DE60038244T2

DE60038244T2 - DNA-Sequenzierungsverfahren

Info

Publication number: DE60038244T2
Application number: DE60038244T
Authority: DE
Inventors: Daniel Henry Totnes DENSHAM
Original assignee: Medical Biosystems Ltd
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1999-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2020-10-07
Also published as: KR20020059444A; EA200200428A1; NZ517775A; KR100809171B1; JP2012196201A; JP2003511043A; US20120214164A1; WO2001025480A3; CN1159457C; MXPA02003534A; ATE388242T1; AU7546700A; EP1226271B1; IS6333A; CA2386115A1; US7939264B1; WO2001025480A2; HK1045857A1; IL148678A; GB9923644D0

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Bestimmungen von Polynukleotidsequenzen.
Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit, Sequenz eines Polynukleotids zu bestimmen, ist von großer wissenschaftlicher Bedeutung. Das Humangenomprojekt, zum Beispiel, ist eine ehrgeizige internationale Bemühung zur Kartierung und Sequenzierung der drei Milliarden DNA-Basen, die im menschlichen Genom enthalten sind. Nach seinem Abschluss wird die resultierende Sequenzdatenbank ein Werkzeug von beispielloser Leistungskraft für die biomedizinische Forschung sein. Das Haupthindernis für den erfolgreichen Abschluss dieses Projekts betrifft die Technologie, die beim Sequenzierungsprozess verwendet wird.
Das allgemein angewendete Hauptverfahren zur großtechnischen DNA-Sequenzierung ist das Kettenabbruchverfahren. Dieses Verfahren wurde zuerst von Sanger und Coulson (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977; 74: 5 463–5 467) entwickelt und beruht auf der Verwendung von Didesoxyderivaten der vier Nukleosidtriphosphate, die in einer Polymerasereaktion in eine entstehende Polynukleotidkette eingebaut werden. Beim Einbau beenden die Didesoxyderivate die Polymerasereaktion, und die Produkte werden anschließend durch Gelelektrophorese aufgetrennt und analysiert, um die Position anzuzeigen, an der das jeweilige Didesoxyderivat in die Kette eingebaut wurde.
Obwohl dieses Verfahren verbreitet eingesetzt wird und zuverlässige Ergebnisse produziert, ist bekannt, dass es langsam, arbeitsaufwändig und teuer ist.
Ein alternatives Sequenzierverfahren, das spektroskopische Mittel verwendet, um den Einbau eines Nukleotids in einen entstehenden Polynukleotidstrang nachzuweisen, der komplementär zu einem Ziel ist, wird in EP-A-0471732 vorgeschlagen. Das Verfahren beruht auf einem immobilisierten Komplex aus Templat und Primer, das einem Durchfluss ausgesetzt wird, der nur eines der verschiedenen Nukleotide enthält. Spektroskopische Techniken werden dann verwendet, um ein zeitabhängiges Signal zu messen, das durch das Polymerase-katalysierte Wachstum der Templat-Kopie entsteht. Die beschriebenen spektroskopischen Techniken sind Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Spektroskopie, die Änderungen in einem Analyten innerhalb eines evaneszenten Wellenfelds misst, und Fluoreszenzmesstechniken. Es sind jedoch Beschränkungen dieses Verfahren bekannt; die schwerste für die SPR-Technik besteht darin, dass, während die Größe des Kopie-Stranges zunimmt, aufgrund der Bewegung des Stranges aus dem evaneszenten Wellenfeld heraus auch die absolute Größe des Signals zunimmt, wodurch es schwieriger wird, Zunahmen zu detektieren. Die Fluoreszenzmesstechniken haben den Nachteil, dass sie Hintergrundinterferenz von den in die wachsende Polynukleotidkette eingebauten Fluorophoren erhöhen. Mit dem Wachsen der Ketten nimmt das Hintergrund-"Rauschen" zu, und die Zeit, die zur Detektion eines jeden Nukleotideinbaus erforderlich ist, muss heraufgesetzt werden. Das schränkt die Verwendung des Verfahrens zum Sequenzieren langer Polynukleotide stark ein.
