnie ważne, gdy przeprowadza się homogenne metody wykrywania z użyciem znaczników z transferem energii fluorescencji, jak wykorzystywana, na przykład, w testach TaqMan (US nr 5 210 015, EP nr 0 543 942).

A zatem, celem niniejszego wynalazku jest polepszenie metod oznaczania wielu analitów z uniknię ciem wszystkich albo części wad znanych metod.

Główny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy sposobu oznaczania wielu analitów z zastosowaniem mniejszej liczby znaczników niż liczba określanych analitów. Osiąga się to przez znakowanie całego zespołu cząsteczek sond swoistych wobec pewnych celów, każdą konkretnym barwnikiem, przy czym jedna część zespołu sond swoistych wobec innych celów jest wyznakowana danym barwnikiem, podczas gdy inna część zespołu jest wyznakowana innym barwnikiem (ta sama sekwencja/różnie wyznakowane oligonukleotydy w mieszaninie). Korzystnie, przez przeprowadzenie homogennych (w fazie roztworu) prób amplifikacji w czasie rzeczywistym real-time (na przykład przez PCR lub TMA), skorygowanie otrzymanego sygnału dla wszystkich rodzajów powiązanych szumów i normalizację sygnału z różnych znaczników dla barwnika odnośnikowego, można wydedukować cele na podstawie rozkładu obrobionego sygnału zebranego przez wielokanałowy detektor. Do tego celu stosuje się kombinacje znaczników.

Na przykład, gdy określa się 3 anality, niezbędne są tylko dwa różne możliwe do wykrycia znaczniki. Pierwszy znacznik jest przyłączony do pierwszego partnera wiążącego swoistego dla pierwszego analitu. Drugi znacznik jest przyłączony do drugiego partnera wiążącego swoistego dla drugiego analitu. Dla wyznakowania trzeciego partnera wiążącego swoistego dla trzeciego analitu używa się tego samego rodzaju znacznika, który został przyłączony do pierwszego i drugiego partnera wiążącego. Jedna część trzeciego partnera wiążącego jest połączona z pierwszym znacznikiem. W przypadku trzech analitów korzystnie poł owa części trzeciego partnera wiążącego jest w ten sposób wyznakowana. Inna cześć trzeciego partnera wiążącego jest połączona z drugim znacznikiem, którym w przypadku trzech analitów korzystnie byłaby pozostała część trzeciego partnera wiążącego. Zatem, każdy z partnerów wiążących swoisty dla tego analitu zawiera pierwszy znacznik lub drugi znacznik. To prowadzi do cząsteczek-partnerów wiążących, każdej wyznakowanej tylko jednym znacznikiem, korzystnie umożliwiając wielokolorową analizę w celu rozwiązania multipleksowych wyników w oparciu o wytwarzanie sygnału, który pochodzi z reakcji biochemicznej, a zatem dostarcza sposobów rejestrowania odpowiedzi kinetycznych, jednocześnie zachowując prosty wzór sond i stosowane w tej dziedzinie oprzyrządowanie do wykrywania. W przeciwieństwie do tego, w piśmiennictwie opisane są sondy, które wiążą liczne znaczniki z jedną cząsteczką sondy (Samiotaki, M. i wsp., Analytical Biochemistry 253, 156-161 (1997)). Takie sondy są trudniejsze do zsyntetyzowania w porównaniu z partnerami wiążącymi według niniejszego wynalazku.

Różne wydajności wykrywania, które mogą występować dla różnych znaczników przyłączonych do trzeciego partnera wiążącego, można skompensować na 2 sposoby. W przypadku, gdy pierwszy znacznik ma wyższy sygnał wyjścia w porównaniu z drugim znacznikiem, można wyrównać tę różnicę bądź chemicznie przez zmieszanie trzeciego partnera wiążącego połączonego z pierwszym znacznikiem, z trzecim partnerem wiążącym połączonym z drugim znacznikiem, w określonym stosunku nie 1:1 albo matematycznie przez normalizację sygnału wyjścia do danego znacznika wybranego jako standard. Takie różne wydajności wykrywania mogą wystąpić na skutek właściwych sondom właściwości, takich jak absorpcyjność lub wydajność kwantowa, ale mogą również być wynikiem różnych wydajności łączenia albo podatności na wpływy rozpuszczalników. W ostatnim przypadku mieszanie różnych ilości trzeciego partnera wiążącego po reakcji łączenia dostarcza dobrej możliwości dostosowania się do takich rozbieżności.

Dodatkowo, unika się możliwej interferencji, która może pojawić się, gdy dwa albo więcej wykrywalnych znaczników przyłącza się do jednej cząsteczki partnera wiążącego. Zatem, partnerzy wiążący zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku są kompatybilni z szerokim spektrum znaczników, które obejmują również fluorofory i kombinację fluoroforów, jak klasyczne znaczniki typu

Forster (Styer i Haugland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 719 (1967)), które można stosować, na przykład, do wykrywania w procesach homogennych, takich jak metoda TaqMan do oznaczania analitów-kwasów nukleinowych o niskich stężeniach.

PL 210 867 B1

Należy zauważyć, że można również określić większą liczbę analitów stosując trzy albo nawet więcej znaczników, które można połączyć w taki sam sposób, jak pokazano dla dwóch znaczników. Gdy stosuje się 3 znaczniki można określić do 7 analitów. Stosując 4 różne znaczniki można wykryć nawet 15 analitów, jeżeli stosuje się pojedyncze, jak również podwójne, potrójne i poczwórne kombinacje. Jeżeli stosuje się pojedyncze albo podwójne kombinacje (co może być korzystne z punktu widzenia praktycznego) można rozróżnić do 10 różnych analitów z zestawem 4 znaczników.

A zatem niniejszy wynalazek dotyczy sposobu oznaczania co najmniej 3 analitów-kwasów nukleinowych, korzystnie HIV, HCV, HBV, który obejmuje następujące etapy:

a) amplifikowanie tych co najmniej 3 analitów-kwasów nukleinowych przez PGR w fazie homogennego roztworu,

b) dostarczenie mieszaniny próbki wytworzonej w etapie a) zawierającej co najmniej te 3 amplifikowane anality-kwasy nukleinowe albo próbki, w której przypuszczalnie jest zawarty jeden lub więcej analitów-kwasów nukleinowych i co najmniej 3 różnych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach umożliwiających swoiste wiązanie tych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego z tymi amplifikowanymi analitami-kwasami nukleinowymi, przy czym

- pierwsza z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla pierwszego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów i jest związana z pierwszym znacznikiem,

- druga z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla drugiego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów i jest związana z drugim znacznikiem, który daje się wykryć oddzielnie od znacznika związanego z pierwszą sondą swoistą dla kwasu nukleinowego i

- trzecia z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla trzeciego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów, przy czym pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym pierwszym znacznikiem co związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym drugim znacznikiem co sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego i pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem, który jest związany z drugą połową ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem, który jest związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym wspomniana pierwsza sonda swoista dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HIV, wspomniana druga sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HCV, a wspomniana trzecia sonda swoista dla trzeciego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HBV,

c) wykrywanie w procesie homogennym intensywności sygnałów wskazujących na pierwszy i drugi znacznik,

d) otrzymywanie stosunku między intensywnościami sygnałów wykrytych w etapie c),

e) oznaczanie analitów-kwasów nukleinowych obecnych w próbce za pomocą intensywności sygnałów wykrytych w etapie d).

Korzystnie, znaczniki wykrywa sie przy użyciu transferu energii fluorescencji.

Korzystnie, analitami są kwasy nukleinowe, które można oznaczyć przy użyciu sond swoistych wobec sekwencji. Takimi analitami-kwasami nukleinowymi mogą być również kwasy nukleinowe amplifikowane z zastosowaniem jednej z kilku metod amplifikacji kwasów nukleinowych znanych w tej dziedzinie, takich jak LCR (opisy patentowe USA nr 5 185 243, nr 5 679 524 i nr 5 573 907; EP nr 0 320 308 B1; WO 90/01069; WO 89/12696 i WO 89/09835), technologia cyklicznej sondy (opisy patentowe USA nr 5 011 769, nr 5 403 711, nr 5 660 988 i nr 4 876 187 oraz opublikowane zgłoszenia PCT WO 95/05480, WO 95/1416 i WO 95/00667), technologia Invader™ (opisy patentowe USA nr 5 846 717; nr 5 614 402; nr 5 719 028; nr 5 541 311; oraz nr 5 843 669), technologia replikazy Q-Beta (opisy patentowe USA nr 4 786 600), NASBA (opis patentowy USA nr 5 409 818; EP-0 329 822), TMA (opisy patentowe USA nr 5 399 491, nr 5 888 779, nr 5 705 365, nr 5 710 029), SDA (opisy patentowe USA nr 5 455 166 i nr 5 130 238) oraz PCR (US-A-4 683 202), przy czym najkorzystniejsza jest metoda PCR.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób oznaczania co najmniej 6 analitów-kwasów nukleinowych, korzystnie wirusów HIV, HCV, HBV, HAV, który obejmuje następujące etapy:

PL 210 867 B1

a) amplifikowanie tych co najmniej 6 analitów-kwasów nukleinowych przez PCR w fazie homogennego roztworu,

b) dostarczenie mieszaniny próbki wytworzonej w etapie a) zawierającej te co najmniej 6 amplifikowanych analitów-kwasów nukleinowych albo próbki, w której przypuszczalnie jest zawarty jeden lub więcej analitów-kwasów nukleinowych i co najmniej 6 różnych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach umożliwiających swoiste wiązanie tych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego z tymi amplifikowanymi analitami-kwasami nukleinowymi, przy czym

- pierwsza z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla pierwszego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych i jest związana z pierwszym znacznikiem,

- druga z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla drugiego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych i jest związana z drugim znacznikiem, który daje się wykryć oddzielnie od znacznika związanego z sondą swoistą dla pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego i

- trzecia z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla trzeciego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych, przy czym pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym pierwszym znacznikiem co związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym drugim znacznikiem co sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego i pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem, który jest związany z drugą połową ilości sondy swoistej dla trzeciego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem co sonda swoista dla pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwsza sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-1-M, a druga sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-1-0, a trzecia sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-2, czwarta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla kwasu nukleinowego jest swoista dla HCV, piąta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HBV, a szósta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HAV,

c) wykrywanie w procesie homogennym intensywności sygnałów wskazujących na pierwszy i drugi znacznik,

d) otrzymywanie stosunku między intensywnościami sygnałów wykrytych w etapie c),

e) oznaczanie analitów-kwasów nukleinowych obecnych w próbce za pomocą intensywności sygnałów wykrytych w etapie d).

