PT1226271E - Método de sequenciação de adn - Google Patents

Description

ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Método de sequenciação de ADN"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a determinações de sequências polinucleotidicas.

Antecedentes da invenção A capacidade de determinar a sequência de um polinucleótido tem grande importância cientifica. Por exemplo, o Projecto do Genoma Humano ("Human Genome Project") constitui um ambicioso esforço internacional para mapear e sequenciar os três mil milhões de bases de ADN codificados no genoma humano. Quando completa, a base de dados de sequências resultante será uma ferramenta com um poder sem paralelo para a investigação biomédica. 0 principal obstáculo para se atingir o sucesso completo deste projecto refere-se à tecnologia utilizada no processo de sequenciação. 0 principal método em uso geral para a sequenciação em larga-escala do ADN é o método da terminação de cadeias. Este método foi primeiro desenvolvido por Sanger e Coulson (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1977; 74: 5463-5467), e assenta na utilização de derivados didesoxi dos quatro nucleósido-trifosfatos que são incorporados numa cadeia polinucleotidica nascente numa reacção pela polimerase. Após a incorporação, os derivados didesoxi terminam a reacção pela polimerase e os produtos são então separados por electroforese em gel e analisados para revelar a posição em que o derivado didesoxi particular foi incorporado na cadeia.

Embora este método seja amplamente utilizado e produza resultados fiáveis, é reconhecido que é lento, laborioso e dispendioso.

Um método de sequenciação alternativo é proposto em EP-A-0471732, que utiliza meios espectroscópicos para detectar a incorporação de um nucleótido numa cadeia polinucleotidica nascente complementar a um alvo. O método assenta num complexo imobilizado de molde e iniciador, que é exposto a um fluxo 2 ΕΡ 1 226 271/PT contendo apenas um dos diferentes nucleótidos. São então utilizadas técnicas espectroscópicas para medir um sinal dependente do tempo que surge do crescimento catalisado pela polimerase da cópia do molde. As técnicas espectroscópicas descritas são a espectroscopia de ressonância plasmónica de superfície (SPR, do inglês "Surface Plasmon Resonance"), que mede alterações num analito no interior de um campo de onda evanescente, e técnicas de medição de fluorescência. Contudo, são reconhecidas limitações deste método; sendo a mais grave para a técnica SPR o facto de que, à medida que a dimensão da cadeia cópia cresce, a dimensão absoluta do sinal também cresce devido ao movimento da cadeia para fora do campo de onda evanescente, tornando mais difícil detectar incrementos. As técnicas de medição de fluorescência têm a desvantagem de aumentarem a interferência de ruído de fundo dos fluoróforos incorporados na cadeia polinucleotídica nascente em crescimento. À medida que a cadeia cresce, o "ruído" de fundo aumenta e o tempo necessário para detectar a incorporação de cada nucleótido tem que ser aumentado. Isto restringe gravemente a utilização do método relativamente à sequenciação de polinucleótidos grandes.

Abordagens de sequenciação de fragmentos de polinucleótidos únicos são delineadas em WO-A-9924797 e WO-A-9833939, ambos empregando detecção de fluorescência de moléculas nucleotídicas marcadas únicas. Estes nucleótidos únicos são clivados do polinucleótido molde, mantidos num fluxo através de uma armadilha óptica (Jett, et al., J. Biomol. Struc. Dyn, 1989; 7:301-309), por acção de uma molécula de exonuclease. Estes nucleótidos clivados escoam então para jusante no interior da célula de fluxo de quartzo, são submetidos a excitação por laser e depois são detectados através de um sistema de detecção sensível. Contudo, são reconhecidas limitações deste método; sendo a mais grave para a técnica da exonuclease o facto dos nucleótidos marcados afectarem gravemente a capacidade de processamento da enzima exonuclease. Outras limitações deste método incluem a 'adesão' do(s) nucleótido (s) à conta de biotina utilizada para imobilizar o fragmento de polinucleótido, resultando assim que o fluxo de nucleótido fica fora de fase; ineficiência e limitação do comprimento do processo de marcação enzimática inicial; e a excitação cruzada { 'cross-over') entre as quatro 3 ΕΡ 1 226 271/PT diferentes moléculas corantes que resulta numa taxa de erro grandemente aumentada.