Ansätze zur Einzelfragment-Polynukleotidsequenzierung sind kurz dargestellt in WO-A-9924797 und WO-A-9833939 , die beide Fluoreszenzdetektion von einzelnen, markierten Nukleotidmolekülen anwenden. Diese einzelnen Nukleotide werden durch die Aktivität eines Exonukleasemoleküls von dem Templat-Polynukleotid abgespalten, das durch eine optische Falle in einem Durchfluss gehalten wird (Jett et al., J. Biomol. Struc. Dyn., 1989; 7: 301–309). Diese abgespaltenen Nukleotide fließen dann innerhalb einer Quartzdurchflusszelle stromabwärts, werden einer Laseranregung unterworfen und anschließend durch ein empfindliches Detektionssystem detektiert. Es sind jedoch Beschränkungen dieses Verfahrens bekannt; die stärkste für die Exonukleasetechnik besteht in der Tatsache, dass die markierten Nukleotide in hohem Maße die Prozessivität des Exonuklease-Enzyms beeinflussen. Andere Beschränkungen dieses Verfahrens umfassen das "Haften" des Nukleotids (der Nukleotide) an dem Biotin-Bead, das verwendet wird, um das Polynukleotidfragment zu immobilisieren, was somit dazu führt, dass der Nukleotiddurchfluss aus der Phase gerät; Ineffizienz und Längenbeschränkung des eingangs enzymatischen Markierungsprozesses; und die Kreuzanregung zwischen den vier verschiedenen Farbstoffmolekülen, was zu einer stark erhöhten Fehlerrate führt.
Es besteht demnach ein Bedarf für ein verbessertes Verfahren, bevorzugt auf der Einzelfragmentebene, zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, das die Geschwindigkeit und die Fragmentgröße des zu sequenzierenden Polynukleotids heraufsetzt, und das bevorzugt durch einen automatisierten Prozess durchgeführt wird, was den Aufwand und die Kosten, die mit herkömmlichen Verfahren verbunden sind, vermindert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Sequenz eines Zielpolynukleotids durch Messen von Konformationsänderungen in einem Enzym gemessen werden kann, das an das Zielnukleotid bindet und sich daran entlang bewegt. Das Ausmaß der auftretenden Konformationsänderung ist verschieden, abhängig davon, welches einzelne Nukleotid auf dem Ziel im Kontakt mit dem Enzym ist.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, wie in Anspruch 1 definiert, bereitgestellt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Enzym ein Polymerase-Enzym, das mit dem Ziel beim Prozess der Verlängerung eines komplementären Strangs interagiert. Das Enzym ist typischerweise auf einem festen Träger immobilisiert, um die Reaktion innerhalb einer begrenzten Region zu lokalisieren.