Korzystnie, znaczniki wykrywa się przy użyciu transferu energii fluorescencji.

Krótki opis rysunków

Na figurze 1 pokazano możliwy schemat postępowania dla automatycznego testu dla oznaczania wielu analitów przy zastosowaniu opisanych metod oznaczania. Patrz również przykład 2.

Anality stosowane w sposobie według niniejszego wynalazku, to anality, które można oznaczyć z zastosowaniem testów wią zania znanych w tej dziedzinie. Są one korzystnie składnikami próbek do diagnostyki medycznej lub innych analitycznych próbek biologicznych. Takie testy można stosować, na przykład, do oznaczania czynników zakaźnych, takich jak HBV, HCV i HIV. W zależności od celu testu, można określić ilość analitu obecnego w próbce, jak również konfigurację analitu, na przykład analit-kwas nukleinowy można analizować pod kątem formy allelicznej albo czy pacjent niesie postać zmutowaną.

Próbka w sposobie według niniejszego wynalazku zawiera analit, który ma być oznaczony. W odniesieniu do diagnostyki medycznej, korzystne są próbki pochodzące od człowieka albo zwierzęcia, np. można użyć pełną krew, skrawki tkanek, mocz, plwocinę, surowicę, osocze, „warstwę pośrednia krwi-granica między erytrocytami a kożuszkiem leukocytarnym” (buffy coat) i wymazy. W zależności od analitu i próbki, może być konieczna obróbka wstępna próbki w celu umożliwienia oznaczenia analitu, na przykład dla większości próbek w pierwszym etapie muszą być wyekstrahowane kwasy nukleinowe. Takie poddane wstępnej obróbce próbki są również próbkami wykorzystywanymi w niniejszym wynalazku.

PL 210 867 B1

Według niniejszego wynalazku można oznaczyć co najmniej 3 anality. Może to być, na przykład, wzór czynników zakaźnych u pacjenta, takich jak wirusy HIV, HBV i HCV, który musi być zbadany dla każdej próbki krwi w bankach krwi.

Anality są wiązane przez swoistych partnerów wiążących. W zależności od analitu można wybrać swoistych partnerów wiążących. Do oznaczania analitu-kwasu nukleinowego można zastosować sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do analitu jako specyficzną sondę.

Kwas nukleinowy-analit jest zwykle przeprowadzony w dostępną postać przez obróbkę wyjściowej próbki jedną z rozmaitych metod. Obejmuje to, na przykład, zmianę pH (alkaliczne, ogrzewanie, zmiany cykliczne temperatury (zamrażanie/rozmrażanie), zmianę fizjologicznych warunków wzrostu, zastosowanie detergentów, soli chaotropowych lub enzymów (na przykład proteaz albo lipaz), samych albo w kombinacji. Na przykład, można użyć magnetycznych, szklanych kulek, które mają zdolność do wiązania się z kwasem nukleinowym w specyficznych warunkach. Odpowiednie cząstki i protokoł y są opisane w WO 96/41811 i WO 01/37291.

Ważny jest wybór warunków reakcji, które promują swoiste wiązanie partnerów wiążących z analitami, co umożliwia pojawienie się swoistych kompleksów wiążących, ale minimalizuje wiązanie partnerów wiążących z nie spokrewnionymi składnikami mieszanin reakcyjnych i próbek, prowadząc do zwiększonego sygnału tła. Takie warunki reakcji i odpowiednie protokoły są znane w tej dziedzinie.

Korzystnie, swoistym kwasem nukleinowym - partnerem wiążącym, zwanym również sondą, do oznaczania kwasu nukleinowego-analitu albo amplifikowanego kwasu nukleinowego-analitu jest oligonukleotyd, ale można również zastosować analogi mające, na przykład szkielet peptydowy zamiast naturalnego szkieletu fosforanowo-cukrowego (PNA, WO 92/20702). W celu umożliwienia swoistego wiązania sondy z analitem sondy korzystnie są dłuższe niż 10 nukleotydów, a nawet bardziej korzystnie, mają długość 10 do 40 nukleotydów. Wymagane jest ponadto, żeby sonda była dostatecznie komplementarna do sekwencji analitu. A zatem korzystnie, sondy są komplementarne co najmniej w 80%, korzystniej, komplementarne co najmniej w 90%. W najbardziej korzystnym przypadku sondy są w pełni komplementarne do analitu. Dokładne określenie komplementarności i homologii można ustalić przy użyciu programów komputerowych, takich jak FastA (Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom. 85, str. 2444-2448 (88)).

W celu oznaczenia kwasu nukleinowego-analitu przeprowadza się jego amplifikację wykorzystując metodę PGR w czasie rzeczywistym. Jest to metoda oparta na starterze.

Starter to cząsteczka podlegająca wydłużaniu albo modyfikowaniu, korzystnie przez enzymy, korzystniej przez polimerazę, na przykład pochodzenia prokariotycznego, gdy hybrydyzuje z kwasem nukleinowym-matrycą. Gdy stosuje się metodologię PGR, korzystne są termostabilne polimerazy, takie jak polimerazy DNA T. aguaticus lub T. thermophilus. Wydłużają one startery przez dodawanie jednostek mononukleotydowych z monodeoksyrybonukleozydotrifosforanów do końca 3'-OH tych starterów. Całkowita długość i sekwencja zasad startera jest dyktowana wymaganą specyficznością reakcji amplifikacji. Korzystnie długości starterów do przeprowadzania PGR wynoszą od 10 to 40, korzystnie od 15 do 30 podjednostek zawierających zasady, wybranych spośród mononukleotydów i/lub monomerów analogów kwasu nukleinowego. Na ogół, startery o tej długości są również przydatne do innych metod amplifikacji. Jeżeli do amplifikacji stosowany jest więcej niż jeden starter, na przykład, gdy stosuje się PGR albo amplifikuje się różnorodne docelowe kwasy nukleinowe w jednej reakcji, korzystnie stosuje się startery, które nie mogą hybrydyzować jeden z drugim, ponieważ nie zawierają żadnego ciągu więcej niż 5 następujących po sobie komplementarnych zasad.

Znaczniki są na ogół znane specjalistom w tej dziedzinie jako grupa, która jest wykrywalna albo można sprawić, aby była wykrywalna do oznaczenia obecności analitu. Dobrze znanymi znacznikami są znaczniki fluorescencyjne, takie jak chelaty fluoresceiny i lantanowców, znaczniki elektrochemiluminescencyjne, takie jak kompleksy rutenu, albo reszty, które mogą być rozpoznawane przez inną cząsteczkę, takie jak hapteny, które mogą być rozpoznawane przez przeciwciało wzbudzone przeciwko temu haptenowi, albo cząstki, które można immobilizować, takie jak biotyna, która może wiązać się, na przykład, z fazą stałą powleczoną streptawidyną, taką jak kulki albo probówki. Najkorzystniejszymi znacznikami, szczególnie w odniesieniu do formatów homogennych, są chromofory. Takie chromofory można stosować same albo w kombinacji z innym chromoforem albo na przykład z nie fluorescencyjnym wygaszaczem.

W przypadku, gdy stosowane są tryby homogennego wykrywania, a w szczególności do oznaczania kwasów nukleinowych-analitów znanych jest w tej dziedzinie kilka metod. Metoda, taka jak test TaqMan (opisy patentowe USA nr 5 210 015 i nr 5 487 972) oraz test „kissling probe” są oparte na

PL 210 867 B1 przeniesieniu energii fluorescencyjnej z barwników fluorescencyjnych (FET, Styer i Haughland Proc. Natl. Acad. Sci. USA tom 98, str. 719-(67)). Po znalezieniu się w bliskim sąsiedztwie, pierwszy fluorofor może oddziaływać z drugim fluoroforem albo nie fluorescencyjnym wygaszaczem. Na przykład, emisja elektromagnetyczna albo wibracyjne wzbudzenie pierwszego barwnika fluorescencyjnego może indukować rezonans w drugim barwniku fluoresecencyjnym. W zależności od zastosowanego trybu, można, na przykład, wykrywać zmniejszoną emisję światła pierwszego barwnika fluorescencyjnego albo zwiększoną emisję światła drugiego barwnika fluorescencyjnego jako oznakę obecności analitu. Kombinacje barwników fluorescencyjnych, które można do tego celu stosować są znane w tej dziedzinie. Przykładami są klasyczne barwniki odpowiednie do przeniesienia energii rezonansu typu

Forster (ang. Forster-type Resonance Energy Transfer), takie jak pentametynoindodikarbocyjanina (Cy5) w kombinacji z 6-karboksyfluoresceiną (6-FAM).

Znacznik w tym kontekście oznacza cząstkę generującą sygnał, która jest właściwie wykrywana w sposobie według niniejszego wynalazku. W odniesieniu do opisywanych homogennych trybów, stosuje się parę fluorochromów, które wchodzą wzajemnie w rezonans i które wykrywa się w tych metodach jako pojedynczy wykrywany sygnał. Chociaż uczestniczą w tym dwie odrębne cząsteczki, na przykład dwa fluorochromy, działają one jako jeden pojedynczy znacznik. Dodatkowo, termin znacznik należy rozumieć jako mogący oznaczać również, że więcej niż jedna cząsteczka różnego znacznika jest połączona z cząsteczką partnera wiążącego.

W zależności od użytych znaczników należy stosować różne detektory do mierzenia sygnałów znaczników. Poza innymi, w tym celu są szeroko stosowane zwłaszcza fluorymetry. Znakowanie fluorescencyjne jest najbardziej korzystne w połączeniu z homogennym PCR, ponieważ dla wytworzenia sygnału nie trzeba dodawać żadnych chemicznych „włączników”, w odróżnieniu od technik znakowania enzymatycznego lub chemiluminescencyjnego. Umożliwia to zastosowanie procedury zamkniętej probówki, najbardziej wydajnego sposobu uniknięcia wzajemnych zanieczyszczeń amplifikowanym materiałem. Gdy określa się sygnały od wielu znaczników, ważne jest, aby sygnały te były od siebie odróżnialne. W celu uniknięcia takiego nakładania się na siebie, korzystne jest przy stosowaniu znaczników optycznych, aby każdy znacznik miał różne spektrum emisji i/lub ekstynkcji. Jednak, gdy stosuje się większość dostępnych handlowo znaczników w teście wykrywania wielu znaczników nie można uniknąć co najmniej jednego z takich nałożeń. Gdy oznacza się jedynie kilka analitów, to nadkładanie się można skompensować przez obróbkę mierzonych sygnałów przy użyciu programów komputerowych albo stosując bardziej kosztowne fluorymetry spektralne zamiast fluorymetrów opartych na filtrach. Odnośnie do trybów homogennych, a w szczególności, gdy stosuje się metody oparte na przeniesieniu energii fluorescencji, konieczność stosowania dodatkowych chromoforów nawet zwiększa możliwości zakłóceń. A zatem, w rzeczywistości liczba odpowiednich znaczników, które można zastosować razem w złożonym teście jest ograniczona.

