DE69635612T2 - Detektion und amplifikation von nukleinsäuren durch chemische verbindung von oligonukleotiden - Google Patents

Detektion und amplifikation von nukleinsäuren durch chemische verbindung von oligonukleotiden Download PDF

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Description

  • GEBIET UND HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein nichtenzymatisches Verfahren und einen ebensolchen Kit zur Amplifikation und zum Nachweis in einer Testprobe vorhandener Zielnukleinsäuresequenzen.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und einen Kit zum Nachweis des Vorhandenseins einer bestimmten Sequenz in einer Probe genetischen Materials. Das Verfahren und der Kit der vorliegenden Erfindung sind hochsensibel gegenüber kleinen Veränderungen in einer untersuchten Sequenz und somit nützlich für den Nachweis winziger Sequenzänderungen, wie z.B. Punktmutationen, bei denen es sich um Veränderungen eines einzelnen Basenpaars in einer DNA-Sequenz handelt.
  • Das vorliegende Verfahren und der zugehörige Kit sind weiterhin von Vorteil beim Identifizieren der Anwesenheit einer genetischen Fremdsequenz in einer Probe genetischen Materials, z.B. beim Nachweis des Vorhandenseins spezifischer bakterieller oder viraler Nukleotidsequenzen in der DNA von Tieren und Pflanzen. Dieses Verfahren wird bezeichnet als „Chemische Amplifikation von Nukleinsäuren" bzw. „Chemical Amplification of Nucleic Acids", abgekürzt ChANA.
  • In den letzten beiden Jahrzehnten wurde eine äußerst große Anzahl menschlicher Gene isoliert und vollständig sequenziert, wodurch es zur Klärung der genetischen Ursache vieler Krankheiten kam, darunter Mukoviszidose, Hämophilie, Lesch-Nyhan-Syndrom, Beta-Thalassämie, Sichelzellenanämie, Phenylketonurie, Tay-Sachs, Morbus Gaucher, Duchenne-Muskeldystrophie, um nur einige zu nennen. Für eine Vielzahl genetischer Krankheiten wurde der Beweis erbracht, dass sie durch multiple alternative Sequenzänderungen, wie ein Replacement (z.B. Punktmutation), eine Deletion oder eine Insertion einer bekannten Anzahl von Nukleotiden in den Genen verschiedener Individuen verursacht werden. Beispielsweise wurden 177 verschiedene Punktmutationen und 66 verschiedene Insertionen und Deletionen in dem CFTR-Gen als alternative Ursachen für die genetisch bedingte Krankheit Mukoviszidose identifiziert (Darvasi, A. und Kerem, B.: Short tandem repeats and mutations in the coding region of human genes, (1994), in Druck). Infolge solcher Punktmutationen oder kleiner Sequenzänderungen erfolgt die Herstellung des von diesen Genen codierten Proteins überhaupt nicht, oder sie wird vorzeitig abgebrochen, oder aber das Protein wird in einer modifizierten Form erzeugt, welche seine Funktionen beeinträchtigt. Viele Beweis stützen die Idee, dass zumindest ein Teil der variablen Manifestationswahrscheinlichkeit, d.h. Alter bei Ausbruch und dessen Schwere, welche einige der genetischen Krankheiten charakterisieren, durch die Variabilität von Sequenzänderungen in deren zugehörigen Genen bedingt wird. Des Weiteren wurde von vielen Krebsarten gezeigt, dass sie mit somatischen Punktmutationen in gewissen Genen in Verbindung stehen.
  • Es besteht nun die Möglichkeit, genetisches Material aus einem Individuum zu erhalten, eine bestimmte Genregion mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR)-Technik zu amplifizieren und dann durch DNA-Sequenzierung oder andere Mutationsnachweisverfahren zu identifizieren, ob das Individuum eine Mutation an irgendeiner besonderen Stelle in dieser Region aufweist. Zudem bietet sich die Möglichkeit, den Genotyp eines solchen Individuums zu bestimmen, d.h. ob das Individuum gesund ist, an einer gewissen Krankheit leidet oder ob das Individuum ein „Träger", d.h. heterozygot im Bezug auf die Mutation der getesteten Stelle ist. Werden derartige Analysen an Fötenzellen durchgeführt, ist es möglich zu ermitteln, mit welcher Wahrscheinlichkeit der Fötus eine bestimmte Erbkrankheit in sich trägt. Dies erlaubt die Behandlung der Krankheit gleich nach der Geburt mit spezieller Diäten, Medikamenten, Gentherapie oder gibt, falls eine Behandlung nicht möglich ist, die Option, die Schwangerschaft abzubrechen.
  • Diese Techniken haben auch bei einer Anzahl anderer Anwendungsgebiete Wichtigkeit erlangt, einschließlich der forensischen Medizin, wo typischerweise nur winzige Proben zur Verfügung stehen, bei der Vaterschaftsbestimmung und bei Analysen zur Feststellung, ob in einer Probe eine Nukleinsäure eines spezifischen Pathogens anwesend ist, z.B. Nukleinsäure viralen Ursprungs wie HIV.
  • Wie erwähnt, haben etliche genetische Krankheiten viele alternative genetische Ursprünge. Einige dieser Krankheiten treten in bestimmten Völkern ziemlich häufig auf. Allele mit Beta-Globin Defekt, die Beta Thalassämie verursachen, sind beispielsweise in Völkern im Mittleren Osten weit verbreitet; verschiedene defekte CFTR Allele werden in einer heterozygoten Form von einem von zwanig Individuen (5%) getragen, und die Krankheit befällt ungefähr 1/1600 Individuen kaukasischer Abstammung weltweit („Harrison's Principles of Internal Medicine", 9. Ausgabe, Hrsg.: Isselbacher, Adams, Braunwald, Petersdorf und Wilson, McGraw-Hill Buchverlag, N.Y., S. 1233 folgende).
  • Aufgrund der Häufigkeit von Mukoviszidose und anderer genetisch vererbter Funktionsstörungen besteht ein allgemein anerkannter Bedarf für, und es wäre äußerst vorteilhaft, darüber zu verfügen, ein kostengünstiges Verfahren, zu dessen Ausführung lediglich nicht geschultes Personal benötigt wird und das einen effizienten und akkuraten Nachweis von Alterationen in DNA-Sequenzen ermöglicht.
  • Das wesentlichste Verfahren zum Nachweis von Punktmutationen ist die DNA-Sequenzierung, und das am Weitesten verbreitete Sequenzierungsverfahren basiert auf der Dideoxynukleotid-Kettenabbruch-Methode (s. Sanger, F (1981), Science 214, 1205–1210). Die Entwicklung von DNA und Dideoxynukleotid-konjugierten Fluoreszenzfarbstoffen und geeigneten Nachweissystemen hat die Verbesserung und die Automatisierung der grundlegenden Dideoxynukleotid-Kettenabbruch-Technik ermöglicht.
  • Zu weiteren Verfahren, die eingesetzt werden, um das Vorhandensein von Veränderungen in bekannten DNA-Sequenzen festzustellen, gehören die Allel-spezifische Oligonukleotid (ASO)-Hybridisierung, reverse-ASO, Restriction Site Generating PCR (RG-PCR), Denaturierungs-/Temperaturgradientengelelektrophorese (D/TGGE), Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP), Heteroduplexanalyse, Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP); PCR-Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (PCR-RFLP), Nuclease Protection Assays, chemische Spaltung und andere, weniger häufig eingesetzte Techniken.
  • Obgleich diese Verfahren von großer wissenschaftlicher Bedeutung sind, leiden sie an Nachteilen, die ihren routinemäßigen Einsatz einschränken, weil ihnen einer oder mehrere der folgenden Aspekte fehlen, die ein Verfahren zur breitgefächerten Durchsuchung vieler Individuen nach verschiedenartigen DNA-Veränderungen anwendbar macht. Zu diesen Aspekten zählen wie folgt: (1) Hochqualifiziertes Personal, das gebraucht wird für (a) eine akkurate Ausführung der Verfahren, von denen viele mehrere komplizierte Schritte einschließen, insbesondere die Gelelektrophorese und/oder komplizierte Blotting- und Hybridiersierungsverfahren, und (b) für die Auswertung der Ergebnisse; (2) strenge Kalibrierschritte sind notwendig vor der Untersuchung jeder beliebigen neuen DNA-Veränderung; (3) theoretisch eignen sich manche der oben erwähnten Methoden nicht für den Nachweis aller Veränderungen; (4) einige sind in sich selbst zeitraubend und arbeitsintensiv und/oder in der Auswertung der Ergebnisse; (5) einige der Verfahren, insbesondere jene, welche Gelelektrophorese beinhalten, sind nicht einfach zu automatisieren, und vor allem (6) basieren diese Verfahren sämtlich auf der Verwendung von Enzymen wie DNA- und RNA-Polymerasen, Restriktionsendonukleasen, einzelstrangspezifischen Endo- und Exonukleasen und dergleichen, die nicht nur teuer sind, sondern auch Variationen von Los zu Los hinsichtlich Aktivität und Konzentrationen nicht erwünschter Nuklease-Kontaminanten aufweisen. Derartige Variationen schmälern die Verlässlichkeit dieser Techniken.
  • Wie erwähnt, haben Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie über die letzten beiden Jahrzehnte hinweg den Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen in Testproben ermöglicht, die einem Patienten oder einem anderen Subjekt entnommen wurden. Zu solchen Testproben gehören Serum, Fäkalien, Speichel, Fruchtwasser und andere Körperflüssigkeiten. Der Nachweis spezifischer Nukleinsäuresequenzen kann verwendet werden, um sowohl genetische Störungen oder Krankheiten nachzuweisen als auch die Anwesenheit pathogener bakterieller und viraler Krankheitserreger beim Menschen und anderen Gattungen.
  • In vielen Fällen von Belang ist eine gewünschte Nukleinsäuresequenz in einer untersuchten Probe nur in einer sehr geringen Konzentration vorhanden. Dann besteht die Möglichkeit, dass das Vorhandensein des gesuchten Moleküls dem Nachweis entgeht, falls sich die Sensibilität des Assays nicht steigern lässt.
  • Das Standardverfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Zielnukleinsäuresequenzen ist die Polymerasekettenreaktion (PCR) (s. Saiki, u.a.: Science 239, 487 (1988) und Mullis, u.a. in US Patent 4 683 195). Ein Problem bei der PCR besteht in der nicht spezifischen Polymerisation, die zu irreführenden Hintergrundsignalen führt.
  • Das PCR-Verfahren zielt auf die Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz. Es ermöglicht eine wiederholte Replikation einer gewünschten spezifischen Nukleinsäuresequenz, indem zwei Oligonukleotidprimer verwendet werden, die jeweils komplementär zu beiden Strängen der zu amplifizierenden Sequenz sind. Extensionsprodukte, in welche diese Primer eingegliedert werden, werden darin zu Templates für nachfolgende Schritte zur Replikation. Mit geometrischer Wachstumsrate erhöht das Verfahren selektiv die Konzentration einer gewünschten Nukleinsäuresequenz, selbst wenn diese Sequenz vor der Amplifikation nicht gereinigt wird und lediglich in einer einzigen Kopie in einer bestimmten Probe vorhanden ist. Das PCR-Verfahren kann eingesetzt werden, um entweder einzel- oder doppelsträngige DNA oder komplementäre DNA (cDNA) zu amplifizieren.
  • Die PCR-Technik ist in der Hinsicht dienlich, dass sie eine schnelle und extensive Amplifikation eines Polynukleotidmoleküls erreicht. Nichtsdestoweniger stellen sich bei Anwendung der PCR-Technik zur Amplifikation von Zielnukleinsäuresequenzen zwei praktische Probleme: (1) nicht spezifische Hybridisierung zwischen in einer untersuchten Nukleinsäure vorhandenen Fremdsequenzen und den Amplifikationsprimern kann in einer Co-Amplifikation irrelevanter Sequenzen resultieren. Zudem erhöht sich mit steigendem Amplifikations-Level auch die Menge derartiger Co-Amplifikationsprodukte; (2) aufgrund der Fähigkeit von PCR, sofort Millionen von Kopien für jedes initiale Template zu erzeugen, führt das versehentliche Einbringen des Endprodukts einer vorangehenden Reaktion in andere Proben leicht zu falsch positiven Ergebnissen.
  • Das Aufkommen von PCR führte zu der Entwicklung zusätzlicher Amplifikationsverfahren. Eines dieser alternativen Verfahren ist von Backman, u.a. in EP 320 308 offenbart und bekannt als Ligasekettenreaktion (LCR), die zur Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz dient. Bei der LCR werden vier Oligonukleotidsonden mehr verwendet. Die erste und dritte Sonde bilden ein komplementäres Oligonukleotidsondenpaar. Die zweite und vierte Sonde bilden ein weiteres komplementäres Oligonukleotidsondenpaar. Die erste und zweite Sonde hybridisieren an Sequenzen, die in dem ersten Strang der Zielnukleinsäuresequenz benachbart sind. Sobald sie hybridisiert sind, stoßen die erste und zweite Sonde in einem 5'-Phosphat-3'-Hydroxyl Verhältnis aneinander, so dass eine Ligase die beiden Sonden in einem fusionierten Produkt verbinden kann. Außerdem hybridiseren die dritte und die vierte Sonde an Sequenzen, die in dem zweiten Strang der Zielnukleinsäuresequenz benachbart sind. Sobald sie hybridisiert sind, stoßen die dritte und vierte Sonde in einem 5'-Phosphat-3'-Hydroxyl Verhältnis aneinander, so dass eine Ligase die beiden Sonden zu einem zweiten fusionierten Produkt verbinden kann.
  • Das erste und das zweite fusionierte Produkt werden von den Zielsträngen getrennt, wobei die Zielpopulation in der Probe effektiv verdoppelt wird. Die fusionierten Produkte dienen dann als Templates für weitere LCR-Reaktionen, indem sie an die komplementären Sonden hybridisieren. Während sich der Zyklus aus Hybridisierung, Ligation und Denaturierung wiederholt, nimmt die Population fusionierter Proben mit geometrischer Wachstumsrate zu. Der Nachweis der fusionierten Proben erfolgt mittels Standardverfahren.
  • Diese Amplifikationsreaktionen gestatten selbst bei äußerst geringer anfänglicher Materialmenge eine schnelle Analyse oder Charakterisierung maßgeblicher Sequenzen. Wichtig ist jedoch, dass der Amplifikationsprozess hochspezifisch abläuft, da die Amplifikation von Nicht-Zielsequenzen zusammen mit dem Zielsignal die Zuverlässigkeit des Amplifikationsprozesses beeinträchtigt.
  • Ein Problem, das mit der LCR einher geht, besteht darin, dass das Verfahren definitionsgemäß vier Oligonukleotidsonden und eine Ligase erforderlich macht und zu der nicht spezifischen „Blunt-End-Ligation" der Oligonukleotidsonden führen kann. Eine derartige nicht spezifische „Blunt-End-Ligation", sollte sie stattfinden, verursacht eine zielunabhängige geometrische Amplifikation der fusionierten Produkte. Dies kann ein starkes Hintergrundsignal falsch positiver Ergebnisse nach sich ziehen. Diese zielunabhängigen Produkte sind von der gewünschten amplifizierten Zielsequenz nicht zu unterscheiden.
  • Sowohl PCR als auch LCR weisen einen zusätzlichen Nachteil auf, der dadurch bedingt ist, dass sie jeweils Polymerasen oder Ligasen benötigen, um eine Amplifikation zu erzielen. Solche Enzyme sind nicht nur teuer, sondern weisen von Los zu Los Variationen hinsichtlich Aktivität und Konzentration nicht erwünschter Nukleasekontaminanten auf. Diese Variationen sind für eine weitere Schmälerung der Zuverlässigkeit der Verfahren verantwortlich.
  • Um beim Amplifikationsprozess nicht mehr auf die Verwendung von Enzymen angewiesen zu sein, hat Segev (internationale PCT Anmeldung US 94106690 ) ein neues chemisches Verfahren offenbart, das auf die nichtenzymatische Amplifikation jeder beliebigen spezifischen Nukleinsäuresequenz abzielt. Bei diesem Verfahren, das als chemische Amplifikationsreaktion (CAR) bezeichnet wird, werden zwei Oligonukleotidsondenkomplementpaare verwendet, wobei:
    • (a) das erste Oligonukleotidsondenkomplementpaar aus Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 1' besteht, und das zweite Oligonukleotidsondenkomplementpaar aus Oligonukleotidsonde 2 und Oligonukleotidsonde 2' besteht;
    • (b) Oligonukleotidsonde 1 eine lange Sequenz H und eine kurze Sequenz I enthält; Oligonukleotidsonde 1' eine lange Sequenz H' und eine kurze Sequenz I' enthält; Oligonukleotidsonde 2 eine lange Sequenz J und eine kurze Sequenz K enthält; Oligonukleotidsonde 2' eine lange Sequenz J' und eine kurze Sequenz K' enthält;
    • (c) Oligonukleotidsonden 1 und 2 ein erstes Oligonukleotidpaar bilden, wohingegen Oligonukleotidsonden 1' und 2' ein zweites Oligonukleotidpaar bilden; die lange Sequenz H von Oligonukleotidsonde 1 und die lange Sequenz J von Oligonukleotidsonde 2 komplementär zu benachbarten Abschnitten der Zielsequenz sind; und die lange Sequenz H' von Oligonukleotidsonde 1' und die lange Sequenz J' von Oligonukleotidsonde 2' komplementär zu benachbarten Abschnitten der Zielkomplementärsequenz sind;
    • (d) die kurze Sequenz I von Oligonukleotidsonde 1 komplementär zu der kurzen Sequenz K von Oligonukleotidsonde 2 und die kurze Sequenz I' von Oligonukleotidsonde 1' komplementär zu der kurzen Sequenz K' von Oligonukleotidsonde 2' ist; kurze Sequenzen nicht an die Zielsequenz hybridisieren.
    • (e) Die Zucker- oder Basen-Moieties von aus kurzen Sequenzen bestehenden Nukleotiden werden mit chemischen funktionellen Gruppen X und Y modifiziert, wobei die X- und Y-Gruppen eine chemische Bindung eingehen könnten. Die für die CAR verwendeten Oligonukleotidsonden sind in 1 dargestellt, wobei die vertikale Linie die Grenze zwischen langen und kurzen Sequenz markiert.
    • (f) Wenn diese Oligonukleotidsonden mit einer doppelsträngigen Sequenz in Kontakt gebracht werden, bestehend aus einer Zielsequenz und einer Zielkomplementärsequenz, kommt es zu den in 2 veranschaulichten Hybridisierungen.
  • Beim CAR-Verfahren dienen lange Sequenzen der zielorientierten Hybridisierung, während kurzen Sequenzen eine duale Funktion zukommt: (a) Sie schirmen ab und schränken dadurch die Interaktion zwischen chemisch aktiven X- und Y-Gruppen ein, wenn lange Sequenzen nicht mit der Zielsequenz hybridisiert werden; (b) sie bringen chemisch aktive X- und Y-Gruppen einander nahe genug und richten sie so aus, dass deren Interaktion begünstigt wird, wenn lange Sequenzen mit der Zielsequenz hybridisiert werden, was zu einer Hybridisierung zwischen den kurzen Sequenzen führt.
  • Jedoch ist dieses Verfahren mit einem größeren Nachteil behaftet, da sich eine (in 3 dargestellte) kreuzähnliche Struktur mit hoher thermodynamischer Stabilität bilden und nach Amplifikation in einem Template-unabhängigen falsch positiven Amplifikationsprodukt resultieren kann.
  • Ein weiterer Nachteil des obigen Verfahrens besteht in seiner Unfähigkeit, zwischen Zielnukleinsäuresequenzen zu differenzieren, die sich durch eine winzige Sequenzänderung unterscheiden, z.B. durch eine Punktmutation, welche eine Veränderung eines einzelnen Basenpaars darstellt. Deshalb eignet sich das CAR-Verfahren nicht für den Nachweis so winziger Sequenzänderungen wie z. B. Punktmutationen.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein einfaches, schnelles und hochgenaues Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis von Zielsequenzen zu bieten, das weder Polymerase noch Ligase einsetzt und irreführende Hintergrundsignale verringert, wodurch eine chemische Amplifikationsreaktion einer Nukleinsäure an Zuverlässigkeit gewinnt.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein sensibles Verfahren zur chemischen Amplifikation von Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, das ausreichend sensibel ist, um Nukleinsäuresequenzen diskriminierend zu amplifizieren, welche sich durch eine winzige Sequenzänderung voneinander unterscheiden, z.B. durch eine Veränderung eines einzelnen Basenpaares wie einer Punktmutation.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Diagnostik-Kit zu bieten, der zur Durchführung des obigen erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt ist und der einen in situ Nachweis ermöglicht, d.h. ein Nachweisverfahren, aus dem ein mit der Amplfikation verknüpftes nachweisbares Signal hervorgeht, ohne dass es notwendig wäre, das Reaktionsgefäß nach der Amplifikation erneut zu öffnen; dadurch verringert das Verfahren das Problem, das die Kontamination durch vorherige Amplifikationsprodukte aufwirft, und somit auch die Zahl falsch positiver Ergebnisse.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und einen Kit zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz, die in einer Testprobe vorhanden sein kann. Das Verfahren ist ausreichend sensibel, um Sequenzen zu unterscheiden, die voneinander durch eine winzige Sequenzänderung differieren, z.B. durch eine Punktmutation, die eine Veränderung eines einzelnen Basenpaars darstellt. Das Verfahren kann sowohl einen Amplifikationsprozess als auch einen Nachweisprozess einsetzen. Diese und weitere Aufgaben, wie für Fachleute auf diesem Gebiet offensichtlich, werden durch ein Verfahren erfüllt, das dazu dient, ein aus einer Zielsequenz bestehendes einzelsträngiges Nukleinsäurezielmolekül oder ein aus einer Zielsequenz und einer Zielkomplementärsequenz bestehendes doppelsträngiges Nukleinsäurezielmolekül in einer Probe zu amplifizieren und nachzuweisen.