Gemäß der Erfindung umfasst das Enzym eine erste gebundene nachweisbare Markierung, deren Eigenschaften sich ändern, wenn das Enzym eine Konformationsänderung erfährt. Das Enzym kann auch eine zweite gebundene detektierbare Markierung umfassen, die in der Lage ist, mit der ersten Markierung zu interagieren, wobei das Ausmaß der Wechselwirkung von einer Konformationsänderung im Enzym abhängt. Typischerweise ist die erste Markierung ein Energieakzeptor und die zweite Markierung ein Energiedonor, und die Detektion der Konformationsänderung wird durchgeführt durch Messen des Energieübertrags zwischen den zwei Markierungen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) verwendet, um eine Konformationsänderung in einem Enzym zu detektieren, das mit einem Zielpolynukleotid interagiert und sich daran entlang bewegt, und dadurch die Sequenz des Polynukleotids zu bestimmen. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) kann durchgeführt werden zwischen FRET-Donor- und Akzeptormarkierungen, die jeweils an das Enzym gebunden sind. Alternativ kann eine der Markierungen an das Enzym und die andere Markierung an das Polynukleotid gebunden sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein detektierbar markiertes Enzym verwendet, das in der Lage ist, mit dem Zielpolynukleotid zu interagieren und sich daran entlang zu bewegen, um die Sequenz des Polynukleotids zu bestimmen, wobei die Markierung ihre detektierbaren Eigenschaften ändert, während das Enzym sich am Polynukleotid entlang bewegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein fester Träger nach Anspruch 12 bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt wird ein System zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids nach Anspruch 14 bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlicher Sequenzierungstechnologie. Sobald ein Polymerase-Enzym seinen Zyklus der Polynukleotidverlängerung beginnt, neigt es dazu, mehrere tausend Nukleotide zu polymerisieren, bevor es vom Strang abfällt. Zusätzlich sind bestimmte spezifische Polymerasesysteme in der Lage, sich an dem Templat-Polynukleotid zu verankern oder sich daran anzubinden, über eine "Ringklemme" (z. B. Polymerase III), die das Templat-Molekül umspannt, oder über einen molekularen Haken (z. B. T7-Thioredoxin-Komplex), der das Templat teilweise umspannt.
Die Erfindung kann es auch ermöglichen, dutzende Kilobasen (kb) oder mehr auf einmal sequenzieren zu können, bei einer Geschwindigkeit von Hunderten von Basenpaaren pro Sekunde. Das ist die Folge des Sequenzierens an einem einzigen DNA-Fragment. Ein Vorteil des Sequenzierens an einem einzigen DNA-Fragment liegt darin, dass die Sequenzierungsgeschwindigkeiten durch das genutzte Enzymsystem und nicht durch indirekte, addierte Reaktionen bestimmt werden und dadurch entsprechend höher sind. Genauso wichtig wie die hohe Geschwindigkeit ist die Möglichkeit, lange DNA-Fragmente zu sequenzieren. Das wird das Ausmaß an Subklonierungen und die Anzahl überlappender Sequenzen, die erforderlich sind, um Megabasen-Abschnitte von Sequenzinformationen zu assemblieren, reduzieren. Ein zusätzlicher Vorteil des Einzelfragmentansatzes liegt in der Beseitigung von Problemen, die mit der Entsorgung von Gefahrstoffabfällen, wie z. B. Acrylamid, verbunden sind, die derzeitige Sequenzierungsbemühungen belasten.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung eines Konfokalmikroskopaufbaus zur Verwendung bei der Erfindung;
2 stellt eine Spur dar, die nach Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer aufgenommen wurde, wobei jede der Spitzen die Detektion eines spezifischen Nukleotids repräsentiert.
Beschreibung der Erfindung
Das vorliegende Verfahren zum Sequenzieren eines Polynukleotids umfasst die Analyse von Konformationsänderungen zwischen einem Enzym und einem Zielpolynukleotid.
Der Begriff "Polynukleotid", wie hier verwendet, soll breit interpretiert werden und umfasst DNA und RNA, einschließlich modifizierter DNA und RNA sowie anderer hybridisierender nukleinsäureartiger Moleküle, z. B. Peptidnukleinsäure (PNA).
Das Enzym kann ein Polymerase-Enzym sein, und eine Konformationsänderung kommt zustande, wenn die Polymerase Nukleotide in einen entstehenden Strang einbaut, der komplementär zum Zielnukleotid ist. Es wurde herausgefunden, dass die Konformationsänderung für jedes der verschiedenen Nukleotide, A, T, G, oder C verschieden ist und dass demnach das Messen der Änderung aufzeigen wird, welches Nukleotid eingebaut wird.