Według niniejszego wynalazku co najmniej jeden ze stosowanych partnerów wiążących jest połączony z kombinacją wykrywalnych znaczników, gdzie każda z tych z cząsteczek partnerów wiążących jest połączona tylko z jednym wykrywalnym znacznikiem. W przeciwieństwie do tego sondy opisane przez Samiotaki i wsp. (jak wyżej) są wyznakowane wieloma znacznikami (np. 10-20 na oligonukleotyd, przyłączonymi na końcu 5'). Z powodu bliskości wykrywalnych znaczników przyłączonych do tej samej cząsteczki sondy, ryzyko oddziaływań między znacznikami jest bardzo wysokie i nie wszystkie typy znaczników, a w szczególności barwników fluorescencyjnych mogą być stosowane.

Sposoby według niniejszego wynalazku można zastosować do określania zwiększonej liczby analitów w złożonym teście i są one kompatybilne z szerokim zakresem znaczników.

Przez zmniejszanie liczby znaczników niezbędnych w złożonym teście unika się potrzeby niekonwencjonalnych znaczników, a także można zastosować tańsze detektory, takie jak fluorymetry oparte na filtrach zamiast fluorymetrów spektralnych, które są znacznie droższe. To umożliwia ponadto zastosowanie homogennych trybów, które są wyjątkowo ważne w przypadku handlowych testów diagnostycznych ze względu na ograniczone ryzyko zanieczyszczania i mniej etapów postępowania.

Jak wskazano powyżej, trzy znaczniki połączone w różne kombinacje można łączyć aż z siedmioma różnymi swoistymi partnerami wiążącymi, co umożliwia odrębne oznaczenie sześciu różnych analitów. Jest to pokazane w tabeli poniżej. P oznacza Parametr = analit, kanał odpowiada szlakowi optycznemu jako części detektora zoptymalizowanego do wyłapania sygnału konkretnego wykrywalnego znacznika. Tabela pokazuje oczekiwany procentowy rozkład sygnału we wszystkich trzech kanałach, znormalizowany bądź chemicznie bądź matematycznie. Brany jest pod uwagę przypadek, gdy anality od P1 do P7 są obecne w próbce tylko jeden raz. Znakowanie różnych partnerów wiążących

PL 210 867 B1 jest następujące: typ P1 - znacznik 1 (sygnał w kanale 1, P2 - znacznik 2 (sygnał w kanale 2), P3 - znacznik 3 (sygnał w kanale 3), P4 - połowa ilości znacznika 1, połowa ilości znacznika 2, P5 - połowa ilości znacznika 1, połowa ilości znacznika 3, P6 - połowa ilości znacznika 2, połowa ilości znacznika 3 i P7 - 1/3 ilości znacznika 1, 1/3 ilości znacznika 2, 1/3 ilości znacznika 3.

Parametr	Kanał
1	2	3
P1	100
P2		100
P3			100
P4	50	50
P5	50		50
P6		50	50
P7	33	33	33

Jeżeli sygnał można zmierzyć jedynie w jednym kanale, podana jest wyraźna wskazówka na obecność jednego analitu o parametrze 1, 2 lub 3 (patrz tabela). Jeżeli sygnały występują w dwóch kanałach w proporcji 50:50, istnieje mocne wskazanie na analit o parametrze 4, 5 lub 6, jak wskazano w tabeli. Stosunek sygnału 33:33:33 wskazywałby, ż e w próbce obecny jest analit P1. Jednak odzwierciedla to sytuację wyidealizowaną. Rzeczywiste sygnały mogą wykazywać odchylenia i często muszą być normalizowane w celu skompensowania, na przykład różnych wydajności wykrywania znaczników, tła i nakładania się sygnałów.

Różne znaczniki połączone z partnerami wiążącymi nie powinny zmieniać wydajności wiązania partnera wiążącego, co mogłoby być również dopasowywane przez zmienianie stosunków partner wiążący związany z pierwszym znacznikiem : partner wiążący związany z drugim znacznikiem. Również różne wydajności wykrywania można dopasowywać w ten sposób.

Stosunek sygnału 50:50 mógłby także wystąpić w przypadku obecności dwóch analitów. Jednak byłoby to prawdopodobnie wyjątkowo rzadkie, ponieważ ich wystąpienie byłoby zależne albo od koinfekcji 1:1 w rozumieniu liczby wyjściowych cząsteczek i identycznych wydajności ekstrakcji/powielania/wykrywania dających rozkład sygnału 50:50 w 2 kanałach, albo od różnej liczby wyjściowych cząsteczek w połączeniu z wydajnościami ekstrakcji/powielania/wykrywania, które precyzyjne wyrównują różnicę w mianie i znowu dają rozkład 50:50. Zatem, konfekcja 2 parametrami wskazana przez pojedynczo znakowaną sondę, np. odpowiednio P1 i P2, powinna dawać nierówny rozkład »50:«50:0 lub «50:»50:0, a zatem być odróżnialna np. od. P4 wskazanego przez rozkład 50:50:0. Jednak, takie wyniki mogłyby również pochodzić z próbek koinfekowanych dwoma czynnikami, na przykład P4 i P1.

W celu dalszego zmniejszenia ryzyka niejednoznacznych wyników i moż liwych błędów w interpretacji mierzonych sygnałów, możliwa jest aranżacja parametrów w taki sposób, żeby sygnały występujące w dwóch lub większej liczbie kanałów można było wyraźnie przypisać jedynemu możliwemu rozkładowi analitu w próbce, jak wyjaśniono w przykładzie 1. Ponadto, można przeprowadzić dodatkowe oznaczenie testujące w szczególności pozostałe możliwe rozkłady analitu, który może być obecny w próbce. Taki sekwencyjny sposób jest bardzo ekonomiczny, ponieważ umożliwia oznaczenie rozkładu danego analitu w większości próbek w pierwszym etapie, natomiast dwuznaczne próbki mogą być ponownie oceniane w drugim etapie z zastosowaniem, na przykład, testu dla wielu analitów ze zmniejszoną liczbą analitów (dla którego będzie możliwa kombinacja jeden niedwuznaczny znacznik-jeden partner wiążący). Ponadto, dla analitów-kwasów nukleinowych i powielanych kwasów nukleinowych można, na przykład, wyznaczyć krzywą topnienia kompleksów hybrydyzacyjnych analit-sonda albo amplifikowany kwas nukleinowy, co umożliwia rozróżnienie między różnymi analitami i uzyskanie jednoznacznego wyniku.

Do przeprowadzenia sposobów według wynalazku mogą służyć zestawy, które zawierają w jednym lub więcej pojemnikach pierwszego partnera wiążącego swoistego dla pierwszego analitu połączonego z pierwszym znacznikiem, drugiego partnera wiążącego swoistego dla drugiego analitu połączonego z drugim znacznikiem, który jest wykrywalny osobno względem znacznika połączonego z ta10

PL 210 867 B1 kim pierwszym partnerem wiążącym, trzeciego partnera wiążącego swoistego dla trzeciego analitu, gdzie pierwsza ilość trzeciego partnera wiążącego jest połączona z tym samym znacznikiem, co połączony z pierwszym partnerem wiążącym, a druga ilość trzeciego partnera wiążącego jest połączona z tym samym znacznikiem, co drugi partner wiążący i pierwsza ilość trzeciego partnera wiążącego nie jest połączona z tym samym znacznikiem, co połączony z drugim partnerem wiążącym, a druga ilość trzeciego partnera wiążącego nie jest połączona z tym samym znacznikiem, co połączona z pierwszym partnerem wiążącym.

Dodatkowo, takie zestawy mogą zawierać środki do swoistego wiązania partnerów wiążących ze swoimi analitami, które mogą obejmować bufory, odczynniki buforujące i inne składniki reakcji znane w tej dziedzinie.

Zestawy do oznaczenia analitów-kwasów nukleinowych mogą również zawierać składniki mieszaniny reakcyjnej do metod amplifikacji kwasów nukleinowych, jak opisano powyżej. Zestaw do reakcji PCR powinien, na przykład, zawierać polimerazę, bufory, trifosforany nukleotydów i/lub startery.

Niniejszy wynalazek jest zilustrowany następującymi przykładami.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Wielobarwną analizę według niniejszego wynalazku można wykonać przy użyciu technologii amplifikacji/wykrywania Roche Cobas Taqman i technologii oznaczeń przy użyciu 5'-nukleazy (EP nr 0 543 942 i US nr 5 210 015) opartej na „klasycznych” związkach fluorochromowych i „klasycznych” zasadach przekazywania energii w rezonansie.

Przyrząd Roche Cobas Taqman jest wyposażony w 4 pary filtrów (zobacz także EP nr 0 953 379, EP nr 0 953 837, US nr 6 134 000 i US nr 6 084 669). Przypuszczalny zestaw składników mógłby składać się z 4 związków reporterowych, a najczęściej 1 lub 2, ewentualnie nie fluorescencyjnych substancji wygaszających. Związki-kandydaci, którzy obejmują zakres widma wyznaczany przez detektor Cobas Taqman, tj. ok. 420 nm - ok. 710 nm, mogą obejmować:

- w przypadku substancji wygaszających (Q) barwniki o szerokopasmowym zakresie absorpcji w czerwieni, na przykł ad barwniki polimetynocyjaninowe (np. n = 5, tj. 4 sprzężone ugrupowania olefinowe tworzące strukturę mezomeryczną) lub pochodne rodaminy przyłączone symetrycznie na obu końcach w postaci fuzji do nienasyconych ugrupowań N-heterocyklicznych, które wchodzą w skład sprzężonego układu π-ε^(-), równie korzystnie, jak nie fluorescencyjne pochodne nitrofenolowe;

- w przypadku związków reporterowych (R) cząsteczki barwników fluorescencyjnych, takich jak barwniki kumarynowe, barwniki typu fluoresceiny, takie jak FAM lub pochodne chlorowane, barwniki typu rodaminy, oksazyny lub związki typu „bodipy”. Trzy z nich byłyby przeznaczone do wyznaczania parametrów docelowych cząsteczek, jeden do monitorowania IC.

