ES2302497T3 - Procedimiento de secuenciacion de adn. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para determinar la secuencia de un polinucleótido, que comprende las etapas de: i. hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima que puede interaccionar con, y procesar, el polinucleótido, en condiciones suficientes para inducir actividad enzimática; y ii. detectar cambios conformacionales en la enzima a medida que la enzima procesa el polinucleótido; en el que la enzima comprende un primer marcador fluorescente unido, cuyas características se ven alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio conformacional.
Description
Procedimiento de secuenciación de ADN.
Esta invención se refiere a determinaciones de
secuencias de polinucleótidos.
La capacidad de determinar la secuencia de un
polinucleótido es de gran importancia científica. Por ejemplo, el
Proyecto Genoma Humano es un ambicioso esfuerzo internacional para
mapear y secuenciar los tres billones de bases del ADN codificado
en el genoma humano. Cuando se complete, la base de datos de
secuencias resultante será una herramienta de potencia sin
precedentes para la investigación biomédica. El principal obstáculo
para la finalización satisfactoria de este proyecto se refiere a la
tecnología usada en el procedimiento de secuenciación.
El procedimiento principal de uso general para
la secuenciación de ADN a gran escala es el procedimiento de
terminación de cadena. Este procedimiento se desarrolló por primera
vez por Sanger y Coulson (Sanger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1977; 74: 5463-5467) y se basa en el uso
de derivados didesoxilo de los cuatro nucleósidos trifosfatos que
se incorporan en una cadena de polinucleótido naciente en una
reacción de polimerasa. Tras la incorporación, los derivados
didesoxilo terminan la reacción de polimerasa y entonces se separan
los productos mediante electroforesis en gel y se analizan para
revelar la posición en la que se incorporó el derivado didesoxilo
particular en la cadena.
Aunque este procedimiento se usa ampliamente y
produce resultados fiables, se reconoce que es lento, requiere
mucho trabajo y es caro.
En el documento
EP-A-0471732 se propone un
procedimiento de secuenciación alternativo que usa medios
espectroscópicos para detectar la incorporación de un nucleótido en
una cadena de polinucleótido naciente complementaria a una diana.
El procedimiento se basa en un complejo inmovilizado de molde y
cebador, que se expone a un flujo que sólo contiene uno de los
diferentes nucleótidos. Entonces se usan técnicas espectroscópicas
para medir una señal que depende del tiempo que surge del
crecimiento catalizado por la polimerasa de la copia del molde. Las
técnicas espectroscópicas descritas son espectroscopía por
resonancia de plasmón superficial (SPR), que mide cambios en un
analito dentro de un campo de onda evanescente, y técnicas de
medición de fluorescencia. Sin embargo, se reconocen limitaciones
de este procedimiento; siendo la más grave para la técnica de SPR
que, a medida que crece el tamaño de la cadena de copia, también
crece el tamaño absoluto de la señal debido al movimiento de la
cadena fuera del campo de onda evanescente, haciendo más difícil
detectar los aumentos. Las técnicas de medición de fluorescencia
tienen la desventaja de interferencia de fondo creciente a partir de
los fluoróforos incorporados en la cadena de polinucleótido
naciente en crecimiento. A medida que crece la cadena, aumenta el
"ruido" de fondo y es necesario aumentar el tiempo requerido
para detectar cada incorporación de nucleótido. Esto limita
gravemente el uso del procedimiento para secuenciar polinucleótidos
grandes.