Existe portanto uma necessidade de um método melhorado, preferivelmente ao nivel de fragmentos únicos, para a determinação da sequência de polinucleótidos, que aumente significativamente a taxa e a dimensão do fragmento do polinucleótido sequenciado e que seja preferivelmente realizado através de um processo automático, reduzindo a complexidade e o custo associados aos métodos existentes.

Sumário da invenção A presente invenção baseia-se na constatação de que a sequência de um polinucleótido alvo pode ser determinada através da medição de alterações conformacionais numa enzima que se liga a, e processa ao longo do polinucleótido alvo. A extensão da alteração conformacional que ocorre é diferente dependendo de que nucleótido individual no alvo está em contacto com a enzima.

De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona-se um método para a determinação da sequência de um polinucleótido como definido na reivindicação 1.

Numa concretização preferida, a enzima é uma enzima polimerase que interactua com o alvo no processo de alongamento de uma cadeia complementar. A enzima é tipicamente imobilizada num suporte sólido para localizar a reacção numa área definida.

De acordo com a invenção, a enzima compreende ligado um primeiro marcador detectável, cujas caracteristicas se alteram à medida que a enzima sofre uma alteração conformacional. A enzima pode também compreender ligado um segundo marcador detectável capaz de interactuar com o primeiro marcador, em que o grau de interacção depende da alteração conformacional na enzima. Tipicamente, o primeiro marcador é um aceitador de energia e o segundo marcador é um dador energia, e a detecção da alteração conformacional é realizada por medição da transferência de energia entre os dois marcadores. 4 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

De acordo com uma outra concretização da invenção, utiliza-se transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET, do inglês "Fluorescence Resonance Energy Transfer") para detectar uma alteração conformacional numa enzima que interactua com, e processa ao longo de uma polimerase alvo, desse modo determinando a sequência do polinucleótido. A transferência de energia de ressonância de fluorescência pode ser realizada entre marcadores dadores e aceitadores de FRET, cada um ligado à enzima. Alternativamente, um dos marcadores pode estar ligado à enzima e o outro marcador ligado ao polinucleótido.

De acordo com uma outra concretização, utiliza-se uma enzima detectavelmente marcada, capaz de interactuar com, e processar ao longo de um polinucleótido alvo, para determinar a sequência do polinucleótido, em que o marcador altera as suas caracteristicas detectáveis à media que a enzima processa ao longo do polinucleótido.

De acordo com um outro aspecto, proporciona-se um suporte sólido de acordo com a reivindicação 12.

De acordo com um outro aspecto, proporciona-se um sistema para a determinação da sequência de um polinucleótido de acordo com a reivindicação 14. A presente invenção oferece várias vantagens sobre a tecnologia convencional de sequenciação. Uma vez que uma enzima polimerase inicie o seu ciclo de alongamento do polinucleótido, esta tende a polimerizar vários milhares de nucleótidos antes de sair da cadeia. Adicionalmente, certos sistemas específicos de polimerases são capazes de ancorar ou ligar-se ao polinucleótido molde por meio de um "grampo deslizante" {'slíding clamp') {e.g. Polimerase III) que circunda a molécula do molde ou por meio de um gancho molecular (e.g. complexo T7:tireodoxina) que circunda parcialmente o molde. A invenção pode também permitir a sequenciação de dezenas de quilobases (kb) ou mais de cada vez, a uma taxa de centenas de pares de bases por segundo. Isto resulta da sequenciação num único fragmento de ADN. Uma vantagem da sequenciação de um 5 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ único fragmento de ADN é que as taxas de sequenciação são determinadas pelo sistema enzimático utilizado e não por reacções indirectas, somadas, e são portanto correspondentemente mais elevadas. Tão importante como a elevada taxa é a capacidade de sequenciar grandes fragmentos de ADN. Isto irá reduzir significativamente a quantidade de subclonagem e o número de sequências sobrepostas necessárias para montar segmentos de megabases de informação de sequenciação. Uma vantagem adicional da abordagem do fragmento único é a eliminação de problemas associados à eliminação de resíduos perigosos, tais como acrilamida, que obstruem os esforços de sequenciação actuais.

