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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft Bestimmungen von Polynukleotidsequenzen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Fähigkeit,
Sequenz eines Polynukleotids zu bestimmen, ist von großer wissenschaftlicher
Bedeutung. Das Humangenomprojekt, zum Beispiel, ist eine ehrgeizige
internationale Bemühung
zur Kartierung und Sequenzierung der drei Milliarden DNA-Basen,
die im menschlichen Genom enthalten sind. Nach seinem Abschluss
wird die resultierende Sequenzdatenbank ein Werkzeug von beispielloser
Leistungskraft für
die biomedizinische Forschung sein. Das Haupthindernis für den erfolgreichen
Abschluss dieses Projekts betrifft die Technologie, die beim Sequenzierungsprozess
verwendet wird.
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Das
allgemein angewendete Hauptverfahren zur großtechnischen DNA-Sequenzierung
ist das Kettenabbruchverfahren. Dieses Verfahren wurde zuerst von
Sanger und Coulson (Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977;
74: 5 463–5
467) entwickelt und beruht auf der Verwendung von Didesoxyderivaten
der vier Nukleosidtriphosphate, die in einer Polymerasereaktion
in eine entstehende Polynukleotidkette eingebaut werden. Beim Einbau
beenden die Didesoxyderivate die Polymerasereaktion, und die Produkte
werden anschließend
durch Gelelektrophorese aufgetrennt und analysiert, um die Position
anzuzeigen, an der das jeweilige Didesoxyderivat in die Kette eingebaut
wurde.
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Obwohl
dieses Verfahren verbreitet eingesetzt wird und zuverlässige Ergebnisse
produziert, ist bekannt, dass es langsam, arbeitsaufwändig und
teuer ist.
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Ein
alternatives Sequenzierverfahren, das spektroskopische Mittel verwendet,
um den Einbau eines Nukleotids in einen entstehenden Polynukleotidstrang
nachzuweisen, der komplementär
zu einem Ziel ist, wird in
EP-A-0471732 vorgeschlagen.
Das Verfahren beruht auf einem immobilisierten Komplex aus Templat
und Primer, das einem Durchfluss ausgesetzt wird, der nur eines
der verschiedenen Nukleotide enthält. Spektroskopische Techniken
werden dann verwendet, um ein zeitabhängiges Signal zu messen, das
durch das Polymerase-katalysierte Wachstum der Templat-Kopie entsteht.
Die beschriebenen spektroskopischen Techniken sind Oberflächenplasmonresonanz
(SPR)-Spektroskopie, die Änderungen
in einem Analyten innerhalb eines evaneszenten Wellenfelds misst,
und Fluoreszenzmesstechniken. Es sind jedoch Beschränkungen
dieses Verfahren bekannt; die schwerste für die SPR-Technik besteht darin,
dass, während
die Größe des Kopie-Stranges
zunimmt, aufgrund der Bewegung des Stranges aus dem evaneszenten
Wellenfeld heraus auch die absolute Größe des Signals zunimmt, wodurch
es schwieriger wird, Zunahmen zu detektieren. Die Fluoreszenzmesstechniken
haben den Nachteil, dass sie Hintergrundinterferenz von den in die
wachsende Polynukleotidkette eingebauten Fluorophoren erhöhen. Mit
dem Wachsen der Ketten nimmt das Hintergrund-"Rauschen" zu, und die Zeit, die zur Detektion
eines jeden Nukleotideinbaus erforderlich ist, muss heraufgesetzt werden.
Das schränkt
die Verwendung des Verfahrens zum Sequenzieren langer Polynukleotide
stark ein.
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Ansätze zur
Einzelfragment-Polynukleotidsequenzierung sind kurz dargestellt
in
WO-A-9924797 und
WO-A-9833939 , die
beide Fluoreszenzdetektion von einzelnen, markierten Nukleotidmolekülen anwenden. Diese
einzelnen Nukleotide werden durch die Aktivität eines Exonukleasemoleküls von dem
Templat-Polynukleotid abgespalten, das durch eine optische Falle
in einem Durchfluss gehalten wird (Jett et al., J. Biomol. Struc.
Dyn., 1989; 7: 301–309).