En los documentos
WO-A-9924797 y
WO-A-9833939 se exponen enfoques de
secuenciación de polinucleótidos de un único fragmento, empleando
ambos detección fluorescente de moléculas de nucleótidos con un
único marcador. Estos nucleótidos individuales se rompen del
polinucleótido de molde, se mantienen en un flujo mediante una
trampa óptica (Jett, et al., J. Biomol. Struc. Dyn, 1989; 7:
301-309), mediante la acción de una molécula de
exonucleasa. Entonces estos nucleótidos rotos fluyen aguas abajo
dentro de una célula de flujo de cuarzo, se someten a excitación
por láser y después se detectan mediante un sistema de detección
sensible. Sin embargo, se reconocen limitaciones de este
procedimiento; siendo la más grave para la técnica de exonucleasa el
hecho de que los nucleótidos marcados afectan gravemente a la
capacidad de procesamiento de la enzima exonucleasa. Otras
limitaciones de este procedimiento incluyen "adhesión" del/de
los nucleótido(s) a la perla de biotina usada para
inmovilizar el fragmento de polinucleótido, dando así como resultado
que el flujo de nucleótidos se desfase; ineficacia y limitación de
longitud del procedimiento de marcaje enzimático inicial; y el
"cruce" de excitación entre las cuatro moléculas de colorante
diferentes dando como resultado un gran aumento de la tasa de
error.
Por tanto, existe una necesidad de un
procedimiento mejorado, preferiblemente en el nivel del fragmento
único, para determinar la secuencia de polinucleótidos, que aumente
significativamente la velocidad y tamaño de fragmento del
polinucleótido secuenciado y que se lleve a cabo preferiblemente
mediante un procedimiento automatizado, reduciendo la complejidad y
coste asociado con los procedimientos existentes.
La presente invención se basa en la constatación
de que la secuencia de un polinucleótido diana puede determinarse
midiendo cambios conformacionales en una enzima que se une a, y
procesa, el polinucleótido diana. El grado del cambio
conformacional que tiene lugar es diferente dependiendo de qué
nucleótido individual en la diana esté en contacto con la
enzima.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento para determinar la secuencia de un
polinucleótido tal como se define en la reivindicación 1.
En una realización preferida, la enzima es una
enzima polimerasa que interacciona con la diana en el procedimiento
de extender una cadena complementaria. Normalmente la enzima está
inmovilizada sobre un soporte sólido para localizar la reacción
dentro de una zona definida.
Según la invención, la enzima comprende un
primer marcador detectable unido, cuyas características se ven
alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio
conformacional. La enzima también puede comprender un segundo
marcador detectable unido que puede interaccionar con el primer
marcador, en el que el grado de interacción depende de un cambio
conformacional en la enzima. Normalmente, el primer marcador es un
aceptor de energía y el segundo marcador es un donador de energía,
y la detección del cambio conformacional se lleva a cabo midiendo
la transferencia de energía entre los dos marcadores.
Según una realización adicional de la invención,
se usa transferencia de energía por resonancia de fluorescencia
(FRET) para detectar un cambio conformacional en una enzima que
interacciona con, y procesa, una polimerasa diana, determinando así
la secuencia del polinucleótido. Puede llevarse a cabo la
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre
marcadores donadores y aceptores de FRET, cada uno unido a la
enzima. Como alternativa, uno de los marcadores puede estar unido a
la enzima y el otro marcador puede estar unido al
polinucleótido.
Según una realización adicional, existe el uso
de una enzima marcada de manera detectable, que puede interaccionar
con, y procesar, un polinucleótido diana, para determinar la
secuencia del polinucleótido, en el que el marcador altera sus
características detectables a medida que la enzima procesa el
polinucleótido.
Según un aspecto adicional, se proporciona un
soporte sólido según la reivindicación 12.
Según un aspecto adicional, se proporciona un
sistema para determinar la secuencia de un polinucleótido según la
reivindicación 14.
La presente invención ofrece varias ventajas con
respecto a la tecnología de secuenciación convencional. Una vez que
una enzima polimerasa comienza su ciclo de alargamiento del
polinucleótido, tiende a polimerizar varios miles de nucleótidos
antes de separarse de la cadena. Adicionalmente, ciertos sistemas de
polimerasa específicos pueden anclarse o unirse ellos mismos al
polinucleótido molde mediante una "sujeción deslizante" (por
ejemplo, la polimerasa III) que rodea a la molécula molde o
mediante un gancho molecular (por ejemplo complejo T7:tireodoxina)
que rodea parcialmente al molde.