Descrição dos Desenhos A Figura 1 é uma ilustração esquemática de uma montagem de microscópio confocal para utilização na invenção; A Figura 2 ilustra um traçado tomado após transferência de energia de ressonância de fluorescência, com cada um dos picos representando a detecção de um nucleótido específico.

Descrição da invenção 0 presente método para sequenciação de um polinucleótido envolve a análise de alterações conformacionais entre uma enzima e um polinucleótido alvo. 0 termo "polinucleótido", como aqui utilizado, deve ser interpretado amplamente, e inclui ADN e ARN, incluindo ADN e ARN modificados, assim como outras moléculas semelhantes a ácido nucleico que podem hibridar, e.g. ácido nucleico peptídico (PNA). A enzima pode ser uma enzima polimerase, e é provocada uma alteração conformacional quando a polimerase incorpora um nucleótido numa cadeia nascente complementar ao polinucleótido alvo. Verificou-se que a alteração conformacional será diferente para cada um dos diferentes nucleótidos, A, T, G ou C e portanto a medição da alteração irá identificar que nucleótido é incorporado. 6 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

Alternativamente, a enzima pode ser qualquer uma que esteja envolvida numa interacção com um polinucleótido, e.g. uma enzima helicase, primase e holoenzima. À medida que a enzima processa ao longo do polinucleótido, a sua conformação irá variar dependendo com que nucleótido no alvo está em contacto.

Um modo de detecção de uma alteração conformacional na enzima é medir a transferência de energia de ressonância entre um marcador dador de energia adequado e um marcador aceitador de energia adequado. Num exemplo, o dador e o aceitador estão cada um ligados à enzima e a alteração conformacional provocada na enzima por esta interacção com o polinucleótido alvo altera o posicionamento relativo dos marcadores. As diferenças no posicionamento reflectem-se na transferência de energia resultante e são caracteristicas do nucleótido particular em contacto com a enzima. Alternativamente, um marcador pode estar posicionado na enzima e o outro num nucleótido do alvo ou num nucleótido incorporado numa cadeia complementar ao alvo. A utilização de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) constitui uma concretização preferida da invenção. Esta técnica é capaz de medir distâncias na escala de 2 a 8 nm e assenta numa transferência de energia dependente da distância entre um fluoróforo dador e um fluoróforo aceitador. A técnica não apenas tem superiores capacidades de co-localização estática como também proporciona informação sobre alterações dinâmicas na distância ou orientação entre os dois fluoróforos para FRET intramolecular e intermolecular. Desde a primeira medição de transferência de energia entre um único dador e um único aceitador (único par de FRET) (Ha, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996; 96:893), esta tem sido utilizada para estudar a co-localização de ligandos-receptores (Schutz, et al., Biophys. J., 1998; 74:2223), para sondar flutuações estruturais de proteínas em equilíbrio e interaeções enzima-substrato durante a catálise (Ha, et al., 1999 Supra), e para identificar estados conformacionais e sub-populações de moléculas individuais em difusão em soluções. Todas estas variáveis estão contempladas como aplicáveis no contexto da invenção. 7

ΕΡ 1 226 271/PT A presente invenção pode também ser realizada utilizando técnicas de medição que requerem apenas um único marcador. Qualquer sistema que seja capaz de medir alterações no ambiente local da enzima ao nivel de uma única molécula, constitui uma concretização aceite da invenção. Várias propriedades de sondas fluorescentes individuais ligadas a uma enzima processadora de polinucleótidos e/ou seu(s) substrato (s), podem ser exploradas no contexto da invenção para proporcionar dados sobre variáveis no interior ou em estreita proximidade com o sistema enzimático/ambiente molecular que são especificas de um evento de incorporação de um nucleótido. Estas variáveis incluem, mas não se lhes limitam, interacções moleculares, actividade enzimática, cinética da reacção, dinâmica conformacional, liberdade de movimento molecular, e alterações na actividade e no ambiente químico e electrostático.