Alternativ kann das Enzym ein beliebiges Enzym sein, das an einer Wechselwirkung mit einem Polynukleotid beteiligt ist, z. B. ein Helikase-Enzym, Primase- und Holoenzym. Wenn das Enzym sich an dem Polynukleotid entlang bewegt, wird sich seine Konformation ändern, abhängig davon, mit welchem Nukleotid auf dem Ziel es in Kontakt gebracht wird.
Eine Möglichkeit, eine Konformationsänderung in dem Enzym zu detektieren, besteht darin, Resonanzenergietransfer zwischen einer geeigneten Donormarkierung und einer geeigneten Akzeptormarkierung zu messen. In einem Beispiel sind der Donor und der Akzeptor jeweils an das Enzym gebunden, und die Konformationsänderung im Enzym, die durch seine Wechselwirkung mit dem Ziel herbeigeführt wird, verändert die relative Positionierung der Markierungen. Die Unterschiede in der Positionierung spiegeln sich in dem resultierenden Energietransfer wider und sind charakteristisch für das jeweilige Nukleotid in Kontakt mit dem Enzym. Alternativ kann eine Markierung an dem Enzym positioniert sein und die andere an einem Nukleotid des Ziels oder an einem Nukleotid, das in einen zum Ziel komplementären Strang eingebaut wird.
Die Verwendung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Diese Technik ist in der Lage, Abstände im Bereich von 2–8 nm zu messen und beruht auf der distanzabhängigen Energieübertragung zwischen einem Donorfluorophor und einem Akzeptorfluorophor. Die Technik weist nicht nur überlegene Fähigkeiten zur statischen Kolokalisation auf, sondern kann auch Informationen über dynamische Änderungen in den Distanzen oder der Orientierung zwischen den beiden Fluorophoren für intramolekularen und intermolekularen FRET bereitstellen. Seit der ersten Messung eines Energieübertrags zwischen einem einzelnen Donor und einem einzelnen Akzeptor (Einzelpaar-FRET) (Ha, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 96: 893), ist sie verwendet worden zur Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Kolokalisation (Schutz et al., Biophys. J., 1998; 74: 2223), zur Untersuchung von Proteinstruktur-Fluktuationen im Gleichgewicht und Enzymsubstrat-Wechselwirkungen während der Katalyse (Ha et al., 1999, wie oben), und zur Identifizierung von Konformationszuständen und Subpopulationen einzelner diffundierender Moleküle in Lösungen. Es ist vorgesehen, dass sämtliche dieser Varianten im Zusammenhang der Erfindung anwendbar sind.
Die vorliegende Erfindung kann auch unter Verwendung von Messtechniken durchgeführt werden, die nur eine einzige Markierung erfordern. Jedes System, dass in der Lage ist, Änderungen in der lokalen Umgebung des Enzyms auf Einzelmolekülebene zu messen, ist eine anerkannte Ausführungsform der Erfindung. Verschiedene Eigenschaften einzelner Fluoreszenzsonden, die an ein Polynukleotid-prozessierendes Enzym und/oder sein(e) Substrat(e) angebunden sind, können im Zusammenhang der Erfindung ausgenutzt werden, um Daten zu Variablen innerhalb des oder in unmittelbarer Nähre des Enzymsystems/der molekularen Umgebung, zu liefern, die spezifisch für ein Nukleotideinbau-Ereignis sind. Solche Variablen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, molekulare Wechselwirkungen, enzymatische Aktivität, Reaktionskinetik, Konformationsdynamik, molekulare Bewegungsfreiheit und Änderungen in Aktivität sowie chemischer und elektrostatischer Umgebung.
Zum Beispiel können die Absorptions- und Emissionsübergangsdipole einzelner Fluorophore unter Verwendung von polarisiertem Anregungslicht bestimmt werden, oder durch Analyse der Emissionspolarisation, oder beides. Die zeitliche Änderung in der Dipolorientierung einer starr angebundenen oder rotationsdiffundierend angebundenen Markierung kann die Winkelbewegung eines Makromolekülssystems oder einer seiner Untereinheiten anzeigen (Warshaw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 8034) und kann demnach in der vorliegenden Erfindung angewendet werden.