Ogólne wymagania odnoszące się do możliwych do zastosowania barwników obejmują: dobrą stabilność chemiczną w roztworze podstawowym, a także na poziomie stosowania jako składników właściwych mieszanin odczynników; stabilne przy ekspozycji na światło dzienne podczas syntezy, oczyszczania i wytwarzania zestawu; stabilne przy ekspozycji na wielokrotne cykle podgrzewania/ochładzania (np. n = 60) w technice PCR; wystarczające pokrywanie się widma i wydajny transfer energii między odpowiednimi parami RQ rezonansu; wysokie współczynniki ekstynkcji (tj. absorpcyjność), a zwłaszcza w przypadku związków reporterowych, wysoka wydajność kwantowa w roztworach wodnych i w zakresie pH zastosowanym w Taqman-PCR (np. pH 7-8,5).

Nowy pomysł umożliwia mierzenie rozkładu znormalizowanych sygnałów po odjęciu tła i zakłóceń 3 barwników reporterowych i ich podwójnych kombinacji w 3 odpowiadających im kanałach optycznych przyrządu Cobas Taqman zamiast posiadania ustalonego oznaczenia konkretnego barwnika, reprezentującego konkretny parametr testu i odpowiadającego mu kanału. Zasada ta zapewniłaby pełne rozdzielenie (przez związki reporterowe R1, R2, R3, R1 + 2, R1 + 3, R2 + 3) pozytywnych wyników otrzymanych z zastosowaniem 6-parametrowego oznaczenia złożonego, mimo maksymalnego skomplikowania układu.

Teoretycznie, w przypadkach zastosowania pojedynczego znakowania 100% odpowiednich przetworzonych sygnałów znajduje się w danym kanale; w przypadkach zastosowania podwójnego znakowania przetworzone sygnały byłyby równo rozłożone na 2 odpowiednie kanały (50% + 50%).

Odróżnienia pul pozytywnych/negatywnych można by dokonać w oparciu o zoptymalizowany algorytm do określania cykli progowych (wartości ct, tj. takiego punktu na współrzędnej reakcji, gdzie intensywność sygnału fluorescencyjnego rośnie znacząco powyżej poziomu tła), przedstawiający profil nachylenia krzywych sygnału względem czasu.

PL 210 867 B1

Rozróżnienia rodzaju infekcji (parametr testu, tj. rodzaj patogenu, dający w wyniku wykrywalny produkt) można by dokonać przez analizę specyficznych dla kanału udziałów w całkowitym polu pod krzywymi sygnał/czas (AUC) lub w całkowitej intensywności znormalizowanego sygnału plateau. Nie ma stałej korelacji dawka-odpowiedź dla kryteriów takich jak te, które jednak nie obowiązują dla oznaczeń jakościowych potrzebnych w trakcie testów przesiewowych krwi.

Odpowiednie 6-parametrowe (P1 do P6) oznaczenie złożone mogłoby zawierać następujące sondy (Q = substancja wygaszająca, R = związek reporterowy i Ni = jeden z czterech nukleotydów):

parametr 1 - sonda = 5'Q-(Nj)_g-R1-(Nj)_h-3-PO4 + 5 ' Q-(Ni)_g-R2-(Nj)_h-3'-PO4: 5 pmol każdy//100 μΐ mieszaniny reakcyjnej;

parametr 2 - sonda = 5'Q-(N_i)_a-R1-(N_i)_b-3'-PO4: 10 pmol/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej; parametr 3 - sonda = 5'Q-(N_i)_c-R2-(N_i)_d-3'-PO4: 10 pmol/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej; parametr 4 - sonda = 5'Q-(N_i)_e-R3-(N_i)_r3'-PO4: 10 pmol/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej; parametr 5 - sonda = 5'Q-(N_i)_k-R1-(N_i)_i-3'-PO4 + 5'Q-(N_i)_k-R3-(N_i)_i-3'-PO4: 5 pmol każdy/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej;

parametr 6 - sonda = 5'Q-(N_i)_n-R2-(N_i)_n-3'-PO4 + 5'Q-( N_i)_k-R3-(N_i)_i-3'-PO4: 5 pmol każdy/100 μΐ mieszaniny reakcyjnej.

Innymi słowy:

- w przypadkach 2-4 około 1 * 6¹² cząsteczek jednakowo wyznakowanej sondy na parametr (taki sam oligonukleotyd/taki sam związek reporterowy) byłoby wprowadzonych do reakcji PCR;

- w przypadkach 1, 5 i 6 znowu około 1 * 6¹² cząsteczek wyznakowanej sondy na parametr byłoby wprowadzonych do PCR, ok. ½ * 6¹² cząsteczek z jednym rodzajem znacznika i ok. ½ * 6¹² cząsteczek z innym rodzajem znacznika (ten sam oligonukleotyd/różne związki reporterowe), które byłyby zużywane w sposób statystycznie wyrównany;

- we wszystkich przypadkach dostępne byłoby 10 pmoH sondy swoistej dte parametru.

Biorąc pod uwagę ryzyko dwuznacznych wyników i skupiając się na zastosowaniu ty^o pojedynczych znaczników i podwójnych kombinacji, można argumentować, że dwuznaczne wyniki byłyby prawdopodobnie niezwykte rzadkie w przypadku koinfekcji 2 parametrami wskazywanymi przez pojedynczo wyznakowaną sondę, odpowiednio, np. P2 <=> R1 + P4 <=> R3. Prawdopodobieństwo koinfekcji 1:1 pod wzg^dem Nczby wyjściowych cząsteczek i identycznych wydajności ekstrakcji/ampNfikacji/wykrywania dających w wyniku rozkład sygnału 50:50 dte 2 kanałów, ano różnych Hczb wyjściowych cząsteczek w połączeniu z wydajnościami ekstrakcji/ampNfikacji/wykrywania, które dokładnie równoważą różnice w mianach i dają ponownie rozkład 50:50, jest uważane za nieistotnie niskie. Zatem, w wyniku powstałby nierówny rozkład > (>) 50: < (<) 50:0 ^b < (<) 50: > (>) 500 (przypadek I) i można byłoby go odróżnić od np. P5 <=> R1R3 wskazanego przez równomierny rozkład 50:0:50.

Koinfekcja 2 parametrami wskazanymi przez mieszaniny 1:1 2 podwójnie znakowanych sond (przypadek II), np. PI <=> R1R2 i P5 <=> R1R3, zawsze powinna być oczywista dzięki rozkładowi sygnału do trzech kanałów (np. około 50:25:25, zakładając porównywane wydajności ekstrakcji/ampNfikacji/wykrywania).

Koinfekcja 2 parametrami, jednym reprezentowanym przez jeden związek reporterowy i innym przez dwa, powinna być rozpoznana dzięki rozkładowi sygnału do trzech kanałów ~ 33:33:33 (przypadek III, np. R1R2 + R3) ^b dawać w wyniku wzór ~ 75: ~ 25:0 (przypadek IV, np. R1R2 + R1), znów zakładając porównywane wydajności ekstrakcji/ampNfikacji/wykrywania. W przypadku II i III cechą wspóną byłby fakt, że nie ma żadnego kanału optycznego związanego z cetem z zasadniczo „zerowym sygnałem”.

Innymi słowy, ważne będzie rozróżnienie progu „zero + x” od „prawdziwego zera”. W przypadku IV, prawdopodobnie najbardziej krytycznym, rozstrzygnięcie zateży od całkowitej wydajności oznaczenia, która okreśn, czy otrzymany rozkład zasadniczo różni się sytuacji 50:50, czy nie. Najprawdopodobniej nateży wziąć pod uwagę dodatkowe kryteria matematyczne w cen wyjaśnienia dwuznaczności, szczegónie tego drugiego typu.

Korzystnie, reakcja PCR w czasie rzeczywistym Taqman oferuje takie „obNczenia pomocnicze”. Nieco bardziej szczegółowo zajęto się tym tematem poniżej.

Rzadkie występowanie dwuznaczności, tj. przypadek rozkładu sygnału 50:50 pojawiający się w przypadku koinfekcji, można jeszcze zminimaNzować przez przypisanie niezwykte rzadko znajdowanych i mniej wydajnie namnożonych parametrów do pojedynczo wyznakowanych sond, co można uzupełnić rozważeniem rozkładów geograficznych.

PL 210 867 B1

Przypuszczalne oznaczenie związków reporterowych (R = znacznik) i testy na oznaczanie HIV-1-M, HIV-1-0, HIV-2, HCV, HBV i HAV mogłyby wyglądać następująco:

P1 <=> HIV-1-M <=> R1/R2 wydajność amplifikacji i wykrywania wysoka

P2 <=> HIV-1-0 <=> R1 niska P3 <=> HIV-2 <=> R2 niska P4 <=> HCV <=> R3 wysoka

P5 <=> HBV <=> R1/R3 wysoka

P6 <=> HAV <=> R2/R3 średnia

IC (kontrola wewnętrzna) <=> R4

Ze względów bezpieczeństwa, a zwłaszcza odnośnie do testów handlowych można także dodać kontrolę wewnętrzną, którą, na przykład, można wykryć sondą sprzężoną z czwartym znacznikiem (R4).

A więc, koinfekcje HIV-1-0 i HIV-2 powinny być bardzo mało prawdopodobne, ponieważ obie są bardzo rzadkie i geograficznie dobrze rozdzielone (co jednak może się zmienić z upływem lat) i ogólny wynik byłby „pozytywny względem HIV” nawet w przypadku takiego nieoczekiwanego zdarzenia.

Z drugiej strony, koinfekcje HIV-1-0 i HCV lub HIV-2 i HCV nie powinny mieć miejsca nawet w przypadku rozkładu 50:0:50 lub 0:50:50, biorąc pod uwagę bieżące wydajnoś ci amplifikacji (niskie dla HIV-1-0 i HIV-2) i nie powinny być mylone z pojedynczymi infekcjami, odpowiednio, HBV i HAV. Zatem, możliwe jest zastosowanie standardowego czterokanałowego fluorymetru do przeprowadzenia sześcioparametrowego oznaczenia obejmującego kontrolę wewnętrzną, oznaczaną osobno, który jest, na przykład, zastosowany w przyrządzie Roche Cobas TaqMan.

Zatem, pomysł ten całkowitego rozdzielenia 6-parametrowego oznaczenia złożonego ze względu na oznaczany parametr wymagałby niewielkich dodatkowych wysiłków w porównaniu z obecnym układem chemicznym i oprzyrządowaniem.

Podobnie, wymagania ze względu na bardziej wyszukane oprogramowanie analityczne nie są bardzo wysokie, jak to pokazano w rozważaniach przedstawionych poniżej.