Diese abgespaltenen Nukleotide fließen dann innerhalb einer Quartzdurchflusszelle
stromabwärts,
werden einer Laseranregung unterworfen und anschließend durch
ein empfindliches Detektionssystem detektiert. Es sind jedoch Beschränkungen
dieses Verfahrens bekannt; die stärkste für die Exonukleasetechnik besteht
in der Tatsache, dass die markierten Nukleotide in hohem Maße die Prozessivität des Exonuklease-Enzyms
beeinflussen. Andere Beschränkungen
dieses Verfahrens umfassen das "Haften" des Nukleotids (der
Nukleotide) an dem Biotin-Bead, das verwendet wird, um das Polynukleotidfragment
zu immobilisieren, was somit dazu führt, dass der Nukleotiddurchfluss
aus der Phase gerät;
Ineffizienz und Längenbeschränkung des
eingangs enzymatischen Markierungsprozesses; und die Kreuzanregung
zwischen den vier verschiedenen Farbstoffmolekülen, was zu einer stark erhöhten Fehlerrate
führt.
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Es
besteht demnach ein Bedarf für
ein verbessertes Verfahren, bevorzugt auf der Einzelfragmentebene,
zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids, das die Geschwindigkeit
und die Fragmentgröße des zu
sequenzierenden Polynukleotids heraufsetzt, und das bevorzugt durch
einen automatisierten Prozess durchgeführt wird, was den Aufwand und
die Kosten, die mit herkömmlichen
Verfahren verbunden sind, vermindert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die Sequenz
eines Zielpolynukleotids durch Messen von Konformationsänderungen
in einem Enzym gemessen werden kann, das an das Zielnukleotid bindet
und sich daran entlang bewegt. Das Ausmaß der auftretenden Konformationsänderung
ist verschieden, abhängig
davon, welches einzelne Nukleotid auf dem Ziel im Kontakt mit dem
Enzym ist.
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung
der Sequenz eines Polynukleotids, wie in Anspruch 1 definiert, bereitgestellt.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Enzym ein Polymerase-Enzym, das mit dem Ziel beim Prozess
der Verlängerung
eines komplementären
Strangs interagiert. Das Enzym ist typischerweise auf einem festen
Träger
immobilisiert, um die Reaktion innerhalb einer begrenzten Region
zu lokalisieren.
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Gemäß der Erfindung
umfasst das Enzym eine erste gebundene nachweisbare Markierung,
deren Eigenschaften sich ändern,
wenn das Enzym eine Konformationsänderung erfährt. Das Enzym kann auch eine zweite
gebundene detektierbare Markierung umfassen, die in der Lage ist,
mit der ersten Markierung zu interagieren, wobei das Ausmaß der Wechselwirkung
von einer Konformationsänderung
im Enzym abhängt.
Typischerweise ist die erste Markierung ein Energieakzeptor und
die zweite Markierung ein Energiedonor, und die Detektion der Konformationsänderung
wird durchgeführt
durch Messen des Energieübertrags
zwischen den zwei Markierungen.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) verwendet, um eine Konformationsänderung
in einem Enzym zu detektieren, das mit einem Zielpolynukleotid interagiert
und sich daran entlang bewegt, und dadurch die Sequenz des Polynukleotids
zu bestimmen. Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) kann
durchgeführt
werden zwischen FRET-Donor- und Akzeptormarkierungen, die jeweils
an das Enzym gebunden sind. Alternativ kann eine der Markierungen
an das Enzym und die andere Markierung an das Polynukleotid gebunden
sein.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird ein detektierbar markiertes Enzym verwendet, das in der Lage
ist, mit dem Zielpolynukleotid zu interagieren und sich daran entlang
zu bewegen, um die Sequenz des Polynukleotids zu bestimmen, wobei
die Markierung ihre detektierbaren Eigenschaften ändert, während das Enzym
sich am Polynukleotid entlang bewegt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt wird ein fester Träger nach Anspruch 12 bereitgestellt.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt wird ein System zur Bestimmung der Sequenz eines
Polynukleotids nach Anspruch 14 bereitgestellt.
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Die
vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlicher
Sequenzierungstechnologie. Sobald ein Polymerase-Enzym seinen Zyklus
der Polynukleotidverlängerung
beginnt, neigt es dazu, mehrere tausend Nukleotide zu polymerisieren,
bevor es vom Strang abfällt.