La invención también puede permitir secuenciar
decenas de kilobases (kb) o más en una pasada, a una velocidad de
cientos de pares de bases por segundo. Esto es un resultado de la
secuenciación en un fragmento único de ADN. Una ventaja de
secuenciar un fragmento único de ADN es que las velocidades de
secuenciación se determinan por el sistema enzimático utilizado y
no tras reacciones indirectas, añadidas, y por tanto son
correspondientemente superiores. Tan importante como la elevada
velocidad es la capacidad de secuenciar grandes fragmentos de ADN.
Esto reducirá significativamente la cantidad de subclonación y el
número de secuencias solapantes requerido para ensamblar segmentos
de megabases de información de secuenciación. Una ventaja adicional
del enfoque del fragmento único es la eliminación de problemas
asociados con la eliminación de desechos peligrosos, tales como
acrilamida, que asolan los esfuerzos actuales de secuenciación.
La figura 1 es una ilustración esquemática de
una configuración de microscopio confocal para su uso en la
invención;
la figura 2 ilustra un perfil tomado tras la
transferencia de energía por resonancia de fluorescencia,
representando cada uno de los picos la detección de un nucleótido
específico.
El presente procedimiento para secuenciar un
polinucleótido implica el análisis de cambios conformacionales
entre una enzima y un polinucleótido diana.
El término "polinucleótido" tal como se usa
en el presente documento debe interpretarse ampliamente, e incluye
ADN y ARN, incluyendo ADN y ARN modificados, así como otras
moléculas similares a ácido nucleico que hibridan, por ejemplo
ácido nucleico peptídico (ANP).
La enzima puede ser una enzima polimerasa, y se
provoca un cambio conformacional cuando la polimerasa incorpora un
nucleótido en una cadena naciente complementaria al polinucleótido
diana. Se ha encontrado que el cambio conformacional será diferente
para cada uno de los diferentes nucleótidos, A, T, G o C y por tanto
la medición del cambio identificará qué nucleótido se
incorpora.
Como alternativa, la enzima puede ser cualquiera
que esté implicada en una interacción con un polinucleótido, por
ejemplo una enzima helicasa, primasa y holoenzima. A medida que la
enzima procesa el polinucleótido, su conformación cambiará
dependiendo de con qué nucleótido en la diana entra en contacto.
Una manera de detectar un cambio conformacional
en la enzima es medir la transferencia de energía por resonancia
entre un marcador donador de energía adecuado y un marcador aceptor
de energía adecuado. En un ejemplo, el donador y el aceptor están
cada uno unidos a la enzima y el cambio conformacional en la enzima
provocado por su interacción con el polinucleótido diana altera la
posición relativa de los marcadores. Las diferencias en la posición
se reflejan en la transferencia de energía resultante y son
características del nucleótido particular en contacto con la
enzima. Como alternativa, un marcador puede estar situado en la
enzima y el otro en un nucleótido de la diana o en un nucleótido
incorporado a la cadena complementaria a la diana.
El uso de transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia (FRET) es una realización preferida de
la invención. Esta técnica puede medir distancias en la escala de 2
nm a 8 nm y se basa en la transferencia de energía dependiente de
la distancia entre un fluoróforo donador y un fluoróforo aceptor. La
técnica no sólo tiene capacidades superiores de colocalización
estática sino que también proporciona información sobre cambios
dinámicos en la distancia u orientación entre los dos fluoróforos
para la FRET intramolecular e intermolecular. Desde la primera
medición de transferencia de energía entre un único donador y un
único aceptor (FRET de un único par) (Ha, et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1996; 96: 893), se ha usado para estudiar la
colocalización de ligando y receptor (Schutz, et al.,
Biophys. J., 1998; 74: 2223), para analizar con sondas fluctuaciones
estructurales de proteínas en equilibrio e interacciones
enzima-sustrato durante la catálisis (Ha, et
al., 1999 citado anteriormente), y para identificar estados
conformacionales y subpoblaciones de moléculas de difusión
individuales en disoluciones. Todas estas variables se consideran
aplicables dentro del contexto de la invención.
