KR20010022392A - 핵산 서열 분석 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 (ⅰ) 목적 폴리뉴클레오티드를 고체 지지체상에 고정된 폴리머라제 효소와, 폴리머라제 반응에 충분한 조건하에서 다른 뉴클레오티드와 반응시키고, (ⅱ) 방사선을 측정하여 목적 폴리뉴클레오티드의 상보성인 특정 뉴클레오티드의 결합을 측정하는 단계로 이루어진다.

Description

핵산 서열 분석{NUCLEIC ACID SEQUENCE ANALYSIS}
폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 능력은 과학적으로 매우 중요하다. 예를 들면, 인간 게놈 프로젝트는 인간 게놈 중에 암호화된 DNA의 3조 기초를 배치하고 배열하기 위한 대규모의 국제적인 노력이다. 완료시에, 생성되는 서열 데이타베이스는 생체의학연구의 비할데 없는 힘의 도구가 될 것이다. 이 프로젝트의 성공적인 완성의 주요 장해는 서열화 방법에서 사용되는 기술에 관한 것이다.
대규모 DNA 서열화에서 일반적으로 사용되는 주요방법은 연쇄정지방법이다. 이 방법은 처음에 생거(Sanger)와 쿨손(Coulson)에 의해 개발되었으며(Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sic, USA 1977 ; 74 : 5463-5467), 이 방법은 폴리머라제 반응에서 발생기 폴리뉴클레오티드 체인에 결합되어 있는 4개의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 디데옥시 유도체의 사용에 의존하고 있다. 결합 후에, 디데옥시 유도체는 폴리머라제 반응을 정지시키고, 이어서 생성물을 겔 전기영동으로 분리시키고, 특정 디데옥시 유도체가 체인에 결합된 위치를 나타내기 위하여 분석했다.
비록 이 방법이 널리 사용되고 있고, 신뢰할만한 결과를 줄지라도, 이 방법은 느리고, 노동집중적이고, 값비싼 방법으로 인식되고 있다.
다른 서열화 방법이 EP-A-0471732에 제안되어 있는데, 이 방법은 목적물에 상보성인 발생기 폴리뉴클레오티드 스트랜드에 뉴클레오티드의 결합을 알아내기 위한 분광검사수단이다. 이 방법은 다른 뉴클레오티드 중 하나만을 함유하는 유동물에 노출된 형판(template)과 프라이머의 고정 착체에 의존한다. 이어서, 분광검사기술을 사용해서 형판 카피의 폴리머라제 촉매성장에서 생기는 시간의존 신호를 측정했다. 상기 분광검사기술은 소실성 파장(evanescent wave field)에서 분석물의 변화를 측정하는 표면 플래즈몬 공명(SPR) 분광검사 및 형광측정 기술이다. 그러나, 이 방법의 한계로 카피 스트랜드의 크기가 성장할 때에, 신호의 절대 크기가 소실성 파장으로 부터 스트랜드의 이동에 기인해서 또한 성장하므로 증대를 검출하는 것을 더욱 어렵게해주는 것을 알 수 있다.
형광측정기술은 발생기 폴리뉴클레오티드 체인 성장시에 결합된 형광단으로부터 배경간섭을 증가시키는 결점이 있다. 체인이 성장할 때에, 배경 소음이 증가하여, 각 뉴클레이티드 결합 요구를 측정하는데 필요한 시간은 증가된다. 이것은 대형 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 방법의 사용을 심하게 제한시킨다.
그러므로, 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 속도를 현저하게 증가시키고, 복잡성을 줄이고, 현존하는 방법에 관련된 비용을 줄여주며, 자동화 방법에 의해서 행하는 것이 바람직한 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법을 개선시킬 필요가 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 SPR 분광검사를 사용하는 폴리뉴클레오티드 서열의 분석의 도해도이다.
도 2는 다른 뉴클레오티드 각각의 중합에 대해서 탐지한 다른 응답 신호를 설명한 것이다.
도 3은 이중 보호 뉴클레오티드 합성방법을 설명한 것이다.
본 발명은 뉴클레오티드를 발생기 폴리뉴클레오티드 스트랜드에 결합시킬 때에 일어나는 폴리머라제 효소에 있어서 구조 및/또는 질량 변화를 알아내기 위하여 전자기 또는 기타 방사선의 측정이 사용될 수 있다는 발견에 기초한 것이다.
본 발명에 따라서, 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 방법은 다음과 같은 단계로 이루어진다.
(ⅰ) 목적 폴리뉴클레오티드를 고체 지지체상에 고정된 폴리머라제 효소와, 폴리머라제 반응에 충분한 조건하에서 다른 뉴클레오티드와 반응시키고,
(ⅱ) 목적 폴리뉴클레오티드에 상보성인 특정 뉴클레오티드의 결합을 방사선을 측정하여 찾아낸다.
방사는, 고체 광학표면에서 광학응답의 변화가 표면에서 결합 상호작용을 나타내기 위하여 사용되는 표면감도 측정기술을 포함해서 다수의 기술을 사용하는 샘플에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 사용하는 기술도 소실성 파동 분광검사기술, 특히 표면 플래즈몬 공명(SPR) 분광기술이다.