Die Markierungen, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, sind für Fachleute offensichtlich. Bevorzugt ist die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung, wie jene, die in Xue, et al., Nature, 1995; 373: 681 offenbart werden. Alternativ können fluoreszierende Enzyme, wie das Grün fluoreszierende Protein (Lu, et al., Science, 1998; 282: 1877) eingesetzt werden.
Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst jedoch die Verwendung kleiner Fluoreszenzmoleküle, die kovalent und ortsspezifisch an das Polynukleotid-prozessierende Enzym, angebunden sind, z. B. Tetramethylrhodamin (TMR).
Wenn Fluoreszenzmarkierungen bei der Erfindung verwendet werden, kann ihre Detektion durch Photobleaching beinträchtig werden, das durch wiederholtes Aussetzten gegenüber Anregungswellenlängen verursacht wird. Eine Möglichkeit, dieses Problem zu vermeiden, besteht darin, viele aufeinander folgende Reaktionen durchzuführen, aber Fluoreszenzsignale nur auf wenigen auf einmal zu detektieren. Unter Verwendung dieses iterativen Prozesses, kann die korrekte Abfolge von Signalen bestimmt werden und die Polynukleotidsequenz bestimmt werden. Zum Beispiel sollten die Sequenzierungsreaktionen durch Immobilisierung einer Vielzahl von Enzymen auf einem festen Träger und Inkontaktbringen dieser mit dem Zielpolynukleotid zu ungefähr demselben Zeitpunkt beginnen. Anregung und Detektion von Fluoreszenz kann auf einen Anteil der gesamten Reaktionen lokalisiert werden, für eine Zeitdauer bis zum Auftreten von Photobleaching. Zu diesem Zeitpunkt können Anregung und Detektion auf einen anderen Anteil der Reaktionen übertragen werden, um die Sequenzierung fortzusetzen. Wenn sämtliche Reaktionen relativ zueinander in Phase sind, sollte die korrekte Sequenz mit minimaler Sequenzreassemblierung erhalten werden.
Die Markierungen können durch kovalente oder andere Verknüpfungen an die Enzyme gebunden sein. Eine Anzahl von Strategien kann verwendet werden, um die Markierungen an die Enzyme anzubinden. Strategien umfassen die Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese und Mutagenese mit nichtnatürlichen Aminosäuren (Anthony-Cahil, et al., Trends Biochem. Sci., 1998; 14: 400) um Cystein- und Keton-Anker für Proteine zur spezifischen und orthogonalen Farbstoffmarkierung einzubauen (Cornish et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91: 2910).
Eine weitere vorgesehene Ausführungsform, verwendet zum Markieren des Polynukleotid-prozessierenden Enzyms, ist die Fusion von Grün fluoreszierendem Protein (GFP) mit dem prozessierenden Enzym (z. B. Polymerase) über molekulare Klonierungstechniken, die im Fachgebiet bekannt sind (Pierce, D. W. et al., Nature, 1997; 388: 338). Es wurde gezeigt, dass diese Technik bei der Messung von Konformationsänderungen (Miyawaki et al., Nature, 1997; 388: 882) und lokalen pH-Wertänderungen (Llopis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 6803) anwendbar ist.
Zur Verwendung bei der Immobilisierung des Enzyms geeignete Träger sind für den Fachmann offensichtlich. Es können Silikon-, Glas- und Keramikmaterialien verwendet werden. Der Träger wird gewöhnlich eine ebene Oberfläche sein. Die Enzymimmobilisierung kann durch kovalente oder andere Mittel durchgeführt werden. Zum Beispiel können kovalente Linker-Moleküle zur Anbindung an ein geeignet vorbereitetes Enzym verwendet werden. Verbindungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Es können ein oder mehrere Enzyme auf dem festen Träger immobilisiert sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Vielzahl von Enzymen angebunden. Das erlaubt die Überwachung von vielen getrennten Reaktionen und kann geeignet sein, um Photobleaching-Probleme zu überwinden, wie oben kurz dargestellt.