Zusätzlich
sind bestimmte spezifische Polymerasesysteme in der Lage, sich an
dem Templat-Polynukleotid zu verankern oder sich daran anzubinden, über eine "Ringklemme" (z. B. Polymerase
III), die das Templat-Molekül
umspannt, oder über
einen molekularen Haken (z. B. T7-Thioredoxin-Komplex), der das
Templat teilweise umspannt.
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Die
Erfindung kann es auch ermöglichen,
dutzende Kilobasen (kb) oder mehr auf einmal sequenzieren zu können, bei
einer Geschwindigkeit von Hunderten von Basenpaaren pro Sekunde.
Das ist die Folge des Sequenzierens an einem einzigen DNA-Fragment.
Ein Vorteil des Sequenzierens an einem einzigen DNA-Fragment liegt
darin, dass die Sequenzierungsgeschwindigkeiten durch das genutzte
Enzymsystem und nicht durch indirekte, addierte Reaktionen bestimmt
werden und dadurch entsprechend höher sind. Genauso wichtig wie
die hohe Geschwindigkeit ist die Möglichkeit, lange DNA-Fragmente
zu sequenzieren. Das wird das Ausmaß an Subklonierungen und die
Anzahl überlappender
Sequenzen, die erforderlich sind, um Megabasen-Abschnitte von Sequenzinformationen
zu assemblieren, reduzieren. Ein zusätzlicher Vorteil des Einzelfragmentansatzes
liegt in der Beseitigung von Problemen, die mit der Entsorgung von
Gefahrstoffabfällen,
wie z. B. Acrylamid, verbunden sind, die derzeitige Sequenzierungsbemühungen belasten.
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Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Konfokalmikroskopaufbaus zur
Verwendung bei der Erfindung;
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2 stellt
eine Spur dar, die nach Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer aufgenommen
wurde, wobei jede der Spitzen die Detektion eines spezifischen Nukleotids
repräsentiert.
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Beschreibung der Erfindung
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Das
vorliegende Verfahren zum Sequenzieren eines Polynukleotids umfasst
die Analyse von Konformationsänderungen
zwischen einem Enzym und einem Zielpolynukleotid.
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Der
Begriff "Polynukleotid", wie hier verwendet,
soll breit interpretiert werden und umfasst DNA und RNA, einschließlich modifizierter
DNA und RNA sowie anderer hybridisierender nukleinsäureartiger
Moleküle, z.
B. Peptidnukleinsäure
(PNA).
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Das
Enzym kann ein Polymerase-Enzym sein, und eine Konformationsänderung
kommt zustande, wenn die Polymerase Nukleotide in einen entstehenden
Strang einbaut, der komplementär
zum Zielnukleotid ist. Es wurde herausgefunden, dass die Konformationsänderung
für jedes
der verschiedenen Nukleotide, A, T, G, oder C verschieden ist und
dass demnach das Messen der Änderung
aufzeigen wird, welches Nukleotid eingebaut wird.
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Alternativ
kann das Enzym ein beliebiges Enzym sein, das an einer Wechselwirkung
mit einem Polynukleotid beteiligt ist, z. B. ein Helikase-Enzym,
Primase- und Holoenzym. Wenn das Enzym sich an dem Polynukleotid
entlang bewegt, wird sich seine Konformation ändern, abhängig davon, mit welchem Nukleotid
auf dem Ziel es in Kontakt gebracht wird.
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Eine
Möglichkeit,
eine Konformationsänderung
in dem Enzym zu detektieren, besteht darin, Resonanzenergietransfer
zwischen einer geeigneten Donormarkierung und einer geeigneten Akzeptormarkierung
zu messen. In einem Beispiel sind der Donor und der Akzeptor jeweils
an das Enzym gebunden, und die Konformationsänderung im Enzym, die durch
seine Wechselwirkung mit dem Ziel herbeigeführt wird, verändert die relative
Positionierung der Markierungen. Die Unterschiede in der Positionierung
spiegeln sich in dem resultierenden Energietransfer wider und sind
charakteristisch für
das jeweilige Nukleotid in Kontakt mit dem Enzym. Alternativ kann
eine Markierung an dem Enzym positioniert sein und die andere an
einem Nukleotid des Ziels oder an einem Nukleotid, das in einen
zum Ziel komplementären
Strang eingebaut wird.