Por exemplo, os dipolos de transição de absorção e emissão de fluoróforos individuais podem ser determinados utilizando luz de excitação polarizada ou por análise da polarização de emissão, ou ambas. A variação temporal na orientação dos dipolos de um marcador ligado de forma rígida ou ligado com difusão rotacional, pode-se reportar no movimento angular de um sistema macromolecular ou uma das suas subunidades (Warshaw, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1998; 95:8034) e portanto pode ser aplicada na presente invenção.

Os marcadores que podem ser utilizados na presente invenção serão evidentes para os peritos na especialidade. Preferivelmente, o marcador é um marcador de fluorescência, tal como os que estão descritos em Xue, et al., Nature, 1995; 373:681. Alternativamente, podem-se empregar enzimas fluorescentes como a Proteína Verde Fluorescente (Lu, et al., Science, 1998; 282:1877). A concretização preferida da invenção, contudo, envolve a utilização de pequenas moléculas de fluorescência que são ligadas covalentemente e de forma específica do local à enzima processadora de polinucleótidos, e.g. tetrametilrodamina (TMR). 8 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

Se forem utilizados marcadores fluorescentes na invenção, a sua detecção pode ser afectada por fotobranqueamento causado pela exposição repetida a comprimentos de onda de excitação. Uma maneira possivel de evitar este problema consiste em realizar muitas reacções sequenciais, mas detectar os sinais de fluorescência apenas em alguns de cada vez. Utilizando este processo iterativo, a sequência correcta de sinais pode ser determinada e a sequência polinucleotidica determinada. Por exemplo, através da imobilização de uma pluralidade de enzimas num suporte sólido e do seu contacto com o polinucleótido alvo, as reacções de sequenciação deverão iniciar-se aproximadamente ao mesmo tempo. A excitação e a detecção da fluorescência podem ser localizadas numa proporção das reacções totais, durante um tempo até o fotobranqueamento se tornar evidente. Neste momento, a excitação e a detecção podem ser transferidas para uma proporção diferente das reacções para continuar a sequenciação. Como todas as reacções estão relativamente em fase, deverá ser obtida a sequência correcta com uma re-montagem minima da sequência.

Os marcadores podem ser ligados às enzimas por ligações covalentes ou outras. Podem-se utilizar várias estratégias para ligar os marcadores à enzima. As estratégias incluem a utilização de mutagénese dirigida ao local e mutagénese de aminoácidos não naturais (Anthony-Cahil, et al., Trends Bíochem. Sei., 1989; 14:400) para introduzir "pegas" de cisteína e cetona para proteínas de marcação corantes ortogonais e específicas (Cornish, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994; 91:2910).

Outra concretização prevista utilizada para marcar a enzima processadora de polinucleótidos é a fusão de proteína verde fluorescente (GFP, do inglês "Green Fluorescent Protein") com a enzima processadora (e.g. polimerase) através de técnicas de clonagem molecular conhecidas na especialidade (Pierce, D.W. et al., Nature, 1997; 388:338). Demonstrou-se que esta técnica é aplicável à medição de alterações conformacionais (Miyawaki, et al., Nature, 1997; 388:882) e alterações locais de pH (Llopis, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 1998; 95:6803). 9 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

Os suportes adequados para utilização na imobilização das enzimas serão evidentes para o perito. Podem-se utilizar materiais de silício, vidro e cerâmicos. 0 suporte será usualmente uma superfície plana. A imobilização da enzima pode ser realizada por meios covalentes ou outros. Por exemplo, podem-se utilizar moléculas ligantes covalentes para fixar uma enzima adequadamente preparada. Os métodos de fixação são conhecidos dos peritos.

