EA006702B1 - Способ определения последовательности полинуклеотида - Google Patents

Abstract

Способ определения последовательности полинуклеотида, включающий стадии (i) взаимодействия полинуклотида-мишени по крайней мере с одним ферментом, способным к взаимодействию с полинуклотидом и передвижению по нему в условиях, достаточных для индуцирования ферментативной активности; и (ii) обнаружения конформационных изменений в ферменте, по мере того как фермент передвигается по полинуклеотиду; используемый для осуществления этого способа твердый носитель, содержащий по меньшей мере один иммобилизованный фермент, способный к взаимодействию с полинуклеотидом-мишенью и передвижению по нему, помеченный одной или несколькими детектируемыми метками; и система для определения последовательности полинуклеотида, включающая такой твердый носитель и устройство для обнаружения метки.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к определению нуклеотидных последовательностей.

Предпосылки создания изобретения

Возможность определения последовательности полинуклеотида имеет большое научное значение. Например, Проект Генома человека является грандиозной международной программой с целью картирования и установления последовательности трех биллионов оснований ДНК, закодированных в геноме человека. По завершении полученная база данных о последовательностях будет являться мощным, не имеющим себе равных инструментом для биомедицинских исследований. Основная помеха для успешного завершения данного проекта относится к технологии, используемой в процессе секвенирования.

Основным способом, как правило, используемым при секвенировании ДНК в большом масштабе, является метод терминации цепи. Данный метод первыми разработали Зайдет и Сои18ои (Зайдет еб а1., Ргос. №111. Асаб. Зеб. ИЗА, 1977; 74: 5463-5467), и он основан на применении дидезоксипроизводных четырех нуклеозидтрифосфатов, которые включаются в образующуюся полинуклеотидную цепь при полимеразной реакции. После включения дидезоксипроизводные обрывают полимеразную реакцию, и затем продукты реакции разделяют гель-электрофорезом и анализируют, чтобы обнаружить позицию, в которой конкретное дидезоксипроизводное включено в цепь.

Хотя такой способ широко применяется и дает надежные результаты, известно, что он слишком медленный, трудоемкий и дорогостоящий.

В ЕР-А-0471732 описывается другой способ секвенирования, в котором применяют спектроскопические средства обнаружения включения нуклеотида в растущую полинуклеотидную цепь, комплементарную мишени. Способ основан на образовании иммобилизованного комплекса матрицы и праймера, который подвергается воздействию потока, содержащего только один из различных нуклеотидов. Затем используют спектроскопические методы для измерения зависящего от времени сигнала, являющегося результатом катализируемого полимеразой роста матричной копии. Описанными спектроскопическими методами являются спектроскопия резонанса поверхностных плазмонов (ЗРЯ), которая измеряет изменения в аналите в пределах поля исчезающей волны, и методы, измеряющие флуоресценцию. Однако известны ограничения такого способа, причем наиболее серьезным для метода ЗРЯ является то, что поскольку размер копийной цепи растет, абсолютная величина сигнала также возрастает из-за смещения цепи из поля исчезающей волны, что затрудняет детекцию инкрементов. Недостатками методов измерения флуоресценции является повышение фоновой помехи от флуорофоров, включенных в растущую полинуклеотидную цепь. Так как цепь растет, фоновый шум возрастает, и необходимо увеличение времени, требуемого для детекции каждого включения нуклеотида. Это обстоятельство серьезно ограничивает применение такого способа для секвенирования больших полинуклеотидов.