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Die
Verwendung von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ist
eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung. Diese Technik ist in der Lage, Abstände im Bereich
von 2–8
nm zu messen und beruht auf der distanzabhängigen Energieübertragung
zwischen einem Donorfluorophor und einem Akzeptorfluorophor. Die
Technik weist nicht nur überlegene
Fähigkeiten
zur statischen Kolokalisation auf, sondern kann auch Informationen über dynamische Änderungen
in den Distanzen oder der Orientierung zwischen den beiden Fluorophoren
für intramolekularen
und intermolekularen FRET bereitstellen. Seit der ersten Messung
eines Energieübertrags
zwischen einem einzelnen Donor und einem einzelnen Akzeptor (Einzelpaar-FRET) (Ha,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 96: 893), ist sie verwendet
worden zur Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Kolokalisation (Schutz
et al., Biophys. J., 1998; 74: 2223), zur Untersuchung von Proteinstruktur-Fluktuationen
im Gleichgewicht und Enzymsubstrat-Wechselwirkungen während der
Katalyse (Ha et al., 1999, wie oben), und zur Identifizierung von
Konformationszuständen
und Subpopulationen einzelner diffundierender Moleküle in Lösungen.
Es ist vorgesehen, dass sämtliche
dieser Varianten im Zusammenhang der Erfindung anwendbar sind.
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Die
vorliegende Erfindung kann auch unter Verwendung von Messtechniken
durchgeführt
werden, die nur eine einzige Markierung erfordern. Jedes System,
dass in der Lage ist, Änderungen
in der lokalen Umgebung des Enzyms auf Einzelmolekülebene zu
messen, ist eine anerkannte Ausführungsform
der Erfindung. Verschiedene Eigenschaften einzelner Fluoreszenzsonden,
die an ein Polynukleotid-prozessierendes Enzym und/oder sein(e)
Substrat(e) angebunden sind, können
im Zusammenhang der Erfindung ausgenutzt werden, um Daten zu Variablen
innerhalb des oder in unmittelbarer Nähre des Enzymsystems/der molekularen
Umgebung, zu liefern, die spezifisch für ein Nukleotideinbau-Ereignis
sind. Solche Variablen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf,
molekulare Wechselwirkungen, enzymatische Aktivität, Reaktionskinetik,
Konformationsdynamik, molekulare Bewegungsfreiheit und Änderungen
in Aktivität
sowie chemischer und elektrostatischer Umgebung.
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Zum
Beispiel können
die Absorptions- und Emissionsübergangsdipole
einzelner Fluorophore unter Verwendung von polarisiertem Anregungslicht
bestimmt werden, oder durch Analyse der Emissionspolarisation, oder
beides. Die zeitliche Änderung
in der Dipolorientierung einer starr angebundenen oder rotationsdiffundierend
angebundenen Markierung kann die Winkelbewegung eines Makromolekülssystems
oder einer seiner Untereinheiten anzeigen (Warshaw et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 8034) und kann demnach in der vorliegenden
Erfindung angewendet werden.
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Die
Markierungen, die in der vorliegenden Erfindung angewendet werden,
sind für
Fachleute offensichtlich. Bevorzugt ist die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung,
wie jene, die in Xue, et al., Nature, 1995; 373: 681 offenbart werden.
Alternativ können
fluoreszierende Enzyme, wie das Grün fluoreszierende Protein (Lu,
et al., Science, 1998; 282: 1877) eingesetzt werden.
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Die
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung umfasst jedoch die Verwendung kleiner Fluoreszenzmoleküle, die
kovalent und ortsspezifisch an das Polynukleotid-prozessierende
Enzym, angebunden sind, z. B. Tetramethylrhodamin (TMR).
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Wenn
Fluoreszenzmarkierungen bei der Erfindung verwendet werden, kann
ihre Detektion durch Photobleaching beinträchtig werden, das durch wiederholtes
Aussetzten gegenüber
Anregungswellenlängen
verursacht wird. Eine Möglichkeit,
dieses Problem zu vermeiden, besteht darin, viele aufeinander folgende
Reaktionen durchzuführen,
aber Fluoreszenzsignale nur auf wenigen auf einmal zu detektieren.