Pode haver uma ou mais enzimas imobilizadas no suporte sólido. Numa concretização preferida, existem uma pluralidade de enzimas fixadas. Isto permite a monitoração de muitas reacções separadas, e pode ser útil para ultrapassar problemas de fotobranqueamento como delineado atrás.

Podem-se utilizar uma variedade de técnicas para medir uma alteração conformacional na enzima. A transferência de energia de ressonância pode ser medida através das técnicas de ressonância plasmónica de superfície (SPR) ou ressonância plasmónica de superfície fluorescente.

Contudo, podem ser consideradas outras técnicas que meçam alterações na radiação por via da interacção com um 'marcador' ou um transdutor de energia, por exemplo espectroscopia por fluorescência de reflectância interna total (TIRF, do inglês "Total Internai Reflectance Fluorescence") , reflexão total atenuada (ATR, do inglês "Attenuated Total Reflection"), reflexão total frustrada (FTR, do inglês "Frustrated Total Reflection"), reflectometria de angulo de Brewster, reflexão interna total dispersa (STIR, do inglês "Scattered Total Internai Reflection'') , microscopia e espectroscopia de imagiologia de tempo de vida de fluorescência (FLIMS, do inglês "Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy and

Spectroscopy"), anisotropia de polarização de fluorescência (FPA, do inglês "Fluorescence Polarisation Anisotrophy"), espectroscopia de fluorescência ou elipsometria de onda evanescente. A invenção será agora adicionalmente ilustrada pelo Exemplo que se segue, com referência aos desenhos anexos. 10 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

Exemplo

Este Exemplo utilizou uma montagem de fluorescência confocal, como mostrado na Fig. 1.

Com referência à Fig. 1, a montagem consiste numa mesa de varrimento (1) capaz de varrer em alta resolução nas dimensões X, Y e Z, uma lamela de vidro (2) que faz parte de um sistema de célula de fluxo microfluidico com uma entrada (8) para introdução do complexo iniciador-molde polinucleotidico (4) e nucleótidos sobre a molécula de polimerase (3) imobilizada (9) num tampão, e uma saída (7) para resíduos. Luz incidente proveniente de uma fonte de luz laser (6) para excitação do dador é entregue por meio de uma objectiva de imersão em óleo (5).

Conjugação de Proteínas

Nesta experiência, utilizaram-se Tetrametilrodamina (TMR, dador) e Cy5 (aceitador) como par de FRET. Isto foi devido aos seus comprimentos de onda de emissão bem separados (>100nm) e grande raio de Fõster.

Utilizou-se ADN-Polimerase de T7 da New England Biolabs (fornecida a 10 000 U/ml). Trocou-se o tampão a 50μ1 de T7 num Vivaspin 500 (Vivaspin) contra 4 x 500μ1 de tampão de Acetato de Sódio 200mM a pH 4 de modo a remover o DTT do tampão de armazenagem em que a ADN-Polimerase de T7 é fornecida. Depois, adicionaram-se 50μ1 da ADN-polimerase de T7 com tampão trocado a 100μ1 de tampão de Acetato de Sódio a pH 4 e 50 μΐ de 2-2-DiPiridil-DiSsulfureto em solução aquosa saturada. Deixou-se esta reacção durante 110 minutos e anotou-se a absorção a 343nm. Finalmente, a amostra foi trovada de tampão para Tris 200mM a pH 8 como antes (4 vezes 500μ1).