Bardziej szczegółowo będzie to obejmowało:

- podwójne rejestrowanie logistyczne dla 3 sond (ten sam oligonukleotyd, róż ne znaczniki fluorescencyjne) wystandaryzowaną procedurę do ustalania sygnałów wyjściowych dla poszczególnych związków reporterowych od pojedynczo znakowanych sond i opracowanie czynników normalizacyjnych (biorąc pod uwagę wpływ otoczenia sekwencji w odpowiednich oligonukleotydach, stopień oczyszczenia wskazany przez np. stosunki Em(R/Q), zawartość energii zależnej od długości fali i czułość spektralną CTM ASICS);

- opracowanie najbardziej niezawodnego kryterium lub zestawu kryteriów dla wartoś ci wyjś ciowych, które byłyby przyjmowane za wartość 100%, określenie wariancji wzorów rozkładu i ustalenie granic zakresu akceptacji dla wartości oczekiwanych;

- opracowanie algorytmu oprogramowania do analizy rozkł adu poprawionych znormalizowanych sygnałów w 3 kanałach analizowanych, który uwzględniałby wszystkie wyżej wymienione parametry.

P r z y k ł a d 2

Odnośnie do protokołu oznaczenia dla zautomatyzowanych urządzeń do testów, takich jak przyrząd Roche Cobas TaqMan™, podany jest poniżej odpowiedni schemat procesu (zobacz także figura 1).

Dostępność podanych nowych odczynników, zbieranie zasadniczych danych i schemat przetwarzania danych w zautomatyzowanym teście mogłyby wyglądać następująco:

- zbieranie danych:

1. zakłócenia średniej (= szum od przyrządu)

2. przesuwanie się zera (= mnożnik poprawkowy zerowania jako f(t))

3. mnożniki poprawkowe wzajemnych oddziaływań i wstępnych ustawień

4. mnożniki normalizacyjne sygnału wyjściowego dla związków reporterowych (= wstępnie zadane mnożniki korygujące wydajność kwantową, efekty mikrośrodowiskowe, czułość spektralną,...)

5. intensywność tła (= szum chemiczny, BG nagromadzony od wszystkich sond zawartych w mieszaninie)

6. zmierzony całkowity sygnał względem czasu TFI status:

DM już wykonane DD już wykonane XT już wykonane

NFRi dodatkowe już wykonane już wykonane

PL 210 867 B1

Korzystnie, wszystkie etapy wykonuje się w przyrządzie Gobas Taqman oddzielnie dla kanałów optycznych 1, 2, 3 i 4.

- przetwarzanie danych:

1) dla każdego kanału i jako wykres sygnału względem czasu, {TFIf(t) - {(DM * DDf(t) + BG)} * XT * NF_R1 = NFI zostaje obliczony, tj. specyficzne dla kanału znormalizowane poprawione intensywności fluorescencji;

2) jeżeli kanały 1, 2, 3 odpowiadają barwnikom reporterowym, a kanał 4 barwnikowi IC, wtedy NFI4 = 100% intensywności odpowiedzi IC, NFI1+2+3 = 100% intensywności odpowiedzi analizowanej cząsteczki;

3) które należy analizować pod względem podziału między te kanały, tj. x% w kanale 1, y% w kanale 2 i z% w kanale 3.

Otrzymane liczby rozkładu sygnału są następnie porównywane z wcześniej obliczonymi wartościami podanymi powyżej, a rodzaj wykrywanego patogenu dedukuje się z korelacji wzmocnienia specyficznego dla kanału optycznego i odpowiednich barwników reporterowych oraz dodatkowych czynników.

Zatem, innymi słowy, oznaczenie nie jest wykalibrowane ze względu na stężenie analizowanej cząsteczki (tj. jest wciąż jakościowym testem przesiewowym, dającym w rezultacie wynik pozytywny/negatywny, odpowiedni w np. zastosowaniach przesiewowych w bankach krwi), ale ze względu na sygnał wyjściowy sond specyficznych dla parametru przy danym stężeniu (w celu zidentyfikowania przyczyny wyniku pozytywnego wielokrotnej amplifikacji).

Analiza pojedynczej próbki mogłaby przebiegać, jak to pokazano na figurze 1.

Aby zrozumieć logikę tego algorytmu przetwarzania, rozważmy zasady stanowiące podstawę oznaczenia.

W technologii nukleazy 5' (PCR Taqman, korzystne wykonanie dla przedstawianego tutaj wynalazku) reakcje, odpowiednio, amplifikacji i wykrywania ściśle się przeplatają. W tym celu do mieszaniny do PCR dodaje się sondy do wykrywania z 2 określonymi chemicznymi modyfikacjami.

Jedną z tych modyfikacji jest fluorogenna grupa reporterowa (R, na przykład pochodna 6-karboksyfluoresceiny) kowalencyjnie przyłączona do szkieletu sondy, drugą jest barwnik (na przykład pochodna polimetynocyjaniny) zdolny do absorbowania światła fluorescencyjnego związku reporterowego i wygaszania go (substancja wygaszająca, Q). Substancja wygaszająca jest typowo przyłączona do szkieletu sondy na końcu 5', podczas gdy związek reporterowy jest umiejscowiony w obrębie sekwencji oligonukleotydowej, oddzielony od substancji wygaszającej pewną liczbą bloków nukleotydowych. Sondy wiążą się z kwasami nukleinowymi analizowanych cząsteczek (nici sensownej lub antysensownej) w pobliżu końca 3' startera (prawego lub lewego). Jak tylko starter przyłączy się do cząsteczki analizowanej i polimeraza DNA zwiąże się z hybrydą starter:cząsteczka analizowana, rozpoczyna się wydłużanie. Dzięki aktywności 5'-nukleolitycznej enzymu równocześnie z syntezą nowej nici, gdy tylko polimeraza dotrze do miejsca wiązania sondy, sonda jest odcinana, związek reporterowy i substancja wygaszająca zostają rozdzielone, a sygnał fluorescencyjny staje się mierzalny. Proces ten jest powtarzany przy każdym cyklu i coraz więcej fluorescencyjnego związku reporterowego gromadzi się w roztworze, dopóki nie wyczerpią się odczynniki na końcu reakcji. Zatem, na wykresie sygnału względem czasu tworzone są sigmoidalne krzywe wzrostu. Punkt na osi czasu, w którym względną intensywność fluorescencji (AFI, ang. arbitrary fluorescent intensity), nazywaną także względnymi jednostkami światła, RLU (ang. relative light units) można wyraźnie odróżnić od sygnału tła, nazywany jest cyklem progowym (ct). ct jest miarą stężenia analitu: im mniejsza wartość ct, tym większa liczba wyjściowych cząsteczek i/lub lepsza wydajność ekstrakcji lub amplifikacji/wykrywania. Wartości ct można obliczyć przy użyciu różnych matematycznych operacji. Na przykład, można zastosować podejścia linii granicznej (średnia intensywność sygnału tła pomnożona przez stały czynnik daje w wyniku graniczną intensywność sygnału do odróżnienia wyników negatywnych od pozytywnych) lub podejścia, gdzie określa się umiejscowienie maksimum pierwszej lub drugiej pochodnej krzywej sygnału względem czasu (tj. profil stromości lub nachylenia) po dopasowaniu krzywej. Podejście związane z profilem nachylenia jest, w przeciwieństwie do podejścia związanego z sygnałem progowym, zasadniczo niezależne od poziomu intensywności tła, a zatem wysoce atrakcyjne w oznaczeniach złożonych z nagromadzonym tłem od wszystkich sond obecnych w mieszaninie reakcyjnej.

W oparciu o te zasady i zgodnie ze schematem przetwarzania opisanym poniżej można byłoby zastosować inne środki do wytwarzania wyniku pierwszorzędowego (tj. pozytywny lub negatywny ?) i wyniku drugorzędowego (tj., który rodzaj infekcji czyni próbkę pozytywną ?).

PL 210 867 B1

W porównaniu z wykonywaniem oznaczenia złożonego z jednym wspóteym znacznikiem, istnieje potencjatea możNwość utraty czułości ze wzg^du na rozcieńczenie sygnału w kUku kanałach optycznych, a zatem zmniejszone specyficzne krzywe wzrostu sygnału w poszczegóteych kanałach. Dtetego, w cen wytworzenia wyniku pierwszorzędowego można byłoby ewentuateie pracować ze złożonymi krzywymi sygnału wzg^dem czasu. Tym sposobem, cała wydajność specyficznego sygnału jest zawarta w jednej krzywej sygnału wzg^dem czasu, która następnie jest używana do okreśtenia cykte progowego (ct) i zasadniczego statusu próbki (pozytywna/negatywna). Przy stosowaniu podejścia związanego z profitem nachytenia dodatkowa intensywność tła nie będzie przeszkodą i można by wykorzystać potencjateą zatetę odczytu fizycznego charakterystyk wyraźnie zaznaczonej krzywej wzrostu wzmocnienia specyficznego sygnału.

Z drugiej strony, przy wytwarzaniu wyników drugorzędowych można byłoby się odnieść do specyficznego wzg^dem kanału rozkładu znormaNzowanego sygnału (intensywności NFI) i wydedukować rodzaj infekcji przez porównanie otrzymanych wzorów rozkładu z wcześniej obNczoną macierzą wzorów podanych powyżej. Dodatkowo oraz w cete zwiększenia zdoteości rozróżniania można także rozważać nieznormaNzowane intensywności specyficznego sygnału dte anaNzy rozkładów sygnału znormaNzowanego ok. 50: ok. 50 ^b ok. 75: ok. 25, tj. tych naprawdę krytycznych.

- W przypadku pojedynczej infekcji, reprezentowanej przez mieszaninę sond 1:1 otrzymany stosunek nieznormaNzowanych, jednak ze skorygowanym tłem sygnałów R1/R2 byłby stały przez cały proces ampNfikacji/wykrywania, na przykład 40/50. Musi się to ściśte równać wartości czynnika normaNzacyjnego (0,80) otrzymanego przy równych iteściach oczyszczonych barwników, ponieważ obydwa rodzaje wyznakowanej sondy (ta sama sekwencja oNgonukteotydowa !) byłyby cięte z identyczną szybkością. Korekta tła (BG) jest konieczna, ponieważ w przypadku rozstrzygającego 6-parametrowego oznaczenia złożonego według przedstawionej tu zasady tło specyficzne dte każdego kanału powstaje z sygnału wyjściowego 3 różnych sond wyznakowanych tym samym znacznikiem. Dtetego intensywność BG jest nie ty^o funkcją właściwości optycznych znacznika, ate także cech struktural· nych sondy, tj. struktury Nniowej ^b spinki do włosów ^b (bardziej ogó^ie) stopnia komptementarności ze sobą, i temperatury podczas pomiarów, która wpływa na równowagę konformacyjną struktur drugorzędowych. Zatem, struktury drugorzędowe nie zhybrydyzowanej sondy muszą być brane pod uwagę ze wzg^du na intensywność BG, a pomocnicze obNczenia muszą być oparte na specyficznych intensywnościach fluorescencji, SFI, SFI = TFI_fffl- [(DM * DD_f(t) + BG] * XT_i = AFI - BG.