  • Die Amplifikation erfolgt durch die Verwendung von mindestens zwei Oligonukleotidsondenkomplementpaaren, wobei Teile von Oligonukleotidsonden aus beiden Paaren der Oligonukleotidsondenkomplementpaare zwei Oligonukleotidsondenpaare bilden, welche komplementär zu einem gegebenen Abschnitt der Zielnukleinsäuresequenz und der Zielnukleinsäurekomplementärsequenz sind, sollte sie bestehen, welche als Templates fungieren. Die Nukleotidsequenz der Teile jedes Paars Oligonukleotidsonden wird so ausgewählt, dass sie zu einem anderen Abschnitt der Zielnukleinsäuresequenz komplementär ist, damit jedes Oligonukleotidsondenpaar im Wesentlichen eine vordefinierte Nukleotidstrecke der Zielsequenz in einer nicht-angrenzenden Weise abdeckt. Der Amplifikationsmodus, der durch diese einzigartigen Oligonukleotidsondenpaare bedingt ist, besteht aus den folgenden Schritten:
    In Kontakt Bringen eines ersten Oligonukleotidsondenkomplementpaars und eines zweiten Oligonukleotidsondenkomplementpaars mit Abschnitten von Nukleotidbasen, die in den maßgeblichen Nukleinsäuren vorhanden sind, wobei:
    • (i) das erste Oligonukleotidsondenkomplementpaar aus Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 1' und das zweite Oligonukleotidsondenkomplementpaar aus Oligonukleotidsonde 2 und Oligonukleotidsonde 2' besteht;
    • (ii) Oligonukleotidsonde 1 aus einer Targeting-Sequenz A, die einen langen Teil α und einen kurzen Teil α' enthält, und einer Schutzsequenz B besteht; Oligonukleotidsonde 1' aus einer Targeting-Sequenz A' und einer Schutzsequenz B' besteht;
    • (iii) Oligonukleotidsonde 2 aus einer Targeting-Sequenz C besteht; Oligonukleotidsonde 2' aus einer Targeting-Sequenz C' besteht, die einen langen Teil γ und einen kurzen Teil γ' enthält;
    • (iv) Teil α von Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' komplementär zueinander sind;
    • (v) Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 und Teil γ von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' komplementär zueinander sind; Teil γ' von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' und Teil α' von Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 komplementär zueinander sind;
    • (vi) Oligonukleotidsonden 1 und 2 ein erstes Oligonukleotidpaar bilden, wobei Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 komplementär zu benachbarten Abschnitten der Targeting-Sequenz sind;
    • (vii) Oligonukleotidsonden 1' und 2' ein zweites Oligonukleotidpaar bilden, wobei Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' komplementär zu benachbarten Abschnitten der Zielkomplementärsequenz sind;
    • (viii) Schutzsequenz B nicht an die Zielsequenz hybridisiert, wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C an die Zielsequenz hybridisieren;
    • (ix) Schutzsequenz B' nicht an die Zielkomplementärsequenz hybridisiert, wenn Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' an die Zielkomplementärsequenz hybridisieren;
    • (x) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz B, eine chemische funktionelle Gruppe X1 an der Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids in Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X1 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 reaktiv ist;
    • (xi) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz B', eine chemische funktionelle Gruppe X2 an die Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids in Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 reaktiv ist;
    • (xii) wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C an die Zielsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X1 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein komplementärer Strang eines zusammengefügten Oligonukleotid- (d.h. Amplifikations-) Produkts gebildet wird; wenn Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' an die Ziellcomplementärsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein komplementärer Strang eines Amplifikationsprodukts gebildet wird; Schaffen von Hybridisierungsbedingungen, um Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 in die Lage zu versetzen, mit benachbarten Abschnitten der Zielsequenz zu hybridisieren, und um Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' in die Lage zu versetzen, mit benachbarten Abschnitten der Zielkomplementärsequenz zu hybridisieren; Schaffen von Bedingungen, welche das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 2, die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Zielsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Herstellen einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X1 und Y1, wodurch ein erstes zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Zielkomplementärsequenz besitzt; Schaffen von Bedingungen, die das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 1' und Oligonukleotidsonde 2', die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Zielkomplementärsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Herstellen einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X2 und Y2, wodurch ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Zielsequenz besitzt;
    • (e) Behandeln der Probe unter Denaturierungsbedingungen;
    • (f) Wiederholen der Schritte (b) bis (e) so oft, wie gewünscht; und
    • (g) Nachweisen der zusammengefügten Oligonukleotidprodukte.
  • Das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignet sich weiterhin für den Nachweis einer winzigen Sequenzänderung, z.B. einer Punktmutation, die eine Veränderung eines einzelnen Basenpaares darstellt, in einer Zielnukleinsäuresequenz. Zu diesem Zweck werden zwei Gruppen mit jeweils vier Oligonukleotidsonden konstruiert. Die erste Gruppe hat die Amplifikation einer Wildtyp-Zielnukleinsäuresequenz und einer Wildtyp-Zielnukleinsäurekomplementärsequenz zum Zweck, wohingegen die zweite Gruppe auf die Amplifikation einer Mutantenzielnukleinsäuresequenz und einer Mutantenzielnukleinsäurekomplementärsequenz gerichtet ist. Die Oligonukleotidsondengruppen werden den folgenden Schritten entsprechend eingesetzt:
    • (a) In Kontakt Bringen einer ersten und einer zweiten Oligonukleotidsondengruppe mit Abschnitten von Nukleotidbasen, die in den maßgeblichen Nukleinsäuren vorhanden sind, wobei:
    • (i) die erste Oligonukleotidsondengruppe konstruiert ist, um die Wildtyp-Sequenzen zu amplifizieren und vier, mit 1, 1', 2 und 2' bezeichnete Oligonukleotidsonden enthält, die in ihrem Aufbau den oben beschriebenen ähneln; Oligonukleotidsonden 1 und 1' ein erstes Oligonukleotidsondenkomplementärpaar bilden; Oligonukleotidsonden 2 und 2' ein zweites Oligonukleotidsondenkomplementärpaar bilden; Oligonukleotidsonden 1 und 2 ein erstes Oligonukleotidsondenpaar bilden; Oligonukleotidsonden 1' und 2' ein zweites Oligonukleotidsondenpaar bilden;
    • (ii) die zweite Oligonukleotidsondengruppe konstruiert ist, um die Mutantensequenzen zu amplifizieren, und vier, mit 3, 3', 4 und 4' bezeichnete Oligonukleotidsonden enthält, die in ihrem Aufbau jeweils Oligonukleotidsonden 1, 1', 2 und 2' der ersten Oligonukleotidsondengruppe ähneln; Oligonukleotidsonden 3 und 3' ein drittes Oligonukleotidsondenkomplementärpaar bilden; Oligonukleotidsonden 4 und 4' ein viertes Oligonukleotidsondenkomplementärpaar bilden; Oligonukleotidsonden 3 und 4 ein drittes Oligonukleotidsondenpaar bilden; Oligonukleotidsonden 3' und 4' ein viertes Oligonukleotidsondenpaar bilden;
    • (iii) Oligonukleotidsonden 1 und 3 jeweils aus einer Targeting-Sequenz A, die einen langen Teil α und einen kurzen Teil α' enthält, und jeweils aus einer Schutzsequenz B und D bestehen; Oligonukleotidsonde 1' und 3' jeweils aus einer Zielsequenz A' und jeweils aus einer Schutzsequenz B' und D' bestehen;
    • (iv) Oligonukleotidsonden 2 und 4 jeweils aus einer Targeting-Sequenz C bestehen; Oligonukleotidsonden 2' und 4' jeweils aus einer Targeting-Sequenz C' bestehen, die einen langen Teil γund einen kurzen Teil γ' enthält;
    • (v) Teil α von Targeting-Sequenzen A von Oligonukleotidsonden 1 und 3 und Targeting-Sequenzen A' von Oligonukleotidsonden 1' und 3' jeweils komplementär zueinander sind;
    • (vi) Targeting-Sequenzen C von Oligonukleotidsonden 2 und 4 und Teil γ von Targeting-Sequenzen C' von Oligonukleotidsonden 2' und 4' jeweils komplementär zueinander sind; Teil γ' von Targeting-Sequenzen C' von Oligonukleotidsonden 2' und 4' und Teil α' von Sequenzen A von Oligonukleotidsonden 1 und 3 jeweils komplementär zueinander sind;
    • (vii) die Sequenz von Oligonukleotidsonden 3' und 4 der zweiten Oligonukleotidsondengruppe jeweils identisch oder sehr ähnlich zu der Sequenz von Oligonukleotidsonden 1' und 2 der ersten Oligonukleotidsondengruppe ist; die Sequenz von Oligonukleotidsonden 3 und 4' der zweiten Oligonukleotidsondengruppe sich jeweils von jener von Oligonukleotidsonden 1 und 2' der ersten Oligonukleotidsondengruppe unterscheidet, und zwar in einer Position einer zu bestimmenden Sequenzänderung, so dass Oligonukleotidsonden 1 und 2' vollständig komplementär zu jeweils der Wildtyp-Zielsequenz und der Wildtyp-Zielkomplementärsequenz an jener Position sind, und Oligonukleotidsonden 3 und 4' vollständig komplementär zu jeweils der Mutantenzielsequenz und der Mutantenzielkomplementärsequenz an jener Position sind;
    • (viii) Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 komplementär zu benachbarten Abschnitten der Wildtyp-Zielsequenz sind; Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 3 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 4 komplementär zu benachbarten Abschnitten der Mutantenzielsequenz sind;
    • (ix) Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' komplementär zu benachbarten Abschnitten der Wildtyp-Zielkomplementärsequenz sind; Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 3' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 4' komplementär zu benachbarten Abschnitten der Mutantenzielkomplementärsequenz sind;
    • (x) Schutzsequenzen B und D jeweils nicht an die Wildtyp- oder Mutantenzielsequenzen hybridisieren, wenn Targeting-Sequenzen A und Targeting-Sequenzen C an diese Zielsequenzen hybridisieren;
    • (xi) Schutzsequezen B' und D' jeweils nicht an die Wildtyp- oder Mutantenzielkomplementärsequenzen hybridisieren, wenn Targeting-Sequenzen A' und Targeting-Sequenzen C' an diese Zielkomplementärsequenzen hybridisieren;
    • (xii) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz B von Oligonukleotidsonde 1 eine chemische funktionelle Gruppe X1 an die Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids von Sequenz A angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X1 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 reaktiv ist;
    • (xiii) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz D von Oligonukleotidsonde 3 eine chemische funktionelle Gruppe X3 an die Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids von Sequenz A angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 4 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y3 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X3 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y3 reaktiv ist;
    • (xiv) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz B' von Oligonukleotidsonde 1' eine chemische funktionelle Gruppe X2 an die Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids von Sequenz A' angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 reaktiv ist;
    • (xv) in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz D' von Oligonukleotidsonde 3' eine chemische funktionelle Gruppe X4 an die Zucker- oder Basen-Moiety des letzten Nukleotids von Sequenz A' angebracht wird; die Zucker- oder Basen-Moiety des End-Nukleotids von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 4' mit der chemischen funktionellen Gruppe Y4 modifiziert wird; die chemische funktionelle Gruppe X4 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y4 reaktiv ist;
    • (xvi) wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C von jeweils Oligonukleotidsonden 1 und 2 an eine Wildtyp-Zielsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X1 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y1 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein komplementärer Strang eines zusammengefügten Oligonukleotidprodukts vom Wildtyp gebildet wird; wenn Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonden 1' und 2' an eine Wildtyp-Zielkomplementärsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X2 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y2 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein Strang eines zusammengefügten Oligonukleotidprodukts vom Wildtyp gebildet wird;
    • (xvii) wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C von jeweils Oligonukleotidsonden 3 und 4 an eine Mutantenzielsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X3 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y3 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein komplementärer Strang eines mutanten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts gebildet wird; wenn Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' von jeweils Oligonukleotidsonden 3' und 4' an eine Mutantenzielkomplementärsequenz hybridisieren, die chemische funktionelle Gruppe X4 mit der chemischen funktionellen Gruppe Y4 reagiert, um eine chemische Bindung herzustellen, und ein Strang eines mutanten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts gebildet wird;
    • (b) Schaffen von Hybridisierungsbedingungen, damit:
    • (i) Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 mit benachbarten Abschnitten der Wildtyp-Zielsequenz hybridisieren;
    • (ii) Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' mit benachbarten Abschnitten der Wildtyp-Zielkomplementärsequenz hybridisieren;
    • (iii) Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 3 und Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 4 mit benachbarten Abschnitten der Mutantenzielsequenz hybridisieren;
    • (iv) Targeting-Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 3' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 4' mit benachbarten Abschnitten der Mutantenzielkomplementärsequenz hybridisieren;
    • (c) Schaffen von Bedingungen, welche das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 2, die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Wildtyp-Zielsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Herstellen einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X1 und Y1, wodurch ein erstes zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Wildtyp-Zielkomplementärsequenz aufweist;
    • (d) Schaffen von Bedingungen, welche das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 1' und Oligonukleotidsonde 2', die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Wildtyp-Zielkomplementärsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Bilden einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X2 und Y2, wodurch ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Wildtyp-Zielsequenz aufweist;
    • (e) Schaffen von Bedingungen, welche das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 3 und Oligonukleotidsonde 4, die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Mutantenzielsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Herstellen einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X3 und Y3, wodurch ein erstes zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Mutantenzielkomplementärsequenz aufweist;
    • (f) Schaffen von Bedingungen, die das Zusammenfügen von Oligonukleotidsonde 3' und Oligonukleotidsonde 4', die nach Schritt (b) an benachbarte Abschnitte der Mutantenzielkomplementärsequenz hybridisiert sind, miteinander ermöglichen, durch Herstellen einer chemischen Bindung zwischen chemischen funktionellen Gruppen X4 und Y4, wodurch ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt gebildet wird, das die Mutantenzielsequenz aufweist;
    • (g) Behandeln der Probe unter Denaturierungsbedingungen;
    • (h) Wiederholen der Schritte (b) bis (g) so oft, wie gewünscht; und
    • (i) Nachweisen der zusammengefügten Oligonukleotidprodukte.
  • Darüber hinaus wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Diagnostik-Kit zum Amplifizieren spezifischer Nukleotidsequenzen einer Probe geboten, der aus zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaaren und mindestens einem Puffer besteht.
  • Eine unkomplizierte Herangehensweise, um einen in situ Nachweis von Amplifikationsprodukten zu erreichen, d.h. ein Nachweisverfahren, welches kein Öffnen der Testgefäße nach Amplifikation beinhaltet, besteht darin, die chemischen funktionellen Gruppen der X-Typen und der Y-Typen so zu konstruieren, dass sie eine nachweisbare Verbindung eingehen, wenn eine chemische Bindung zwischen ihnen hergestellt wird.
  • In Abhängigkeit von ihrer chemischen Natur kann die nachweisbare Verbindung beispielsweise kolorimetrisch in OD-Einheiten oder fluorimetrisch erfasst werden. Auch mittels direkt oder indirekt gelabelter Antikörper, z.B. monoklonaler Antikörper, die gegen die Verbindung gezüchtet wurden, lässt sich die Verbindung nachweisen.
  • Während der Durchführung des oben beschriebenen Amplifikationsverfahrens werden mindestens zwei einzelsträngige Produkte, B und B' und/oder D und D', hergestellt. Diese einzelsträngigen Sequenzen sind für zusammengefügte Oligonukleotidprodukte einzigartig; aus diesem Grund werden einige oder alle von ihnen eingesetzt, um die Anwesenheit zusammengefügter Oligonukleotidprodukte in Übereinstimmung mit zwei alternativen Nachweisverfahren zu erfassen. Der Einfachheit halber wird das Nachweisverfahren hierin anhand der ersten Oligonukleotidsondengruppe beschrieben. Selbstverständlich ist bei der zweiten Oligonukleotidsondengruppe eine ähnliche Herangehensweise möglich.
  • Bei dem ersten Nachweisverfahren werden zwei gelabelte Nachweisoligonukleotidsonden in einem Nachweisprozess benützt, der Proximitätsenergietransferlabeling umfasst. Als erste Nachweisoligonukleotidsonden dienen Schutzsequenz B und/oder B' von den jeweiligen Oligonukleotidsonden 1 und 1'. An die erste Nachweisoligonukleotidsonde wird eine Proximitätslabel-Moiety R1 konjuiert. An die zweite Nachweisoligonukleotidsonde B.1 und/oder B'.1 wird eine entsprechende zweite Proximitätslabel-Moiety R2 konjugiert. Die zweiten Nachweisoligonukleotidsonden B.1 und B'.1 können außerdem direkt oder indirekt verbunden werden, um ein kontinuierliches Molekül B.1–B'.1 zu bilden. Die zweiten Nachweisoligonukleotidsonden B.1. und B'.1 sind jeweils komplementär zu den Schutzsequenzen B und B'. Die erste und zweite gelabelte Nachweisoligonukleotidsonde hybridisieren aneinander und bringen daher die Proximitätslabel-Moieties R1 und R2 in eine Nähe zueinander, die für deren Interaktion zwecks Erzeugung eines nachweisbaren Signals ausreicht. Bei der Hybridisierung der beiden gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden werden die Proximitätslabel-Moieties R1 und R2 einander ausreichend nahe gebracht, damit eine Energietransferreaktion zwischen ihnen stattfindet, die in einer messbaren Energieabgabe resultiert.
  • Das zweite Nachweisverfahren für die Amplifikationsprodukte basiert auf der Freisetzung einer Label-Moiety L, die an einzelsträngige B und/oder B'-Sequenzen konjugiert ist, die in zusammengefügte Oligonukleotidprodukte eingegliedert werden, und der Entfernung aller doppelsträngigen B- und B'-Sequenzen gemeinsam mit den Label-Moieties L, die an dieselben aus dem Testgefäß mittels einer an die Oligonukleotidsonden 1 und/oder 1' konjugierten Affinitätseparation-Moiety S konjugiert wird. Die einzelsträngigen B- und B'-Sequenzen können nach Amplifikation mittels der Verwendung einer einzelsträngigen spezifischen Nuklease nukleiert werden oder mittels eines geeigneten chemischen Verfahrens, das in der Abgabe der Label-Moiety L, welche an dieselben konjugiert ist, an die umgebende Lösung resultiert. An eine oder mehr Stellen einer oder mehr der Oligonukleotidsonden, die in der Amplifikationsreaktion Verwendung finden, werden eine oder mehr Affinitätsseparation-Moieties S konjugiert. Die Affinitätsseparation-Moiety S charakterisiert sich durch ihre Fähigkeit, eine Gegensubstanz-Moiety S' mit hoher Affinität zu binden. Die Gegensubstanz-Affinitätsseparation-Moiety S' ist vorzugsweise auf einem festen Träger angebracht. Im Anschluss an die Amplifikation wird ein einzelsträngiges spezifisches nukleierendes Verfahren angewandt, um einzelsträngige Sequenzen B und B' abzubauen, die in die zusammengefügten Oligonukleotidprodukte eingegliedert sind. Ergebnis der Nukleolyse ist die Abgabe der Label-Moiety L an die Lösung in einer zum Amplifikationslevel proportionalen Menge. Label-Moieties L, die nicht in dieser Weise freigesetzt werden, also Label-Moieties, die an Sequenzen B oder B' konjugiert sind, die nicht in zusammengefügte Oligonukleotidprodukte eingegliedert wurden, werden durch Affinitätssepartation entfernt. Somit lassen sich diese freigesetzten Label-Moieties L nachweisen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein Diagnostik-Kit zum Nachweis der Anwesenheit spezifischer Nukleotidsequenzen in Proben geboten, welcher wie folgt umfasst: (a) zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaare; (b) zwei oder mehr an eine Proximitätslabeling-Moiety konjugierte Nachweisoligonukleotidsonden; und (c) mindestens einen Puffer;
    oder alternativ Folgendes aufweist: (a) zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaare, von denen eines oder mehr an eine Separations-Moiety konjugiert sind und eines oder mehr an eine Label-Moiety konjugiert sind; (b) eine einzelsträngige spezifische Nuklease; und (e) einen festen Träger für die Affinitätsseparation zusammengefügter Oligonukleotidprodukte.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die hierin gegebene Beschreibung der Erfindung dient lediglich als Beispiel und erfolgt unter Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen, bei welchen:
  • 1 eine schematische Darstellung der Oligonukleotidsonden zeigt, die im CAR (chemisches Amplifikationsreaktions)-Verfahren nach Stand der Technik verwendet werden.
  • 2 eine schematische Darstellung der Hybridisierungen zeigt, welche die Oligonukleotidsonden des CAR-Verfahrens bei Kontakt mit einer Zielnukleinsäuresequenz und einer Zielnukleinsäurekomplementärsequenz kennzeichnen.
  • 3 eine schematische Darstellung einer kreuzähnlichen Struktur mit einer hohen thermodynamischen Stabilität zeigt, welche die Oligonukleotidsonden kennzeichnet, die beim CAR-Verfahren eingesetzt werden, aus dem nach Amplifikation Template-unabhängige falsch positive Amplifikationsprodukte hervorgehen können.
  • 4 eine schematische Darstellung von Oligonukleotidsondenpaaren zeigt, die zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • 5 eine schematische Darstellung von zwölf alternativen Oligonukleotidsondenpaaren zeigt, die zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • 6 eine schematische Darstellung des Aufbaus der Oligonukleotidsonden zeigt, die zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • 7 eine schematische Darstellung der Hybridisierungen zeigt, welche die Oligonukleotidsonden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung bei Kontakt mit einer Zielnukleinsäuresequenz und einer Zielnukleinsäurekomplementärsequenz kennzeichnen.
  • 8 eine schematische Darstellung einer Oligonukleotidsondenstruktur mit hoher thermodynamischer Stabilität ist, die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • 9 eine schematische Darstellung der Formation zusammengefügter Oligonukleotidprodukte während der Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist.
  • 10 Adeninderivate A1, A2, A3 und A4 zeigt, die mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z modifiziert sind.
  • 11 Cytidinderivate C1, C2, C3 und C4 zeigt, die mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z modifiziert sind.
  • 12 Guaninderivate G1, G2, G3 und G4 zeigt, die mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z modifiziert sind.
  • 13 Thymidinderivate T1, T2, T3 und T4 zeigt, die mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z modifiziert sind.
  • 14 Uridinderivate U1, U2, U3 und U4 zeigt, die mit einer chemisch funktionellen Gruppe Z modifiziert sind.
  • 15 die bevorzugte Ausführungsform für eine Diels-Alder-Reaktion veranschaulicht, wobei es sich um ein System handelt, in dem Uridin an der C-5-Position modifiziert wird, um ein Dien zu bilden, das in den Oligonukleotidsonden 1, 1', 3 und 3' als chemische funktionelle Gruppe, z.B. X, agiert. Demgegenüber wird am Ende von Targeting-Sequenzen C und C' der Zucker an der C-2'-Position durch 2-Butendisäure modifiziert, die als chemische funktionelle Gruppe, z.B. Y, fungiert.
  • 16 eine verallgemeinerte Darstellung von Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C oder von Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' zeigt, welche an die Zielnukleinsäuresequenz oder die Zielsäurekomplementärsequenz hybridisiert sind, wobei die chemischen funktionellen Gruppen an den Nukleotidbasen angebracht sind.
  • 17 eine verallgemeinerte Darstellung von Oligonukleotidsonden zeigt, die an ein doppelsträngiges Zielmolekül hybridisiert und durch chemische funktionelle Gruppen zusammengefügt sind, um ein erstes und ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt zu bilden.
  • 18 eine schematische Darstellung des ersten Zyklus in dem Amplifikationsverfahren für eine doppelsträngige Sequenz zeigt, welches die Hybridisierung der Oligonukleotidsonden an die Zielsequenz und die Zielkomplementärsequenz umfasst und das Zusammenfügen der Oligonukleotidsonden mittels der chemischen funktionellen Gruppen, um zusammengefügte Oligonukleotidprodukte zu bilden.
  • 19 eine schematische Darstellung der Bildung zusammengefügter Oligonukleotidsonden mittels der chemischen funktionellen Gruppen zeigt, in deren Anschluss die Denaturierung der ersten und zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukte aus jeweils den Zielsequenzen und den Zielkomplementärsequenzen stattfindet.
  • 20 eine verallgemeinerte Darstellung der Fähigkeit der ersten und zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukte zeigt, als Templates für die Bildung zusätzlicher, jeweils erster und zweiter zusammengefügter Oligonukleotidprodukte zu fungieren, und zwar während des zweiten und aller nachfolgender Zyklen des Amplifikationsprozesses.
  • 21 die Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Oligonukleotidsonden verdeutlicht, welche die erste und zweite Oligonukleotidsondengruppe bilden, die auf die diskriminierende Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen gerichtet sind, die sich durch eine A → G Punktmutation unterscheiden.
  • 22 einen Fall veranschaulicht, wo die wichtigsten chemischen funktionellen Gruppen, also jene, welche die tertiäre Struktur der hybridisierten Sequenzen auf ein zulässiges Maß verzerren, das die Verwendung von Oligonukleotidsondenkomplementärpaaren mit der gleichen Länge ermöglicht, benützt werden, wobei die modifizierten Nukleotide selbst, an welche die chemischen funktionellen Gruppen konjugiert sind, als die unterscheidenden Amplifikationssequenzen agieren.
  • 23 eine schematische Darstellung der einzelsträngigen B und B' Schutzsequenzen zeigt, die während des Amplifikationsprozesses des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
  • 24 eine schematische Darstellung der gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden zeigt, die in einem in situ Nachweisverfahren benützt werden, welches Proximitätsenergietransferlabeling umfasst.
  • 25 eine schematische Darstellung der gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden zeigt, die in einem in situ Nachweisverfahren verwendet werden, welches Proximitätsenergietransferlabeling umfasst, wobei die Hybridisierung zu der Bildung von Aggregaten führt, die aus einer variablen Anzahl zusammengefügter Oligonukleotidprodukte bestehen, die via das B.1–B'1 Molekül aneinander gekoppelt sind.
  • 26 eine schematische Darstellung eines in situ Nachweisverfahrens zeigt, welches die Freisetzung und den Nachweis einer Label-Moiety L aus einzelsträngigen B- und B'-Schutzsequenzen mittels der Aktivität einer einzelsträngigen spezifischen Nuklease umfasst und die Entfernung von Label-Moieties L, die damit nicht mittels der Affinitätsseparation freigesetzt werden.