Unter Verwendung dieses iterativen Prozesses, kann die korrekte
Abfolge von Signalen bestimmt werden und die Polynukleotidsequenz
bestimmt werden. Zum Beispiel sollten die Sequenzierungsreaktionen
durch Immobilisierung einer Vielzahl von Enzymen auf einem festen
Träger
und Inkontaktbringen dieser mit dem Zielpolynukleotid zu ungefähr demselben
Zeitpunkt beginnen. Anregung und Detektion von Fluoreszenz kann
auf einen Anteil der gesamten Reaktionen lokalisiert werden, für eine Zeitdauer
bis zum Auftreten von Photobleaching. Zu diesem Zeitpunkt können Anregung
und Detektion auf einen anderen Anteil der Reaktionen übertragen
werden, um die Sequenzierung fortzusetzen. Wenn sämtliche
Reaktionen relativ zueinander in Phase sind, sollte die korrekte
Sequenz mit minimaler Sequenzreassemblierung erhalten werden.
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Die
Markierungen können
durch kovalente oder andere Verknüpfungen an die Enzyme gebunden sein.
Eine Anzahl von Strategien kann verwendet werden, um die Markierungen
an die Enzyme anzubinden. Strategien umfassen die Verwendung von
ortsspezifischer Mutagenese und Mutagenese mit nichtnatürlichen Aminosäuren (Anthony-Cahil,
et al., Trends Biochem. Sci., 1998; 14: 400) um Cystein- und Keton-Anker
für Proteine
zur spezifischen und orthogonalen Farbstoffmarkierung einzubauen
(Cornish et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994; 91: 2910).
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Eine
weitere vorgesehene Ausführungsform,
verwendet zum Markieren des Polynukleotid-prozessierenden Enzyms, ist die Fusion
von Grün
fluoreszierendem Protein (GFP) mit dem prozessierenden Enzym (z. B.
Polymerase) über
molekulare Klonierungstechniken, die im Fachgebiet bekannt sind
(Pierce, D. W. et al., Nature, 1997; 388: 338). Es wurde gezeigt,
dass diese Technik bei der Messung von Konformationsänderungen
(Miyawaki et al., Nature, 1997; 388: 882) und lokalen pH-Wertänderungen
(Llopis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 6803) anwendbar
ist.
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Zur
Verwendung bei der Immobilisierung des Enzyms geeignete Träger sind
für den
Fachmann offensichtlich. Es können
Silikon-, Glas- und Keramikmaterialien verwendet werden. Der Träger wird
gewöhnlich eine
ebene Oberfläche
sein. Die Enzymimmobilisierung kann durch kovalente oder andere
Mittel durchgeführt werden.
Zum Beispiel können
kovalente Linker-Moleküle
zur Anbindung an ein geeignet vorbereitetes Enzym verwendet werden.
Verbindungsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
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Es
können
ein oder mehrere Enzyme auf dem festen Träger immobilisiert sein. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
ist eine Vielzahl von Enzymen angebunden. Das erlaubt die Überwachung
von vielen getrennten Reaktionen und kann geeignet sein, um Photobleaching-Probleme zu überwinden,
wie oben kurz dargestellt.
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Es
kann eine Auswahl von Techniken verwendet werden, um eine Konformationsänderung
im Enzym zu messen. Resonanzenergietransfer kann durch die Techniken
der Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) oder Fluoreszenz-Oberflächenplasmonresonanz
gemessen werden.
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Jedoch
können
andere Techniken, die Änderungen
in der Strahlung über
Wechselwirkung mit einer „Markierung" oder einem Energieüberträger messen,
in Betracht gezogen werden, zum Beispiel Spektroskopie durch Totalreflexions-Fluoreszenz
(TIRF), abgeschwächte
Totalreflexion (ATR), frustrierte Totalreflexion, gestreute interne
Totalreflexion (STIR), zeitaufgelöste Fluoreszenz-Mikroskopie
und -Spektroskopie (FLIMS), Fluoreszenz-Polarisationsanisotropie
(FPA), Fluoreszenzspektroskopie oder Evaneszenzwellen-Ellipsometrie.
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Die
Erfindung wird nun anhand des folgenden Beispiels mit Bezug auf
die beiliegenden Zeichnungen näher
erläutert.