Przeciwnie, specyficzny sygnał jest tworzony przy użyciu aktywności 5'-nukteoNtycznej poNmerazy zateżnej od zasadniczo dokładnej hybrydyzacji sondy z cząsteczką anaNzowana, tj. Nnearyzacji oNgonukteotydu sondy, a zatem zasadniczo niezateżnej od struktury sondy. Odnosi się to także do skróconej sondy po odcięciu i dysocjacji od nici anaNzowanej spowodowanych równoczesnym spadkiem Tm (temperatury topnienia). Krótkie wewnętrzne hybrydy w pozostałym oNgomerze sondy nie powinny być stabNne w podwyższonych temperaturach stosowanych do przyłączania/wydłużania w reakcji PGR. Po normaNzacji, która kompensuje różnice w wydajności kwantowej ^b wrażNwości na wpływy rozpuszczateika, rozkład sygnału w kanate 1 i 2 wynosiłby 50:50. Znatezienie stosunków NFI oraz SFI takich, jak się oczekiwało, jest podwójnym dowodem na infekcję pojedynczą.

- W przypadku podwójnej infekcji, wskazanej przez specyficzne sondy wyznakowane odpowiednio R1 i R2 (przypadek I), bardzo prawdopodobne jest, że dynamika sygnału (tj. wzrost jako funkcja czasu) będzie różna dte dwóch różnych oznaczeń, bo ateo początkowe miano anaNtu, ateo całkowita wydajność oznaczenia, ateo obie będą prawdopodobnie różne. Zatem, oprócz prawdopodobieństwa sytuacji > 50: < 50 na poziomie NFI także stosunek SFI R1/R2 musi być różny dte dość wczesnych, środkowych i późnych faz reakcji, tj. stosunek SFI będzie zmienny. Stosunki będą miały pewien trend i będą się różniły od odpowiedniego czynnika normaNzacyjnego otrzymanego przy równych mieszaninach oczyszczonych barwników, korzystnie sprzężonych z sondą modetewą (w cete oceny nieuniknionych czynników mikrośrodowiskowych, np. sekwencji łączącej, ładunków tekateych), np. oHgonukteotydem T3-R-T16, który przez swoją konfigurację strukturateą nie zmienia sygnału wyjściowego.

- W przypadku podwójnej infekcji, reprezentowanej przez R1 + R1R2 (przypadek IV) i zasadniczo różnych całkowitych wydajnościach odzyskiwania d^ 2 oznaczeń w kanate 112 mógłby być obserwowany rozkład znormaNzowanego sygnału niewiete różniący się od 50:50, np. 55:45. Ze wzg^du na nieznormaNzowane intensywności sygnału stosunek R1/R2 wynosiłby jednak np. 44/50 (0,88), tj. więcej niż czynnik normaNzacyjny. Zatem, podwójne odchytenie „większe niż spodziewane” na poziomie zarówno znormaNzowanym, jak i nieznormaNzowanym, wskazywałoby na podwójną infekcję. Co więcej, stosunek R1/R2, np. zarejestrowany przez AUC, najprawdopodobniej nie byłby stały podPL 210 867 B1 czas całego oznaczenia z powodu różnych dynamik sygnału otrzymanych z różnymi wydajnościami amplifikacji, co uwypukli rozróżnienie.

- Jeż eli w przypadku podwójnej infekcji obydwa oznaczenia będą miały mniej więcej równą wydajność i rozpoczną się albo od zasadniczo różnych, albo mniej więcej równych stężeń analitu, wynik będzie się zbliżał lub nawet przekraczał wzór NFI 75:25:0 ze znakowaniem R1 + R2 lub R1 + R1R2 (przypadek I, czy przypadek IV ?). Zatem, rozróżnienie między przypadkiem IV a silnie odchyloną jednoczesną infekcją typu przypadku I można osiągnąć za pomocą bezwzględnych specyficznych intensywności sygnału (intensywność R1 powinna być dużo niższa w sytuacji przypadku I) lub bezwzględnych różnic specyficznych dla kanału, ewentualnie poprawionych wartości SFI. Jednak w pewnych przypadkach wyniki mogą nie być całkowicie jednoznaczne.

Oprócz tego, złożone krzywe AFI/t można analizować biorąc pod uwagę charakterystyki kształtu krzywej. W przypadku infekcji pojedynczej oczekuje się krzywej monosigmoidalnej z jednym punktem przegięcia. W przypadku infekcji podwójnej, jednak, najbardziej prawdopodobne jest to, że 2 krzywe wzrostu pochodzące od 2 rodzajów analizowanych cząsteczek kwasów nukleinowych wyekstrahowanych z 2 czynników infekcyjnych nie będą identyczne ze względu na ct (tj. punkt na osi czasu, gdzie krzywa zagina się do góry i wzrasta ponad tło oraz poziom zerowania przesunięcia), ze względu na kształt i intensywność specyficznego sygnału. Zatem, można wytworzyć bisigmoidalny kształt krzywej z dwoma punktami przegięcia. Więc, mono- lub bisigmoidalne kształty krzywej mogłyby wskazywać na pojedyncze lub podwójne czynniki infekcyjne obecne w badanej próbce. W niekorzystnych przypadkach, jednak, nałożenie się 2 lub więcej krzywych może prowadzić do nieregularnych kształtów bez wyraźnego maksimum nachylenia i o zwiększonym szumie (tj. zaburzonej krzywej). Jeszcze inną możliwością jest złożona krzywa z 1 punktem przegięcia, gdy nałożą się 2 krzywe prawie identyczne.

Podsumowując, istnieje pewna liczba matematycznych środków dostępnych, aby osiągnąć rozróżnienie wyników oznaczeń wielokrotnych ze względu na typ infekcji. Obejmują one, ale nie ograniczają się do:

Środków podstawowych - wzory odniesienia rozkładu NFI oraz typ odchylenia albo w sytuacjach ze znaczną intensywnością sygnału w 2, albo 3 kanałach optycznych związanych z cząsteczką analizowaną. Dopuszczalny zakres odchyleń od wzoru odniesienia można ustawić liczbami bezwzględnymi, % pasm odnoszący się do odpowiedniej wartości NFI oparty na precyzyjnych danych lub ich kombinację.

Środków pomocniczych - analiza stosunków NFI oraz SFI odnoszących się do poszczególnych kanałów optycznych dla wspólnych odchyleń; analiza stosunków NFI lub SFI jako funkcji numeru cyklu, tj. dynamicznie wzdłuż współrzędnej reakcji (stałe lub zmienne); związek stosunków NFI i odpowiednich wartości bezwzględnych SFI lub bezwzględnych różnic SFI między 2 dowolnymi kanałami optycznymi (ewentualnie skorygowanymi przez odniesienie do różnicy dawki standardowej), biorąc pod uwagę znane całkowite wydajności specyficzne dla oznaczenia (ekstrakcji/amplifikacji/wykrywania) dla różnych badanych czynników infekcyjnych; analiza złożonych kształtów krzywych AFI względem czasu (jeśli jest to możliwe do zastosowania).

Przypuszczalny tryb zastosowania tego zestawu kryteriów został zilustrowany na fig. 1-2.

Co więcej, w celu monitorowania całego procesu można dodać do wszystkich próbek sztuczny konstrukt kwasu nukleinowego, korzystnie opakowany (opancerzony) w modyfikowaną cząstkę wirusa, który jest koekstrahowany i koamplifikowany z naturalną cząsteczką analizowaną. Tę wewnętrzną kontrolę (IC) cechuje unikalny obszar wiązania sondy specyficzny dla sondy do wykrywania IC, która różni się od sond specyficznych dla cząsteczek analizowanych inną grupą reporterową o odróżnialnej charakterystyce emisji promieniowania.

Zatem, sygnał IC można odróżnić od sygnału cząsteczki analizowanej i, ponieważ wiadomo, że IC jest obecna w próbce, służy ona jako czynnik monitorujący. Jeżeli nie ma żadnej odpowiedzi IC, odpowiednia reakcja musi być uznana za nieważną i powtórzona.

Oprócz koekstrahowanej/amplifikowanej/wykrywanej kontroli wewnętrznej (IC) dodanej do każdej bez wyjątku przetwarzanej próbki (tj. zarówno nieznanej jak i kontroli zewnętrznych i próbek kalibracyjnych) i wskazywanej przez R4 częścią oznaczenia będą zewnętrzne kontrole pozytywne. Są to „znane”, które muszą okazać się pozytywne, w przeciwieństwie do „nieznanych” i mogą być zaprojektowane jako mieszane próbki kontrolne, które powodują wzrost sygnału we wszystkich związanych z czą steczkami analizowanymi kanał ach optycznych.

W połączeniu z IC był aby wtedy dodatkowo monitorowana uż yteczność cał ego ukł adu optycznego, oprócz funkcjonowania całego procesu ekstrakcji/amplifikacji/wykrywania. Do zastosowań prze16

PL 210 867 B1 siewowych opartych na kwasach nukleinowych w bankach krwi, na przykład, wymagany jest wysoce czuły, aczkolwiek jakościowy test w celu zidentyfikowania każdej bez wyjątku próbki pozytywnej, na tyle, na ile jest to tylko technicznie możliwe. Dlatego miana zewnętrznych kontroli pozytywnych zawierałyby się w niższym zakresie stężeń.

P r z y k ł a d 3

W oparciu o listę parametrów podaną w przykładzie 1 analizowany jest pokazany poniżej rozkład sygnału. Dla każdego z 6 badanych parametrów istnieje wzór odniesienia rozkładu sygnału w 3 kanałach optycznych przeznaczonych do wykrywania cząsteczek analizowanych.

Każdy wzór odniesienia jest uzupełniony przez współistniejący dopuszczalny zakres, na przykład:

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
P1	50	50	0
P2	100	0	0
P3	0	100	0
P4	0	0	100
P5	50	0	50
P6	0	50	50

Wzór odniesienia NFI:

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
P1	10	10	9,17
P2	10	1,67	6,25
P3	7,08	10	7,92
P4	4,17	1,67	10
P5	10	4,17	10
P6	5,83	10	10

Przypuszczalne 10%/20% pasma poboczne odnoszące się do wartości średnich 100% i 50% oraz wielokrotności 5 x wartości bliskich zeru, co przekłada się na następujące dopuszczalne zakresy dla wzoru odniesienia:

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
P1	40-60	40-60	0-9
P2	90-100	0-2	0-6
P3	0-7	90-100	0-8
P4	0-4	0-2	90-100
P5	40-60	0-8	40-60
P6	0-8	40-60	40-60

Dopuszczalne zakresy odchyleń można obliczyć, na przykład, jako procent wartości (%), liczby bezwzględne, wielokrotności prostego odchylenia standardowego lub ich kombinacje.