  • 27 eine schematische Darstellung eines Reagenzgefäßes zeigt, das zur Affinitätsseparation dient.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um ein neuartiges nichtenzymatisches Verfahren zur Amplifikation und zum Nachweis bestehender Zielnukleinsäuresequenzen in einer Testprobe und um Kits zur Verwendung bei der Durchführung besagten Verfahrens. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann sowohl eine Amplifikationsmethode als auch eine Nachweismethode anwenden und ist weiterhin nutzvoll beim Nachweis winziger Sequenzänderungen wie Punktmutationen, die Veränderungen eines einzelnen Basenpaares darstellen.
  • Die Prinzipien und die Funktionsweise des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erschließen sich besserem Verständnis anhand der Beschreibung und der begleitenden Zeichnungen.
  • Die vorliegende Erfindung wird detailliert beschrieben, wobei der Schwerpunkt sowohl auf einem Verfahren zur Identifizierung der Anwesenheit einer Zielnukleinsäuresequenz in einer untersuchten Probe liegt als auch auf einem Verfahren zur Identifizierung winziger Sequenzänderungen in Genen, welche mit genetischen Störungen in Zusammenhang stehen. Obgleich den nachstehend genannten Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenwärtig der Vorzug gegen wird, handelt es sich bei diesen keinesfalls um die einzigen Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung, was für Fachleute auf diesem Gebiet sicherlich selbstverständlich ist. Beispielsweise verfügt das Verfahren über zahlreiche andere Anwendungsbereiche, wozu auch der Nachweis spezifischer genetischer Sequenzen in einer Probe gehört, z.B. jener Sequenzen, die wie der HLA-Locus mit bestimmten genetischen Polymorphismen assoziiert werden; ferner lassen sich, um nur einige zu nennen, Vaterschaftstests, Techniken in der Gerichtsmedizin und die Diagnose bestimmter Krebsarten anführen.
  • Nachstehend werden Definitionen der folgenden Begriffe gegeben, welche deren Gebrauch hierin entsprechen.
  • Zielnukleinsäuresequenz
  • Der Prozess der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, eine geometrische Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz zu erzeugen, vorausgesetzt dass zumindest ein Teil der Nukleotidsequenz in seinen Einzelheiten ausreichend bekannt ist, damit sich komplementäre Oligonukleotidsondenpaare synthetisieren lassen. Die „Amplifikation", welche durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht wird, bezeichnet eine Vergrößerung der Menge gewünschter, in einem Reaktionsgefäß vorhandener Nukleinsäuremoleküle. Unter einer „substantiellen Amplifikation" ist eine mehr als etwa 100-fache Amplifikation zu verstehen. Bei der Zielnukleinsäuresequenz, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifiziert wird, kann es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA, einzelsträngige oder doppelsträngige RNA, einzelsträngige oder doppelsträngige Proteinnukleinsäure (PNA) oder um ein Hybrid aus DNA, RNA und/oder PNA handeln. Da keine Enzyme in dem Amplifikationsprozess der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, kann die Zielsequenz gereinigt sein oder nicht. Die Nukleinsäureprobe kann jeder beliebigen Quelle entnommen werden, sei sie natürlich oder synthetisch, und sich zusammensetzen aus Deoxyribonukleinsäuren, Ribonukleinsäuren oder Deoxyribonukleinsäure- und Ribonukleinsäure-Copolymeren oder auch aus Kombinationen derselben. Die relevante Nukleinsäure lässt sich enzymatisch in vitro synthetisieren oder auch in nicht enzymatischer Weise. Die Probe, welche die maßgebliche(n) Nukleinsäure(n) enthält, kann weiterhin extragenomische DNA aus einem Organismus aufweisen, RNA Transkripte derselben oder cDNA, die aus RNA Transkripten derselben hergestellt ist. Außerdem lässt/lassen sich die relevante(n) Nukleinsäure(n) mittels der Polymerase- oder Ligasekettenreaktion synthetisieren.
  • Die Zellen, welche die Zielnukleinsäuresequenz enthalten, können unter Anwesenheit der Reagenzien lysiert werden, die bei der Realisierung des Verfahrens Anwendung finden. Typischerweise wird die Probe zu einem Maß behandelt, das zur Entfernung von Fremdstoffen ausreicht, die andernfalls die Amplifikation der Nukleinsäure beeinträchtigen könnten. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise die Präparation einer Serumprobe zur Analyse in deren einstündiger Inkubation bestehen, und zwar bei 70°C in Anwesenheit von Proteinase K mit einer Konzentration von 2.5 mg/ml in 25 ml MOPS (pH 6.5), 2.5 mM EDTA und 0.5% SDS. Im Anschluss an diese Behandlung ist die Probe ohne weitere Reinigungsschritte zur Amplifikation parat.
  • Die Nukleinsäureprobe enthält die spezifischen Nukleotidsequenzen, an welche die Oligonukleotidsonden hybridisieren. Wenn eine Zielsequenz doppelsträngig ist, beinhaltet sie eine Zielsequenz und deren Komplement, die sogenannte Zielkomplementärsequenz. Zwar kann die Zielsequenz so kurz sein, dass sie nur 12 Nukleotide aufweist, aber vorzugsweise umfasst sie mindestens sechzehn Nukleotide und noch besser mindestens zwanzig Nukleotide. Eine Höchstanzahl für Nukleotide in der Zielsequenz oder der Zielkomplementärsequenz, welche entweder einen Abschnitt der Nukleinsäureprobe oder die gesamte Nukleinsäureprobe darstellen kann, besteht nicht.
  • Die Moleküle, die sich mittels des erfundenen Verfahrens amplifizieren lassen, sind u.a. enthalten in genetischem Material in Form von DNA oder RNA, das aus beliebigen natürlich vorkommenden Prokaryoten erhalten wird, z.B. pathogene oder nichtpathogene Bakterien, zu denen u.a. die Arten Escherichia, Salmonella, Clostridium, Chlamydia, etc. gehören; des Weiteren anzuführen sind Eukarioten von z.B. tierischen Einzellern und Parasiten, Pilzen, Hefe, höheren Pflanzen, niederen und höheren Tieren, einschließlich Säugetieren und Menschen und Zellen in Gewebekulturen; auch Viren sind zu nennen, z.B. Herpesviren, HIV, das Influenza-Virus, das Epstein-Barr-Virus, das Hepatitis-B-Virus, etc. Ferner kann es sich bei den Nukleinsäuremolekülen um irgendwelche Nukleinsäuremoleküle handeln, die chemisch oder enzymatisch synthetisiert wurden/werden können.
  • DNA oder RNA aus diesen Quellen sind beispielsweise in Körperflüssigkeitsproben eines Lebewesens, einschließlich eines Menschen, anzutreffen, u.a. in Blut, Urin, Lymphflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Schleim, Speichel, Menstruationsflüssigkeit und Sperma. Außerdem lassen sich Proben, die DNA oder RNA aufweisen, z.B. in pflanzlichen Fluiden finden, u.a. in Xylemflüssigkeit, Phloemflüssigkeit und Pflanzenexsudaten. DNA oder RNA enthaltende Proben können beispielsweise auch aus nicht lebenden Quellen stammen, u.a. aus Lebensmitteln, Abwässern, forensischen Proben, Seen, Reservoirs, Flüssen und Meeren.
  • Das Nukleinsäurezielmolekül, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden soll, kann entweder einzel- oder doppelsträngig sein. In jenem Fall allerdings, in dem das Nukleinsäurezielmolekül doppelsträngig ist, wird es vorzugsweise zunächst mittels eines Denaturierungsagens behandelt, um den beiden Strängen eine einzelsträngige oder teilweise einzelsträngige Form zu geben, und zwar bei Beginn der Amplifikationsreaktion und durch Verfahren, die nach Stand der Technik bekannt sind, z.B. durch Erhitzen, Alkalibehandlung oder enzymatische Verfahren. Übliche Methoden zur Durchführung dieser Behandlung werden dargelegt von Sambrook, J., u.a. in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • Komplementarität
  • Unter „aneinander hybridisieren", wie hierin verwendet, ist zu verstehen, dass zwei Sequenzen in der Lage sind, eine anti-parallele doppelsträngige Nukleinsäurestruktur zu bilden. Als „komplementär" werden zwei Nukleinsäuremoleküle bezeichnet, wenn sie mit einer Stabilität aneinander hybridisieren können, die ausreicht, damit sie unter zumindest herkömmlichen Bedingungen „geringer Stringenz" aneinander gelagert bleiben. (Diese Bedingungen werden von Sambrook beschrieben, dito).
  • Somit müssen zwei komplementäre Moleküle nicht eine präzise Komplementarität vorweisen, sondern lediglich ausreichend komplementär im Bezug auf ihre Sequenz sein, damit sie eine stabile doppelsträngige Struktur bilden können. Dementsprechend sind Abweichungen von einer vollständigen Komplementarität zulässig, solange derartige Abweichungen nicht ausreichen, um eine Hybridisierung zur Bildung einer doppelsträngigen Struktur völlig auszuschließen.
  • Oligonukleotidsondenkomplementpaar
  • Der Begriff „Oligonukleotidsondenkomplementpaar", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich auf zwei verschiedene Oligonukleotidsonden, die beispielsweise als Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 1' oder als Oligonukleotidsonde 2 und Oligonukleotidsonde 2' bezeichnet werden, wie 4 zeigt. Oligonukleotidsonden 1 und 1', Oligonukleotidsonden 2 und 2', Oligonukleotidsonden 3 und 3' und auch Oligonukleotidsonden 4 und 4' teilen komplementäre Sequenzregionen, wie gleich im Detail erläutert. Jede Oligonukleotidsonde eines Komplementpaares aus Oligonukleotidsonden kann die gleiche oder vorzugsweise, wie auf der Zeichnung dargestellt, eine andere Länge aufweisen wie ihr Co-Teil. Selbstverständlich lassen sich mehr als zwei Oligonukleotidsondenkomplementpaare pro Zielsequenz oder Zielkomplementärsequenz während der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwenden.
  • Oligonukleotidsondenpaar
  • Der Begriff „Oligonukleotidsondenpaar", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich auf die Gruppierung von Oligonukleotidsonden 1 und 2 als erstes „Oligonukleotidsondenpaar", die Gruppierung von Oligonukleotidsonden 1' und 2' als zweites „Oligonukleotidsondenpaar", die Gruppierung von Oligonukleotidsonden 3 und 4 als drittes „Oligonukleotidsondenpaar" und die Gruppierung von Oligonukleotidsonden 3' und 4' als viertes „Oligonukleotidsondenpaar".
  • Vorzugsweise sind die Oligonukleotidsonden aus Deoxyribonukleotiden aufgebaut, obgleich Analoge aus Ribonukleotiden und Nukleotiden, unter anderem Proteinnukleinsäure (PNA), einen annehmbaren Ersatz darstellen.
  • Bezugnehmend auf das erste Oligonukleotidsondenkomplementpaar in 4 besitzt Oligonukleotidsonde 1 eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' verfügt über eine Targeting-Sequenz A' und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; und Oligonukleotidsonde 2' weist eine Targeting-Sequenz C' auf. X und Y sind chemische funktionelle Gruppen, wobei X- und Y-Gruppen eine chemische Bindung eingehen könnten. Wie gleich beschrieben, ist die ovale Form, ein einzelsträngiges Looput, ein Teil von Targeting-Sequenz A und komplementär zu dem einzelsträngigen Sequenzabschnitt von Targeting-Sequenz C'.
  • Wie für Fachleute auf diesem Gebiet selbstverständlich, gibt es bei diesen Oligonukleotidsonden zwölf geringfügig verschiedene Versionen der Sequenzanordnung. Diese Versionen sind in 5 veranschaulicht und umfassen wie folgt: (1) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die kürzer ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die länger ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2, und eine Schutzsequenz B'; (2) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting- Sequenz A', die länger ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die kürzer ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2, und eine Schutzsequenz B'; (3) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 hat; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 hat, und eine Schutzsequenz B'; (4) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die kürzer ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1, und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die länger ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2; (5) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die länger ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1, und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die kürzer ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2; (6) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 hat, und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 hat; (7) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die kürzer ist als Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die länger ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2, und eine Schutzsequenz B'; (8) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die länger ist als Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die kürzer ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2, und eine Schutzsequenz B'; (9) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', welche die gleiche Länge wie Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 hat; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 hat, und eine Schutzsequenz B; (10) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', welche kürzer ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1, und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die länger ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2; (11) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', die länger ist als Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1, und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', die kürzer ist als Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2; (12) Oligonukleotidsonde 1 hat eine Targeting-Sequenz A; Oligonukleotidsonde 1' hat eine Targeting-Sequenz A', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 hat, und eine Schutzsequenz B; Oligonukleotidsonde 2 hat eine Targeting-Sequenz C und eine Schutzsequenz B'; Oligonukleotidsonde 2' hat eine Targeting-Sequenz C', welche die gleiche Länge wie Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 hat. Selbstverständlich existieren ähnliche Versionen für Oligonukleotidsonden 3, 3', 4 und 4', wobei Oligonukleotidsonde 3 Ähnlichkeit zu Oligonukleotidsonde 1 besitzt; Oligonukleotidsonde 4 Ähnlichkeit zu Oligonukleotidsonde 2 besitzt; Oligonukleotidsonde 3' Ähnlichkeit zu Oligonukleotidsonde 1' besitzt; und Oligonukleotidsonde 4' Ähnlichkeit zu Oligonukleotidsonde 2' besitzt.
  • Der Einfachheit halber erfolgt jede weitere Beschreibung mit Bezug auf die oben beschriebene vierte Option, bei welcher Oligonukleotidsonde 1 eine Targeting-Sequenz A und eine Schutzsequenz B hat; Oligonukleotidsonde 1' eine Targeting-Sequenz A' und eine Schutzsequenz B' hat; Oligonukleotidsonde 2 eine Targeting-Sequenz C hat; und Oligonukleotidsonde 2' eine Targeting-Sequenz C' hat.
  • Wie in 6 in weiteren Einzelheiten dargestellt, umfasst Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 einen langen Teil α und einen kurzen Teil α' (die Grenze zwischen Teil α und Teil α' ist in der Zeichnung durch eine vertikale Linie gekennzeichnet); Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' umfasst einen langen Teil γ und einen kurzen Teil γ' (die Grenze zwischen Teil γ und Teil γ' ist in der Zeichnung durch eine vertikale Linie gekennzeichnet); Teil α von Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Targeting- Sequenz A' von Oligonukleotidsonde 1' sind zueinander komplementär; Teil α' von Targeting-Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 und Teil γ' von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' sind zueinander komplementär; Targeting-Sequenz C von Oligonukleotidsonde 2 und Teil γ von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' sind zueinander komplementär; Teil γ' von Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonde 2' und Teil α' von Sequenz A von Oligonukleotidsonde 1 sind zueinander komplementär. X und Y sind chemische funktionelle Gruppen, wobei X- und Y-Gruppen eine chemische Bindung bilden könnten. Eine ähnliche Struktur kennzeichnet Oligonukleotidsonden 3, 3', 4 und 4'. Der Einfachheit halber nehmen einige der Beschreibungen hierin nur auf Oligonukleotidsonden 1, 2, 1' und 2' Bezug, obwohl sie, wenn nicht anders vermerkt, auch auf Oligonukleotidsonden 3, 4, 3' und 4' zutreffen.
  • Wenn, wie 7 zeigt, eine Zielnukleinsäuresequenz in einer Testprobe vorhanden ist, sind Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C entweder vollständig komplementär oder ausreichend komplementär zu benachbarten Bereichen der Zielsequenz, um unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen einen stabilen Hybriden zu bilden. Falls ein zu einer Zielnukleinsäuresequenz komplementärer Strang in einer Testprobe vorhanden ist, sind Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' entweder vollständig komplementär zu der Zielkomplementärsequenz oder ausreichend komplementär zu benachbarten Bereichen der Zielkomplementärsequenz, um unter ausgewählten Hybridisierungsbedingungen einen stabilen Hybriden zu bilden.
  • Die Begriffe „benachbarte Bereiche einer Zielsequenz" oder „benachbarte Bereiche einer Zielkomplementärsequenz", wie sie hierin gebraucht werden, betreffen Sequenzen in diesen Nukleinsäuremolekülen, die vorzugsweise unmittelbar aneinander anstoßen und nebeneinander liegen oder, alternativ hierzu, durch eine oder zwei Nukleotidbasen getrennt sind.
  • Der Begriff „anstoßen", wie er hierin gebraucht wird, bezieht sich auf Targeting-Sequenzen A und C oder A' und C', die keine chemische Bindung zwischen ihren 3'-End- und 5'-Endpositionen bilden wie bei der enzymatischen Ligation, sondern chemische Bindungen zwischen den chemischen funktionellen X- und Y-Gruppen formen können, wobei X- und Y-Gruppen eine chemische Bindung bilden könnten, wie nachstehend im Einzelnen erläutert.
  • Die minimale Nukleotidanzahl der Targeting-Sequenzen A und A' und der Targeting-Sequenzen C und C' der relevanten Oligonukleotidsonden entspricht der kleinsten Anzahl, die ausreichende Selektivität bei dem Amplifikations- und Nachweisprozess der vorliegenden Erfindung bietet. Beispielsweise können diese Sequenzen mindestens sechs, vorzugsweise mindestens zwölf und stärker bevorzugt mindestens zwanzig Deoxyribonukleotide, Ribonukleotide oder Analoge von diesen enthalten.
  • Die maximale Länge der Targeting-Sequenzen A und A' und der Targeting-Sequenzen C und C' der maßgeblichen Oligonukleotidsonden ist lediglich durch die Länge der Zielnukleinsäuresequenz in der Testprobe begrenzt. Diese Sequenzen sollten lang genug zur Bildung eines stabilen Hybriden mit der Zielsequenz sein, vorzugsweise aber nicht so lang, dass sie übermäßig viel Zeit zur Hybridisierung benötigen. Einige geeignete Maximallängen dieser Sequenzen umfassen 244 Nukleotide, vorzugsweise 154 Nukleotide und stärker bevorzugt 144 Nukleotide. Einige geeignete Längen für diese Sequenzen weisen 6-144 Nukleotide auf, vorzugsweise 10-70 Nukleotide, stärker bevorzugt 16-50 Nukleotide und am stärksten bevorzugt 18-34 Nukleotide.
  • Die Schutzsequenzen B und B' müssen nicht komplementär zueinander sein, sind dies aber vorzugsweise. Zu einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die in der untersuchten Nukleinsäureprobe vorhanden ist, sind die Schutzsequenzen B und B' vorzugsweise nicht komplementär. Die Schutzsequenzen B und B' können aus einer universalen Zufallssequenz bestehen, können sich aber auch in ihrer Sequenz von einem Oligonukleotidsondenmolekül zum anderen unterscheiden.
  • Die Schutzsequenzen D und D' müssen nicht zueinander komplementär sein, sind dies aber vorzugsweise. Zu einer beliebigen Nukleinsäuresequenz, die in der untersuchten Nukleinsäureprobe vorhanden ist, sind die Schutzsequenzen D und D' vorzugsweise nicht komplementär. Die Schutzsequenzen D und D' können aus einer universalen Zufallssequenz bestehen, können sich aber auch in ihrer Sequenz von einem Oligonukleotidsondenmolekül zum anderen unterscheiden. Bei einigen der Anwendungen, die hierin zu beschreiben sind, können die Schutzsequenzen B und D und die Schutzsequenzen B' und D' identisch sein.
  • Die Schutzsequenzen einer beliebigen Oligonukleotidsonde sind so gestaltet, dass sie nicht an die Zielsequenz hybridisieren, wenn die Targeting-Sequenzen der Oligonukleotidsonden an die Zielsequenz oder die Zielkomplementärsequenz hybridisiert haben. Deshalb wird beispielsweise Schutzsequenz B nicht hybridisiert, wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C an benachbarte Abschnitte der Zielsequenz hybridisieren. Ebenso wird Schutzsequenz B' nicht hybridisiert, wenn die Targeting-Sequenz A' und die Targeting-Sequenz C' an benachbarte Abschnitte der Zielkomplementärsequenz hybridisieren. Diese nicht hybridisierten einzelsträngigen Sequenzen werden für ein Nachweisverfahren in sitze verwendet, wie hierin noch hervorgehoben wird.
  • Der Aufbau der Oligonukleotidsonden wird vorzugsweise so gestaltet, dass der Reaktionspunkt zwischen den chemischen funktionellen Gruppen der Targeting-Sequenzen A und C abseits von dem Reaktionspunkt zwischen den chemischen funktionellen Gruppen der Targeting-Sequenzen A' und C' liegt. Der α'-Teil von Targeting-Sequenz A und der γ'-Teil von Targeting-Sequenz C' sollten lang genug sein, um ein Scheitern der Amplifikation bedingt durch Distorsion der tertiären Struktur der hybridisierten Sequenzen zu vermeiden, welche durch die chemischen funktionellen Gruppen selbst verursacht wird, nachdem sich eine chemische Bindung zwischen ihnen gebildet hat. Die wichtigsten chemischen funktionellen Gruppen wären daher jene, welche die tertiäre Struktur der hybridisierten Sequenzen zu einem zulässigen Maß verzerren, das die Verwendung von Oligonukleotidkomplementärpaaren ermöglicht, welche die gleiche Länge aufweisen; das bedeutet, dass Targeting-Sequenz A genauso lang wie die Targeting-Sequenz A' ist und Targeting-Sequenz C genauso lang wie Targeting-Sequenz C'. In diesen Oligonukleotidsonden ist der Nukleotidgehalt der Teile α' und γ' gleich null.
  • Die maximale Länge einer α'-Sequenz der Targeting-Sequenz A und einer γ'-Sequenz der Targeting-Sequenz C' hängt jeweils ab von dem Längenverhältnis zwischen den α- und den α'-Sequenzen und den γ- und den γ'-Sequenzen. α'- und γ'-Sequenzen, die zu lang sind, können zu der unerwünschten Formation von templateunabhängigen Amplifikationsprodukten führen, und zwar durch Bildung einer stabilen Struktur vom in 8 gezeigten Typ.
  • Keine Einschränkungen hinsichtlich der Länge bestehen, was die Schutzsequenzen B, B', D und D' anbelangt. Dies gestattet einen vielfältigen Einsatz dieser Sequenzen zum Nachweis zusammengefügter Oligonukleotidprodukte, wie hierin beschrieben noch wird.
  • Am Ende von Targeting-Sequenz A, in der Verbindungsstelle zwischen Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz B von Oligonukleotidsonde 1, und am Ende von Targeting-Sequenz A', in der Verbindungsstelle zwischen Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz B' von Oligonukleotidsonde 1', befinden sich chemische funktionelle Gruppen, die jeweils als X1 und X2 bezeichnet werden. An jeder der Targeting-Sequenzen C von Oligonukleotidsonde 2 und C' von Oligonukleotidsonde 2' ist eine chemische funktionelle Gruppe angebracht, die jeweils als Y1 bzw. Y2 bezeichnet wird. Diese chemischen funktionellen Gruppen sind kovalent an der Zucker- und/oder Basen-Moiety eines der Nukleotide in jeder Sequenz angebracht. Wenn die Targeting-Sequenzen A und C der jeweiligen Oligonukleotidsonde 1 oder 2 oder die Targeting-Sequenzen A' und C' der jeweiligen Oligonukleotidsonde 1' oder 2' an die Zielnukleinsäuresequenz oder die Zielnukleinsäurekomplementärsequenz hybridisiert werden, reagieren die jeweiligen chemischen funktionellen Gruppen X1 und Y1 bzw. X2 und Y2 chemisch, um eine chemische Bindung herzustellen, welche jeweils Oligonukleotidsonden 1 und 2 bzw. Oligonukleotidsonden 1' und 2' verbindet, um ein erstes und ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt mit der in 9 dargestellten Form zu schaffen. In einer ähnlichen Weise bilden Oligonukleotidsonden 3 und 4 bzw. Oligonukleotidsonden 3' und 4' zusammengefügte Oligonukleotidprodukte.