Подходы к секвенированию отдельных фрагментов полинуклеотида описываются в ^О-А-9924797 и \УО-А-9833939. и в обоих случаях используют флуоресцентный анализ отдельных меченых молекул нуклеотидов. Такие отдельные нуклеотиды отщепляют от матричного полинуклеотида, удерживаемого в потоке с помощью оптической ловушки (Лебб еб а1., 1. Вюшо1. Збгис. Эуп., 1989; 7: 301-309), под действием молекулы экзонуклеазы. Затем полученные отщепленные нуклеотиды стекают в потоке в кварцевой проточной кювете, подвергаются возбуждению излучением лазера и затем обнаруживаются с помощью чувствительной системы обнаружения. Однако ограничения данного способа известны, причем наиболее сложным для эндонуклеазного метода является тот факт, что меченные нуклеотиды сильно влияют на процессивность экзонуклеазы. Другими ограничениями данного способа являются слипание нуклеотида(ов) с биотиновой гранулой, используемой для иммобилизации фрагмента полинуклеотида, причем в результате нуклеотидный поток не соответствует фазе, неэффективность и ограничение длительности процесса начального ферментного мечения и возбуждение.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на реализации того, что последовательность полинуклеотидамишени можно определить, измеряя конформационные изменения в ферменте, который связывается с полинуклеотидом-мишенью и передвигается по ней, проявляя свое действие. Степень происходящего конформационного изменения различается в зависимости от того, какой отдельный нуклеотид на мишени находится в контакте с ферментом.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения способ определения последовательности полинуклеотида включает стадии (б) взаимодействия полинуклеотида-мишени с ферментом, способным к взаимодействию с полинуклеотидом, и передвижению по нему в условиях, достаточных для индуцирования ферментной активности; и (ίί) обнаружения конформационных изменений в ферменте по мере того, как фермент передвигается по полинуклеотиду;

причем фермент содержит присоединенную флуоресцентную молекулу, флуоресцентные характеристики которой изменяются по мере того, как фермент претерпевает конформационное изменение, а полинуклеотид-мишень не содержит флуоресцентную молекулу, и степень проходящего конформационного изменения указывает на то, с каким нулеотидом на указанной мишени контактирует фермент.

- 1 006702

В предпочтительном варианте воплощения изобретения фермент представляет собой полимеразу, взаимодействующую с мишенью в процессе удлинения комплементарной цепи. Фермент, как правило, иммобилизуют на твердом носителе для локализации реакции в пределах определенной области. Согласно еще одному варианту, на твердом носителе иммобилизуют множество ферментов, с использованием которых осуществляют способ.

В еще одном предпочтительном варианте воплощения изобретения фермент представляет собой геликазу или праймазу.

Согласно второму варианту воплощения настоящего изобретения фермент содержит одну или более присоединенную метку, способную к взаимодействию с флуоресцентной молекулой, а степень взаимодействия зависит от конформационного изменения в ферменте. Как правило, метка является донором энергии и стадию (и) указанного способа осуществляют с помощью изменения переноса энергии между флуоресцентной молекулой и меткой. Предпочтительно, стадию (и) осуществляют с помощью конфокального микроскопа. В еще одном варианте стадию (и) осуществляют с помощью визуализации флуоресценции. Еще в одном варианте осуществления стадию (и) осуществляют с помощью изменения эффекта поляризации, являющегося результатом изменившихся характеристик флуоресцентной молекулы. В другом варианте стадию (и) осуществляют с помощью флуоресцентной поляризационной анизотропии.

Согласно еще одному варианту воплощения настоящего изобретения для осуществления указанного выше способа используется твердый носитель, содержащий по меньшей мере одни иммобилизованный фермент, способный к взаимодействию с полинуклеотидом-мишенью и передвижению по нему, помеченный одной или несколькими детектируемыми метками. Предпочтительно, ферментом является полимераза, а метка является флорофором.

Согласно другому аспекту, твердый носитель, как описано выше, содержит множество иммобилизованных ферментов.

Также настоящее изобретение относится к системе для определения последовательности полинуклеотида, включающая описанный выше твердый носитель и устройство для обнаружения метки.

Настоящее изобретение имеет несколько преимуществ перед общепринятыми технологиями секвенирования. Как только полимераза начинает свой цикл элонграции полинуклеотида, к полимеразе направляются несколько тысяч нуклеотидов, прежде чем оно отсоединится от цепи. Кроме того, некоторые специфические полимеразные системы способны сами закрепляться и связываться с матричным полинуклеотидом через скользящий-фиксатор (например, полимераза III), охватывающий матричную молекулу, или с помощью молекулярного крюка (например, комплекс Т7:тиреодоксин), частично охватывающего матрицу.