La presente invención también puede llevarse a
cabo usando técnicas de medición que sólo requieren un único
marcador. Cualquier sistema que pueda medir cambios en el entorno
local de la enzima a nivel de la molécula única es una realización
aceptada de la invención. Pueden explotarse diversas propiedades de
sondas fluorescentes únicas unidas a una enzima que procesa
polinucleótidos y/o su(s) sustrato(s) en el contexto
de la invención para proporcionar datos sobre variables dentro de,
o en estrecha proximidad con, el sistema enzimático/entorno
molecular que son específicos para un acontecimiento de
incorporación de nucleótido. Tales variables incluyen, pero no se
limitan a, interacciones moleculares, actividad enzimática, cinética
de reacción, dinámica conformacional, libertad de movimiento
molecular y alteraciones en la actividad y en el entorno químico y
electrostático.
Por ejemplo, pueden determinarse los dipolos de
transición de absorción y emisión de fluoróforos únicos usando luz
de excitación polarizada o analizando la polarización de emisión, o
ambas. La variación temporal en la orientación del dipolo de un
marcador fijado de manera rígida o unido en difusión rotacional
puede informar sobre el movimiento angular de un sistema
macromolecular o una de sus subunidades (Warshaw, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 8034) y por tanto puede
aplicarse en la presente invención.
Los marcadores que pueden usarse en la presente
invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica.
Preferiblemente, el marcador es un marcador de fluorescencia, tales
como los dados a conocer en Xue, et al., Nature, 1995; 373:
681. Como alternativa, pueden emplearse enzimas fluorescentes tales
como proteína verde fluorescente (Lu, et al., Science, 1998;
282: 1877).
Sin embargo, la realización preferida de la
invención implica el uso de pequeñas moléculas de fluorescencia que
están fijadas de manera covalente y específica del sitio a la enzima
que procesa polinucleótidos, por ejemplo tetrametilrodamina
(TMR).
Si se usan marcadores fluorescentes en la
invención, su detección puede realizarse mediante fotoblanqueado
provocado por una exposición repetida a longitudes de onda de
excitación. Una manera posible de evitar este problema es llevar a
cabo muchas reacciones secuenciales, pero detectando señales de
fluorescencia sólo en unas pocas cada vez. Usando este
procedimiento iterativo, puede determinarse la secuencia correcta de
señales y determinarse la secuencia del polinucleótido. Por
ejemplo, inmovilizando una pluralidad de enzimas sobre un soporte
sólido y poniéndolas en contacto con el polinucleótido diana, las
reacciones de secuenciación deben comenzar aproximadamente en el
mismo momento. La excitación y detección de fluorescencia pueden
localizarse en una proporción de las reacciones totales, durante un
tiempo hasta que el fotoblanqueado se hace evidente. En este
momento, la excitación y detección pueden transferirse a una
proporción diferente de las reacciones para continuar con la
secuenciación. Ya que todas las reacciones están relativamente en
fase, debe obtenerse la secuencia correcta con un reensamblaje
mínimo de la
secuencia.
secuencia.
Los marcadores pueden fijarse a las enzimas
mediante enlaces covalentes u otros. Pueden usarse varias
estrategias para fijar los marcadores a la enzima. Las estrategias
incluyen el uso de mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis de
aminoácidos no naturales (Anthony-Cahil, et
al., Trends Biochem. Sci., 1989; 14: 400) para introducir asas
de cisteína y cetona para marcar proteínas con colorantes
específicos y ortogonales (Cornish, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1994; 91: 2910).
Otra realización prevista usada para marcar con
etiqueta la enzima que procesa polinucleótidos es la fusión de
proteína verde fluorescente (GFP) a la enzima que procesa (por
ejemplo polimerasa) mediante técnicas de clonación molecular
conocidas en la técnica (Pierce, D.W. et al., Nature, 1997;
388: 338). Se ha demostrado que esta técnica es aplicable a la
medición de cambios conformacionales (Miyawaki, et al.,
Nature, 1997; 388: 882) y cambios de pH locales (Llopis, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998; 95: 6803).