  • Wenn die Zielnukleinsäuresequenz und die Zielnukleinsäurekomplementärsequenz nicht in der untersuchten Nukleinsäureprobe vorhanden sind, schützen die Nukleotide, an welchen die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 angebracht sind, und das/die benachbarte(n) Nukleotid(e) in der maßgeblichen Oligonukleotidsonde die chemischen funktionellen Gruppen vor einer Reaktion mit der jeweiligen chemischen funktionellen Gruppe Y1 oder Y2 auf einer anderen Oligonukleotidsonde.
  • Mittels Verfahren, die nach Stand der Technik wohlbekannt sind, lassen sich die Oligonukleotidsondenpaare als Ganzes oder teilweise chemisch aus den vier Nukleotiden synthetisieren. Derartige Verfahren umfassen jene, die beschrieben sind von Caruthers in „Science" 230: 281–285 (1985) und von Beaucage, u.a. in „Tetrahedron Letters" 22: 1859–1862 (1981).
  • Template-Sequenz
  • Der Begriff „Template-Sequenz", wie er hierin gebraucht wird, betrifft die Nukleinsäuresequenz, an welche eine Mehrzahl von Oligonukleotidsondenpaaren oder eine Mehrzahl von Nachweisoligonukleotidsonden hybridisieren. In dem ersten Zyklus des Amplifikationsverfahrens fungieren, wie hierin im Einzelnen beschrieben wird, die Zielnukleinsäuresequenz und die Zielnukleinsäurekomplementärsequenz als Template-Sequenzen. In nachfolgenden Zyklen des Amplifikationsverfahrens und bei dem Nachweisverfahren dienen auch zusammengefügte Oligonukleotidprodukte als Template-Sequenzen, wie hierin noch erläutert wird.
  • Amplifikationsprodukt
  • Der Begriff „Amplifikationsprodukt", wie hierin gebraucht, betrifft jene Nukleinsäuresequenzen, die erzeugt werden, indem Oligonukleotidsondenpaare chemisch miteinander verbunden werden, um zusammengefügte Sequenzen herzustellen;
  • „Irreführendes Amplifikationsnebenprodukt"
  • Der Begriff „Irreführendes Amplifikationsnebenprodukt", wie hierin gebraucht, bezieht sich auf ein Produkt, das aus einer Reaktion zwischen den chemischen funktionellen Gruppen X und Y hervorgeht; diese Reaktion führt zur Verbindung der zu einem Oligonukleotidsondenpaar gehörenden Oligonukleotidsonden, woraus ein zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt entsteht, welches zu einer von der Zielnukleinsäuresequenz oder der Zielnukleinsäurekomplementärsequenz unabhängigen Hybridisierung in der Lage ist.
  • „Proximität-Label"
  • Der Begriff „Proximität-Label", wie hierin verwendet, bezeichnet einen der mindestens zwei Labels, die miteinander in Wechselwirkung treten, um ein nachweisbares Signal dort zu erzeugen, wo die Proximität-Labels zusammengebracht werden. Typischerweise wird ein erstes Proximität-Label in Kombination mit einem entsprechenden zweiten Proximität-Label verwendet, um ein nachweisbares Signal unter Bedingungen zu erzeugen, bei welchen die beiden Proximität-Labels nahe beieinander sind.
  • Chemische funktionelle Gruppen
  • Bei den chemischen funktionellen Gruppen X und Y (X = X1, X2, X3 oder X4 und Y = Y1, Y2, Y3 oder Y4) handelt es sich um Paare aus Atomen und/oder um Gruppen, welche miteinander reaktiv sind (X1 mit Y1; X2 mit Y2; X3 mit Y3; und X4 mit Y4), um chemische Bindungen herzustellen, wenn sie in große Nähe zueinander gebracht werden, und zwar durch Hybridisierung von Targeting-Sequenzen A und Targeting-Sequenzen C an eine Zielnukleinsäuresequenz oder durch Hybridisierung von Targeting-Sequenzen A' und Targeting-Sequenzen C' an eine Zielnukleinsäurekomplementsequenz. Die Entfernung zwischen Paaren chemischer funktioneller Gruppen (z.B. X1 und Y1) sollte bei zweckdienlicher Ausrichtung ungefähr 4A° oder weniger betragen, damit eine chemische Reaktion zwischen den Gruppen stattfindet.
  • Eine chemische funktionelle Gruppe eines X1-Typs wird an der Basen- oder der Zucker-Moiety eines Nukleotids angebracht, das in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz B von Oligonukleotidsonde 1 positioniert ist; ein X2-Typ wird an die Basen- oder Zucker-Moiety eines Nukleotids angebracht, das in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz B' von Oligonukleotidsonde 1' positioniert ist; ein X3-Typ wird an der Basen- oder Zucker-Moiety eines Nukleotids angebracht, das in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A und Schutzsequenz D von Oligonukleotidsonde 3 positioniert ist; ein X4-Typ wird an der Basen- oder Zucker-Moiety eines Nukleotids angebracht, das in der Verbindungsstelle von Targeting-Sequenz A' und Schutzsequenz D' von Oligonukleotidsonde 3' positioniert ist; Y1- und Y2-Typen werden jeweils an das Ende von Targeting-Sequenzen C und C' von Oligonukleotidsonden 2 und 2' angebracht; und Y3- und Y4-Typen werden jeweils an das Ende von Targeting-Sequenzen C und C' von Oligonukleotidsonden 4 und 4' angebracht.
  • Die chemischen funktionellen Gruppen X1, X2, X3 und X4 können gleicher oder unterschiedlicher chemischer Natur sein; auch die chemischen funktionellen Gruppen Y1, Y2, Y3 und Y4 können gleicher oder unterschiedlicher Natur sein, solange die Teile eines Paars chemischer funktioneller Gruppen (z.B. X1 und Y1) in der Lage sind, untereinander eine chemische Bindung einzugehen, wenn jeweils Targeting-Sequenzen A und C und A' und C' der relevanten Oligonukleotidsonden an die Zielnukleinsäuresequenz und die Zielnukleinsäurekomplementärsequenz hybridisiert werden.
  • Eine chemische funktionelle Gruppe wird an ein Nukleotid kovalent an einer sterisch toleranten Stelle angebracht, die als eine Position auf einer Nukleotidbase oder einer Zucker-Moiety definiert ist, an welcher eine chemische funktionelle Gruppe angebracht werden kann, ohne eine erhebliche Beeinträchtigung zu verursachen bei der jeweiligen Hybridisierung von Targeting-Sequenzen A und Targeting-Sequenzen C von Oligonukleotidsonden 1 und 3 und Oligonukleotidsonden 2 und 4 an die Zielsequenzen oder von Targeting-Sequenzen A' und Targeting-Sequenzen C' von Oligonukleotidsonden 1' und 3' und Oligonukleotidsonden 2' und 4' an die Zielkomplementärsequenzen. Zu den sterisch toleranten Stellen gehören Positionen auf den Purin- und Pyrimidinbasen und polyvalente Heteroatome des Basen- oder Ribosenabschnitts eines Nukleotids oder eines Nukleotidanalogs.
  • Beispiele für sterisch tolerante Stellen umfassen die Methylgruppe, die an der C-5-Position von Thymidin angebracht wird, die Aminogruppe, die an der C-6-Position von Adenin oder Cytidin angebracht wird, die C-8-Position von Adenin oder Guanin, die C-2'-Position des Riboserings jedes Nukleotidtyps und die Hydroxylgruppe, die an die C-2'-Position des Riboserings eines Ribonukleotids angebracht wird.
  • Die Modifikation der Purin- und Pyrimidinbasen lässt sich beispielsweise mittels nach Stand der Technik bekannten Verfahren durchführen, wie jenen, die von Ruth in EP 135 587 beschrieben werden. Die Modifikation eines Ribonukleotids an der C-2'-Position des Riboserings des Ribonukleotids kann zum Beispiel nach jenem Verfahren erfolgen, das von Yamana, K., u.a. in „Bioconjugate Chemistry 1", S. 319–324 (1990) erläutert ist.
  • Beispiele von Nukleotiden, die mit einer chemischen funktionellen Gruppe an jeder der oben erwähnten sterisch toleranten Stellen modifiziert sind, werden in 10–14 dargestellt. Ungeachtet dessen, ob Deoxyribonukleotide oder modifizierte Deoxyribonukleotide in 10–14 veranschaulicht sind, stellen Ribonukleotide selbstverständlich annehmbare Substituten dar. Eine Liste der Bezeichnungen für die modifizierten Nukleotide ist nachstehend angeführt.
    • A1 bezeichnet Adenin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die ein Hydrogen aus der Aminogruppe ersetzt, die an der C-6-Position liegt.
    • A2 bezeichnet Adenin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die an der Hydroxylgruppe angebracht ist, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • A3 bezeichnet Adenin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, die den an der C-8-Position liegenden Wasserstoff ersetzt,
    • A4 bezeichnet Adenin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, die das Hydroxyl ersetzt, das sich an der C-2'-Position des Ribonserings befindet.
    • C1 bezeichnet Cytidin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die einen Wasserstoff aus der Aminosäuregruppe ersetzt, die sich an der C-6-Position befindet.
    • C2 bezeichnet Cytidin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die an die Hydroxylgruppe angebracht ist, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • C3 bezeichnet Cytidin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, welche die Hydtoxylgruppe ersetzt, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • G1 bezeichnet Guanin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die das an der C-8-Position liegende Hydrogen ersetzt.
    • G2 bezeichnet Guanin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die an der Hydroxylgruppe angebracht ist, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • G3 bezeichnet Guanin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, welche die Hydroxlgruppe ersetzt, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • T1 bezeichnet Thymidin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, die einen Wasserstoff aus der Methylgruppe ersetzt, die sich an der C-5-Position befindet.
    • T2 bezeichnet Thymindin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die an die Hydroxylgruppe angebracht ist, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • T3 bezeichnet Thymidin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, welche die Hydroxylgruppe ersetzt, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • U1 bezeichnet Uridin mit chemischer funktioneller Gruppe Z, welche die Hydroxylgruppe ersetzt, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • U2 bezeichnet Uridin mit einer chemischen funktionellen Gruppe Z, die an die Hydroxylgruppe angebracht ist, die sich an der C-2'-Position des Riboserings befindet.
    • Z bezeichnet chemische funktionelle Gruppen X1, X2, X3, X4, Y1, Y2, Y3 oder Y4.
  • Es ist wichtig anzumerken, dass die chemischen funktionellen Gruppen X und Y auf ihren jeweiligen Nukleotiden nicht an den gleichen Positionen angebracht werden müssen. Beispielsweise könnte Gruppe X ohne Einschränkung an Uridin an Position C-5 auf einem Nukleotid in der Verbindungsstelle von Sequenzen A/B angebracht sein und Gruppe Y an Position C-2' auf einem geeigneten Nukleotid am Ende von Targeting-Sequenz C.
  • Die bevorzugte Position zum Anbringen einer der chemischen funktionellen Gruppen, z.B. Y, an ein Nukleotid ist die C-2'-Position des Riboserings des Nukleotids. Beispielsweise ist es zweckmäßig, die Hydroxylgruppe an der C-2'-Position des Riboserings mit einer Aminogruppe zu ersetzen, z.B. anhand des Protokolls, das aufgestellt ist von Moffatt, u.a.: J. Org. Chem., 36, 250 (1971), oder durch eine Aminomethylgruppe, wie erläutert von Ioannidid, u.a.: Nucleosides and Nucleotides, 11:1205 (1992); demgegenüber wird die zweite chemische funktionelle Gruppe, z.B. X, beispielsweise an der C-5-Position der Pyrimidinbase angebracht. Beispielhalber sei auf die Erläuterungen von Ruth in EP 135 587 verwiesen. Die Aminogruppe kann entweder als chemische funktionelle Gruppe oder als Brückengruppe für das Anbringen chemischer funktioneller Gruppen an den Ribosering dienen.
  • Eine chemische funktionelle Gruppe kann optional eine Brückengruppe enthalten, durch welche sie an das Nukleotid angebracht wird. Zu den Beispielen für Brückengruppen zählen unter anderem Amino-, Amido-, Thio-, Carbonyl-, Carboxyl- und Alkylgruppen, Aryl-Alkylaryl- und Arylalkylgruppen, und zwar optional an jeder beliebigen Position mit Gruppen wie unter anderem Amido-, Carbonyl-, Carboxyl-, Amino- und Thiogruppen. Alkylgruppen können insgesamt oder teilweise zyklisch sein. Beispiele für Alkylgruppen umfassen unter anderem Methyl, Ethyl, Propyl, Pentyl, Cyclopentyl, Hexyl, Cyclohexyl, etc. Zu den Beispielen für Arylgruppen gehören unter anderem Phenyl, Naphthyl, Imidazolyl, Indyl, etc.
  • In einem gegebenen Paar Oligonukleotidsonden verfügt ein Teil des Paars über eine nukleophile chemische funktionelle Gruppe und der andere Teil des Paars besitzt eine elektrophile chemische funktionelle Gruppe (d.h. wenn X ein Nukleophil ist, dann ist Y ein Elektrophil, und vice versa).
  • Einige Beispiele für Nukleophile sind -SH, -NH2, -NHA (wobei A eine Alkylgruppe wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, etc. ist oder eine Arylgruppe wie Phenyl, Naphthyl, Imidazolyl, Indyl, etc.). Elektrophile sind in der Lage, mittels Elektronentransfer aus einem Nukleophil Einzel- oder Doppelbindungen herzustellen. Die Reaktion zwischen dem Nukleophil und dem Elektrophil kann die Addition des Nukleophils über eine Doppelbindung beinhalten, die an eine Elektronen ziehende Gruppe angebracht ist, oder die Substitution einer elektrophilen Austrittsgruppe durch ein Nukleophil.
  • Ein Beispiel für die Addition eines Nukleophils über eine Doppelbindung ist eine Michael-Addition, wie die Addition einer Thiolgruppe zu einer Doppelbindung einer Maleimido-Moiety.
  • Andere Typen der Reaktion zwischen den chemischen funktionellen Gruppen sind beispielsweise die Diels-Alder-Reaktion oder jede beliebige perizyklische Reaktion, die eine oder mehr neue chemische Bindungen hervorbringt.
  • Die bevorzugte Ausführungsform für eine Diels-Alder-Reaktion stellt jenes System dar, in welchem Uridin an der C-5-Position modifiziert wird, um ein Dien zu bilden, das als chemische funktionelle Gruppe, z.B. X, in Oligonukleotidsonden 1, 1', 3 und 3' fungiert. Demgegenüber wird am Ende von Targeting-Sequenzen C und C' der Zucker an der C-2'-Position durch 2-Butendisäure modifiziert, die als chemische funktionelle Gruppe, z.B. Y, agiert, wie in 15 dargestellt.
  • Die Rechnergestützte Modellerstellung von eben diesem Beispiel hat ergeben, dass die Aminogruppe an der C-2'-Position um ein weiteres Atom, das eine vierflächige Gestalt besitzt, erweitert werden sollte, damit die Diels-Alder-Reaktion stattfindet. Eine Methylengruppe könnte beispielsweise dieses Erfordernis erfüllen.
  • Weiterhin können chemische funktionelle Gruppen ausgewählt werden, welche chemische Bindungen bilden mittels einer photochemischen Reaktion wie der [2 + 2] Photocyclodimerisierung oder einer anderen An von Photozyclus.
  • Schutz chemischer funktioneller Gruppen vor Reaktion miteinander bei Abwesenheit der Zielnukleinsäuresequenz
  • Eines der wichtigsten Merkmale der DNA Oligonukleotidsondenamplifikation des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Beseitigung irreführender Amplifikationsnebenprodukte. Die vorliegende Erfindung bietet vielfältige Wege, um chemische funktionelle Gruppen (X und Y) vor einer Reaktion miteinander in einer Templateunabhängigen Weise zu schützen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die chemische Bindung zwischen X- und Y-Gruppen mittels der Diels-Alder-Reaktion hergestellt. Bevorzugt wird diese Reaktion, weil sie naturgemäß regionsgenau und stereospezifisch ist. Beispielsweise sollten sich die π-Elektronen der Dien- und En-Gruppen präzise überlappen, um in einer perizyklischen Reaktion zu interagieren.
  • Beschreibung des chemischen Amplifikationsprozesses des Verfahrens der Erfindung für den Nachweis des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe
  • In einer ersten Ausführungsform wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung für den Nachweis des Vorhandenseins einer Nukleinsäuresequenz in einer Probe eingesetzt.
  • Bei der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz erreicht durch Zusammenfügen zweier oder mehr chemisch modifizierter Oligonukleotidsonden für jeden Strang einer Zielnukleinsäuresequenz, um ein zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt zu bilden. Die „Amplifikation", die mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung erreicht wird, zeigt einen Zuwachs bei der Menge der gewünschten Nukleinsäuremoleküle, die in dem Reaktionsgefäß vorhanden sind. Eine „substantielle Amplifikation" ist eine Amplifikation um mehr als etwa das Hundertfache. Sobald es erzeugt ist, dient das zusammengefügte Oligonukleotidprodukt als Template für die weitere Herstellung zusammengefügter Oligonukleotidprodukte. Die Schritte dieses Prozesses werden so oft wie nötig wiederholt, um eine nachweisbare Menge zusammengefügter Oligonukleotidprodukte herzustellen. Jede Wiederholung der Schritte des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird als Zyklus bezeichnet. Die Anzahl der Zyklen, die zur Erzeugung einer nachweisbaren Menge zusammengefügter Nukleotidprodukte erforderlich ist, hängt in hohem Maße von der Anzahl der Zielmoleküle ab, die anfänglich in der untersuchten Nukleinsäureprobe vorhanden sind. Je größer die Anzahl der Zielmoleküle in einer Probe, desto geringer die Anzahl der Zyklen, die zur Herstellung einer nachweisbaren Menge zusammengefügter Oligonukleotidprodukte notwendig sind. Wenn eine gewünschte Menge zusammengefügter Oligonukleotidprodukte hergestellt ist, wird diese nachgewiesen. Ein neuartiger Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in dem Weg, auf welchem die Oligonukleotidsonden zwecks Bildung eines Oligonukleotidprodukts zusammengefügt werden. Weder DNA-Polymerase noch DNA-Ligase wird bei der vorliegenden Erfindung verwendet, um die zusammengefügten Oligonukleotidprodukte herzustellen.
  • Zur Amplifikation von Zielsequenzen in einem einzel- oder doppelsträngigen Nukleinsäuremolekül werden die Oligonukleotidsonden 1, 1', 2 und 2' in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in der nachstehend beschriebenen Weise eingesetzt.
  • Wenn obigen Erläuterungen entsprechend eine Zielnukleinsäuresequenz in einer Testprobe vorhanden ist, hybridisieren, unter sorgfältig kontrollierten Hybridisierungsbedingungen, nur Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C von jeweils Oligonukleotidsonden 1 und 2 an benachbarte Regionen der Zielsequenz. Schutzsequenz B von Oligonukleotidsonde 1 hybridisiert nicht an die Zielsequenz. Wenn Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C stabile Hybridkomplexe mit der Zielsequenz gebildet haben, werden chemische funktionelle Gruppen X1 und Y1 einander weit genug angenähert, damit sie eine chemische Bindung eingehen. Die Bindung zwischen den chemischen funktionellen Gruppen X1 und Y1 fügt Oligonukleotidsonde 1 und Oligonukleotidsonde 2 zusammen, wodurch ein erstes zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt entsteht. Sobald dieses geformt ist, stellen die beiden Sequenzen des ersten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts eine „Zielkomplementärsequenz" dar und sind komplementär zu benachbarten Sequenzen der Zielsequenz.
  • Ein ähnlicher Prozess vollzieht sich, wenn Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' von jeweils Oligonukleotidsonden 1' und 2' an benachbarte Regionen der Zielkomplementärsequenz hybridisieren, wohingegen Schutzsequenz B' von Oligonukleotidsonde 1' unhybridisiert bleibt. Die chemische funktionelle Gruppe X2 von Targeting-Sequenz A' und die chemische funktionelle Gruppe Y2 von Targeting-Sequenz C' werden einander weit genug angenähert, damit sie eine chemische Bindung eingehen, welche Oligonukleotidsonden 1' und 2' miteinander verbindet, so dass ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt hergestellt wird. Sobald dieses geformt ist, stellen die beiden Sequenzen des zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts eine „Zielsequenz" dar und sind komplementär zu benachbarten Sequenzen der Ziellcomplementärsequenz.
  • Die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 auf Oligonukleotidsonden 1 und 1' sind abgeschirmt und deshalb vor einer Interaktion mit den chemischen funktionellen Gruppen Y1 und Y2 geschützt, und zwar jeweils durch Nukleotide der Schutzsequenzen B und B' auf der einen Seite und durch Nukleotide der Targeting-Sequenzen A und A' auf der anderen.
  • Darüber hinaus können die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 auf Oligonukleotidsonden 1 und 1' abgeschirmt und somit geschützt werden vor einer Interaktion mit den chemischen funktionellen Gruppen Y1 und Y2, indem Schutzsequenzen B und B' mit Sequenzen versehen werden, die zu Targeting-Sequenzen A und A' auf palindrome An komplementär sind, wodurch eine Stamm- und Schleifenstruktur geschaffen wird; der Stamm ist so positioniert, dass die chemischen funktionellen Gruppen basengepaart und dementsprechend geschützt sind. Das Ausstatten von Schutzsequenzen D und D' mit Sequenzen, die auf palindrome An komplementär zu Targeting-Sequenzen A und A' sind, würde in ähnlicher Weise die chemischen funktionellen Gruppen X3 und X4 auf Oligonukleotidsonden 3 und 3' davor schützen, mit chemischen funktionellen Gruppen Y3 und Y4 auf Oligonukleotidsonden 4 und 4' zu interagieren, wenn diese sich frei in Lösung aushalten.
  • Die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 auf Oligonukleotidsonden 1 und 1' und die chemischen funktionellen Gruppen Y1 und Y2 auf Oligonukleotidsonden 2 und 2' können jeweils weiter abgeschirmt und geschützt werden durch Oligonukleotide 1.1, 2.1, 1.1' und 2.1', welche jeweils komplementär zu Oligonukleotidsonden 1, 2, 1' und 2' sind, und zwar in jenem Bereich, wo sich die chemischen funktionellen Gruppen befinden. (Die äquivalenten Oligonukleotide 3.1, 4.1, 3.1' und 4.1' können jeweils zum Schutz der chemischen funktionellen Gruppen X3, Y3, X4 und Y4 eingesetzt werden.)
  • Infolge des Schutzes der chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 von jeweils Oligonukleotidsonden 1 und 1' wird jede chemische funktionelle Gruppe daran gehindert, mit einer entsprechenden chemischen funktionellen Gruppe anderer Oligonukleotidsonden zu reagieren. Durch Hybridisierung von Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C von jeweils Oligonukleotidsonden 1 und 2 werden chemische funktionelle Gruppen nahe genug an die Zielnukleinsäuresequenz herangebracht, und durch Hybridisierung von Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C' von Oligonukleotidsonden 1' und 2' werden die chemischen funktionellen Gruppen der Zielnukleinsäurekomplementärsequenz weit genug angenähert.
  • 16 zeigt verallgemeinerte Darstellungen von Targeting-Sequenz A und Targeting-Sequenz C oder von Targeting-Sequenz A' und Targeting-Sequenz C', welche an die Zielnukleinsäuresequenz oder die Zielnukleinsäurekomplementärsequenz hybridisiert sind, wobei die chemischen funktionellen Gruppen an den Nukleotidbasen angebracht sind. Wie aus dieser Zeichnung ersichtlich, können die chemischen funktionellen Gruppen X und Y entweder an der C-2'-Position des Riboserings oder an der Nukleotidbase angebracht werden.
  • In 17 wird mit fetten Linien eine verallgemeinerte Darstellung beider Oligonukleotidsondenpaare gezeigt, die an ein doppelsträngiges Zielmolekül hybridisiert und durch chemische funktionelle Gruppen zusammengefügt sind, um ein erstes und ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt zu bilden. Selbstverständlich besteht in den bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung keine Lücke zwischen den Oligonukleotidsonden, obwohl bei einigen Anwendungen eine Lücke von ein oder zwei Nukleotiden zulässig ist.