Es kann eine Auswahl von Techniken verwendet werden, um eine Konformationsänderung im Enzym zu messen. Resonanzenergietransfer kann durch die Techniken der Oberflächenplasmonresonanz (SPR) oder Fluoreszenz-Oberflächenplasmonresonanz gemessen werden.
Jedoch können andere Techniken, die Änderungen in der Strahlung über Wechselwirkung mit einer „Markierung" oder einem Energieüberträger messen, in Betracht gezogen werden, zum Beispiel Spektroskopie durch Totalreflexions-Fluoreszenz (TIRF), abgeschwächte Totalreflexion (ATR), frustrierte Totalreflexion, gestreute interne Totalreflexion (STIR), zeitaufgelöste Fluoreszenz-Mikroskopie und -Spektroskopie (FLIMS), Fluoreszenz-Polarisationsanisotropie (FPA), Fluoreszenzspektroskopie oder Evaneszenzwellen-Ellipsometrie.
Die Erfindung wird nun anhand des folgenden Beispiels mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert.
Bespiel
In diesem Beispiel wurde ein konfokaler Fluoreszenzaufbau verwendet, wie in 1 gezeigt.
Mit Bezug auf 1 besteht der Aufbau aus einem Scan-Tisch (1), der mit hoher Auflösung in X, Y- und Z-Richtung scannen kann, einem Glasobjektträger (2), der Teil eines Mikrofluid-Durchflusszellensystems ist, mit einem Einlass (8) zum Einbringen des Primer-Templat-Polynukleotidkompiexes (4) und Nukleotiden über das immobilisierte (9) Polymerasemolekül (3) innerhalb eines Puffers, und Auslass (7) für Abfall. Auflicht von einer Laserlichtquelle (6) zur Donoranregung wird über ein Ölimmersionsobjektiv (5) geliefert.
Proteinkonjugation
Bei diesem Experiment wurden Tetramethylrhodamin (TMR, Donor) und Cy5 (Akzeptor) als FRET-Paar verwendet. Das geschah aufgrund ihrer gut getrennten Emissionswellenlängen (> 100 nm) und ihrem großen Förster-Radius.
Es wurde T7-DNA-Polymerase von New England Biolabs (geliefert in einer Konzentration von 10 000 U/ml) verwendet. 50 μl T7-Polymerase wurde dem Pufferaustausch gegen 4 × 500 μl 200 mM Natriumacetatpuffer bei pH 4 in einer Vivaspin 500 (Vivaspin) unterworfen, um das DDT aus dem Aufbewahrungspuffer zu entfernen, in dem die T7-Polymerase geliefert wird. Dann wurden 50 μl der T7-Polymerase nach Pufferaustausch zu 100 μl Natriumazetatpuffer bei pH 4 und 50 μl gesättigtes 2-2-Dipyridyl-disulfid in wässriger Lösung gegeben. Diese Reaktion wurde dann für 110 Minuten stehen gelassen, und die Absorption bei 343 nm notiert. Schließlich wurde die Probe dann wie zuvor einem Pufferaustausch zu 200 mM Tris bei pH 8 unterworfen (4 Mal 500 μl).
Farbstoffanbindung wurde durch denaturierende Poylacrylamidgelelektrophorese überprüft. Cy5-Succinimidylester (Molecular Probes) wurde unter denselben Markierungsbedingungen an die TMR-T7-DNA-Polymerase konjugiert und gereinigt und charakterisiert wie oben beschrieben.