Изобретение также позволяет секвенировать десятки килобаз (кб) или больше за один прием со скоростью сотен пар оснований в секунду. Это является результатом секвенирования отдельного фрагмента ДНК. Преимуществом секвенирования отдельного фрагмента ДНК является то, что скорости секвенирования определяются используемой ферментной системой, а не косвенными суммарными реакциями, и, следовательно, являются более высокими. Столь важной, как и высокая скорость, является возможность секвенирования больших фрагментов ДНК. Это будет значительно уменьшать количество субклонирований и число перекрывающихся последовательностей, необходимых для сборки мегабазовых сегментов информации о секвенировании.

Дополнительным преимуществом подхода с отдельным фрагментом является устранение проблем, связанных с удалением опасных отходов, таких как акриламид, которые в настоящее время досаждают при работах по секвенирования.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой схему, поясняющую установку конфокального микроскопа для применения в изобретении.

Фиг. 2 иллюстрирует кривую, полученную после переноса флуоресцентной резонансной энергии с пиками, каждый из которых представляет детекцию конкретного нуклеотида.

Описание изобретения

Способ секвенирования полинуклеотида включает анализ конформационных изменений между ферментом и полинуклеотидом-мишенью.

Используемый в данном описании термин полинуклеотид следует интерпретировать в широком смысле, и он включает ДНК и РНК, в том числе, модифицированные ДНК и РНК, а также другие гибридизирующиеся полинуклеотидоподобные молекулы, например пептиднуклеиновую кислоту (ΡΝΑ).

Фермент может представлять собой полимеразу, и конформационное изменение вызывается, когда полимераза включает нуклеотид в растущую цепь, комплементарную полинуклеотиду-мишени. Обнаружено, что конформационное изменение будет разным для каждого из различных нуклеотидов А, Т, О или С, и, следовательно, измерение изменения будет указывать, какой включен нуклеотид.

С другой стороны, фермент может представлять собой любой фермент, участвующий во взаимодействии с полинуклеотидом, например геликазу, праймазу и голофермент. По мере того как фермент

- 2 006702 передвигается по пополинуклеотиду, его конформация будет изменяться в зависимости от того, какой нуклеотид на мишени вступает с ним в контакт.

Одним из способов обнаружения конформационного изменения в ферменте является измерение резонансного переноса энергии между подходящей меткой-донором энергии и подходящей меткойакцептором энергии. В одном примере донор и акцептор - каждый связываются с ферментом, и конформационное изменение в ферменте, вызываемое его взаимодействием с полинуклеотидом-мишенью, изменяет относительное расположение меток. Различия в расположении отражаются в полученном переносе энергии и являются характеристикой определенного нуклеотида, контактирующего с ферментом. С другой стороны, одна метка может располагаться на ферменте, а другая - на нуклеотиде мишени или на нуклеотиде, включенном в цепь, комплементарную мишени.

Использование флуоресцентного резонансного переноса энергии (РКЕТ) является предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения. Такой метод позволяет измерять расстояния по шкале 2-8 нм и опирается на зависимый от расстояния перенос энергии между донорным флуорофором и акцепторным флуорофором. Метод не только имеет превосходные возможности в отношении статических колокализаций, но также дает информацию о динамических изменениях расстояния или взаимной ориентации двух флуоро-форов в случае внутримолекулярного и межмолекулярного РКЕТ. Со времени первых измерений переноса энергии между отдельным донором и отдельным акцептором (отдельная пара РКЕТ) (На е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А, 1996; 96:893) такой перенос используют для исследования лигандрецепторной колокализаций (8с1ш1х е! а1., ВюрНуъ. 1., 1998; 74:2223), для зондирования структурных флюктуации белков в равновесном состоянии и взаимодействий фермент-субстрат при катализе (На е! а1., 1999, цит. выше) и для идентификации конформационных состояний и субпопуляций отдельных диффундирующих молекул в растворах. Все указанные параметры представляются пригодными в контексте настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также можно осуществить с использованием методов измерений, для которых требуется только одна метка. Любая система, которая способна измерять изменения в локальном окружении фермента на уровне отдельной молекулы, является подходящим вариантом для осуществления настоящего изобретения. Различные свойства отдельных флуоресцирующих зондов, присоединенных к ферменту, передвигающемуся по полинуклеотиду с проявлением своего действия, и/или его субстрату(ам), можно использовать, в контексте настоящего изобретения, для получения данных о параметрах в или в непосредственной близости от ферментной системы/молекулярного окружения, специфичных для события включения нуклеотида. К таким параметрам относятся, но не ограничиваются перечисленным, молекулярные взаимодействия, ферментативная активность, кинетика реакций, конформационная динамика, свобода перемещения молекул и изменения в активности и химической и электростатической обстановке.