  • In einer Probe, die ein einzelsträngiges Zielmolekül enthält, wird das zweite zusammengefügte Oligonukleotidprodukt nach dem ersten Zyklus gebildet. Um ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt in Abwesenheit eines Zielkomplementärmoleküls zu bilden, muss ein erstes zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt in dem ersten Zyklus des Verfahrens gebildet werden. Das erste zusammengefügte Oligonukleotidprodukt verfügt über die Zielkomplementärsequenz und fungiert als Template, an welches Oligonukleotidsonden 1' und 2' hybridisieren. Die Oligonukleotidsonden 1' und 2' bilden ein zweites zusammengefügtes Oligonukleotidprodukt, das die Zielsequenz besitzt, in dem zweiten Zyklus und nachfolgenden Zyklen des Verfahrens.
  • Sobald das erste zusammengefügte Oligonukleotidprodukt in dem ersten Zyklus des Verfahrens gebildet ist, wird das Produkt von der Zielsequenz durch Denaturierung getrennt. Die Begriffe „denaturierten" oder „Denaturierung", wie hierin verwendet, beziehen sich auf einen reversible Verlust einer Struktur von höherem Rang und auf die Trennung hybridisierter Nukleinsäuren in Einzelstränge, was durch physiologische oder nicht-physiologische Bedingungen hervorgerufen wird, z.B. durch Enzyme, pH, Temperatur, Salz oder organische Lösungsmittel.
  • Das zweite zusammengefügte Oligonukleotidprodukt wird, sobald es gebildet ist, ebenfalls aus der Zielkomplementärsequenz oder dem ersten zusammengefügten Oligonukleotidprodukt durch Denaturierung getrennt. Das Zielmolekül und das erste und zweite Oligonukleotidprodukt dienen als Templates für Wiederholungszyklen des Verfahrens.
  • Eine verallgemeinerte Darstellung des ersten Zyklus des Amplifikationsprozesses der vorliegenden Erfindung für eine doppelsträngige Sequenz wird in 18–24 gezeigt.
  • Wie 18 veranschaulicht, umfasst der erste Zyklus in dem Amplifikationsverfahren einer doppelsträngigen Sequenz sowohl die Hybridisierung der Oligonukleotidsonden an die Zielsequenz und die Zielkomplementärsequenz als auch das Verbinden der Oligonukleotidsonden mittels der chemischen funktionellen Gruppen zwecks Bildung zusammengefügter Oligonukleotidprodukte.
  • Wie aus 19 hervorgeht, folgt der Bildung zusammengefügter Oligonukleotidsonden mittels der chemischen funktionellen Gruppen die Denaturierung des ersten und des zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts jeweils aus der Zielsequenz und den Zielkomplementärsequenz.
  • Sobald der erste Zyklus des Prozesses abgeschlossen ist, wird eine weitere Amplifikation der Zielsequenz dadurch erreicht, dass die Zyklen der Denaturierung der zusammengefügten Oligonukleotidprodukte, der Anlagerung der Oligonukleotidsondenpaare an die zusammengefügten Oligonukleotidprodukte und der Bildung chemischer Bindungen zwischen den chemischen funktionellen Gruppen wiederholt werden, um mehr zusammengefügte Oligonukleotidprodukte herzustellen. Deshalb verfügen alle Zyklen, die dem ersten Zyklus folgen, notwendigerweise sowohl über die Zielsequenz als auch über die Zielkomplementärsequenz.
  • In 24 wird die Fähigkeit des ersten und zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts verallgemeinert dargestellt, jeweils als Template zu fungieren für die Bildung zusätzlicher erster und zweiter zusammengefügter Oligonukleotidprodukte während des zweiten und allen nachfolgenden Zyklen des Amplifikationsprozesses für eine einzel- oder doppelsträngige Zielsequenz.
  • Die Hybridisierung von Oligonukleotidsonden an die Zielsequenz und die Zielkomplementärsequenz des ersten und des zweiten zusammengefügten Oligonukleotidprodukts, die gebildet werden, wie im Bezug auf den vorangehenden Schritt beschrieben, und das Zusammenfügen der Oligonukleotidsonden, um mehr zusammengefügte Oligonukleotidprodukte zu bilden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die lineare Amplifikation einer Zielsequenz oder alternativ einer Ziellcomplementärsequenz, falls vorhanden, erreicht werden, indem jeweils lediglich Sonden 1 und 2 oder Sonden 1' und 2' in dem obigen Prozess verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden ein standardmäßiger Hybridisierungspuffer, z.B. 34% deionisiertes Formamid in Wasser (vol/vol), 0.54 M NaCl, 34 mM Natriumphosphat (pH 7.4), 0.3 mM EDTA, 5% Dextransulfat 500K m.w. (Sigma) (w/vol) und 0.1% Triton X-100 (vol/vol) bei Oligonukleotidsonden einer beliebigen Länge im Bereich von sechs bis einhundert Nukleotiden verwendet. Lediglich die Denaturierungs- und die Hybridisierungstemperatur wechseln, während sich die Länge (akkurater ausgedrückt die Schmelztemperatur Tm) der Oligonukleotidsonden verändert. Sowohl die Hybridisierungstemperatur als auch die Denaturierungstemperatur sind Funktionen der Länge (oder Tm) der Oligonukleotidsonden.
  • Im Allgemeinen sind die Oligonukleotidsondenpaare in einem molaren Überschuss von ungefähr 105–1015, vorzugsweise von 109–1015 Paaren pro Nukleinsäurezielsequenz oder -zielkomplementärsequenz vorhanden. Die exakte Menge der für diagnostische Zwecke zu verwendenden Paare entzieht sich der Kenntnis bedingt durch die Ungewissheit, die hinsichtlich der Menge der in einer Probe befindlichen Nukleinsäureziele besteht. Jedoch ist bei einem typischen Diagnose-Assay-Format die Verwendung einer durchschnittlichen Menge von 1015 Oligonukleotidsondenpaaren angebracht. Ein hoher molarer Überschuss wird in jedem Fall bevorzugt, um die Effizienz des erfundenen Verfahrens zu steigern.
  • Da die chemischen funktionellen Gruppen nicht miteinander reagieren und die Oligonukleotidsonden miteinander verbinden dürfen, falls die Zielhybridisierungssequenzen beider Oligonukleotidsonden nicht an die Zielsequenz hybridisiert haben, wird die Bildung zielunabhängiger zusammengefügter Oligonukleotidprodukte vermieden.
  • Beschreibung des chemischen Amplifikationsprozesses des erfindungsgermäßen Verfahrens zum Nachweis von Seguenzänderungen
  • In einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird diese zum Nachweis von Nukleotidänderungen in einer Zielnukleinsäuresequenz eingesetzt. Wie sogleich erläutert, ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung, wenn es zum Nachweis einer Nukleotidänderung in einer Zielnukleinsäuresequenz verwendet wird, sensibel genug, um eine einzelne Basenänderung nachzuweisen, z.B. eine Punktmutation, also eine Veränderung eines einzelnen Basenpaares.
  • Die Fähigkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, Sequenzänderungen nachzuweisen, wird hierin anhand des Nachweises einer einzelnen Basenänderung erläutert, wie etwa einer Punktmutation in einer Zielnukleinsäuresequenz.
  • Zu diesem Zweck werden zwei Gruppen mit vier Oligonukleotidsonden konstruiert. Die erste Gruppe ist zur Amplifikation einer Wildtyp-Sequenz gestaltet und umfasst vier Oligonukleotidsonden, die mit 1, 1', 2 und 2' bezeichnet sind. Diese Oligonukleotidsonden ähneln in ihrem Aufbau, d.h. in der Anordnung von Schutz- und Targeting-Sequenzen, den oben beschriebenen, die für den Nachweis des Vorhandenseins einer Zielnukleinsäure in einer Testprobe verwendet werden. Die zweite Gruppe Oligonukleotidsonden besteht aus Oligonukleotidsonden, die mit 3, 3', 4 und 4' bezeichnet werden. Der Aufbau von Oligonukleotidsonden 3, 3', 4 und 4' der zweiten Oligonukleotidsondengruppe ähnelt jeweils jenem von Oligonukleotidsonden 1, 1', 2 und 2' der ersten Oligonukleotidsondengruppe. Die Sequenz von Oligonukleotidsonden 3' und 4 der zweiten Oligonukleotidsondengruppe besitzt jeweils Ähnlichkeit zu jener von Oligonukleotidsonden 1' und 2 der ersten Oligonukleotidsondengruppe, wohingegen sich Oligonukleotidsonden 3 und 4' der zweiten Oligonukleotidsondengruppe in ihrer Sequenz von Oligonukleotidsonden 1' und 2 der ersten Oligonukleotidsondengruppe unterscheiden, und zwar an einer Stelle, die komplementär ist zu der Sequenzänderung, die jeweils in der Zielnukleinsäuresequenz oder der Zielnukleinsäurekomplementärsequenz zu bestimmen ist. An diesen Stellen sind Oligonukleotidsonden 3 und 4' vollständig komplementär zu jeweils der Mutantenzielsequenz und der Mutantenzielkomplementärsequenz. Außerdem sind an äquivalenter Position auf Oligonukleotidsonden 3, 3', 4 und 4' chemische funktionelle Gruppen X3, X4, Y3 und Y4 platziert, wobei die chemischen funktionellen Gruppen X3 und Y3 eine chemische Bindung eingehen können, wenn Oligonukleotidsonden 3 und 4 an die Mutantenzielnukleinsäuresequenz hybridisiert werden, und die chemischen funktionellen Gruppen X4 und Y4 eine chemische Bindung eingehen können, wenn Oligonukleotidsonden 3' und 4' an die Mutantenzielnukleinsäurekomplementärsequenz hybridisiert werden. Diese Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Oligonukleotidsonden, welche die erste und die zweite Oligonukleotidsondengruppe bilden, sind in 21 schematisch dargestellt, gemeinsam mit einer Wildtyp- und einer Mutanten- (A → G Punktmutation, wie aus der Zielnukleinsäuresequenz ausgelesen) Zielnukleinsäuresequenz und -komplementärsequenz.
  • Für die Durchführung einer Technik zur Erfassung einer winzigen Sequenzänderung gemäß der zweiten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung in ihrer einfachsten Form werden zwei Reaktionsgefäße verwendet. Ein erstes Reaktionsgefäß enthält eine Nukleinsäureprobe, einen zur Ausführung eines Amplifikationsprozesses geeigneten Puffer, wie oben beschrieben, und Oligonukleotidsonden der ersten Oligonukleotidsondengruppe, nämlich Oligonukleotidsonden 1, 1', 2 und 2'. Ein zweites Reaktionsgefäß beinhaltet die Nukleinsäureprobe, den geeigneten Puffer und die Oligonukleotidsonden der zweiten Oligonukleotidsondengruppe, also Oligonukleotidsonden 3, 3', 4 und 4'. Eine zweckmäßige Anzahl von Amplifikationszyklen wird ausgeführt, wie oben umrissen, und im Anschluss an die Amplifikation erfolgt ein Nachweisverfahren, um die An- oder Abwesenheit von Amplifikationsprodukten in jedem der Gefäße zu bestimmen.
  • Wenn die in der untersuchten Nukleinsäureprobe enthaltende Zielnukleinsäuresequenz bezüglich des Wildtyp-Nukleotids homozygot ist (A in dem oben gegebenen Beispiel), akkumulieren sich Amplifikationsprodukte nur in dem ersten Reaktionsgefäß, das Oligonukleotidsonden 1, 2, 1' und 2' enthält, die an der untersuchten Nukleotidstelle jeweils zu der Wildtyp-Zielnukleinsäuresequenz und der Wildtyp-Zielnukleinsäurekomplementärsequenz komplementär sind; demgegenüber akkumulieren sich keine Amplifikationsprodukte in dem zweiten Reaktionsgefäß, welches Oligonukleotidsonden 3, 4, 3' und 4' enthält, die jeweils an der untersuchten Nukleotidstelle nicht komplementär sind zu der Wildtyp-Zielnukleinsäuresequenz und zu der Wildtyp-Zielnukleinsäurekomplementärsequenz. Falls jedoch die in der untersuchten Nukleinsäureprobe enthaltene Zielnukleinsäuresequenz homozygot hinsichtlich des Mutantennukleotids ist (G in dem oben gegebenen Beispiel), akkumulieren sich Amplifikationsprodukte nur in dem zweiten Reaktionsgefäß, das Oligonukleotidsonden 3, 4, 3' und 4' enthält, die an der untersuchten Stelle jeweils komplementär zu der Mutantezielnukleinsäuresequenz und zu der Mutantenzielnukleinsäurekomplementärsequenz sind; demgegenüber akkumulieren sich keine Amplifikationsprodukte in dem ersten Reaktionsgefäß, das Oligonukleotidsonden 1, 2, 1' und 2' enthält, die jeweils an der untersuchten Nukleotidstelle nicht komplementär zu der Mutantenzielnukleinsäuresequenz und zu der Mutantenzielnukleinsäurekomplementärsequenz sind. Falls die in der untersuchten Nukleinsäureprobe enthaltene Zielnukleinsäuresequenz heterozygot ist, was bedeutet, dass die untersuchte Nukleinsäureprobe sowohl die Wildtyp- als auch die Mutantennukleinsäuresequenz und deren jeweilige Nukleinsäurekomplementärsequenz enthält, akkumulieren sich Amplifikationsprodukte in beiden Reaktionsgefäßen. Wird die untersuchte Nukleinsäuresequenz aus einem spezifischen Individuum erhalten, lässt sich auf diese Weise der Genotyp dieses Individuums an der Mutationsstelle bestimmen (d.h. ob der Einzelne homozygot bezüglich der Wildtyp- oder der Mutantensequenz ist oder etwa heterozygot).
  • Bei einer ausgeklügelteren Durchführungsform für das Verfahren zum Nachweis einer winzigen Sequenzänderung gemäß der zweiten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung reicht ein einziges Reaktionsgefäß aus, vorausgesetzt dass die aus einer Wildtyp-Sequenz abgeleiteten Amplifikationsprodukte von den aus der Mutantensequenz abgeleiteten zu unterscheiden sind.
  • Wenn die Methode zum Nachweis der winzigen Sequenzänderung gemäß der zweiten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens der vorliegenden Erfindung Anwendung findet, können alle oder ein paar der chemischen funktionellen Gruppen X1, X2, X3 und X4 zueinander identisch sein, obgleich bevorzugt wird, dass sich die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 von den chemischen funktionellen Gruppen X3 und X4 unterscheiden, wenn die Reaktion gemäß der oben dargelegten höher entwickelten Form in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt wird. In allen Fällen werden die chemischen funktionellen Gruppen Y1, Y2, Y3 und Y4 so ausgewählt, dass sie die Herstellung einer chemischen Bindung mit den entsprechenden chemischen funktionellen Gruppen X1, X2, X3 und X4 ermöglichen.
  • Damit die zweite Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung von Vorteil ist beim Nachweis einer winzigen Sequenzänderung, z.B. einer Punktmutation, wie oben beschrieben, sollten einige wenige Einschränkungen bezüglich des Aufbaus der Oligonukleotidsonden und bezüglich des Typs der chemischen funktionellen Gruppen berücksichtigt werden, damit die erläuterte diskriminierende Amplifikation ermöglichen wird. Die α'-Teile von Oligonukleotidsonden 1 und 3 und die γ'-Teile von Oligonukleotidsonden 2' und 4' sollten so kurz wie nötig sein, um eine Distorsion in der tertiären Struktur der hybridisierten Sequenzen an der Position der chemischen funktionellen Gruppen zu bedingen, und zwar selbst im Fall eines einzelnen Nukleotid-Mismatch. Allerdings sollten die α'-Teile von Oligonukleotidsonden 1 und 3 und die γ'-Teile von Oligonukleotidsonden 2' und 4' auch lang genug sein, um ein Scheitern der Amplfikation infolge einer Distorsion in der tertiären Struktur zu vermeiden, welche eigens durch die chemischen funktionellen Gruppen verursacht wird, nachdem eine chemische Bindung zwischen ihnen hergestellt ist. Die chemischen funktionellen Gruppen sollten so ausgewählt werden, dass sie diese Anforderungen erfüllen. Die wichtigsten chemischen funktionellen Gruppen würden daher jene sein, welche die tertiäre Struktur der hybridisierten Sequenzen zu einem zulässigen Maß verzerren, welches die Verwendung von Oligonukleotidsondenkomplementärpaaren mit der gleichen Länge gestattet. Wie schematisch in 22 dargestellt, fungieren in diesem Fall die modifizierten Nukleotide selbst (in den FIG. bezeichnet als T1, T2, A1, A2, C1, C2, G1 und G2; T3, T4, A3, A4, C3, C4, G3 und G4), an welche die chemischen funktionellen Gruppen konjugiert werden, als die unterscheidenden Amplifikationssequenzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lässt sich eine lineare Amplifikation einer Zielsequenz oder alternativ einer Zielkomplementärsequenz, falls vorhanden, dadurch erreichen, dass lediglich Sonden 1, 2, 3 und 4 oder Sonden 1', 2', 3' und 4' in dem oben erläuterten Prozess verwendet werden.
  • Nachweis von Amplifikationsprodukten
  • Sobald eine ausreichende Menge zusammengefügter Oligonukleotidprodukte hergestellt ist, lässt sich diese mittels auf diesem Gebiet routinemäßiger Verfahren nachweisen, z.B. durch Immobilisieren eines Oligonukleotidsondenteils eines zusammengefügten Oligonukleotidprodukts (d.h. Oligonukleotidsonde 1 oder 1') und durch Labeln des anderen Teils (d.h. Oligonukleotidsonde 2 oder 2') mit z.B. einer oder mehreren radioaktiven, chromogenen, chemilumineszenten oder fluoreszenten Moieties oder durch Sizing der zusammengefügten Oligonukleotidprodukte auf einem Gel.
  • Verfahren zum Labeln von Oligonukleotidsonden sind beispielsweise beschrieben von Leary, u.a.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1983) 80: 4045, Renz und Kurz: Nucl. Acis res., (1984) 12: 3435; Richardson und Gumport: Nucl. Acids Res. (1983) 11:6167; Smith, u.a.: Nucl. Acids Res., (1985) 13:2399 und von Meinkoth und Wahl: Anal. Biochem., (1984) 138:267.
  • Das verwendete Label kann radioaktiv sein. Einige Beispiele zweckdienlicher radioaktiver Labels umfassen 32P, 33P, 125I 131I und 3H. Die Anwendung radioaktiver Labels ist erläutert in UK 2 434 323 , US 4 358 535 und US 4 302 204 .
  • Zu den Beispielen für nicht radioaktive Labels zählen Enzyme, Chromophoren, Atome und Moleküle, die mittels Elektronenmikroskopie nachweisbar sind, und Metallionen, die sich aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften nachweisen lassen.
  • Zu den geeigneten enzymatischen Labels gehören Enzyme, die eine nachweisbare Veränderung in einem Substrat hervorrufen. Brauchbare Enzyme und ihre Substrate (in Klammern) sind z.B. Meerrettich Peroxidase (Pyrogallol und o-Phenylenediamin), beta-Galaktosidase (Fluorescein beta-D-galaktopyranosid) und Alkalin-Phosphatase (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat/Nitro Blue Tetrazolium). Die Verwendung enzymatischer Labels ist beschrieben in UK 2 019 404 , EP 63 879 und von Rotman in: Proc. Natl. Acad. Sci., 47, 1981–1991 (1961).
  • Zu den nützlichen Chromophoren zählen beispielsweise sowohl fluoreszente, chemilumineszente und biolumineszente Moleküle als auch Farbstoffe. Als für die vorliegende Erfindung besonders geeignete Chromophoren lassen sich z.B. Fluorescein, Rhodamin, Texas Red, Phycoerythrin, Umbelliferon und Luminol anführen.
  • Der Nachweis des zusammengefügten Oligonukleotidprodukts erfolgt mittels Verfahren, die nach Stand der Technik bekannt sind, z.B. mittels eines radioaktiven Labels oder eines nicht radioaktiven Capture Assays. Beispielsweise werden zusammengefügte Oligonukleotidprodukte mit einem radioaktiven Label im Anschluss an das Sizing der zusammengefügten Oligonukleotide auf einem Gel durch Autoradiographie nachgewiesen. Alternativ wird der Nachweis für zusammengefügte Oligonukleotidprodukte in einem nicht radioaktiven Capture Assay durchgeführt, indem ein Rezeptor, z.B. Biotin, an Oligonukleotidsonde 1 und ein enzymatisches Label, z.B. wärmebeständige Alkalinphosphatase, an Oligonukleotidsonde 2 angebracht wird. Eine Mikrotiterplatte, die mit einem Liganden für den Rezeptor überzogen ist, z.B. mit Avidin, wird verwendet, um Oligonukleotidsonde 1 mittels des an der Sonde angebrachten Biotins zu binden. Das an Oligonukleotidsonde 2 angebrachte enzymatische Label wird einem chromogenen Substrat ausgesetzt, z.B. 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat/Nitro Blue Tetrazolium, und eine colorimetrische Veränderung in dem Substrat wird z.B. durch Messen der optischen Dichte (OD) der Lösung nachgewiesen.
  • Die Labels können durch nach Stand der Technik wohlbekannte Verfahren an die Oligonukleotidsonde konjugiert werden. Durch eine funktionelle Gruppe auf der Oligonukleotidsonde lassen sich die Labels direkt anbringen. Beispiele für geeignete funktionelle Gruppen sind Amino, Carboxyl, Sulfhydryl, Melamid, Isocynat und Isothiocyanat.
  • Als Alternative dazu können mit Hilfe von Koppelungs-Agenzien, wie Dialdehyden, Carbodiimiden und Ähnlichen, Labels, wie Enzyme und chromophore Moleküle, an die Oligonukleotidsonde konjugiert werden.
  • Das Label kann außerdem an die Oligonukleotidsonde mittels eines Liganden konjugiert werden, welcher an der Oligonukleotidsonde durch ein oben beschriebenes Verfahren angebracht wird, und mittels eines am Label angebrachten Rezeptors für diesen Liganden. Hierzu eignet sich jede beliebige der bekanten Liganden-Rezeptor-Kombinationen, zu denen beispielsweise Biotion-Avidin oder Biotin-Streptavidin und Antigen-Antikörper gehören. Allerdings wird der Biotin-Avidin-Kombination den Vorzug gegeben.
  • Falls ein Label zum Nachweis des zusammengefügten Oligonukleotidprodukts benützt wird, kann dieses entweder an ein Teil oder an einer Sequenz von einer oder mehr Oligonukleotidsonden angebracht werden.
  • In situ Nachweis von Amplifikationsprodukten
  • Nach einer ausreichenden Anzahl von Zyklen ist eine nachweisbare Menge von Amplifikationsprodukten erzeugt und lässt sich in Übereinstimmung mit den Nachweistechniken der vorliegenden Erfindung nachweisen, wie oben beschrieben. Nichtsdestoweniger erweist es sich als sehr großer Vorteil, über eine effektive in situ Nachweistechnik(en) zu verfügen, die den Nachweis von in dieser Weise gebildeten Amplifikationsprodukten ermöglicht/ermöglichen, und zwar durch die bloße Addition eines Nachweisreagens zu dem Reaktionsgefäß, vorzugsweise vor Beginn des Amplifikationsprozesses oder alternativ nach dessen Abschluss.
  • Eine unkomplizierte Herangehensweise, um den obigen in situ Nachweis von Amplifikationsprodukten zu erreichen, besteht darin, die chemischen funktionellen Gruppen X1 und Y1, X2 und Y2, X3 und Y3 und/oder X4 und Y4 so zu gestalten, dass sie eine nachweisbare Verbindung darstellen, sobald eine chemische Bindung zwischen ihnen hergestellt ist.
  • In Abhängigkeit von deren chemischer Natur kann die nachweisbare Verbindung beispielsweise colorimetrisch in OD-Einheiten oder fluorimetrisch nachgewiesen werden. Weiterhin lässt sich die Verbindung mittels direkt oder indirekt gelabelter Antikörper nachweisen, z.B. mittels eines monoclonalen Antikörpers, der gegen die Verbindung gezüchtet wird.