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Bespiel
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In
diesem Beispiel wurde ein konfokaler Fluoreszenzaufbau verwendet,
wie in 1 gezeigt.
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Mit
Bezug auf 1 besteht der Aufbau aus einem
Scan-Tisch (1), der mit hoher Auflösung in X, Y- und Z-Richtung
scannen kann, einem Glasobjektträger
(2), der Teil eines Mikrofluid-Durchflusszellensystems ist, mit einem
Einlass (8) zum Einbringen des Primer-Templat-Polynukleotidkompiexes
(4) und Nukleotiden über
das immobilisierte (9) Polymerasemolekül (3) innerhalb eines
Puffers, und Auslass (7) für Abfall. Auflicht von einer
Laserlichtquelle (6) zur Donoranregung wird über ein Ölimmersionsobjektiv
(5) geliefert.
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Proteinkonjugation
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Bei
diesem Experiment wurden Tetramethylrhodamin (TMR, Donor) und Cy5
(Akzeptor) als FRET-Paar verwendet. Das geschah aufgrund ihrer gut
getrennten Emissionswellenlängen
(> 100 nm) und ihrem
großen
Förster-Radius.
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Es
wurde T7-DNA-Polymerase von New England Biolabs (geliefert in einer
Konzentration von 10 000 U/ml) verwendet. 50 μl T7-Polymerase wurde dem Pufferaustausch
gegen 4 × 500 μl 200 mM
Natriumacetatpuffer bei pH 4 in einer Vivaspin 500 (Vivaspin) unterworfen,
um das DDT aus dem Aufbewahrungspuffer zu entfernen, in dem die
T7-Polymerase geliefert wird. Dann wurden 50 μl der T7-Polymerase nach Pufferaustausch
zu 100 μl
Natriumazetatpuffer bei pH 4 und 50 μl gesättigtes 2-2-Dipyridyl-disulfid
in wässriger
Lösung gegeben.
Diese Reaktion wurde dann für
110 Minuten stehen gelassen, und die Absorption bei 343 nm notiert. Schließlich wurde
die Probe dann wie zuvor einem Pufferaustausch zu 200 mM Tris bei
pH 8 unterworfen (4 Mal 500 μl).
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Farbstoffanbindung
wurde durch denaturierende Poylacrylamidgelelektrophorese überprüft. Cy5-Succinimidylester
(Molecular Probes) wurde unter denselben Markierungsbedingungen
an die TMR-T7-DNA-Polymerase konjugiert und gereinigt und charakterisiert
wie oben beschrieben.
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Polymerase-Immobilisierung
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Glasobjektträger wurden
mit N-((3-Trimethoxysilyl)-propyl)-ethylendiamintriessigsäure derivatisiert. Der
Objektträger
wurde dann in eine Durchflusszellenanordnung geklebt, die es erlaubte,
Puffer kontinuierlich über
die derivatisierte Glasoberfläche
fließen
zu lassen. Die markierte Polymerase wurde dann zu dem Puffer gegeben
und über
den Objektträger
fließen
gelassen, sodass Protein auf der Glasoberfläche immobilisiert wurde.
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Proteine
wurden dann mit geringer Dichte auf der Glas-Wasser-Grenzfläche immobilisiert,
sodass sich zu jedem gegebenen Zeitpunkt nur ein Molekül im Laser-Anregungsvolumen
befand. Laserlicht (514 nm Argonionen-Laser, 15 μW, zirkular polarisiert) wurde
auf einen 0,4 μm-Bereich
fokussiert, unter Verwendung eines Ölimmersionsobjektivs in einem
Epi-Beleuchtungs-Aufbau
eines Konfokalmikroskops mit Scan-Tisch. Die Fluoreszenzemission
wurde durch dasselbe Objektiv gesammelt und durch einen dichroitischen
Strahlenteiler zweigeteilt (Langpass bei 630 nm) und durch zwei
Lawinenphotodioden (APD)-Zähleinheiten
gleichzeitig detektiert.
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Ein
585 nm Bandpassfilter wurde vor den Donordetektor gesetzt; ein 650
Langpassfilter wurde vor den Akzeptordetektor gesetzt. Da die Spektralbereiche
während
der Fluoreszenzdetektion ausreichend entfernt von der Grenzwellenlänge des
dichroitischen Strahlteilers liegen, ist die Polarisationsabhängigkeit
der Detektionseffizienz von sowohl Donor- als auch Akzeptorsignal vernachlässigbar.