Например, переходные диполи поглощения и испускания отдельных флуорофоров можно определить с использованием поляризованного возбуждающего света или путем анализа поляризации испускания, или тем и другим способом. Временное изменение ориентации диполя присоединенной жестко или связанной вращательно-размытой связью метки может сообщить об угловом перемещении макромолекулярной системы или одного из ее звеньев (^агкйате е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А, 1998; 95:8034) и, следовательно, может быть использовано в настоящем изобретении.

Для специалистов в данной области техники очевидно, какие метки можно использовать в настоящем изобретении. Предпочтительно, метка является флуоресцетной меткой, такой, какая описана в Хие е! а1., №1иге. 1995; 373:681. С другой стороны, можно использовать флуоресцирующие ферменты, такие как белок с зеленой флуоресценцией (Ьи е! а1., 8с1еисе, 1998; 282:1877).

Однако предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения включает применение небольших флуоресцирующих молекул, которые ковалентно и в определенном месте присоединяются к ферменту, передвигающемуся по полинуклеотиду, например тетраметилродамин (ТМК).

Если в изобретении используют флуоресцентные метки, на их обнаружение может повлиять фотообесцвечивание, вызываемое повторным воздействием возбуждающих длин волн. Одним из возможных способов избежать такой проблемы является осуществление многих последовательных реакций, но с детектированием флуоресцентных сигналов от только нескольких в один момент времени. С использованием такого итеративного процесса можно определить правильную последовательность сигналов и определить полинуклеотидную последовательность. Например, при иммобилизации множества ферментов на твердом носителе и контактировании их с полинуклеотидом-мишенью реакции по секвенированию должны начинаться приблизительно в одно и то же время. Возбуждение и детекцию флуоресценции можно локализовать на части всех реакции в течение времени, пока фотообесцвечивания не становится очевидным. В это время возбуждение и детекция могут быть перенесены на другие части реакций для продолжения секвенирования. Так как все реакции относительно одновременны по фазе, правильная последовательность должна определяться с минимальной повторной сборкой.

Метки можно присоединить к ферментам с помощью ковалентной или другой связи. Ряд подходов можно использовать для присоединения меток к ферменту. Стратегии включают использование сайтнаправленного мутагенеза и мутагенеза неприродных аминокислот (Аи1йоиу-СаЫ1 е! а1., Тгеибк ВюсНет.

- 3 006702

8с1., 1989; 14:400) для введения цистеиновых и кетонных рукояток для специфического и ортогонального мечения белков красителями (Сотшзй е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8сг И8А, 1994; 91:2910).

Другим предугадываемым вариантом, используемым для мечения передвигающегося по полинуклеотиду фермента, является гибридизация белка зеленой флуоресценции (СЕР) с процессивным ферментом (например, полимеразой) с помощью методов молекулярного клонирования, известных в технике (Р1егсе, ЭЛУ., е! а1., Иа!иге, 1997; 388:338). Показано, что такой метод применим для измерения конформационных изменений (М1уа^ак1 е! а1., Иа1иге, 1997; 388:882) и локальных изменений рН (Ь1ор15 е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8οΐ. И8А, 1998; 95:6803).