Polymerase-Immobilisierung
Glasobjektträger wurden mit N-((3-Trimethoxysilyl)-propyl)-ethylendiamintriessigsäure derivatisiert. Der Objektträger wurde dann in eine Durchflusszellenanordnung geklebt, die es erlaubte, Puffer kontinuierlich über die derivatisierte Glasoberfläche fließen zu lassen. Die markierte Polymerase wurde dann zu dem Puffer gegeben und über den Objektträger fließen gelassen, sodass Protein auf der Glasoberfläche immobilisiert wurde.
Proteine wurden dann mit geringer Dichte auf der Glas-Wasser-Grenzfläche immobilisiert, sodass sich zu jedem gegebenen Zeitpunkt nur ein Molekül im Laser-Anregungsvolumen befand. Laserlicht (514 nm Argonionen-Laser, 15 μW, zirkular polarisiert) wurde auf einen 0,4 μm-Bereich fokussiert, unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs in einem Epi-Beleuchtungs-Aufbau eines Konfokalmikroskops mit Scan-Tisch. Die Fluoreszenzemission wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen dichroitischen Strahlenteiler zweigeteilt (Langpass bei 630 nm) und durch zwei Lawinenphotodioden (APD)-Zähleinheiten gleichzeitig detektiert.
Ein 585 nm Bandpassfilter wurde vor den Donordetektor gesetzt; ein 650 Langpassfilter wurde vor den Akzeptordetektor gesetzt. Da die Spektralbereiche während der Fluoreszenzdetektion ausreichend entfernt von der Grenzwellenlänge des dichroitischen Strahlteilers liegen, ist die Polarisationsabhängigkeit der Detektionseffizienz von sowohl Donor- als auch Akzeptorsignal vernachlässigbar. Es wurde gezeigt, dass die Polarisationsmischung aufgrund der hohen Nahfeldapertur (NA) des Objektivs ignoriert werden kann (Ha et al., wie oben).
Um Donor- und Akzeptoremissionszeiten aufzuzeichnen, wurde eine Suchbedingung auf das Akzeptorsignal angewandt, wie in (Ha et al., Appl. Phys. Lett., 1997; 70: 782) kurz dargestellt. Diese Prozedur hilft bei der Auswahl von doppelt markierten Proteinen: ohne direkte Anregung des Akzeptors können nur Proteine, die FRET erfahren, ein Akzeptorsignal zeigen. Sobald ein Protein ausgewählt wurde, im Laserbereich lokalisiert und positioniert wurde, wurden Donor- und Akzeptor-Zeitspuren (5 ms Integrationszeit) aufgenommen. Der Aufnahmezeitraum dauerte an, bis sämtliche Fluoreszenzmarkierungen auf dem Zielprotein durch Photobleaching gebleicht waren.
Reaktionsinitiierung
Zwei Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Standard-Phosphoamiditchemie synthetisiert. Das Oligonukleotid, das als SEQ ID Nr. 1 definiert ist, wurde als das Zielnukleotid eingesetzt, und das Oligonukleotid, das als SEQ ID, Nr. 2 definiert ist, wurde als Primer eingesetzt. Die beiden Oligonukleotide wurden unter Hybridisierungsbedingungen zur Bildung des Ziel-Primer-Komplexes umgesetzt. SEQ ID Nr.: 1
SEQ ID Nr.: 2
Die Reaktion wurde dann initiiert durch Injektion des Primer-DNA-Komplexes in die Durchflusszelle in Gegenwart von allen vier Nukleotiden (dGTP, dCTP, dATP und dTTP) in einer Konzentration von 0,4 mM. Die Durchflusszelle wurde durch eine modifizierte Peltier-Vorrichtung auf 25°C gehalten.
Zudem wurde ein Sauerstofffängersystem eingesetzt (50 μg/ml Glucoseoxidase, 10 μg/ml Katalase, 18% (w/w) Glucose, 1% (w/v) β-Mercaptoethanol) um die Fluoreszenzlebensdauer zu verlängern (Funatsu et al., Nature, 1995; 374: 555–559).