Los soportes adecuados para su uso en la
inmovilización de las enzimas resultarán evidentes al experto.
Pueden usarse materiales de silicio, vidrio y cerámica. El soporte
será normalmente una superficie plana. La inmovilización de enzimas
puede llevarse a cabo por medio covalente u otro. Por ejemplo,
pueden usarse moléculas conectoras covalentes para fijarse a una
enzima preparada de manera adecuada. Los procedimientos de fijación
los conoce el experto.
Puede haber una o más enzimas inmovilizadas al
soporte sólido. En una realización preferida, hay una pluralidad de
enzimas fijadas. Esto permite monitorizar muchas reacciones
separadas, y puede ser útil para superar problemas de
fotoblanqueado tal como se expuso anteriormente.
Puede usarse una variedad de técnicas para medir
un cambio conformacional en la enzima. Puede medirse la
transferencia de energía por resonancia mediante las técnicas de
resonancia de plasmón superficial (SPR) o resonancia de plasmón
superficial fluorescente.
Sin embargo, pueden considerarse otras técnicas
que miden cambios en la radiación mediante interacción con un
"marcador" o transductor de energía, por ejemplo espectroscopía
mediante fluorescencia por reflexión interna total (TIRF),
reflexión total atenuada (ATR), reflexión total frustrada (FTR),
reflectometría de ángulo de Brewster, reflexión interna total
dispersada (STIR), espectroscopía y microscopía de visualización de
la vida media de fluorescencia (FLIMS), anisotropía de polarización
de fluorescencia (FPA), espectroscopía de fluorescencia o
elipsometría de ondas evanescentes.
Ahora se ilustrará adicionalmente la invención
mediante el siguiente ejemplo, con referencia a los dibujos
adjuntos.
Ejemplo
Este ejemplo usó una configuración de
fluorescencia confocal, tal como se muestra en la figura 1.
Con referencia a la figura 1, la configuración
consiste en una mesa (1) de barrido para realizar un barrido a alta
resolución en las dimensiones X, Y y Z, un cubreobjetos (2) de clase
que es parte de un sistema de células de flujo microfluidas con una
entrada (8) para introducir el complejo (4)
cebador-polinucleótido molde y nucleótidos sobre la
molécula (3) de polimerasa inmovilizada (9) dentro de un tampón, y
una salida (7) para el desecho. Se envía luz incidente a partir de
una fuente (6) luminosa para la excitación del donador mediante un
objetivo (5) de inmersión en aceite.
En este experimento, se usaron
tetrametilrodamina (TMR, donador) y Cy5 (aceptor) como par de FRET.
Esto se debió a sus longitudes de onda de emisión bien separadas
(> 100 nm) y gran radio de Föster.
Se usó ADN polimerasa de T7 de New England
Biolabs (suministrada a 10.000 U/ml). Se cambió el tampón de
50 \mul de T7 en un sistema Vivaspin 500 (Vivaspin) frente a 4 x 500 \mul de tampón acetato de sodio 200 mM a pH 4 con el fin de eliminar el DTT del tampón de almacenamiento en el que se suministra la ADN polimerasa de T7. Después, se añadieron 50 \mul de la ADN polimerasa de T7 sometida a cambio de tampón a 100 \mul de tampón acetato de sodio a pH 4 y 50 \mul de 2-2-dipiridil-disulfuro saturado en disolución acuosa. Después se dejó esta reacción durante 110 minutos y se observó la absorción a 343 nm. Finalmente, se cambió entonces la muestra de tampón en Tris 200 mM a pH 8 tal como anteriormente (4 veces 500 \mul).
50 \mul de T7 en un sistema Vivaspin 500 (Vivaspin) frente a 4 x 500 \mul de tampón acetato de sodio 200 mM a pH 4 con el fin de eliminar el DTT del tampón de almacenamiento en el que se suministra la ADN polimerasa de T7. Después, se añadieron 50 \mul de la ADN polimerasa de T7 sometida a cambio de tampón a 100 \mul de tampón acetato de sodio a pH 4 y 50 \mul de 2-2-dipiridil-disulfuro saturado en disolución acuosa. Después se dejó esta reacción durante 110 minutos y se observó la absorción a 343 nm. Finalmente, se cambió entonces la muestra de tampón en Tris 200 mM a pH 8 tal como anteriormente (4 veces 500 \mul).