Для специалистов в данной области техники будут очевидны носители, подходящие для применения при иммобилизации ферментов. Можно использовать силиконы, стекла и керамические материалы. Носитель, как правило, будет иметь плоскую поверхность. Иммобилизацию ферментов можно осуществить с помощью ковалентной связи или другими способами. Например, можно использовать ковалентные линкерные молекулы для присоединения к подходящим образом приготовленному ферменту. Способы присоединения известны специалистам в данной области техники.

На твердом носителе можно иммобилизовать один или несколько ферментов. В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения присоединяют множество ферментов. Это позволяет контролировать многие отдельные реакции и может быть полезным для преодоления проблем фотообесцвечивания, описанных выше.

Различные методы можно использовать для измерения конформационных изменений в ферменте. Резонансный перенос энергии можно измерить методами резонанса поверхностных плазмонов (8РВ) или флуоресцентного резонанса поверхностных плазмонов.

Однако, можно рассматривать другие методы, которыми измеряют изменения в излучении через взаимодействие с меткой или трансдуктором энергии, например спектроскопию флуоресценции полного внутреннего отражения (ΤΙΕΒ), ослабленного полного отражения (АТВ), нарушенного полного отражения (ЕТВ), рефлектометрии по углу Брюстера, диффузного полного внутреннего отражения (8ΤΙΒ), микроскопию и спектроскопию по визуализации времени жизни флуоресценции (ЕЫМ8), флуресцентную анизотропию поляризации (ЕРА), флуресцентную спектроскопию или эллипсометрию исчезающей волны.

Теперь настоящее изобретение будет дополнительно пояснено с помощью приведенного далее примера со ссылкой на прилагаемые чертежи.

Пример

В данном примере используют конфокальную флуоресцентную установку, как показано на фиг. 1.

Если обратиться к фиг. 1, то установка состоит из сканирующего столика (1), способного сканировать с высоким разрешением по координатам X, Υ и Ζ, покровного стекла (2), являющегося частью системы микропроточной кюветы с входным отверстием (8) для введения комплекса праймера с матричным полинуклеотидом (4) и нуклеотидов помимо иммобилизованной (9) молекулы полимеразы (3) в буфере, и выходным отверстием (7) для отходов. Падающий свет от источника лазерного излучения (6) для возбуждения донора поступает через масляно-иммерсионный объектив (5).

Конъюгация белков

В данном эксперименте в качестве пары ЕВЕТ используют тетраметилродамин (ТМВ, донор) и Су5 (акцептор). Такую пару используют из-за хорошо разделяемых длин волн их возбуждения (>100 нм) и большого радиуса Фостера.

Используют ДНК-полимеразу Т7 от Иете Еид1аиб Вю1аЬз (содержащую 10000 Е/мл). Заменяют буфер в 50 мкл Т7 в УВазрш 500 (УВазрш) на 200 мМ натрийацетатный буфер, рН 4 (4 х 500 мкл), для того, чтобы удалить ΌΤΤ из буфера для хранения, который добавляют к ДНК-полимеразе Т7. Затем к 50 мкл ДНК-поли-меразы Т7 в замененном буфере добавляют 100 мкл натрийацетатного буфера, рН 4, и 50 мкл насыщенного водного раствора 2,2-дипиридилдисульфида. Затем полученную реакционную смесь оставляют на 110 мин, и отмечают поглощение при 343 нм. Наконец, заменяют буфер на 200 мМ Трис, рН 8, как ранее (4 раза по 500 мкл).

Присоединение красителя проверяют методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Су5-сукцинимидильный эфир (Мо1еси1аг РтоЬез) конъюгируют с ДНК-полимеразой ΤΜΒΤ7 в тех же условиях мечения, очищают и характеризуют, как описано выше.

Иммобилизация полимеразы

Покровные стекла дериватизируют Х-[(3-триметоксисилил)пропил]этилендиаминтриуксусной кислотой. Затем покровное стекло вклеивают в проточную кювету, что позволяет буферу непрерывно протекать над дериватизированной поверхностью стекла. Затем к буферу добавляют меченую полимеразу, и позволяют протекать над покровным стеклом, так что белок иммобилизуется на поверхности стекла.