  • Der in situ Nachweis von Amplifikationsprodukten kann überdies in der nachfolgend beschriebenen Weise erfolgen:
    Während der Durchführung der oben erläuterten Amplifikationsverfahren werden die einzelsträngigen Sequenzen B und B' und/oder D und D' erhalten. Diese einzelsträngigen Sequenzen sind in Amplifikationsprodukten einmalig; daher können eine oder alle von ihnen eingesetzt werden, um die Anwesenheit von Amplifikationsprodukten in Übereinstimmung mit zwei hierin zu beschreibenden Nachweisverfahren nachzuweisen:
    Der Einfachheit halber bezieht sich die nachstehende Beschreibung in erster Linie auf die Schutzsequenzen B und B' der Oligonukleotidsonden der ersten Oligonukleotidsondengruppe. Nichtsdestoweniger besitzt die selbe Beschreibung selbstverständlich auch Gültigkeit für die Schutzsequenzen D und D' der Oligonukleotidsonden der zweiten Oligonukleotidsondengruppe.
  • Wenn die Nukleotidsequenzen der Schutzsequenzen B und B' ausgewählt werden, um sie einander komplementär zu machen, dann hybridisieren schließlich nach Abschluss des Amplifikationsprozesses alle B- und B'-Schutzsequenzen, die nicht in ein Amplifikationsprodukt eingegliedert sind, aneinander, und zwar zusammen mit den Targeting-Sequenzen A und A' von Oligonukleotidsonden 1 und 1'; hingegen bleiben die Schutzsequenzen B und B', die in ein Amplifikationsprodukt eingegliedert sind, einzelsträngig, wie in 23 mit fetten Linien dargestellt.
  • In dem Fall, wo die Schutzsequenzen B und B' ausgewählt werden, um in ihrer Sequenz universell zu sein, können sie zum Nachweis jeder beliebigen gewünschten Zielnukleinsäuresequenz verwendet werden, wie hierin für die dritte und vierte Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
  • In einer dritten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden zwei gelabelte Nachweisoligonukleotidsonden in einem in situ Nachweisprozess benützt, der Proximitätsenergietransferlabeling beinhaltet. Als erste Nachweisoligonukleotidsonde dienen jeweils Schutzsequenzen B und/oder B' von Oligonukleotidsonden 1 und 1'. Die erste Nachweisoligonukleotidsonde wird an eine Proximitätslabel-Moiety R1 konjugiert. Eine zweite Nachweisoligonukleotidsonde B.1 und/oder B'.1 wird an eine entsprechende zweite Proximitätslabel-Moiety R2 konjugiert. Wie in 24 veranschaulicht, sind die zweiten Nachweisoligonukleotidsonden B.1 und B'.1 jeweils komplementär zu Schutzsequenzen B und B'. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden, wie 25 zeigt, die zweiten Nachweisoligonukleotidsonden B.1 und B'.1 zwecks Bildung eines kontinuierlichen Moleküls B.1-B'.1 direkt oder indirekt verbunden.
  • Die beiden gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden hybridisieren an einander und bringen dementsprechend die Proximitätslabel-Moieties R1 und R2 in eine Nähe zueinander, die für deren Interaktion zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals ausreicht. In dem Fall, wo die Nachweisoligonukleotidsonden B.1 und B.1' jeweils individuelle Moleküle sind, wird eine Hybridisierung der in 24 dargestellten Art gebildet; wenn hingegen die Nachweisoligonukleotidsonden B.1 und B'.1 verbunden werden, um ein kontinuierliches Molekül B.1-B'.1 (skizziert als
    Figure 00560001
    in 25) zu bilden, führt die Hybridisierung zur Formation von Aggregaten, die aus einer variablen Anzahl von Amplifikationsprodukten bestehen, die aneinander über das B.1-B'.1 Molekül gekoppelt sind, wie in 25 veranschaulicht, wo ••• eine Koppelungsposition zusätzlicher Amplifikationsprodukte skizziert.
  • Wenn die beiden gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden, z.B B und B.1, hybridisiert sind, werden die Proximitätslabeling-Moieties R1 und R2 einander nahe genug gebracht, um zu ermöglichen, dass eine Energietransferreaktion zwischen ihnen stattfindet, die in einer messbaren Energieemission resultiert.
  • Bei dem ersten Proximitätslabel R1 kann es sich beispielsweise um einen Energiespender handeln und bei dem zweiten Proximitätslabel R2 um einen Energieakzeptor. Beispielsweise lässt sich ein Energiespender wie eine fluoreszente oder chemilumineszente Verbindung als ein Proximitätlabel einsetzen, wobei ein Energieakzeptor wie Rhodamin als das zweite Proximitätslabel verwendet wird.
  • Das oben beschriebene Nachweisverfahren ist verhältnismäßig einfach in Kombination mit dem Amplifikationsverfahren anzuwenden, da alles, was über Letzteres hinaus benötigt wird, zusätzliche Oligonukleotidsonden (B.1 und/oder B'.1 oder B.1-B'.1) und ein zusätzlicher Hybridisierungszyklus sind.
  • Die zweite Nachweisoligonukleotidsonde, an welche die Proximitätslabeling-Moiety R2 angebracht ist, kann zusammen mit allen anderen Reagenzien in das Reaktionsgefäß gegeben werden, bevor der Amplifikationsprozess beginnt oder, alternativ dazu, nachdem er abgeschlossen ist.
  • Falls die Zielnukleinsäure nicht in der untersuchten Probe enthalten ist, findet keine Amplifikation statt, und alle B- und B'-Sequenzen werden aneinander jeweils gemeinsam mit den Targeting-Sequenzen A und A' von Oligonukleotidsonden 1 und 1' hybridisiert; daher hybridisiert die zweite Proximitätslabelingnachweisoligonukleotidsonde nicht an diese, und es wird kein Signal erzeugt.
  • Falls die zweite Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, die auf den Nachweis winziger Sequenzänderungen ausgerichtet ist, durchgeführt wird, gestattet der Einsatz unterschiedlicher Proximitätslabeling-Moieties (d.h. jener Moieties, die ein unterschiedliches Signal erzeugen, wenn sie in passende Nähe gebracht werden) auf jeder der Oligonukleotidsondengruppen die simultane Durchführung der Sequenz unterscheidenden Amplifikation der Wildtyp- oder der Mutantennukleinsäuresequenzen in einem einzigen Reaktionsgefäß.
  • In einer vierten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung basiert der in situ Nachweis der Amplifikationsprodukte auf der Freisetzung einer Label-Moiety L, die an einzelsträngige B- und/oder B'-Sequenzen konjugiert wird, die in Amplifikationsprodukte eingegliedert sind, und auf der Entfernung aller doppelsträngigen B- und B'-Sequenzen gemeinsam mit den Label-Moieties, die an dieselben aus dem Testgefäß mittels einer an Oligonukleotidsonden 1 und/oder 1' konjugierten Affinitätsseparations-Moiety S konjugiert sind.
  • Wie oben erläutert, sind nach Abschluss des Amplifikationsprozesses die in Amplifikationsprodukte eingegliederten Schutzsequenzen B und B' die einzigen einzelsträngigen B- und B'-Schutzsequenzen in dem Reaktionsgefäß, da die Schutzsequenzen B und B' von Oligonukleotidsonden 1 und 1', die nicht in ein Amplifikationsprodukt eingegliedert wurden, aneinander hybridisiert werden, wie oben dargelegt. Diese einzelsträngigen B- und B'-Sequenzen können, z.B. unter Verwendung einer einzelsträngigen spezifischen Nuklease oder eines geeigneten chemischen Verfahrens, nukleiert werden, wodurch die an dieselben konjugierte Label-Moiety L an die umgebende Lösung abgegeben wird.
  • An eine oder mehr Stellen einer oder mehr der Oligonukleotidsonden, die in der Amplifikationsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, beispielsweise an verschiedenen Stellen entlang der Targeting-Sequenzen A und A' der jeweiligen Oligonukleotidsonde 1 oder 1', werden eine oder mehr Affinitätsseparation-Moieties S konjugiert. Die Affinitätsseparation-Moiety S kennzeichnet sich durch ihre Fähigkeit, eine Gegensubstanz-Moiety S' mit hoher Affinität zu binden. Bei der Affinitätsseparation-Moiety S kann es sich beispielsweise um ein Hapten oder ein Biotin handeln; dementsprechend kann die Gegensubstanz-Moiety jeweils ein geeigneter Antikörper oder auch Avidin oder Streptavidin sein. Vorzugsweise wird die Gegensubstanz-Affinitätsseparation-Moiety S' an einem festen Träger, wie Kunststoff, Dextran, Glas oder magnetischen Kugeln, und am oberen Ende des Reaktionsgefäßes angebracht, z.B. an einem Schraubdeckel.
  • Eine einzelsträngige spezifische Nuklease, wie Exonuklease VII aus E. coli., bei der es sich um eine progressive einzelsträngige Exonuklease handelt, die sowohl vom 3'- als auch vom 5'-Ende einer einzelsträngigen DNA aus wirkt und deshalb eine geeignete Nuklease zur Ausführung der obigen Funktion ist (s. z.B. Berk, A.J., u.a.: Cell, 12:721–732 (1977) und Goff, S., u.a.: Proc. Natl. Sci. USA, 75:1763–1767 (1978)), wird im Anschluss an die Amplifikation zusammen mit einem passenden Puffer in das Reaktionsgefäß gegeben. Alternativ dazu wird ein geeignetes chemisches Verfahren angewandt, das auf die spezifische Degradation von einzelsträngigen Sequenzen zielt. Die Mischung wird unter den entsprechenden Bedingungen inkubiert (z.B. 30 Minuten lang bei 37°, wenn eine Nuklease benützt wird), um einzelsträngige B- und B'-Sequenzen zu degradieren, die in Amplifikationsprodukte eingegliedert sind. B- und B'-Sequenzen, die nicht in Amplifikationsprodukte eingegliedert sind, werden aneinander gemeinsam mit den A- und A'-Targeting-Sequenzen von jeweils Oligonukleotidsonde 1 oder 1' hybridisiert und daher nicht, z.B. durch die Nuklease, nukleiert. Das Ergebnis der Nukleolyse besteht darin, das die Label-Moiety L in einer zum Amplifikationslevel proportionalen Menge an die Lösung abgegeben wird. In 26 wird das Ergebnis der Nukleolyse veranschaulicht. Label-Moieties L, die nicht auf diese Weise freigesetzt wurden, also jene, welche an die nicht in Amplifikationsprodukte eingegliederten B- und B'-Sequenzen konjugiert sind, werden durch Affinitätsseparation entfernt, z.B. durch Drehen des Reaktionsgefäßes um 180°, was zu der Absorption der Separations-Moiety S, z.B. Biotin, an der Verschlusskappe führt, die mit einem Affinititätsseparation-Gegensubstanz-Molekül S' überzogen ist, in diesem Beispiel Avidin. Somit kann die freigesetzte Label-Moiety L, z.B. Fluorescein, im gegebenen Beispiel auf fluorometrische Weise erfasst werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Gegensubstanz-Moiety S' an magnetische Kugeln angebracht, die aus der Reaktion entfernt werden können, indem das Reaktionsgefäß um 180° gedreht wird, wodurch die Kugeln, wie in 27 dargestellt, zu dem Magneten gezogen werden, der in dem Gefäßdeckel eingebettet ist.
  • Falls die Zielnukleinsäure nicht in der untersuchten Probe enthalten ist, findet keine Amplifikation statt; alle B und B'-Sequenzen werden aneinander hybridisiert; nach der Addition der spezifischen einzelsträngigen Nukleare erfolgt keine Freisetzung einer nachweisbaren Label-Moiety L; daher wird nach der Absorption der Affinitätsseparations-Moieties an einen festen Träger kein Label in dem Reaktionsgefäß nachgewiesen.
  • Der Einfachheit halber bezieht sich das Amplifikations- und das Nachweisverfahren, die oben beschrieben sind, auf die Amplifikation und den Nachweis einer einzelnen Zielnukleinsäure. Selbstverständlich können mehr Oligonukleotidsonden pro gesampelte Nukleinsäure in dem Prozess der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um viele Zielnukleinsäuresequenzen oder -sequenzänderungen nachzuweisen und um, wie oben angemerkt, eine Sequenzänderung unter Verwendung nur eines Reaktionsgefäßes zu erfassen. Zusammengefügte Oligonukleotidprodukte aus verschiedenen Sequenzen der selben gesampelten Nukleinsäuren können voneinander unterschieden werden, z.B. mittels verschiedener Labels, Nachweisverfahren oder Oligonukleotidsonden mit distinkt unterschiedlichen Längen. Weiterhin ist es selbstverständlich, dass jede Zielnukleinsäuresequenz durch zwei Gruppen von Oligonukleotidsonden getestet werden kann. In diesem Fall wird der Nachweis zwecks genauer Überprüfung zweimal überwacht.
  • Vorteile des Verfahrens der vorliegenden Erfindung gegenüber Verfahren nach Stand der Technik
  • Verfahren gemäß bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zeichnen sich durch eine Reihe von Vorteilen gegenüber Verfahren nach Stand der Technik aus, welche die Amplifikation von Nukleinsäure und den Nachweis von Sequenzvariationen zum Zweck haben.
  • Im Gegensatz zu auf Enzymen basierenden Verfahren, wie Hybridisierung mit Hilfe einer Allel-spezifischen Oligonukleotidsonde (ASO), reverse-ASO, Restriction Site Generating PCR (RG-PCR), Denaturierungs-/Temperaturgradientengelelektrophorese (D/TGGE), Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP), Heteroduplexanalyse, Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP), PCR-Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (PCR-RFLP), Nuclease Protection Assays, und zur chemischen Spaltung und anderen, weniger häufig eingesetzten Verfahren fungiert das Verfahren der vorliegenden Erfindung als enzymfreies System zur selektiven Amplifikation von Zielnukleinsäuresequenzen und bietet eine Reihe von Vorteilen:
    Erstens erfordert das Verfahren der vorliegenden Erfindung kein hochqualifiziertes Personal zur (a) akkuraten Ausführung der Amplifikations- und Nachweisverfahren, die ein bis zwei einfache Schritte umfassen und keine anspruchsvollen Schritte beinhalten wie eine Gelelektrophorese und/oder komplizierte Blotting- und Hybridisierungsverfahren, (b) zur Auswertung der Ergebnisse;
    zweitens sind Schritte zur strikten Kalibrierung vor der Untersuchung jeder beliebigen neuen DNA-Änderung nicht notwendig;
    drittens eignet sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung theoretisch zum Nachweis aller Sequenzänderungen;
    viertens lässt sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung problemlos automatisieren;
    fünftens beruht das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auf der Verwendung von Enzymen wie DNA- und RNA-Polymerasen, Restriktionsendonukleasen, Einzelstrangspezifischen Endo- und Exonukleasen und dergleichen, welche nicht nur teuer sind, sondern auch von Los zu Los Variationen hinsichtlich Aktivität und Konzentrationen unerwünschter Nukleasekontaminanten aufweisen.
  • Gegenüber der chemischen Amplifikationsreaktion (CAR) (intemationale PCT Anmeldung US 94/06690) hat das Verfahren der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile vorzuweisen:
    Der erste Punkt besteht darin, dass das CAR-Verfahren, wie oben erwähnt, mit einem schwerwiegenden Nachteil behaftet ist, da sich eine kreuzähnliche Struktur (s. 3) mit hoher thermodynamischer Stabilität bilden und nach Amplifikation in einem Templateunabhängigen falsch positiven Amplifikationsprodukt resultieren kann. Der Aufbau der Oligonukleotidsonden für die Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde mit Sorgfalt gestaltet, um die Bildung von Zielnukleinsäuresequenz-unabhängigen stabilen Hybridisierungsstrukturen, wie jener in 3, zu verhindern. Gleichwohl sind die in der vorliegenden Erfindung realisierten Schutzsequenzen nicht durch ihre Länge eingeschränkt. Diese Charakteristik erwies sich für die oben erläuterten Nachweisverfahren von Vorteil.
  • Zweitens ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung vollauf zu einer unterscheidenden Amplifikation von Sequenzen in der Lage, die in einer winzigen Sequenzänderung wie einer Punktmutation differieren, wohingegen das CAR-Verfahren unfähig ist, zwischen Zielnukleinsäuresequenzen zu unterscheiden, die in winzigen Sequenzänderungen differieren. Aus diesem Grund eignet sich das Verfahren der vorliegenden Erfindung sowohl zur Analyse von Mutationen, die mit verschiedenen genetischen Krankheiten in Verbindung gebracht werden, als auch zum Nachweis des Vorhandenseins jeder beliebigen Zielnukleinsäuresequenz in einer Probe, einschließlich jener von Pathogenen. Die Fähigkeit des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, Punktmutationen nachzuweisen, ist bedingt durch die Positionierung der chemischen funktionellen Gruppen nahe der untersuchten Stelle der Zielnukleinsäuresequenz, nämlich in der Verbindungsstelle zwischen Targeting-Sequenzen A und A' und jeweiligen Schutzsequenzen B oder D und B' oder D', und am Ende von Targeting-Sequenzen C und C'. Beim CAR-Verfahren sind die chemischen funktionellen Gruppen abseits von der Zielnukleinsäuresequenz platziert, weshalb dieses Verfahren nicht ausreichend sensibel ist, um zwischen Sequenzen zu unterscheiden, die hinsichtlich einer winzigen Sequenzänderung wie einer Punktmutation differieren.
  • Drittens sind bei einigen der bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung alle für die Amplifikations- und Nachweisprozesse erforderlichen Reagenzien bereits vor der Amplifikation im Testgefäß enthalten. Aufgrund ihrer einzigartigen Fähigkeit, ein positives oder ein negatives Signal auszugeben, ohne dass dazu das Öffnen des Testgefäßes erforderlich wäre, erweist sich die vorliegende Erfindung besonders vorteilhaft. Die Einfachheit des Nachweisprozesses ergibt sich aus der Bildung einzelsträngiger Schutzsequenzen B und B' und/oder D und D', welche einzig bei den durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erzeugten Amplifikationsprodukten vorkommen.
  • Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann eingesetzt werden, um mittels der oben beschriebenen Vorgehensweise die Identität von Nukleotidbasen an verschiedenen Allelen festzustellen, von denen jedes eine spezifische Position in relevanten Nukleinsäuren hat.
  • Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eingesetzt werden, um eine Nukleinsäuren enthaltende Probe zu typisieren. Ein derartiger Prozess umfasst das Identifizieren der Nukleotidbase(n) an jeder von einer oder mehr spezifischen Positionen, wobei jede derartige Nukleotidbase unter Verwendung verschiedener Oligonukleotidsondengruppen identifiziert wird, wie oben beschrieben.
  • Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiterhin zur Identifizierung verschiedener Allele in einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe eingesetzt werden. Ein derartiger Prozess umfasst das Identifizieren der Nukleotidbase(n), die an jeder der einen oder mehr spezifischen Stellen vorhanden ist/sind, wobei jede dieser Nukleotidbasen durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wird.
  • Eine weitere Anwendung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in der Bestimmung des Genotyps eines Organismus an einem oder mehr speziellen genetischen Loci. Ein derartiger Prozess erfordert den Erhalt einer Probe aus einem Organismus, die genomische, mitochondriale oder chloroplastische DNA oder RNA enthält. Die Nukleotidbase(n), die an jeder der einen oder mehr spezifischen Positionen in maßgeblichen Nukleinsäuren vorhanden ist/sind, wird/werden durch den oben erläuterten Prozess identifiziert. Auf diese Weise erfolgt die Identifizierung verschiedener Allele, und dann wird seinerseits der Genotyp des Organismus an einem oder mehr speziellen genetischen Loci bestimmt.
  • Der Erfindungsgegenstand bietet weiterhin ein Verfahren zur Typisierung einer Probe von Nukleinsäuren, das in der Identifizierung der Base oder Basen besteht, die an jeder der einen oder mehr spezifischen Stellen vorhanden sind, wobei alle derartigen Nukleotidbasen mittels des oben skizzierten Verfahrens identifiziert werden, bei welchem jede spezifische Stelle in den maßgeblichen Nukleinsäuren durch verschiedene Oligonukleotidsondengruppen bestimmt wird. Die Identität jeder (der) Nukleotidbase(n) an jeder Stelle kann individuell bestimmt werden; vorzugsweise können die Identitäten der Nukleotidbasen an verschiedenen Stellen auch simultan bestimmt werden, indem beispielsweise verschiedene Label-Moieties zum Einsatz kommen.
  • Der Erfindungsgegenstand bietet außerdem ein weiteres Verfahren zur Typisierung einer Probe von Nukleinsäuren, welches die Bestimmung der An- oder Abwesenheit einer oder mehr bestimmter Nukleotidsequenzen umfasst, wie oben beschrieben.
  • Der Erfindungsgegenstand bietet weiterhin ein zusätzliches Verfahren zur Typisierung einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe. Zuerst wird die An- oder Abwesenheit einer oder mehr bestimmter Nukleotidsequenzen bestimmt, wie oben dargelegt. Dann wird/werden den obigen Erläuterungen entsprechend die Nukleotidbase(n) identifiziert, die an jeder der einen oder mehr spezifischen Positionen vorhanden ist/sind.
  • Der Erfindungsgegenstand bietet weiterhin ein Verfahren zur Identifizierung verschiedener Allele in einer Nukleinsäuren enthaltenden Probe, welches das Identifizieren der Base(n) umfasst, die an jeder der einen oder mehr spezifischen Positionen vorhanden ist/sind, wie oben ausgeführt.
  • Gruppen aus Oligonukleotidsonden können, der obigen Beschreibung entsprechend, unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen als Kit zur Diagnostizierung oder Typisierung von Nukleinsäuren eingesetzt werden. Darüber hinaus enthält der Kit die passenden Reagenzien, die auf den Nachweis von Amplifikationsprodukten zielen, wie oben erläutert, und zweckmäßige Puffer, wie eine Hybridisierungslösung.
  • Tabelle 1 listet einen Auszug verschiedener Krankheiten auf, die bekanntermaßen aus dem Vorhandensein einer oder mehr Mutationen in einem Gen hervorgehen, das ein spezifisches Protein oder Enzyme codiert. Bei den meisten dieser Leiden handelt es sich um rezessive Krankheiten, d.h. bei dem erkrankten Individuum sind beide Allele Träger einer Mutation, wobei die Mutation darin besteht, dass das Protein fehlt (Gen nicht exprimiert), in einem inaktiven Zustand ist (durch eine veränderte Aminosäuresequenz), oder nicht in den erforderlichen Mengen vorhanden ist (erheblich reduzierte Genexpression). TABELLE 1
    KRANKHEIT GEN
    Hämophilie A Faktor VIII
    Hämophilie B Faktor IX
    Lesch-Nyhan-Syndrom HPRT
    Ornithin-Transcarbamylase OTC
    Hereditäre Amyloidose Transthyretin (TTR)
    Morbus Gaucher Glukocerebrosidase
    Zystische Fibrose CFTR
    Osteogenesis imperfecta Collagen (I, II Procollagen)
    Hämoglobinopathien (z.B. β-Thalassämie, Sichelzellenanämie) Hämoglobingene
    Akute intermittierende Porphyrie (AIP) Uroporphyrinogen-I-Synthetase
    Phenylkentonurie Phenylalanin-Hydroxylase
    Tay-Sachs Hexosaminidase A (HEXA)
    Familiäre Hyperocholesterolämie (FH) LDL-Rezeptor
    Neurofibromatose NF1
  • Die permanente Forschung zur Feststellung der genetischen Grundlagen von Krankheiten und das Aufkommen von Technologien wie der Polymerasekettenreaktion (PCR) haben zur Entdeckung und kompletten Sequenzierung von immer mehr Genen geführt, die strukturelle Protein- oder Enzymprodukte codieren, und van Mutationen, welche entweder zu keiner Expression des Genprodukts oder zur Expression eines Produkts führen würden, die qualitativ oder quantitativ beeinträchtigt ist und dadurch eine Krankheit bedingt. Somit besteht für das obige Verfahren der Erfindung ein sich ständig erweiterndes Anwendungsgebiet.