Verificou-se a fixação de corante por electroforese em gel de poliacrilamida desnaturante. Conjugou-se éster succinimidílico de Cy5 (Molecular Probes) a TMR-ADN-Polimerase de T7 sob as mesmas condições de marcação e purificou-se e caracterizou-se como descrito acima. 11 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ

Imobilização da Polimerase

Fez-se a derivação de lamelas de vidro com ácido N-[(3-trimetoxissilil)propil]etilenodiaminotriacético. Colou-se então a lamela a um arranjo de célula de fluxo que permitiu que o tampão escoasse continuamente sobre a superfície de vidro derivatizada. A polimerase marcada foi então adicionada ao tampão e deixada escoar sobre a lamela de modo a que a proteína ficasse imobilizada na superfície de vidro.

As proteínas foram então imobilizadas na interface vidro-água com baixa densidade de modo a que apenas uma molécula ficasse sob o volume de excitação por laser em cada momento. Focou-se luz laser (laser de iões de Ar de 514 nm, 15 yW, circularmente polarizado) num ponto de 0,4 ym utilizando uma objectiva de imersão em óleo numa montagem de epi-iluminação de um microscópio confocal com etapa de varrimento. Recolheu-se a emissão de fluorescência através da mesma objectiva e dividiu-se em duas através de um divisor de feixe dicróico (passagem longa a 630 nm) e detectou-se através de duas unidades de contagem Avalanche Photo Diode (APD), simultaneamente.

Colocou-se um filtro de passagem de banda de 585 nm em frente do detector do dador; colocou-se um filtro de passagem longa de 650 nm em frente do detector do aceitador. Como as alterações espectrais durante a detecção de fluorescência são suficientemente removidas do comprimento de onda limite do divisor de feixe dicróico, a dependência da polarização da eficiência de detecção de ambos os sinais, do dador e do aceitador, é desprezável. Foi demonstrado que a mistura de polarização devida à elevada abertura de objectiva de campo próximo (NA) pode ser desprezada (Ha et al, supra) .

De modo a adquirir os tempos de emissão do dador e do aceitador, empregou-se uma condição de busca no sinal do aceitador como delineado em (Ha, et al., Appl. Phys. Lett., 1997; 70:782). Este procedimento ajuda a rastrear as proteínas duplamente marcadas: sem excitação directa do aceitador, apenas proteínas que sofrem FRET podem apresentar sinal do aceitador. Uma vez rastreada uma proteína, localizada e posicionada sob o ponto de laser, adquiriram-se os traçados no 12 ΕΡ 1 226 271/PT tempo do dador e do aceitador (tempo de integração de 5 ms). 0 tempo de aquisição durou até que todos os marcadores fluorescentes na proteína alvo estivessem fotobranqueados.

Iniciação da Reacção

Sintetizaram-se dois oligonucleótidos utilizando a química do fosforoamidito Standard. Utilizou-se o oligonucleótido definido como SEQ ID N0.1 como polinucleótido alvo, e utilizou-se o oligonucleótido definido como SEQ ID No. 2 como iniciador. Fizeram-se reagir os dois oligonucleótidos sob condições de hibridação para formar o complexo alvo-iniciador.

CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG SEQ ID N0.1 CTCTCCCTTCTCTCGTC SEQ ID NO.2

Iniciou-se então a reacção por injecção do ADN iniciado na célula de fluxo com todos os quatro nucleótidos (dGTP, dCTP, dATP e dTTP) presentes numa concentração de 0,4 mM. Manteve-se a célula de fluxo a 25 graus Celsius através de um dispositivo de Peltier modificado.

Empregou-se também um sistema sequestrante de oxigénio [glucose-oxidase a 50 pg/ml, catalase a 10 pg/ml, glucose a 18% (p/p), β-mercaptoetanol a 1% (p/vol)] para prolongar os tempo de vida de fluorescência (Funatsu, et ai., Nature, 1995; 374:555-559).