Затем белки иммобилизуют на границе раздела стекло-вода с низкой плотностью так, чтобы в любой момент времени в объеме, возбуждаемом лазерным излучением, находилась только одна молекула. Лазерное излучение (лазер на ионах Аг, 514 нм, 15 мкВт, круговая поляризация) фокусируют в пятно 0,4 мкм с использованием масляно-иммерсионного объектива в эпииллюминационном устройстве на сканирующем предметном столике конфокального микроскопа. Излучение флуоресценции собирают с помо

- 4 006702 щью того же объектива, делят надвое разделителем дихроичного луча (длинный проход при 630 нм) и детектируют одновременно с помощью двух счетных элементов на лавинных фотодиодах (ΆΡΌ).

Фильтр, пропускающий полосу 585 нм, ставят перед донорным детектором; фильтр, пропускающий 650 нм, ставят перед акцепторным детектором. Так как спектральные интервалы во время детекции флуоресценции достаточно удалены от отсекаемой длины волны разделителя дихроичного луча, зависимость эффективности детекции от поляризации как в случае донорного сигнала, так и в случае акцепторного сигнала ничтожна. Показано, что поляризационным смещением из-за высокой околополевой апертуры (ΝΑ) объектива можно пренебречь (На е! а1., цит. выше).

Для того, чтобы получить время донорной и акцепторной эмиссии, можно использовать условия исследования акцепторного сигнала, описанные в На с1 а1., Арр1. Рйуз. ЬсЦ.. 1997; 70:782). Такая процедура способствут скринингу белков, меченных дважды: при отсутствии непосредственного возбуждения акцептора только белки, в которых происходит ТКЕТ, могут показать акцепторный сигнал. Как только белок скринирован, локализован и установлен под лазерным пятном, получают кривые зависимости от времени для донора и акцептора (общее время 5 мин). Время обнаружения продолжается до тех пор, пока все флуоресцентные метки на белке-мишени не будут фотообесцвечены.

Инициирование реакции

Синтезируют два олигонуклеотида с использованием обычных методов химии фосфорамидитов. Олигонуклеотид, обозначенный ПОСЛЕД. № 1, используют в качестве полинуклеотида-мишени, а олигонуклеотид, обозначенный ПОСЛЕД. № 2, используют в качестве праймера. Два олигонуклеотида взаимодействуют в условиях гибридизации с образованием комплекса мишень-праймер.

ΟΑΑΟΟΑΟΑΟΟΑΟΟΟΤΟΤΟΤΟΤΟΟΑΑΟΟΤΑΑΟΟΑΑΟΟΟΑΟΟΑΟΑΟΑΑΟΟΟΑΟΑΟ ПОСЛЕД. № 1

ΟΤΟΤΟΟΟΤΤΟΤΟΤΟΟΤΟПОСЛЕД. № 2

Затем инициируют реакцию посредством введения праймированной ДНК в проточную кювету со всеми четырьмя нуклеотидами (6ΟΤΡ, 6ΟΤΡ, 6ΑΤΡ и 6ΤΤΡ), присутствующими в концентрации 0,4 мМ. Проточную кювету поддерживают при 25°С с помощью реШет устройства.

Также используют систему, поглощающую кислород [50 мкг/мл глюкозооксидазы, 10 мкг/мл каталазы, 18% (мас./мас.) глюкозы, 1% (мас./об.) р-меркаптоэтанола], для того, чтобы продлить время жизни флуоресценции (Еипа!зи е! а1., ΝοΙιιιό, 1995; 37 4:555-559).

Результаты ЕКЕТ-анализа

В более ранних исследованиях определены источники мерцания, фотообесцвечивания и пики триплетного состояния (На е! а1., СЬет. Ρίπ., 1999; 247:107-118), которые все могут служить помехами основополагающим изменениям в эффективности ΕΡΕΤ из-за изменений в расстоянии между флуорофорами в результате конформационных изменений. После вычитания фонового сигнала из временных донорной и акцепторной кривых, как описано в На е! а1., 1999 (цит. выше), применяют средний фильтр с усреденением по пяти точкам для удаления триплетных пиков. Далее, во временных кривых не учитываются полученные точки, показывающие одновременную темновую скорость счета на обоих детекторах из-за случаев донорного мерцания.