  • Neben seiner Zweckdienlichkeit bei der Diagnose spezifischer, mit Krankheiten einhergehenden Mutationen in bekannten Genregionen kann sich das Verfahren der Erfindung auch bei Tests hinsichtlich der Anwesenheit bestimmter Sequenzen nützlich erweisen in Verbindung mit Bluttypisierung, Gewebeklassifikation – HLA-Typisierung, Geschlechtsbestimmung oder bei möglichem Verdacht auf Erkrankung eines Individuums. Gewebe lassen sich beispielsweise durch die Identifizierung eines Polymorphismus klassifizieren, der für ein bestimmtes Individuum spezifisch ist. Die Möglichkeit eröffnet sich, das Durchsuchen dieser bekannten HLA-Gensequenzen mittels des vorliegenden Verfahrens auch als diagnostisches Hilfsmittel einzusetzen zwecks Bestimmung, ob besagte Individuen anfällig für gewisse Krankheiten sind, z.B. für verschiedene spezifische Autoimmunkrankheiten, welche in Korrelation mit den speziellen HLA-Genen stehen, die von dem Individumm getragen werden.
  • Wie oben angemerkt, lässt sich das Verfahren der Erfindung auch auf dem Gebiet der forensischen Medizin anwenden, in welcher der Polymorphismus in spezifischen Genen, z.B. dem β-Globingen-Cluster und den verschiedenen bekannten Wiederholungssequenzen, bestimmt werden kann in z.B. am Ort eines Verbrechens gefundenen Blut- oder Spermaproben. Die Ergebnisse können zur Klärung verwendet werden, ob ein bestimmter Verdächtiger in das Verbrechen involviert war oder nicht. In ähnlicher Weise kann die zuvor erwähnte Bestimmungstechnik in Fällen eines Vaterschaftsstreits Anwendung finden um festzustellen, ob ein gewisser Mann der Vater eines Kindes ist oder nicht.
  • Es bestehen Beweise dafür, dass gewisse Krebsarten aus spezifischen Punktmutationen in der Sequenz bestimmter Gene hervorgehen können. Dementsprechend können die vorliegenden Verfahren als Instrument zur Früherkennung eingesetzt werden, um die Bevölkerung im Allgemeinen zu testen oder jene Individuen, bei denen die Wahrscheinlichkeit, derartige Krebsarten zu entwickeln, am größten ist.
  • Eine weitere Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung bietet sich, wie oben vermerkt, beim Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe anhand der Anwesenheit spezifischer Sequenzen in der Probe. Beispielsweise kann ein Individuum, bei dem Verdacht auf Infektion mit einem Mikroorganismus wie einem Bakterium oder einem Virus besteht, einem Test unterzogen werden unter Verwendung einer Kombination von Oligonukleotidsonden, die nur an einer spezifischen bakteriellen und/oder viralen DNA-Sequenz anlagern und nicht an in dem Individuum vorhandenen Sequenzen. Ein Beispiel für eine solche Anwendung stellt das Screening von Individuen auf die Anwesenheit des AIDS-Virus dar. In ähnlicher Art lassen sich verschiedene Bakterienarten oder -stämme in einer Probe voneinander differenzieren, z. B. Shigella- und Salmonella-Bakterien, deren Unterscheidung mittels standardgemäßer Techniken Schwierigkeiten bereitet.
  • Genregionen, welche den in der obigen Tabelle 1 aufgeführten und vielen anderen entsprechen, lassen sich an jeder beliebigen Anzahl von Stellen auf die Anwesenheit einer oder mehr Punkt- oder anderer Mutationen analysieren oder auf das Vorhandensein eines Polymorphismus bezüglich eines beliebigen spezifischen Allels; weiterhin kann analysiert werden, ob das getestete Individuum hinsichtlich einer bestimmten Mutation homozygot oder heterozygot (d.h. Träger) ist oder ob das Individuum an dieser spezifischen Stelle keine Anomalien aufweist (d.h. zwei normale Allele trägt).
  • Das vorliegende Verfahren kann eine ausgesprochen effiziente Alternative zu den traditionellen Nachweismethoden für Mutationen darstellen, welche radioaktives Material verwenden, verschiedene Hybridisierungs- oder PCR-Bedingungen für jede Mutation, spezielle Gels oder einen teueren automatisierten Sequenzer. Demgegenüber ermöglicht das vorliegende Verfahren eine diagnostische Vorgehensweise in großem Stil, welche die Möglichkeit eröffnet, viele verschiedene Proben innerhalb eines kurzen Zeitraums zu durchsuchen. Darüber hinaus bietet das vorliegende Verfahren ein Mittel, um die Bevölkerung auf eine ganze Reihe von Erbkrankheiten und genetische Krankheiten hin zu durchsuchen, z.B auf genetisch bedingte Krebsarten und dergleichen; problemlos lässt sich das vorliegende Verfahren anpassen für die Durchsuchung nach Polymorphismus, z.B, jener in HLA-Genen, für den Nachweis des Vorhandenseins pathogener RNA oder DNA oder für die Differenzierung zwischen unterschiedlichen Bakterien- und Virenstämmen.
  • Anhand der folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert:
  • BEISPIEL 1
  • Einsatz der Amplifikations- und der Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung zwecks Amplifikation und Nachweis einer DNA-Sequenz mit 54 Basenpaaren, die in dem menschlichen Papilloma-Virus 16 Genom enthalten ist.
  • Bei der zu amplifizierenden und nachzuweisenden Region handelt es sich um eine doppelsträngige Sequenz des menschlichen Papilloma-Virus 16 Genom (Human Papilloma Virus/HPV 16 Genom), welche sich von Nukleotidbasen-Nr. 800 bis 854 erstreckt (Nummern gemäß Seedorf K., u.a.: Virology 145, 181–185 (1985)) und welche folgende Sequenz (SEQ. ID. NO. 1) aufweist:
    5'-AGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACC-3'
    3'-TCTGGACAATTACCCGTGTGATCCTTAACACACGGGGTAGACAAGAGTCTTTGG-5'
  • Vier mit 1, 1', 2 und 2' bezeichnete Oligonukleotidsonden werden eingesetzt, um die obige Zielsequenz zu amplifizieren; diese Oligonukleotidsonden weisen die folgenden Sequenzen auf
    Figure 00690001
    Figure 00700001
  • Die Schrägstriche stellen lediglich die Abgrenzung zwischen Targeting-Sequenzen A und A' und Schutzsequenzen B und B' der jeweiligen Oligonukleotidsonden 1 und 1' dar. Die vertikalen Einzellinien zeigen eine chemische Bindung an, welche die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 an eine Substituentengruppe auf Uridinrückständen bindet, die sich am Ende von Targeting-Sequenzen A und A' befinden, und zwar zwischen den Verbindungsstellen von Targeting-Sequenzen A und A' und Schutzsequenzen B und B' der jeweiligen Oligonukleotidsonden 1 und 1'.
  • In diesem Beispiel wird eine Diels-Alder-Reaktion zwischen chemischen funktionellen Gruppen X und Y veranschaulicht. Des Weiteren sind in diesem Beispiel die chemischen funktionellen Gruppen X1 und X2 die gleichen, wie auch die chemischen funktionellen Gruppen Y1 und Y2; deshalb wird auf sie in diesem Beispiel als chemische funktionelle Gruppen X und Y Bezug genommen.
  • Wie anhand der oben aufgelisteten Oligonukleotidsonden ersichtlich, sind die chemischen funktionellen Gruppen X und Y an Uridinrückständen angebracht. Y-Gruppen, die als Dienophile in der Diels-Alder-Reaktion dienen, werden jeweils mittels der C-2'-Position der Ribose-Moiety an ein 2'-Aminomethyl Uridin angebracht, wohingegen X-Gruppen, die als Diene dienen, jeweils an die C-5-Position der Uridinbasen-Moiety angebracht werden.
  • Synthese von 2'-trifluoroacetamidomethyluridin phosphoramidit Derivat zum Anbringen von Y-Gruppen an Sonden 2 und 2' mittels einer 2'-Position eines Uridinrückstands.
  • Ein Uridinrückstand wird modifiziert, so dass zu einem späteren Zeitpunkt eine gewünschte chemische funktionelle Gruppe kovalent an diesen angebracht werden kann; daraufhin werden herkömmliche Verfahren angewandt, um die Oligonukleotidsonden schrittweise zu synthetisieren, und das modifizierte Uridin wird an einer beliebigen Stelle positioniert. Sobald die Oligonukleotidsonden synthetisiert sind, werden chemische funktionelle Y-Gruppen an den modifizierten Uridinrückstände angebracht. In diesem Beispiel handelt es sich bei den chemischen funktionellen Y-Gruppen von Sonden 2 und 2' um ein 2-Butendisäurederivat.
  • 1. Synthese von 2'-deoxy-2'-C-trifluoroacetamidomethyluridin.
  • Das Nukleosid 2'-deoxy-2'-C-azidomethyluridin kann entsprechend einem Verfahren hergestellt werden, das beschrieben ist von Ioannidis, u.a.: Nucleosides & Nucleotides, 11: 1205 (1992). Somit wird eine Lösung hergestellt, die 10 mmol Azidoverbindung (2.83 Gramm) in Methanol (200 ml) enthält; diese Lösung wird in einer Wasserstoffatmosphäre mit 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator (1.4 Gramm) eine Stunde lang kräftig gerührt. Die Mischung wird gefiltert und eingedampft, und das Aminomethyluridin bleibt als eine ölige Substanz zurück. Das so hergestellte Aminoprodukt wird ohne weitere Reinigung in dem folgenden zweiten Schritt benützt.
  • Einer Lösung (50 ml), die 10 mmol C-2'-aminomethyluridin (2.5 Gramm) und 10 mmol Triethylamin (1.1 Gramm) in Ethylacetat enthält, welches auf 0°C abgekühlt wird, wird tropfenweise einer Lösung zugegeben, die 11 mmol Trifluoressigsäureanhydrid (2.31 Gramm) in Ethylacetat (30 ml) enthält. Diese Mischung wird drei Stunden lang gerührt, woraufhin eine Extraktion mit Ethylacetat-Wasser durchgeführt wird. Die organische Schicht wird mit Salzwasser gewaschen und mit anhydrischem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird bis zur Trockenheit eingedampft. Zwecks weiterer Reinigung kann das Produkt auf einer Silicagelsäule separiert werden.
  • 2. Herstellung von 5'-dimethoxytrityl-2'-C-trifluoroacetamido-methyluridin.
  • Eine Lösung, die 10 mmol 4,4'-dimethoxytritylchlorid (3.38 Gramm) in trockenem Pyridin enthält, wird tropfenweise einer gekühlten (0°C) Lösung aus trockenem Pyridin (100 ml) zugegeben, die 10 mmol Trifluoroacetamidouridin (3.54 Gramm) enthält. Diese Mischung wird drei Stunden lang gerührt, und das Pyridin wird bis zur Trockenheit eingedampft. Das ölige Produkt wird in Ethylacetat gelöst und mit Wasser und Salzwasser gewaschen; die organische Schicht wird mit anhydrischem Natriumsulfat getrocknet. Die Mischung wird bis zur Trockenheit eingedampft, und das Produkt kann auf einer Silicagelsäule weiter gereinigt werden.
  • 3. Herstellung von 5'-dimethoxytrityl-3'-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidit-2'-C-trifluoroacetamido-methyluridin.
  • 10 mmol 5'-dimethoxytrityl-2'-C-trifluoroacetamido-methyluridin (6.56 Gramm) und 20 mmol N,N-diisopropylethylamin (2.60 Gramm) werden in trockenem Dichlormethan (50 ml) unter Argon gelöst, und die Lösung wird bei 0°C gehalten. Dieser Lösung werden 10 mmol 2-cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidit (Aldrich) (2.36 Gramm) in 25 ml trockenem Dichlormethan tropfenweise zugegeben. Die Reaktion wird zehn Minuten lang gerührt, und weitere 10 min bei Raumtemperatur aufbewahrt. Ethylacetat (250 ml} wird der Mischung zugegeben und dreimal mit Salzwasser extrahiert. Das Lösungsmittel wird unter einem Vakuum entfernt, Toluol (50 ml) wird zugegeben, und die Mischung wird lyophilisiert, wodurch weißes Pulver zurückbleibt, das unter Argon gesammelt wird.
  • Derivatisierung von Uridin an C-5-Position für das Anbringen von chemischen funktionellen X-Gruppen an Sonden 1 und 1' mittels eines Uridinphosphoramiditderivats.
  • In diesem Beispiel handelt es sich bei den chemischen funktionellen Gruppen X von Sonden 1 und 1' jeweils um ein Dien, das aus dem Anbringen einer Doppelbindung C=C an der C-5-Position einer Uridinbase abgeleitet ist. Mehrere Diene könnten angebracht werden. Das Anbringen einer Doppelbindung an der C-5-Position von Uridin wird erläutert von Bergstrom, u.a.: J. Amer. Chem. Soc., 100: 8106 (1977). Das bevorzugte Beispiel besteht im Anbringen von Propylen an der C-5-Position gemäß genannter Referenz.
  • Die Herstellung des 5'-dimethoxytrityl-C-5-Propylen-3'-(2-cyanoethyl N,N-diisopropyl) phosphoramidit wird ausgeführt gemäß Ruth, J.R., u.a.: DNA 4: 93, (1985), EP 135 587 und obiger Beschreibung.
  • Alle der oben aufgelisteten Oligonukleotide werden mit Hilfe des folgenden Verfahrens synthetisiert und gereinigt.
  • 1. Automatisierte Syntheseverfahren.
  • 2-Cyanoethylphosphoramidite werden bei Applied Biosystems Inc erworben. Das automatisierte Syntheseverfahren umfasst die Kondensation von Nukleosidphosphoramiditen an 30 mg eines Nukleosid-derivatisierten CPG (controlled pore glas) Partikelträger (500 Angstrom Porendurchmesser) unter Verwendung eines Synthesizers vom Typ 380B-02DNA von Applied Biosystems Inc. Die Zyklen (von jeweils 30-minütiger Dauer) beinhalten die Detritylation mit 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan; die Kondensation unter Verwendung von Tetrazol als aktivierendem Protonengeber, das Capping mit Acetic Anhydrid und Dimethylaminopyridin; Detritylation mittels 2% Trichloressigsäure in Dichlormethan; und Oxidation des Phoshites an das Phosphat mit 0.1 M I2/H2O/Lutidin/Tetrahydrofuran. Die Erträge bei jedem Schritt sind im Wesentlichen quantitativ und werden überwacht, indem der während der Detritylation freigesetzte Dimethoxytritylalkohol gesammelt und spektroskopisch untersucht wird.
  • Oligodeoxyribonukleotid-Entschützungs- und Reinigungsverfahren.
  • Der feste Träger wird aus der Säule entfernt und sechzehn Stunden lang bei 60°C in einem geschlossenen Gefäß 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid ausgesetzt. Das Ammoniak wird entfernt, und der Rückstand wird mittels eines Tris-Borate-EDTA (TBE)-Puffers (pH 8.0) auf ein präparatives 12% Polyacrylamidgel angewandt, das 7 M Harnstoff enthält. Bei 20 Volt/cm wird eine fünfstündige Elektrophorese durchgeführt, nach welcher das Band, welches das Produkt enthält, durch UV-Shadowing einer fluoreszenten Platte identifiziert wird. Das Band wird exzidiert und mit 1 ml doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur über Nacht eluiert. Diese Lösung wird gefiltert, und der Überstand wird mit n-Butanol extrahiert (3 × 300 Mikroliter). Die wässrige Phase wird oben auf einer Sephadex G50 Säule (Pharmacia) (1 × 10 cm) platziert und mit doppelt destilliertem Wasser eluiert. Das Eluat wird bei UV-Extinktion mit 260 nm kontrolliert, und die geeigneten Fraktionen werden gesammelt, über die UV-Extinktion in einem festgelegten Volumen quantifiziert und bis zur Trockenheit bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge eingedampft.
  • Reaktion von Maleinsäureanhydrid mit Aminomethylgruppen die an Uridinrückstände angebracht werden, um die chemischen funktionellen Y-Gruppen von Sonden 2 und 2' herzustellen.
  • Aliquots von Oligonukleotidsonden 2 und 2', die 2'-aminomethyl-2'-Deoxyuridin mit einer optischen Dichte von 5.0 (5.0 OD) enthalten, werden bis zur Trockenheit lyophilisiert, und zwar jeweils in einem 1.5 ml Einweg-Eppendorfgefäß. Jede Sondenpräparation wird in 200 μl von 1 M Natriumboratpuffer (pH 9.3) rekonstituiert. Um chemische funktionelle Y-Gruppen anzubringen, werden 200 μl Lösung aus Maleinsäureanhydrid (Aldrich), das in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Konzentration von 20 mg/ml gelöst ist, in jede der Phiolen gegeben, welche dann bei Raumtemperatur (RT) ungefähr 12 Stunden lang geschüttelt werden. Daraufhin wird jede der Mischungen entsalzen und von überschüssigem Reagens chemischer funktioneller Gruppen mittels Zentrifugieren durch eine Pharmacia Sephadex NAP-10 Säule gereinigt. Jede der daraus resultierenden Lösungen wird auf einer Sephadex G50 Säule (Pharmacia) (1 × 10 cm) gereinigt. Jedes Eluat wird bei UV-Extinktion mit 260 nm kontrolliert, und die geeigneten Fraktionen werden gesammelt und über die UV-Extinktion in einem festgelegten Volumen quantifiziert. Jede der Sonden, 2 und 2', wird bis zur Trockenheit lypophilisiert und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
  • Amplifikation
  • Die HPV-16-Sequenz ist beispielsweise in einem Plasmid enthalten, das durch Clonen der HPV-16-Sequenz, veröffentlicht von Seedorf, u.a.: Virology 145, 181–185 (1985), in einem Bluescript-Vektor (Stratagene) hergestellt und in doppelt destilliertem Wasser mit einer Konzentration von 24 ng/ml gelöst wird.
  • Der Amplifikationsprozess der obig dargestellten HPV-16-Sequenz (SEQ. ID. NO. 1) gemäß dem Verfahren der Erfindung umfasst die folgenden Schritte: 1011 Moleküle jeder der Oligonukleotidsonden (1, 1', 2 und 2' werden in einem Hybridisierungspuffer mit einem finalen Volumen von 100 μl rekonstituiert. Der Hybridisierungspuffer enthält 30% deionisiertes Formamid in Wasser (vol/vol) (optional), 0.54 M NaCl, 30 mM Natriumphosphat (pH 7.4), 0.3 mM EDTA, 5% Dextransulfat 500K m.w. (Sigma) (w/vol) und 0.1% Triton X-100.
  • Einem Eppendorfgefäß (Perkin Elmer), das eine 1 μl Probe der oben beschriebenen HPV-16 Zielsequenz enthält, werden 99 μl des die vier Oligonukleotidsonden 1, 1', 2 und 2' enthaltenden Hybridisierungspuffers zugegeben. Ein zweites Gefäß, das der Kontrolle dient, enthält alle Reagenzien außer der Zielsequenz in einem finalen Volumen von 100 μl. Die Lösung in jeder der Gefäße wird sanft gevortext. 100 μl Mineralöl wird in jedes der Gefäße gegeben, um die Evaporation während der wiederholten Erhitzungszyklen der Amplifikationsreaktion zu verhindern.
  • Die Gefäße werden in einem DNA Thermocycler (Perkin Elmer, Cetus) platziert und 30 Erhitzungs- und Kühlzyklen ausgesetzt. Jeder Zyklus besteht aus einer 65-sekündigen Inkubation bei 90°C und einer 240-sekündigen Inkubation bei 40°C.
  • Im Anschluss an diese Zyklen werden 20 μl jeder Lösung mit 2 μl 40% Glycerol in 1 × TBE-Puffer (pH 8.0) gemischt, der Bromphenol-Blau enthält, und werden auf einem 12% Polyacrylamidgel unter Verwendung von 1 × TBE-Puffer (pH 8.0) bei 20 Volt/cm drei Stunden lang elektrophoresiert, wonach das Gel in eine 100 ml Lösung Ethidiumbromid (0.5 mg/ml in H2O) 45 Minuten lang bei Raumtemperatur eingetaucht wird.
  • Das Gel wird einem Polaroidfilm vom Typ 57 oder 667 (ASA 3000) 0.5 Sekunden lang bei f8 unter einer effizienten Quelle (72500 mW/cm2) ultravioletten (UV) Lichts ausgesetzt; auf diese Weise ist ein Band aus verbundenen Oligonukleotidprodukten in einer so geringfügigen Menge wie 10 ng nachweisbar.
  • Nichtradioaktiver in situ Nachweis der amplifizierten Produkte mittels Exonuklease VII
  • Für den nichtradiaktiven in situ Nachweis der amplifizierten Produkte mittels Exonuklease VII werden Oligonukleotidsonden 2 und 2' verwendet wie in Beispiel 1; allerdings wird an das 5'-Ende von Oligonukleotidsonde 1 ein Fluoresceinmolekül und an das 5'-Ende von Oligonukleotidsonde 1' ein Biotinmolekül angebracht, wie unten veranschaulicht.
    Figure 00760001
  • Um Fluorescein und Biotin an das 5'-Ende der jeweiligen Oligonukleotidsonde 1 oder 1' anzubringen, werden jeweils die Reagenzien Fluoresceinphosphoramidit und Biotinphosphoramidit (Glenn Research) eingesetzt.
  • Die Oligonukleotidsondensynthese und -reinigung werden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • Zwecks Amplifikation wird ein Reaktionsgefäß wie folgt aufgebaut:
    Benützt wird ein transparentes Kunststoffgefäß, das durch einen zerstörbaren Trennungsabschnitt in zwei Fächer geteilt ist. Diese Fächer liegen übereinander, wobei der interne Trennungsabschnitt auf der dem unteren Fach zugewandten Seite mit Avidin (Sigma) überzogen ist. Das untere Fach enthält die Reaktionsmischung, wohingegen das obere Fach 0.4 Einheiten Exonuklease VII in einem Puffer aufweist, der sich aus 74 mM Tris.Cl mit pH 8.0, 8 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol und 50 μg/ml BSA zusammensetzt.
  • Im Anschluss an die Amplifikation wird das Reaktionsgefäß bei 37°C gehalten, und der Inhalt des oberen Fachs wird durch den zerstörbaren Trennungsabschnitt herausgedrückt, damit er sich mit dem des unteren Fachs vermischt, welches die Amplifikationsprodukte enthält. Die Reaktionsmischung wird 30 Minuten lang inkubiert, um die einzelsträngigen Schutzsequenzen B und B' zu spalten.
  • Nach der Behandlung mit Exonuklease VII wird das Reaktionsgefäß um 180° gedreht und dann zehn Minuten auf dem Kopf gehalten, um die Bindung biotinylierter doppelsträngiger DNA an der mit Avidin überzogenen Kappe zu ermöglichen. Das Reaktionsgefäß wird erneut um 180° gedreht, und das durch die Nukleaseaktivität aus dem einzelsträngigen B-Fragment an die Lösung abgegebene Fluorescein wird durch ein Fluorometer (Perkin Elmer) nachgewiesen.
  • BEISPIEL 3
  • Der Einsatz des Amplifikations- und des Nachweisverfahrens der vorliegenden Erfindung zwecks Nachweis der Kodon 245 (GGC → GAC) Punktmutation des menschlichen p53 Gens.