Dla każdej próbki (parametru) rozkład sygnału w kanale 1 (związek reporterowy R1), kanale 2 (związek reporterowy R2) i kanale 3 (związek reporterowy R3) jest podany w postaci 6 równoległych zestawów symulowanych danych opartych każdy na 6-krotnych oznaczeniach, jak to pokazano w tabeli (prawa strona). Po lewej stronie pokazano kolejne etapy szacowania danych dotyczą cych sygnału.

PL 210 867 B1

Symulowany rozkład

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
PI	49,33	48,83	1,83
P2	98,42	0,33	1,25
P3	1,42	97,00	1,58
P4	0,83	0,33	98,83
P5	48,17	1,67	50,17
P6	1,17	50,33	48,50

wartości średnich (arytmetycznych) według wzoru odniesienia, z odchyleniem

Zestaw symulowanych danych:

Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3	Razem
52	48	0	100
49	48	3	100
47	52	1	100
50	46	4	100
48	49	3	100
50	50	0	100
98	0	2	100
97,5	0	2,5	100

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
PI	5,25	6,12	5,17
P2	4,69	2,45	3,25
P3	2,75	5,02	3,34
P4	3,51	1,55	4,81
P5	7,92	6,75	7,92
P6	3,51	6,48	7,29

trzykrotne odchylenie standardowe według wzoru odniesienia, z odchyleniem

	Kanał 1 Kanał 2	Kanał 3
PI	50	50	0
P2	100	0	0
P3	0	100	0
P4	0	0	100
P5	50	0	50
P6	0	50	50
wzór	odniesienia	NFI

100

100

2,5 o

1	100
0	100
2	100
0	100
3	100
2	100
1	100
0	100
0	100
2,5	100
100	100
100	100
96	100
99	100
100	100
98	100
48	100
49	100
55	100
48	100
50	100
51	100
50	100
50	100
46	100
51	100
45	100
49	100

PL 210 867 B1

	Kanał 1	Kanał 2	Kanał 3
P1	10,00	10,00	9,17
P2	10,00	1,67	6,25
P3	7,08	10,00	7,92
P4	4,17	1,67	10,00
P5	10,00	8,33	10,00
P6	7,50	10,00	10,00

10%/20% pasma poboczne odnoszące się do wartości średnich 100% i 50% oraz czynnik 5 odnoszący się do wartości 0%, t j. dopuszczalne zakresy dla wzoru odniesienia.

Odnośnie P5 znaleziono rozkład kanał 1:Kanał 2:Kanał 3 około 50:0:50 zarówno z wartościami średnich, jak i rozrzutem wartości w obrębie dopuszczalnych zakresów. To prowadziłoby do wyniku „P5-pozytywny”, co oznacza pojedynczą infekcję HBV.

P r z y k ł a d 4

Jak nakreślono powyżej podczas głównych rozważań podanych w przykładzie 1 i 2, rozkłady 50:50 nie zawsze muszą wskazywać prawidłowo na pojedyncze infekcje. Chociaż trzeba wspomnieć, że istnieje kilka zastosowań, gdzie takie dwuznaczne wyniki się nie pojawiają, w wielu innych przypadkach, szczególnie dla zastosowań diagnostycznych, wymagana jest często dalsza analiza. W celu przeprowadzenia dalszej analizy można, na przykład, zastosować dodatkowe charakterystyki krzywych otrzymanych sposobami homogennej amplifikacji. To odzwierciedla schemat pokazany na fig. 5, gdzie zastosowano dodatkowe charakterystyki krzywej, jak bezwzględne poziomy SFI barwnika Ry i cechy zapisu NFI (stałe/zmienne stosunki NFI; wczesne/późne przybliż enie końcowego rozkładu; odchylenie < 1/> 1; itp.) w celu odnalezienia parametru/ów infekcyjnych.

Na podstawie tych przykładów staje się jasne, że rozwiązanie powinno być znacząco wzmocnione przez analizowanie danych z oznaczenia w czasie rzeczywistym dynamicznie wzdłuż współrzędnej reakcji, zamiast rozważania tylko warunków punktu końcowego. Szczególnie dla próbek S4-S6 sama czysta analiza punktu końcowego spowodowałaby ryzyko diagnozowania infekcji pojedynczych, podczas gdy obszerny zestaw narzędzi analitycznych pozwalałby na bardziej precyzyjne oznaczenia. W przypadku S5, na przykład, rozkład NFI punktu końcowego przypomina pojedynczą infekcję HBV, jak w przykładzie 3, podczas gdy przy użyciu analizy rozkładu NFI dynamicznie wzdłuż współrzędnej reakcji można łatwo odrzucić fałszywe oznaczenie „pojedyncza infekcja HBV” i zastąpić je prawidłowym oznaczeniem „koinfekcja HIV-1-0 + HCV”, ponieważ HCV wydajnie amplifikowany i reprezentowany przez R3 powoduje wzrost intensywności specyficznej fluorescencji (SFI) znacznie wcześniej niż HIV-1-0, który jest mniej wydajnie amplifikowany i reprezentowany przez Rl. Zatem wykres R1/R3 opada szybko poniżej linii podstawowej 50:50, dalej ciągnie się z odchyleniem dodatnim, ponieważ Rl jest wytwarzany z pewnym opóźnieniem, przybliżając końcowy rozkład.

P r z y k ł a d 5

Dane doświadczalne z pojedynczą infekcją HBV

Analizowany genom (HBV podtyp A), różniący się dawką od 25-5000 kopii/ml i konstrukty kontroli wewnętrznej ekstrahowano z próbek osocza przy użyciu technologii magnetycznych cząstek szklanych, jak to opisano w PCT/EP00/11459. Eluowane kwasy nukleinowe specyficznie amplifikowano i wykrywano w homogennym Taqman-PCR w czasie rzeczywistym na przyrządzie COBAS Taq-Man™ działającym pod AmpliLink^® wersja 2.1 (Roche Molecular Systems). Do badań podstawowych tutaj opisywanych zastosowano sondę specyficzną dla HBV (kod JW144) w stężeniu 7,5 pmol/100 μΐ wyznakowaną FAM (λ₍χ = 494 nm; A_EM = 518 nm) i w stężeniu 7,5 pmol/100 μl wyznakowaną JA274 (λ₍χ = 580 nm; A_EM = 609 nm). Wyniki eksportowano do MS Excel® wersja 7.0 do dalszej analizy danych (np. obliczenia zakresu branych pod uwagę cykli [SFI >> szum AFI-BG], wzmocnienia specyficznego sygnału, znormalizowanych intensywności sygnału, stosunków NFI i zapisu NFI wzdłuż współrzędnej reakcji, klasyfikacji zarejestrowanych wykresów NFI na stałe/poboczne/zmienne z dodatnim nachyleniem/zmienne z ujemnym nachyleniem, jak również do graficznego przedstawienia wyników).

Homogenne wielokrotne reakcje PGR przeprowadzono w standardowych warunkach dla PCR przy użyciu par starterów i sond specyficznych dla HIV-1M, HIV-10, HIV2, HGV i HBV.

PL 210 867 B1

Jak pokazano na fig. 3a-d, sygnały FAM i JA274 wytworzone w jednej i tej samej reakcji biochemicznej (tj. ekstrakcji i namnażania HBV-DNA) zachowują się w sposób sprzężony zgodnie z rozwiązaniem według niniejszego wynalazku, tj. ulegają odchyleniom w kierunku linii rozkładu 50:50, jak tylko poziomy SFI wzrosną znacząco powyżej tła. Im wyższa dawka HBV, tym wcześniej jest to osiągnięte i pozostaje stałe aż do końca reakcji. Jest to szczególnie godne uwagi, ponieważ sygnał wyjściowy zmierzony na GOBAS TaqMan™ różni się bardzo dla FAM i JA274, dając czynnik normalizacyjny NF(JA274/FAM) około 11,5:1. To z kolei przekłada się na zwiększoną czułość analityczną reakcji wskazywanych przez JA274 w porównaniu z podobnymi reakcjami wskazywanymi przez FAM, tj. w zakresie mniejszych wykrywalnych dawek HBV krytyczne jest przy użyciu tej pary barwników osiągnięcie rozkładu NFI 50:50 („model najgorszego przypadku”). Jednak po zamianie SFI na NFI z zastosowaniem doświadczalnie ustalonego NF(JA274/FAM), barwniki te - sprzężone drogą wytworzenia we wspólnej reakcji biochemicznej - dają w efekcie rozkłady 50:50 ze znaczną dokładnością (patrz także fig. 4b).

P r z y k ł a d 6

Dane doświadczalne z różnymi koinfekcjami (typu I i typu IV)

Zastosowano procedury i zestawy odczynników takie, jak opisano to dla przykładu 5, z wyjątkiem tego, że tutaj w zależności od cząsteczki analizowanej ekstrahowanej z koinfekowanych próbek, sondy swoiste dla HBV, HCV lub HIV-1-0 były zużywane w reakcji amplifikacji/wykrywania. Sondę HBV zastosowano jako mieszaninę równych ilości oligonukleotydów wyznakowanych FAM lub JA274, sonda HCV była w całości znakowana FAM, a sonda HIV-1-0 była w całości znakowana JA274. Próbki osocza HBV + HCV-pozytywne i próbki osocza HBV + HIV-1-0-pozytywne są koinfekcjami typu IV, HCV + HIV-1-0-pozytywne są koinfekcją typu I. Uwaga: dla HIV-1-0 stężenia podane są jako x-krotne rozcieńczenia supernatantu z hodowli; dla wszystkich innych parametrów dostępny jest precyzyjnie zmierzony [cp/ml] i wystandaryzowany materiał.