Величину донорного сигнала, извлеченного после акцепторного фотообесцвечивания, соотносят с квантовыми выходами молекул и их полными эффективностями детекции.

Затем получают временную кривую эффективности переноса энергии. Временная кривая эффективности ΕΡΕΤ во время полимеризации цепи-мишени ПОСЛЕД. № 1 показана на фигуре 2. Из фигуры 2 следует, что последовательность соответствует комплементу последовательности ПОСЛЕД. № 1 (при чтении справа налево за вычетом той части, которая гибридизирует с праймерной последовательностью).

- 5 006702

Перечень последовательностей <110> МесИса1 В1озузЬетз ЬЫ.

<120> Способ секвенирования ДНК <130> ΚΕΡ06193ΜΌ <140> (пока не известны) <141> 2000-10-06 <150> 9923644.0 <151> 1999-10-06 <160> 2 <170> РаЬепЫп, версия 2.1 <210> 1 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: матричный полинуклеотид <400> 1 сааддададд асдсЬдЬсЬд ЬсдааддЬаа ддаасддасд ададааддда дад 53 <210> 2 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности:

праймерный полинуклеотид <400> 2 сЬсЬсссЬЬс ЬсЬсдЬс 17

- 6 006702

Claims (16)

1. Способ определения последовательности полинуклеотида, включающий стадии (ί) взаимодействия полинуклеотида-мишени по крайней мере с одним ферментом, способным к взаимодействию с полинуклеотидом и передвижению по нему в условиях, достаточных для индуцирования ферментативной активности; и (ίί) обнаружения конформационных изменений в ферменте, по мере того как фермент передвигается по полинуклеотиду;

причем фермент содержит присоединенную флуоресцентную молекулу, флуоресцентные характеристики которой изменяются по мере того, как фермент претерпевает конформационное изменение, а полинуклеотид-мишень не содержит флуоресцентную молекулу, и степень происходящего конформационного изменения указывает на то, с каким нуклеотидом на указанной мишени контактирует фермент.

2. Способ по п.1, где фермент представляет собой полимеразу.

3. Способ по п.1, где фермент представляет собой геликазу или праймазу.

4. Способ по любому из пп.1-3, где фермент иммобилизуют на твердом носителе.

5. Способ по п.4, где на твердом носителе иммобилизуют множество ферментов, с использованием которых осуществляют способ.

6. Способ по любому из пп.1-5, где фермент содержит одну или более присоединенную метку, способную к взаимодействию с флуоресцентной молекулой, а степень взаимодействия зависит от конформационного изменения в ферменте.

7. Способ по п.6, где метка является донором энергии и стадию (ίί) осуществляют с помощью измерения переноса энергии между флуоресцентной молекулой и меткой.

8. Способ по любому из пп.1-7, где стадию (ίί) осуществляют с использованием конфокального микроскопа.

9. Способ по п.8, где стадию (ίί) осуществляют с помощью визуализации флуоресценции.

10. Способ по любому из пп.1-8, где стадию (ίί) осуществляют с помощью измерения эффекта поляризации, являющегося результатом изменившихся характеристик флуоресцентной молекулы.

11. Способ по п.10, где стадию (ίί) осуществляют с помощью флуоресцентной поляризационной анизотропии.

12. Твердый носитель, содержащий по меньшей мере один иммобилизованный фермент, способный к взаимодействию с полинуклеотидом-мишенью и передвижению по нему, помеченный одной или несколькими детектируемыми метками, используемый для осуществления способа по п.1.

13. Твердый носитель по п.12, где фермент представляет собой полимеразу.

14. Твердый носитель по п.12 или 13, где метка представляет собой флуорофор.

15. Твердый носитель по любому из пп.12-14, содержащий множество иммобилизованных ферментов.

16. Система для определения последовательности полинуклеотида, включающая твердый носитель по любому из пп.12-15 и устройство для обнаружения метки.