  • Zwei Oligonukleotidsondengruppen werden gestaltet, um ein 58 bp Fragment des menschlichen p53 Gens zu amplifizieren. Die erste Oligonukleotidsondengruppe ist konstruiert, um die Wildtyp-Sequenz des Gens zu amplifizieren; die Sequenz lautet wie folgt (SEQ. ID. NO. 6):
    5'-TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCA-3'
    3'-ATGTACACATTGTCAAGGACGTACCCGCCGTACTTGGCCTCCGGGTAGGAGTGGTAGT-5'
  • Die zweite Oligonukleotidsondengruppe ist gestaltet, um die Mutantensequenz des Gens zu amplifizieren; die Sequenz lautet wie folgt (SEQ. ID. NO. 7):
    5'-TACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCAGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCA-3'
    3'-ATGTACACATTGTCAAGGACGTACCCGCTGTACTTGGCCTCCGGGTAGGAGTGGTAGT-5'
  • Oligonukleotidsonden der ersten Gruppe umfassen:
    Figure 00770001
    Figure 00780001
  • Das Nachweisverfahren für die amplifizierte Wildtyp-Sequenz mittels der ersten Oligonukleotidsondengruppe ist das Proximitätsenergietrarisferlabeling. Als erste Nachweisoligonukleotidsonde dient Schutzsequenz B von Oligonukleotidsonde 1. Die erste Nachweisoligonukleotidsonde wird an ein Flouresceinproximitätslabel konjugiert. Eine zweite Nachweisoligonukleotidsonde B.1 (nachstehend dargestellt; SEQ. ID. NO. 12) wird an eine entsprechende zweite Rhodaminproximitätslabel-Moiety konjugiert. Die beiden gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden hybridisieren aneinander und bringen daher die Proximitätslabel-Moieties Flourescein und Rhodamin einander nahe genug, dass sie zwecks Erzeugung eines nachweisbaren Signals miteinander interagieren. Wenn die beiden gelabelten Nachweisoligonukleotidsonden hybridisiert sind, werden die Proximitätslabeling-Moieties Flourescein und Rhodamin einander nahe genug gebracht, dass eine Energietransferreaktion zwischen ihnen stattfindet, die in einer messbaren Energieabgabe resultiert, welche sich fluorometrisch messen lässt (Erregung 472 nm, Readout 577 nm)
    Figure 00780002
  • Oligonukleotidsonden der zweiten Gruppe umfassen:
    Figure 00790001
  • Das Nachweisverfahren für die amplifizierte Mutantensequenz mittels der zweiten Oligonukleotidsondengruppe beruht auf der Freisetzung einer Isoluminol-Label-Moiety, die an die einzelsträngige D-Sequenz konjugiert ist, die in Amplifikationsprodukte eingegliedert wird, und der Entfernung aller doppelsträngigen D-Sequenzen zusammen mit den Isoluminol-Label-Moieties, die an dieselben aus dem Testgefäß mittels einer an Oligonukleotidsonde 4 konjugierten Affinitätsseparation-Moiety Biotin konjugiert sind. Die einzelsträngige D-Sequenz wird nach der Amplifikation mittels der nukleierenden Aktivität von Exonuklease VII aus E. coli nukleiert, bei der es sich um eine spezifische einzelsträngige Nuklease handelt. Dies führt zu der Freisetzung der an die einzelsträngigen D-Sequenzen konjugierten Isoluminol-Label-Moiety in die umgebende Lösung. Die nicht in dieser Weise freigesetzten Isoluminol-Label-Moieties, also jene Label-Moieties, die an D-Sequenzen konjugiert sind, die nicht in Amplifikationsprodukte eingegliedert wurden, werden durch Affinitätsseparation entfernt. Somit können die freigesetzten Isoluminol-Label-Moieties luminometrisch nachgewiesen werden.
  • Die Oligonukleotidsondensynthese und -reinigung erfolgt im Wesentlichen in der Art, wie in Beispiel 1 dargelegt.
  • Der in diesem Beispiel beschriebene Versuch zielt auf die Bestimmung des Genotyps an Kodon 245 des p53 Gens eines untersuchten Individuums und gründet auf einem simultanen Amplifikationsverfahren in Kombination mit einem simultanen Nachweisverfahren für sowohl Wildtyp- als auch Mutantensequenzen; dabei wird bestimmt, welche davon in der genomischen DNA untersuchter Individuen vorhanden sind.
  • Für die kombinierten Amplifikations- und Nachweisreaktionen sind die Gefäße wie folgt aufgebaut:
    Transparente Gefäße, in deren Deckeln ein Magnet eingebettet ist, wie in 27 dargestellt, werden als Behälter für die Versuchs- und Kontrollamplifikationsreaktionen verwendet, deren Durchführung im Wesentlichen wie in Beispiel 1 erfolgt; eine Ausnahme bildet jedoch, dass in diesem Beispiel in jedem Gefäß zwei Oligonukleotidsondengruppen verwendet werden, wohingegen in Beispiel 1 lediglich eine Gruppe benützt wird.
  • Das Versuchsgefäß enthält genomische DNA, die aus einem Individuum stammt, dessen Genotyp bestimmt werden soll. Zur Kontrolle dieses kombinierten Amplifikations- und Nachweisverfahrens werden vier ähnliche zusätzliche Gefäße eingesetzt. Das erste enthält keine Ziel-DNA-Sequenz und dient daher als negative Kontrolle, bei der keiner der beiden Nachweisprozesse zur Erzeugung eines Signals führen sollte. Das zweite Gefäß enthält genomische DNA aus einem Individuum, bei dem zuvor festgestellt wurde, das es homozygot bezüglich des Wildtyp-Allels ist; demzufolge dient dieses Gefäß der positiven Kontrolle für den ersten Nachweisprozess und der negativen Kontrolle für den zweiten. Es sollte sich daher ein nachweisbares Signal für den ersten, aber nicht für den zweiten Nachweisprozess ergeben. Das dritte Gefäß enthält genomische DNA aus einem Individuum, von dem zuvor festgestellt wurde, dass es homozygot hinsichtlich des Mutanten-Allels ist; deshalb dient dieses Gefäß als positive Kontrolle für den zweiten Nachweisprozess und als negative Kontrolle für den ersten Nachweisprozess; daraus sollte ein nachweisbares Signal für den zweiten, jedoch nicht für den ersten Nachweisprozess hervorgehen. Das vierte Gefäß enthält genomische DNA aus einem Individuum, von dem zuvor festgestellt wurde, dass es heterozygot bezüglich des Wildtyp- und des Mutantenallels ist; infolgedessen dient dieses Gefäß als positive Kontrolle für den ersten und den zweiten Nachweisprozess, woraus ein nachweisbares Signal bei dem ersten und dem zweiten Prozess resultieren sollte.
  • Im Anschluss an die Amplifikation wird die oben beschriebene zweite Nachweisoligonukleotidsonde B.1 in die Reaktionsgefäße gegeben, und ihr wird gestattet, mit den einzelsträngigen B-Sequenzen zu hybridisieren, die in Amplifikationsprodukte eingegliedert sind, welche, wie erläutert, als die ersten Nachweisoligonukleotidsonden dienen, falls welche vorhanden sind.
  • Im Anschluss an den Nachweis des Proximitätslabelingsignals wird das Reaktionsgefäß auf eine Temperatur von 37°C gebracht und 0.4 Einheiten von Exonuklease VII in einem Puffer, der sich zusammensetzt aus 70 mM Tris.Cl mit pH 8.0, 8 mM EDTA, 14 mM β-Mercaptoethanol und 50 μg/ml BSA, wird in das Gefäß gegeben. Zur Spaltung der einzelsträngigen D-Schutzsequenzen wird die Reaktionsmischung 30 Minuten lang inkubiert. Nach der Behandlung mit Exonuklease VII werden mit Avidin überzogene magnetische Kügelchen in das Reaktionsgefäß gegeben, welches zehn Minuten lang auf einen Shaker kommt, um das Binden der biotinylierten doppelsträngigen DNA an die Avidinmoleküle zu ermöglichen. Das Reaktionsgefäß wird um 180° gedreht, damit die magnetischen Kügelchen an den Deckel anhaften können, woraufhin das Reaktionsgefäß erneut um 180° gedreht wird; der Nachweis des Isoluminols, das durch die Nukleaseaktivität aus dem einzelsträngigen D-Fragment in die Lösung abgegeben wird, erfolgt mit einem Luminometer (Perkin Elmer).
  • Falls der erste Nachweisprozess ein positives Signal ergibt, enthält die untersuchte Nukleinsäure die Wildtyp-Sequenz. Geht hingegen kein Signal aus dem ersten Nachweisprozess hervor, enthält die untersuchte Nukleinsäure die Wildtyp-Sequenz nicht. Falls der zweite Nachweisprozess ein positives Signal ergibt, enthält die untersuchte Nukleinsäure die Mutanten-Sequenz; geht hingegen kein Signal aus dem zweiten Nachweisprozess hervor, enthält die untersuchte Nukleinsäure die Mutantensequenz nicht.
  • Dies kann zu drei alternativen Ergebnissen führen: (1) Falls der erste Nachweisprozess ein positives Ergebnis ergibt und der zweite nicht, ist die untersuchte DNA-Probe homozygot im Bezug auf Kodon 245 (GGC) des menschlichen p53 Gens; (2) falls das zweite Nachweisverfahren ein positives Ergebnis ergibt und das erste nicht, ist die untersuchte DNA-Probe homzygot im Bezug auf Kodon 245 (GAC) Punktmutation des menschlichen p53 Gens; (3) falls allerdings sowohl das erste als auch das zweite Nachweisverfahren positive Signale hervorbringen, ist die untersuchte DNA-Probe an Kodon 245 des menschlichen p53 Gens heterozygot, was bedeutet, das ein Allel die Wildtyp-Sequenz besitzt, während das andere die Mutantensequenz aufweist.
  • BEISPIEL 4
  • Diagnostik-Kits zur Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren gemäß der vorliegenden und obig detailliert geschilderten Erfindung können die folgenden Komponenten umfassen:
    Ein Diagnostik-Kit zur Amplifikation spezifischer Nukleotidsequenzen in Proben besteht aus zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaaren und mindestens einem Puffer.
    Ein Diagnostik-Kit zum Nachweis des Vorhandenseins, spezifischer Nukleotidsequenzen in Proben umfasst: (a) zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaare; (b) zwei oder mehr an eine Proximitätslabeling-Moiety konjugierte Nachweisoligonukleotidsonden; und (c) mindestens einen Puffer;
    Ein zweiter Diagnostik-Kit zum Nachweis des Vorhandenseins spezifischer Nukleotidsequenzen weist auf wie folgt: (a) zwei oder mehr Oligonukleotidsondenkomplementärpaare, von denen eine oder mehr an eine Separations-Moiety konjugiert sind und eine oder mehr an eine Label-Moiety konjugiert sind; (b) eine einzelsträngige spezifische Nuklease; und (e) einen festen Träger für Affinitätsseparation von Amplifikationsprodukten.
  • Wenn die Kits beim Suchen nach der Anwesenheit einer oder aller der zahlreichen bekannten genetischen Krankheiten, z.B. der in der obigen Tabelle 1 aufgelisteten, eingesetzt werden sollen, können sie eine beliebige passende Anzahl an Oligonukleotidsonden in irgendeiner geeigneten Kombination für das Screening nach Mutationen in bestimmten Genen enthalten, die in Bezug zu Krankheiten stehen. In Fällen, in denen ein bestimmtes, mit Krankheiten assoziiertes Gen eine oder mehr Mutationen aufweist, z.B. das CFTR-Gen, sollte der Kit die spezifischen Oligonukleotidsonden für das Screening nach den gängigeren Mutationen enthalten, die sich je nach Bevölkerungsgruppe unterscheiden können. Soll der Kit zur Analyse für die Blut- und Gewebetypisierung benützt werden, kann er eine beliebige Kombination aus Oligonukleotidsonden enthalten, von denen jede zur Identifizierung eines bestimmten Blut- oder Gewebetyps konstruiert ist. In Abhängigkeit von den Umständen können alle der Kits außerdem zusätzliche Oligonukleotidsonden zur Bestimmung der An- oder Abwesenheit einer Nukleinsäuresequenz umfassen, die speziell dem Vorhandensein eines Pathogens, z.B. dem Vorhandensein des AIDS-Virus oder eines spezifischen Typs eines derartigen Virus entspricht, z.B. HIV-I, HIV-II oder HIV-III. Dementsprechend lässt sich ein Kit für die Überprüfung einer beliebigen Anzahl von Genen oder Genstellen innerhalb eines einzelnen Gens verwenden, und dies erfordert lediglich, dass der Kit eine Anzahl spezifischer Oligonukleotidsonden enthält, wobei alle anderen Komponenten des Kits stets die selben sind.
  • Obgleich die Erfindung mit Bezug auf eine begrenzte Anzahl von Ausführungsformen beschrieben wurde, können selbstverständlich mannigfaltige Variationen, Modifikationen und andere Anwendungen der Erfindung ausgeführt werden. SEOUENZPROTOKOLL
    Figure 00840001
    Figure 00850001
    Figure 00860001
    Figure 00870001
    Figure 00880001

Claims (24)

  1. Verfahren zum Nachweis einer Zielpolynukleotidsequenz eines Zielpolynukleotids, wobei dieses Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen: (i) einer ersten Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren kann, und eine chemische funktionelle Gruppe; und (ii) einer zweiten Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen zweiten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz, welcher zu dem ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz benachbart ist, hybridisieren kann, eine chemische funktionelle Gruppe, welche eine chemische Bindung mit der chemischen funktionellen Gruppe der ersten Oligonukleotidsonde bilden kann, und eine Schutzsequenz, die nicht fähig ist, an die Zielpolynukleotidsequenz oder die erste Oligonukleotidsonde zu hybridisieren; wobei die chemischen funktionellen Gruppen so positioniert sind, dass jene Hybridisierung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde an die Zielpolynukleotidsequenz die chemischen funktionellen Gruppen einander nahe genug bringt, um die gegenseitige chemische Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde zu ermöglichen, und wobei die Schutzsequenz des zweiten Oligonukleotids einer gegenseitigen chemischen Verbindung der ersten und zweiten Oligonukleotidsonde vorbeugt, wenn diese nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert sind; (b) in Kontakt Bringen des Zielpolynukleotids mit der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde unter Bedingungen, welche geeignet sind, um eine Hybridisierung der Targeting-Sequenz der ersten Oligonukleotidsonde an den ersten Bereich des Zielpolynukleotids und der Targeting-Sequenz der zweiten Oligonukleotidsonde an den zweiten Bereich des Zielpolynukleotids zu ermöglichen, und dadurch Bilden eines hybridisierten Komplexes; (c) Inkubieren des hybridisierten Komplexes unter Bedingungen, welche geeignet sind für die gegenseitige chemische Verbindung zwischen der chemischen funktionellen Gruppe der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde; und (d) Nachweisen eines Produkts, welches aus der gegenseitigen chemischen Verbindung aus Stufe (c) hervorgeht, und dadurch Nachweisen der Zielpolynukleotidsequenz.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielpolynukleotid ein Strang eines doppelsträngigen Polynukleotids ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zielpolynukleotidsequenz eine Mutantensequenz aufweist und wobei die Targeting-Sequenz der ersten Oligonukleotidsonde und/oder der zweiten Oligonukleotidsonde komplementär zu der Mutantensequenz ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chemische funktionelle Gruppe der ersten oder der zweiten Oligonukleotidsonde ein Nukleophil oder ein Elektrophil ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielpolynukleotid RNA, DNA, cDNA oder genomische DNA ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gegenseitige chemische Verbindung durch eine Substitution einer elektrophilen Spaltgruppe durch ein Nukleophil, eine Michael-Additionsreaktion, eine Diels-Adler-Reaktion, eine Addition einer Thiolgruppe zu der Doppelbindung einer Maleimido-Moiety, eine photochemische Reaktion oder eine Photocyclodimerisierungsreaktion erfolgt.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis eines Produkts der chemischen Ligation erfolgt durch radioaktiven Nachweis, kolorimetrischen Nachweis, fluorometrischen Nachweis, luminometrischen Nachweis, Elektronenmikroskopie, magnetischen Nachweis, Capture Assay, Größentrennung, DNA-Konformation oder Proximitätsenergietransfer.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schutzsequenz der zweiten Oligonukleotidsonde eine Label Moiety aufweist, welche im Anschluss an eine gegenseitige chemische Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde freigesetzt werden kann.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chemische funktionelle Gruppe der zweiten Oligonukleotidsonde zwischen der Targeting-Sequenz und der Schutzsequenz positioniert ist.
  10. Verfahren zur Amplifizierung einer Zielpolynukleotidsequenz eines Zielpolynukleotids oder einer dazu komplementären Sequenz, wobei dieses Verfahren Folgendes umfasst: (a) Bereitstellen: (i) einer ersten Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren kann, und eine chemische funktionelle Gruppe; und (ii) eine zweite Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen zweiten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren kann, welcher zu dem ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz benachbart ist, eine chemische funktionelle Gruppe, welche eine chemische Bindung mit der chemischen funktionellen Gruppe der ersten Oligonukleotidsonde bilden kann, und eine Schutzsequenz, die nicht fähig ist, an die Zielpolynukleotidsequenz oder die erste Oligonukleotidsonde zu hybridisieren; wobei die chemischen funktionellen Gruppen so positioniert sind, dass die Hybridisierung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde an die Zielpolynukleotidsequenz die chemischen funktionellen Gruppen einander nahe genug bringt, um eine gegenseitige chemische Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde zu ermöglichen, und wobei die Schutzsequenz des zweiten Oligonukleotids einer gegenseitigen chemischen Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde vorbeugt, wenn diese nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert sind; (b) in Kontakt bringen der Zielpolynukleotidsequenz mit der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde unter Bedingungen, die geeignet sind, um eine Hybridisierung der Targeting-Sequenz der ersten Oligonukleotidsonde an den ersten Bereich des Zielpolynukleotids und der Targeting-Sequenz der zweiten Oligonukleotidsonde an den zweiten Bereich des Zielpolynukleotids zu ermöglichen, und dadurch Bilden eines hybridisierten Komplexes; (c) Inkubieren des hybridisierten Komplexes unter Bedingungen, die geeignet sind für die gegenseitige chemische Verbindung zwischen der chemischen funktionellen Gruppe der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde; (d) Schaffen von Bedingungen zur Denaturierung des hybridisierten Komplexes; und (e) Wiederholen der Stufen (a)–(d) eine vorgegebene Anzahl von Malen bis ein gewünschtes Amplifizierungsniveau eingetreten ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Zielpolynukleotid ein Strang eines doppelsträngigen Polynukleotids ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Zielpolynukleotidsequenz eine Mutantensequenz aufweist und wobei die Targeting-Sequenz der ersten Oligonukleotidsonde und/oder zweiten Oligonukleotidsonde komplementär zu der Mutantensequenz ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die chemische funktionelle Gruppe der ersten oder zweiten Oligonukleotidsonde ein Nukleophil oder ein Elektrophil ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Zielpolynukleotid RNA, DNA, cDNA oder genomische DNA ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die gegenseitige chemische Verbindung durch eine Substitution einer elektrophilen Spaltgruppe durch ein Nukleophil, eine Michael-Additionsreaktion, eine Diels-Adler-Reaktion, eine Addition einer Thiolgruppe zu der Doppelbindung einer Maleimido-Moiety, eine photochemische Reaktion oder eine Photocyclodimerisierungsreaktion erfolgt.
  16. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die chemische funktionelle Gruppe der zweiten Oligonukleotidsonde positioniert ist zwischen der Targeting-Sequenz und der Schutzsequenz.
  17. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei der Amplifizierung um eine exponentielle Amplifizierung handelt, und wobei das Verfahren weiterhin die folgenden Stufen umfasst: (a) Bereitstellen: (iii) einer dritten Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen ersten Bereich einer zielkomplementären Polynukleotidsequenz hybridisieren kann, und eine chemische funktionelle Gruppe; und (iv) eine vierte Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting- Sequenz, die an einen zweiten Bereich der zielkomplementären Polynukleotidsequenz hybridisieren kann, welcher zu dem ersten Bereich der zielkomplementären Polynukleotidsequenz benachbart ist, eine chemische funktionelle Gruppe, die eine chemische Bindung mit der chemischen funktionellen Gruppe der dritten Oligonukleotidsonde bilden kann, und eine Schutzsequenz, die nicht fähig ist, an die zielkomplementäre Polynukleotidsequenz oder die dritte Oligonukleotidsonde zu hybridisieren; wobei die chemischen funktionellen Gruppen so positioniert sind, dass eine Hybridisierung der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde an der zielkomplementären Polynukleotidsequenz die chemischen funktionellen Gruppen einander nahe genug bringt, um die gegenseitige chemische Verbindung der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde zu ermöglichen, und wobei die Schutzsequenz des vierten Oligonukleotids einer gegenseitigen chemischen Verbindung der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde vorbeugt, wenn diese nicht mit der zielkomplementären Polynukleotidsequenz hybridisiert sind; in Stufe (b) in Kontakt bringen des zielkomplementären Polynukleotids mit der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde unter Bedingungen, die geeignet sind, um die Hybridisierung der Targeting-Sequenz der dritten Oligonukleatidsonde an den ersten Bereich des zielkomplementären Polynukleotids und der Targeting-Sequenz der vierten Oligonukleotidsonde an den zweiten Bereich des zielkomplementären Polynukleotids zu ermöglichen, und dadurch Bilden eines hybridisierten Komplexes; und in Stufe (c) Inkubieren des hybridisierten Komplexes unter Bedingungen, welche geeignet sind für die gegenseitige chemische Verbindung zwischen der chemischen funktionellen Gruppe der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die chemischen funktionellen Gruppen der dritten und der vierten Oligonukleotidsonde in einer Entfernung von wenigstens ein paar Nukleotiden von den chemischen funktionellen Gruppen der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde positioniert sind, wenn die Sonden an ihren jeweiligen zielkomplementären Polynukleotid- oder Zielpolynukleotidsequenzen hybridisiert werden.
  19. Kit zum Nachweis einer Zielpolynukleotidsequenz eines Zielpolynukleotids, welcher Folgendes enthält: (a) eine erste Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren kann, und eine chemische funktionelle Gruppe; und (b) eine zweite Oligonukleotidsonde umfassend eine Targeting-Sequenz, die an einen zweiten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz hybridisieren kann, welcher zu dem ersten Bereich der Zielpolynukleotidsequenz benachbart ist, eine chemische funktionelle Gruppe, die eine chemische Bindung mit der chemischen funktionellen Gruppe der ersten Oligonukleotidsonde bilden kann, und eine Schutzsequenz, die nicht fähig ist, an die Zielpolynukleotidsequenz oder die erste Oligonukleotidsonde zu hybridisieren; wobei die chemischen funktionellen Gruppen so positioniert sind, dass die Hybridisierung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde an die Zielpolynukleotidsequenz die chemischen funktionellen Gruppen einander nahe genug bringt, um eine gegenseitige chemische Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde zu ermöglichen, und wobei die Schutzsequenz des zweiten Oligonukleotids einer gegenseitigen chemischen Verbindung der ersten und der zweiten Oligonukleotidsonde vorbeugt, wenn diese nicht mit der Zielpolynukleotidsequenz hybridisiert sind, wobei das erste und/oder das zweite Oligonukleotid eine nachweisbare Moiety hat/haben.
  20. Kit nach Anspruch 19, wobei die chemische funktionelle Gruppe der ersten oder der zweiten Oligonukleotidsonde ein Nukleophil oder ein Elektrophil ist.
  21. Kit nach Anspruch 19, wobei die nachweisbare Moiety der ersten und/oder der zweiten Oligonukleotidsonde eine radioaktive Moiety, ein Chromophor, ein Fluorophor, ein Luminophor, eine magnetische Moiety, eine Capture Moiety oder eine Proximitätsenergietransfer Moiety ist.
  22. Kit nach Anspruch 19, wobei die Schutzsequenz der zweiten Oligonukleotidsonde eine Label Moiety aufweist, welche im Anschluss an eine gegenseitige chemische Verbindung des ersten und des zweiten Oligonukleotids freigesetzt werden kann.
  23. Kit nach Anspruch 19, wobei die chemisch funktionelle Gruppe der zweiten Oligonukleotidsonde zwischen der Targeting-Sequenz und der Schutzsequenz positioniert ist.
  24. Kit nach Anspruch 19, wobei die Targeting-Sequenz der ersten Oligonukleotidsonde und die Targeting-Sequenz der zweiten Oligonukleotidsonde jeweils mindestens sechs zu der Zielpolynukleotidsequenz komplementäre Nukleotide aufweisen.
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