Se verificó la fijación del colorante mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. Se
conjugó éster succinimidílico de Cy5 (Molecular Probes) a
TMR-ADN polimerasa de T7 en las mismas condiciones
de marcaje y se purificó y caracterizó tal como se describió
anteriormente.
Se derivatizaron cubreobjetos de vidrio con
ácido
N-[(3-trimetoxisilil)propil]etilendiaminatriacético.
Después se pegó el cubreobjetos en una disposición de células de
flujo que permitió hacer fluir el tampón de manera continua sobre
la superficie de vidrio derivatizada. Después se añadió la
polimerasa marcada al tampón y se dejó fluir sobre el cubreobjetos
de manera que se inmovilizó la proteína sobre la superficie de
vidrio.
Después se inmovilizaron las proteínas sobre la
superficie de contacto vidrio-agua con baja densidad
de manera que sólo había una molécula en el volumen de excitación
por láser cada vez. Se enfocó luz láser (láser de ión Ar a 514 nm,
15 \muW, polarizado de manera circular) sobre un punto de 0,4
\mum en un objetivo de inmersión en aceite en una configuración
de epi-iluminación de un microscopio confocal en
fase de barrido. Se recogió la emisión de fluorescencia por el
mismo objetivo y se dividió en dos mediante un divisor del haz
dicroico (paso largo a 630 nm) y se detectó simultáneamente por dos
unidades de recuento de fotodiodo de avalancha (APD).
Se colocó un filtro de paso de banda a 585 nm
enfrente del detector de donador; se colocó un filtro de paso largo
a 650 nm enfrente del detector de aceptor. Ya que los intervalos
espectrales durante la detección de fluorescencia están lo
suficientemente separados de la longitud de onda límite del divisor
del haz dicroico, la dependencia de la polarización de la eficacia
de detección de las señales tanto de donador como de aceptor es
despreciable. Se ha mostrado que puede pasarse por alto el mezclado
de la polarización debido al objetivo de alta abertura de campo
próximo (NA) (Ha et al, citado anteriormente).
Con el fin de adquirir tiempos de emisión de
donador y de aceptor, se empleó una condición de búsqueda sobre la
señal de aceptor tal como se expone en (Ha, et al., Appl.
Phys. Lett., 1997; 70: 782). Este procedimiento ayuda en la
selección de proteínas marcadas de manera doble: sin excitación
directa del aceptor, sólo las proteínas que experimentan FRET
pueden mostrar señal de aceptor. Una vez seleccionada una proteína,
localizada y colocada bajo el punto de láser, se adquirieron
perfiles de tiempo de donador y de aceptor (tiempo de integración
de 5 ms). El tiempo de adquisición duró hasta que se fotoblanquearon
todos los marcadores fluorescentes en la proteína diana.
Los dos oligonucleótidos se sintetizaron usando
química de fosforamidita convencional. Se usó el oligonucleótido
definido como SEC ID NO. 1 como el polinucleótido diana, y se usó el
oligonucleótido definido como SEC ID NO. 2 como el cebador. Se
hicieron reaccionar los dos oligonucleótidos en condiciones de
hibridación para formar el complejo
diana-cebador.
| CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG | SEC ID NO. 1 |
| CTCTCCCTTCTCTCGTC | SEC ID NO. 2 |
Entonces se inició la reacción inyectando el ADN
con cebador en la célula de flujo con los cuatro nucleótidos (dGTP,
dCTP, dATP y dTTP) presentes a una concentración de 0,4 mM. Se
mantuvo la célula de flujo a 25ºC mediante un dispositivo Peltier
modificado.