Análise de resultados de FRET

Estudos iniciais determinaram as origens de cintilação, fotobranqueamento e picos de estado tripleto (Ha, et al., Chem. Phy., 1999; 247:107-118), todos podendo interferir com as causas subjacentes na eficiência de FRET, devido a alterações da distância entre fluoróforos em resultado de alterações conformacionais. Após subtrair o sinal de fundo dos traçados no tempo do dador e do aceitador como descrito em Ha, et al., 1999 (Supra), aplicou-se um filtro mediano, com cinco pontos em média, para remover picos de tripletos. 13

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Seguidamente, os pontos de resultados que apresentavam contagens escuras simultâneas em ambos os detectores devido a eventos de cintilação do dador foram desprezados dos traçados no tempo. A quantidade de recuperação de sinal do dador após o fotobranqueamento do aceitador está relacionada com os rendimentos quânticos das moléculas e com as suas eficiências globais de detecção.

Foi então obtido o traçado no tempo da eficiência da transferência de energia. 0 traçado no tempo da eficiência de FRET durante a polimerização da cadeia alvo SEQ ID N0.1 é apresentado na Figura 2. Lendo a Fig. 2, a sequência corresponde ao complemento da SEQ ID No. 1 (lendo da direita para a esquerda, menos a parte que híbrida com a sequência iniciadora).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Medicai Biosystems Ltd.

<120> Método de sequenciação de ADN

<130> REP06193WO <140> (ainda desconhecido) <141> 2000-10-06 <150> 9923644.0 <151> 1999-10-06 < 16 0 > 2 <170> Patentln Ver. 2.1 < 210 > 1 <211> 53

< 212 > ADN <213> Sequência Artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Molde < 4 0 0 > 1 caaggagagg acgctgtctg tcgaaggtaa ggaacggacg agagaaggga gag 53

< 210 > 2 <211> 17 < 212 > ADN <213> Sequência Artificial 14 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: Polinucleótido Iniciador <400> 2 ctctcccttc tctcgtc 17

Lisboa, 2008-05-12

Claims (14)

1. ΕΡ 1 226 271/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a determinação da sequência de um polinucleótido, compreendendo os passos de: i. leitura de um polinucleótido alvo com uma enzima que é capaz de interactuar com, e processar ao longo do polinucleótido, sob condições suficientes para induzir actividade enzimática; e ii. detecção de alterações conformacionais na enzima à medida que a enzima processa ao longo do polinucleótido; em que a enzima compreende ligado um primeiro marcador fluorescente, cujas caracteristicas se alteram à medida que a enzima sofre uma alteração conformacional.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima é uma enzima polimerase.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima é uma enzima helicase ou uma enzima primase.
4. 4. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a enzima está imobilizada num suporte sólido.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, compreendendo uma pluralidade de enzimas imobilizadas no suporte sólido.
6. 6. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a enzima compreende ligado um segundo marcador capaz de interactuar com o primeiro marcador fluorescente ligado, em que o grau de interacção está dependente de uma alteração conformacional na enzima.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o segundo marcador ligado é um dador de energia, e em que o passo (ii) é realizado por medição da transferência de energia entre o primeiro marcador fluorescente ligado e o segundo marcador ligado. ΕΡ 1 226 271/ΡΤ 2/2
8. 8. Método de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o passo (ii) é realizado utilizando microscopia confocal.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o passo (ii) é realizado por imagiologia de fluorescência.
10. 10. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, em que o passo (ii) é realizado por medição de um efeito de polarização consequente das caracteristicas alteradas do primeiro marcador fluorescente ligado.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o passo (ii) é realizado por anisotropia de polarização de fluorescência.
12. 12. Suporte sólido compreendendo pelo menos uma enzima polimerase, helicase ou primase imobilizada, sendo a enzima marcada com pelo menos um marcador dador de FRET e pelo menos um marcador aceitador de FRET.
13. 13. Suporte sólido de acordo com a reivindicação 12, em que o marcador é um fluoróforo.
14. 14. Sistema para a determinação de uma sequência de um polinucleótido, compreendendo um suporte sólido de acordo com a reivindicação 12 ou a reivindicação 13, e um aparelho para a detecção dos marcadores. Lisboa, 2008-05-12 ΕΡ 1 226 271/ΡΤ 1/2

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