Jak można zobaczyć na wykresie na fig. 4a-d, sam rozkład NFI oraz zapisy NFI wzdłuż współrzędnej reakcji różnią się bardzo od tych otrzymywanych w przypadku infekcji pojedynczych. Na przykład, na fig. 4a, reakcje nr 1-12 wykazują niskie i w przybliżeniu równe miana HBV (bardzo dobrze amplifikuje się; nie jest zaangażowany żaden etap odwrotnej transkrypcji) i HCV (dobrze amplifikuje się; jednak nieco wolniej niż HBV w PCR z odwrotną transkrypcją; przy czym analizowane cząsteczki HCV nie są łatwo dostępne z powodu wytwarzanych struktur drugorzędowych). Wskutek tego, zaraz po rozpoczęciu się specyficznej reakcji SFI(FAM) i SFI(JA274) wytwarzane są w reakcji z HBV w znacznych ilościach, a stosunki NFI(JA274/FAM) mają tendencję do zbliżania się do linii rozkładu 50:50 (= 1). W miarę postępu reakcji cyklicznej, jednak, HCV reaguje z pewnym opóźnieniem i wytwarzany jest nowy SFI(FAM), spychając stosunek NFI(JA274/FAM) poniżej linii podziału, dając w efekcie wykres o ujemnym nachyleniu. Reakcje nr 13-24 na fig. 4a, cechuje infekcja niską dawką HBV plus 100-krotny nadmiar dawki HCV, dając w efekcie przesunięcie zakresu prawidłowych cykli w kierunku wcześniejszego przekroczenia linii, wykres stosunku NFI(JA274/FAM), który spada poniżej linii podziału, a następnie powoli rośnie z dodatnim nachyleniem, ponieważ SFI(FAM) jest wytwarzany w reakcji HCV w wysokiej dawce przed „sprzężonym z nim” wytwarzaniem SFI(FAM) i SFI(JA274) w reakcji HBV w niskiej dawce, co stopniowo zwiększa stosunek NFI(JA274/FAM).

Zatem, stosując kryteria przedstawione w przykładzie 2 w uporządkowany po kolei sposób, jak to pokazano na fig. 1-2, analiza ta dałaby w efekcie „koinfekcję HBV + HCV”. Jest to prawdą nawet dla większości reakcji z kombinacją HBV w wysokiej dawce i HCV w niskiej dawce (wysokie poziomy SFI(FAM) i SFI(JA274) plus niewielka ilość dodatkowego samego SFI(FAM), zobacz fig. 4 d) lub kombinacją HBV w wysokiej dawce i HIV-1-0 w niskiej dawce (wysokie poziomy SFI(FAM) i SFI(JA274) plus bardzo niewielka ilość dodatkowego samego SFI(JA274), patrz fig. 4c, reakcje nr 7-24). W kilku przypadkach, szczególnie z tym ostatnim zestawieniem, obydwa kształty krzywych NFI badane wizualnie i wstępne matematyczne deskryptory (stosunki NFI punktu końcowego, charakterystyka zapisu NFI, bezwzględne poziomy SFI, itp.) są dość zbliżone do tych wskazujących na pojedynczą infekcję. Można to jednak poprawić stosując środki chemiczne (zastosowanie barwników z mniej więcej podobnymi intensywnościami emisji, tj. stosunki NFI bardziej stabilne niezależnie od dawki cząsteczki analizowanej i towarzyszącego mu poziomu wytwarzania sygnału bezwzględnego), matematyczne (bardziej wyszukane narzędzia statystyczne zastosowane do analizy, odpowiednio, pierwszorzędowego wzrostu i drugorzędowych krzywych NFI), jak również techniczne (blok TC i konfiguracja oprogramowania sterującego zaprojektowane specyficznie do szybkich zmian temperatury w cyklach reakcji, jak zastosowany

PL 210 867 B1 tutaj profil TC; pomaga to wygładzić krzywe pierwszorzędowego wzrostu, co z kolei stabilizuje wykresy zapisu stosunku NFI).

Co więcej, fig. 4b (reakcje nr 13-24) i fig. 4c (reakcje nr 1-6) pokazują przykłady koinfekcji typu I, tj. w tym przypadku HCV plus HIV-1-0, co daje w efekcie „niesprzężone” wytwarzanie SFI(FAM) i SFI(JA274). Wskutek tego, wykres zapisu stosunku NFI biegnie i pozostaje daleko poniż ej linii podział u, ponieważ HCV jest powielany o wiele lepiej niż HIV-1-0 (konsekwencja między innymi polimorfizmów wpływających na miejsca wiązania starter/sonda). Ponadto, także intensywność sygnału specyficznego JA274 wytworzonego od samego HIV-1-0 jest znacząco niższa niż ta wytworzona od pojedynczych infekcji HBV, co znów zgadza się z teorią. Pomaga to dalej rozróżnić koinfekcję od pojedynczej infekcji.

Ogólnie mówiąc, koinfekcje typu IV są trudniejsze do odróżnienia od pojedynczych infekcji, zwłaszcza gdy wysokie dawki parametru 5 (wytwarzającego wysokie poziomy SFI zarówno dla R1 [Ry], jak i R3 [Rx]) są połączone z bardzo niskimi dawkami parametru 2 (wytwarzającego tylko niewielką ilość dodatkowego R1), ale w większości przypadków jest to możliwe nawet przy użyciu raczej prostych kryteriów matematycznych, jak w tym wstępnym układzie testującym i pary barwników „modelu najgorszego przypadku”.

Połączenie 2 dobrze amplifikowanych cząsteczek analizowanych w koinfekcji typu IV, np. parametru 5 [wskazywany przez R1 + R3] i parametru 4 [wskazywany przez R3] posiada dużo mniej dwuznaczności, ponieważ zasadnicze ilości intensywności R3 dodają się asynchronicznie i asymetrycznie. Jednak, jeżeli względna obfitość parametru 4 kontra parametr 5 staje się nieistotna, obserwuje się podobne ograniczenia rozdzielczości. W przeciwieństwie do koinfekcji typu IV obejmującej parametr 2 (i jak się oczekuje) jednoczesne infekcje typu I są dość łatwo odróżnialne od pojedynczych infekcji wskazywanych przy użyciu tej samej, choć biochemicznie sprzężonej, pary barwników. Staje się to jasne na poziomie stosunków punktu końcowego NFI, jak również zapisów NFI wzdłuż współrzędnej reakcji, a także znacząco niższych intensywności sygnału R1 (Ry). Jest to spowodowane faktem, że zasadnicza intensywność R3 jest wytwarzana przez parametr 4 nawet w niskich dawkach, podczas gdy intensywność R1 wytwarzanego w wyniku cięcia sond specyficznych dla parametru 2 jest zasadniczo niska i wytwarzana raczej późno podczas przebiegu 60 cykli. Więc, z powodu praktycznie nieuniknionych różnic albo w początkowym stężeniu albo w wydajności ekstrakcji/wymywania/amplifikacji, najmniej prawdopodobne jest uzyskanie rozkładu sygnału 50:50 podczas reakcji.

Claims (4)

1. Sposób oznaczania co najmniej 3 analitów-kwasów nukleinowych, korzystnie HIV, HCV, HBV, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) amplifikowanie tych co najmniej 3 analitów-kwasów nukleinowych przez PCR w fazie homogennego roztworu,

b) dostarczenie mieszaniny próbki wytworzonej w etapie a) zawierającej co najmniej te 3 amplifikowane anality-kwasy nukleinowe albo próbki, w której przypuszczalnie jest zawarty jeden lub więcej analitów-kwasów nukleinowych i co najmniej 3 różnych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach umożliwiających swoiste wiązanie tych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego z tymi amplifikowanymi analitami-kwasami nukleinowymi, przy czym

- pierwsza z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla pierwszego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów i jest związana z pierwszym znacznikiem,

- druga z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla drugiego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów i jest związana z drugim znacznikiem, który daje się wykryć oddzielnie od znacznika związanego z pierwszą sondą swoistą dla kwasu nukleinowego i

- trzecia z co najmniej 3 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla trzeciego z co najmniej trzech kwasów nukleinowych-analitów, przy czym pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym pierwszym znacznikiem co związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym drugim znacznikiem co sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego i pierwsza połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym

PL 210 867 B1 znacznikiem, który jest związany z drugą połową ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem, który jest związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym wspomniana pierwsza sonda swoista dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HIV, wspomniana druga sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HCV, a wspomniana trzecia sonda swoista dla trzeciego kwasu nukleinowego jest swoista dla wirusa HBV,

c) wykrywanie w procesie homogennym intensywności sygnałów wskazujących na pierwszy i drugi znacznik,

d) otrzymywanie stosunku między intensywnościami sygnałów wykrytych w etapie c),

e) oznaczenie analitów-amplifikowanych kwasów nukleinowych obecnych w próbce za pomocą intensywności sygnałów wykrytych w etapie d).

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znaczniki wykrywa się przy użyciu transferu energii fluorescencji.

3. Sposób oznaczania co najmniej 6 analitów-kwasów nukleinowych, korzystnie wirusów HIV, HCV, HBV, HAV, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) amplifikowanie tych co najmniej 6 analitów-kwasów nukleinowych przez PCR w fazie homogennego roztworu,

b) dostarczenie mieszaniny próbki wytworzonej w etapie a) zawierającej co najmniej 6 tych amplifikowanych analitów-kwasów nukleinowych albo próbki, w której przypuszczalnie jest zawarty jeden lub więcej agalitów,

- kwasów nukleinowych i co najmniej 6 różnych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego w warunkach umożliwiających swoiste wiązanie tych sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego z tymi amplifikowanymi analitami-kwasami nukleinowymi, przy czym

- pierwsza z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla pierwszego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych i jest związana z pierwszym znacznikiem,

- druga z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla drugiego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych i jest związana z drugim znacznikiem, który daje się wykryć oddzielnie od znacznika związanego z sondą swoistą dla pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego i

- trzecia z co najmniej 6 sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla trzeciego z co najmniej sześciu analitów-kwasów nukleinowych, przy czym pierwsza połowa ilości trzeciej sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest związana z tym samym pierwszym znacznikiem co związany z sondą swoistą dla sekwencji pierwszego kwasu nukleinowego, a druga poł owa iloś ci trzeciej sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego jest zwią zana z tym samym drugim znacznikiem co sonda swoista dla sekwencji drugiego kwasu nukleinowego i pierwsza poł owa iloś ci sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest zwią zana z tym samym znacznikiem, który jest zwią zany z drugą poł ową iloś ci sondy swoistej dla trzeciego kwasu nukleinowego, a druga połowa ilości sondy swoistej dla sekwencji trzeciego kwasu nukleinowego nie jest związana z tym samym znacznikiem co sonda swoista dla pierwszego kwasu nukleinowego, przy czym pierwsza sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-1-M, a druga sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-1-0, a trzecia sonda swoista dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HIV-2, czwarta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla kwasu nukleinowego jest swoista dla HCV, piąta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HBV, a szósta z tych co najmniej sześciu sond swoistych dla sekwencji kwasu nukleinowego jest swoista dla HAV,

c) wykrywanie w procesie homogennym intensywności sygnałów dla pierwszego i drugiego znacznika,

d) otrzymywanie stosunku między intensywnościami sygnałów wykrytych w etapie c),

e) oznaczenie analitów-amplifikowanych kwasów nukleinowych obecnych w próbce za pomocą intensywności sygnałów wykrytych w etapie d).

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że znaczniki wykrywa się przy użyciu transferu energii fluorescencji.