FRET-Datenanalyse
Erste Untersuchungen haben die Ursprünge von Blinken, Photobleaching und Triplettzustand-Signalspitzen (Ha, et al., Chem. Phys., 1999; 247: 107–118), die allesamt die eigentlichen Änderungen in der FRET-Effizienz, aufgrund von Distanzänderungen zwischen Fluorophoren als eine Folge von Konformationsänderungen, beeinträchtigen können. Nach Subtraktion des Hintergrundsignals von Donor- und Akzeptor-Zeitspuren, wie offenbart in Ha et al., 1999 (wie oben), wurde ein Medianfilter, mit fünf Punkten Durchschnitt, angewendet, um Triplettzustand-Signalspitzen zu entfernen. Als Nächstes wurden Datenpunkte, die aufgrund von Donor-Blinken simultane Dunkelzählungen auf beiden Detektoren zeigten, für die Zeitspuren nicht berücksichtigt. Das Ausmaß der Donorsignal-Regeneration nach Akzeptor-Photobleaching steht in Relation zu den Quantenausbeuten der Moleküle und ihrer gesamten Detektionseffizienz.
Eine Energieübertragungseffizienz-Zeitspur wurde dann erhalten. Die FRET-Effizienz-Zeitspur während der Polymerisation des Zielstranges SEQ ID Nr. 1 ist in 2 gezeigt. Beim Lesen von 2 entspricht die Sequenz dem Komplement von SEQ ID Nr. 1 (gelesen von rechts nach links, abzüglich des Teils, der mit dem Primer hybridisiert). SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, aufweisend die Schritte: i. ein Zielpolynukleotid mit einem Enzym eine Reaktion eingehen lassen, das in der Lage ist, mit dem Polynukleotid zu interagieren und entlang dieses Polynukleotids zu verfahren, unter Bedingungen welche ausreichend sind, um eine Enzymaktivität zu induzieren, und ii. Detektieren von konformativen Änderungen in dem Enzym, wenn das Enzym entlang des Polynukleotids fortschreitet; wobei das Enzym eine erste gebundene fluoreszierende Markierung aufweist, deren Eigenschaften sich ändern, wenn das Enzym eine konformative Änderung erfährt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Enzym ein Polymerase-Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Enzym ein Helicase-Enzym oder ein Primase-Enzym ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Enzym auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem eine Vielzahl von auf einem festen Träger immobilisierten Enzymen vorgesehen ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem das Enzym eine zweite gebundene Markierung aufweist, welche in der Lage ist, mit der ersten gebundenen fluoreszierenden Markierung zu interagieren, wobei das Ausmaß der Interaktion von einer konformativen Änderung in dem Enzym abhängt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem die zweite gebundene Markierung ein Energiespender ist und bei welchem Schritt (ii) dadurch ausgeführt wird, dass der Energieübertrag zwischen der ersten gebundenen fluoreszierenden Markierung und der zweiten gebundenen Markierung gemessen wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei welchem Schritt (ii) unter Verwendung konfokaler Mikroskopie durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei welchem Schritt (ii) durch Fluoreszenzbildgebung durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei welchem Schritt (ii) dadurch ausgeführt wird, dass der Polarisationseffekt als Folge der veränderten Eigenschaften der ersten gebundenen fluoreszierenden Markierung gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 10, bei welchem Schritt (ii) durch Fluoreszenz-Polarisationsanisotropie durchgeführt wird.
Fester Träger aufweisend zumindest ein immobilisiertes Polymerase-, Helicase- oder Primase-Enzym, wobei das Enzym mit zumindest einer FRET-Gebermarkierung und zumindest einer FRET-Empfängermarkierung markiert ist.
Fester Träger nach Anspruch 12, bei welchem die Markierung fluorophor ist.
System zur Bestimmung einer Sequenz eines Polynukleotids, aufweisend einen festen Träger nach Anspruch 12 oder Anspruch 13 und eine Vorrichtung zur Detektion der Markierungen.