Es wurde gezeigt, dass die Polarisationsmischung aufgrund der hohen
Nahfeldapertur (NA) des Objektivs ignoriert werden kann (Ha et al.,
wie oben).
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Um
Donor- und Akzeptoremissionszeiten aufzuzeichnen, wurde eine Suchbedingung
auf das Akzeptorsignal angewandt, wie in (Ha et al., Appl. Phys.
Lett., 1997; 70: 782) kurz dargestellt. Diese Prozedur hilft bei
der Auswahl von doppelt markierten Proteinen: ohne direkte Anregung
des Akzeptors können
nur Proteine, die FRET erfahren, ein Akzeptorsignal zeigen. Sobald
ein Protein ausgewählt
wurde, im Laserbereich lokalisiert und positioniert wurde, wurden
Donor- und Akzeptor-Zeitspuren
(5 ms Integrationszeit) aufgenommen. Der Aufnahmezeitraum dauerte
an, bis sämtliche
Fluoreszenzmarkierungen auf dem Zielprotein durch Photobleaching
gebleicht waren.
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Reaktionsinitiierung
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Zwei
Oligonukleotide wurden unter Verwendung von Standard-Phosphoamiditchemie
synthetisiert. Das Oligonukleotid, das als SEQ ID Nr. 1 definiert
ist, wurde als das Zielnukleotid eingesetzt, und das Oligonukleotid,
das als SEQ ID, Nr. 2 definiert ist, wurde als Primer eingesetzt.
Die beiden Oligonukleotide wurden unter Hybridisierungsbedingungen
zur Bildung des Ziel-Primer-Komplexes umgesetzt. SEQ
ID Nr.: 1
SEQ
ID Nr.: 2
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Die
Reaktion wurde dann initiiert durch Injektion des Primer-DNA-Komplexes
in die Durchflusszelle in Gegenwart von allen vier Nukleotiden (dGTP,
dCTP, dATP und dTTP) in einer Konzentration von 0,4 mM. Die Durchflusszelle
wurde durch eine modifizierte Peltier-Vorrichtung auf 25°C gehalten.
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Zudem
wurde ein Sauerstofffängersystem
eingesetzt (50 μg/ml
Glucoseoxidase, 10 μg/ml
Katalase, 18% (w/w) Glucose, 1% (w/v) β-Mercaptoethanol) um die Fluoreszenzlebensdauer
zu verlängern
(Funatsu et al., Nature, 1995; 374: 555–559).
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FRET-Datenanalyse
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Erste
Untersuchungen haben die Ursprünge
von Blinken, Photobleaching und Triplettzustand-Signalspitzen (Ha, et al., Chem. Phys.,
1999; 247: 107–118),
die allesamt die eigentlichen Änderungen
in der FRET-Effizienz, aufgrund von Distanzänderungen zwischen Fluorophoren
als eine Folge von Konformationsänderungen,
beeinträchtigen
können.
Nach Subtraktion des Hintergrundsignals von Donor- und Akzeptor-Zeitspuren,
wie offenbart in Ha et al., 1999 (wie oben), wurde ein Medianfilter,
mit fünf
Punkten Durchschnitt, angewendet, um Triplettzustand-Signalspitzen zu
entfernen. Als Nächstes
wurden Datenpunkte, die aufgrund von Donor-Blinken simultane Dunkelzählungen
auf beiden Detektoren zeigten, für
die Zeitspuren nicht berücksichtigt.
Das Ausmaß der
Donorsignal-Regeneration nach Akzeptor-Photobleaching steht in Relation
zu den Quantenausbeuten der Moleküle und ihrer gesamten Detektionseffizienz.
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Eine
Energieübertragungseffizienz-Zeitspur
wurde dann erhalten. Die FRET-Effizienz-Zeitspur während der
Polymerisation des Zielstranges SEQ ID Nr. 1 ist in
2 gezeigt.
Beim Lesen von
2 entspricht die Sequenz dem
Komplement von SEQ ID Nr. 1 (gelesen von rechts nach links, abzüglich des
Teils, der mit dem Primer hybridisiert). SEQUENZPROTOKOLL