También se empleó un sistema de eliminación de
oxígeno [glucosa oxidasa 50 \mug/ml, catalasa 10 \mug/ml,
glucosa al 18% (p/p), \beta-mercaptoetanol al 1%
(p/v)] para prolongar las vidas medias fluorescentes (Funatsu,
et al., Nature, 1995; 374: 555-559).
Estudios iniciales han determinado los orígenes
de picos de parpadeos, fotoblanqueado y estado de tripletes (Ha,
et al., Chem. Phy., 1999; 247: 107-118),
todos los cuales pueden interferir con los cambios subyacentes en
la eficacia de FRET, debido a cambios en la distancia entre
fluoróforos como resultado de cambios conformacionales. Tras
sustraer la señal de fondo de los perfiles de tiempo de donador y de
aceptor tal como se da a conocer en Ha, et al., 1999 (citado
anteriormente), se aplicó un filtro mediano, con un promedio de
cinco puntos, para eliminar picos de tripletes. A continuación, se
ignoraron de los perfiles de tiempo los puntos de datos que
mostraron cuentas oscuras simultáneas en ambos detectores debido a
acontecimientos de parpadeo del donador.
La cantidad de recuperación de señal de donador
tras el fotoblanqueado del aceptor está relacionada con los
rendimientos cuánticos de las moléculas y sus eficacias globales de
detección.
Entonces se obtuvo el perfil de tiempo de
eficacia de transferencia de energía. El perfil de tiempo de la
eficacia de FRET durante la polimerización de la cadena diana SEC ID
NO. 1 se muestra en la figura 2. Al leer la figura 2, la secuencia
corresponde a la complementaria de la SEC ID NO. 1 (leyendo de
derecha a izquierda, menos la parte que se hibrida con la secuencia
de cebador).
<110> Medical Biosystems Ltd.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de secuenciación de
ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<130> REP06193WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> (aún no se conoce)
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
06-10-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 9923644.0
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-10-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: polinucleótido molde
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: polinucleótido cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipctctcccttc tctcgtc
\hfill17
Claims (14)
1. Un procedimiento para determinar la secuencia
de un polinucleótido, que comprende las etapas de:
- i.
- hacer reaccionar un polinucleótido diana con una enzima que puede interaccionar con, y procesar, el polinucleótido, en condiciones suficientes para inducir actividad enzimática; y
- ii.
- detectar cambios conformacionales en la enzima a medida que la enzima procesa el polinucleótido;
en el que la enzima comprende un
primer marcador fluorescente unido, cuyas características se ven
alteradas a medida que la enzima experimenta un cambio
conformacional.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la enzima es una enzima polimerasa.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la enzima es una enzima helicasa o una enzima primasa.
4. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la enzima está inmovilizada sobre
un soporte sólido.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
que comprende una pluralidad de enzimas inmovilizadas sobre el
soporte sólido.
6. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la enzima comprende un segundo
marcador unido que puede interaccionar con el primer marcador
fluorescente unido, en el que el grado de interacción depende de un
cambio conformacional en la enzima.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el segundo marcador unido es un donador de energía, y en
el que la etapa (ii) se lleva a cabo midiendo la transferencia de
energía entre el primer marcador fluorescente unido y el segundo
marcador unido.
8. Un procedimiento según cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo
usando microscopía confocal.
9. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que la etapa (ii) se lleva a cabo mediante formación de
imágenes por fluorescencia.
10. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la etapa (ii) se lleva a cabo
midiendo un efecto de polarización consecuente sobre las
características alteradas del primer marcador fluorescente
unido.
11. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que la etapa (ii) se lleva a cabo mediante anisotropía de
polarización de fluorescencia.
12. Un soporte sólido que comprende al menos una
enzima polimerasa, helicasa o primasa inmovilizada, estando la
enzima marcada con al menos un marcador donador de FRET y al menos
un marcador aceptor de FRET.
13. Un soporte sólido según la reivindicación
12, en el que el marcador es un fluoróforo.
14. Un sistema para determinar una secuencia de
un polinucleótido, que comprende un soporte sólido según la
reivindicación 12 o la reivindicación 13, y un aparato para detectar
los marcadores.
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