본 발명의 구현예에서, 상기 방법에 사용된 뉴클레오티드는 3'위치에서 보호기, 그리고 임의로 폴리뉴클레오티드 스트랜드으로의 뉴클레오티드의 결합을 막아주는 5'위치에서의 보호기를 포함한다. 그러나, 보호기들은 결합이 일어나도록 허용해서 선택적으로 제거할 수 있다. 보호된 뉴클레오티드를 사용함으로써, 반응에 존재하는 뉴클레오티드 모두를 사용해서 상기 방법을 어떠한 시간에든지 수행할 수 있다. 보호기의 선택적인 제거는 결합된 각 뉴클레오티드의 검출을 보장해주는 어떤 방법으로든지 행한다. 그러므로, 상기 방법은 서열분석의 높은 속도를 성취하기 위하여, "실시간(real time)"에 기초하여 수행한다.
폴리뉴클레오티드를 서열화하는 본 발명의 방법은, 폴리머라제 효소, 목적 폴리뉴클레오티드 및 상보성 뉴클레오티드 사이의 운동 상호작용의 분석을 포함한다. 운동상호작용의 측정은 반응이 진행할 때에 일어나는 전자기 또는 기타 방사선의 변화 또는 흡수를 감시해서 수행한다.
본 명세서에 기재된 "폴리뉴클레오티드"는 넓게 해석되는 것으로, 다른 잡종 핵산과 같은 분자, 예를 들면 펩티드 핵산(PNA)은 물론, 변형 DNA 및 RNA를 포함하는 DNA 및 RNA를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 방법은, 전자기 방사를 적용하고, 표면 플래즈몬 공명 또는 핵자기 공명의 기술을 사용해서 수행한다. 그러나, 방사선에 있어서 변화를 측정하는 다른 기술, 예를 들면 총내부반사 형광(TIRF), 감쇠된 총반사(ATR), 좌절된 총반사(FTR), 브류스터 앵글 반사율 측정법(Brewster angle reflectometry), 분산 총내부반사(STIR) 또는 소실성 파동 타원편광반사측정법 (evanescent wave ellipsometry)에 의한 분광검사기술을 고려할 수 있다.
전자기 방사를 요구하는 것들 이외의 기술, 특히 화학루미네센스 (chemiluminescence) 등의 광화학 기술, 및 표면음향파(SAW) 기술 및 석영결정 마이크로 밸런스(QCM) 기술 등의 공명 시스템을 포함하는 중량측정기술을 상상할 수 있다.
표면 플래즈몬 공명(SPR) 분광검사가 바람직한 방법이며, 이 방법은 용액의 벌크상과 소실성 파동영역 사이에서 굴절율의 차이를 측정해서 용액의 특성들을 측정한다. 입사되는 단색광은 특정 각도에 연구 중인 샘플의 반대 측부상에서 고체 광학(센서 칩)표면을 반사하지 않는다. 상기 단색광은 매우 짧은 거리로 샘플에 걸치며, 표면에서 상호작용에 의해서 영향을 받는다.
적당한 센서 칩은 이 기술분야에 알려졌다. 전형적으로, 센서 칩은 광학적으로 투명한 물질(예, 유리) 및 얇은 반사필름(예, 은 또는 금)으로 구성된다. SPR 분광검사의 검토를 위해서 유럽특허 공고 제0648328호를 참조할 수 있다.
핵자기 공명(NMR) 분광검사는 또다른 바람직한 방법이며, 이 방법은 화합물의 자기특성을 측정한다. 화합물들의 핵은 적용한 자장과 고주파 방사선의 조합에 의해서 효과적으로 배향시킨다. 핵에 나타낸 에너지가 스핀상태 사이의 에너지 차이(적용한 자장의 방향과 병행하거나 또는 병행하지 않는 배향 사이의 차이)와 같아지면, 공명으로서 알려진 상태가 성취된다. 한 스핀 상태로부터 다른 스핀 상태까지의 변화와 관련된 에너지의 흡수 또는 후속적인 방출은 고주파 리시버에 의하여 검출할 수 있다.
본 발명의 방법의 중요한 면은 고체 지지체상에 고정된 폴리머라제 효소의 사용이다. 폴리머라제의 고정은 이 방법의 성공에 대해서 몇개의 중요한 잇점을 제공해준다. 첫째로, 가용성 분자 중에서 에너지 흡수측정과 관련한 랜덤 "소음"의 문제는 현저하게 감소되었다. 둘째로, 폴리머라제와 직접 관련되지 않은 어떤 기질(예, 뉴클레오티드)의 상호작용에서 생기는 소음의 문제는, 폴리머라제를 측정분야와 관련해서 특별히 한정된 영역내에 유지시킬 수 있으므로 감소된다. 이것은, 방사선의 변화를 측정하기 위하여 사용된 기술이 TIRF(여기서, 배경 형광은 발생기 체인이 성장할 때에 증가한다)의 경우와 같이, 형광의 측광을 요구할 경우에 특별히 적절하다. 또한, SPR 분광검사가 사용될 경우에, 폴리머라제 반응은 소실성 파장내에 유지되므로, 폴리뉴클레오티드의 사이즈에도 불구하고 정확한 측정을 할 수 있다. 최종적으로, 목적 폴리뉴클레오티드나 올리고뉴클레오티드 프라이머는 고체 표면에 비가역적으로 부착되므로, 표면을 재생하는 것이 비교적 간단해서 동일한 고정 폴리머라제를 사용해서 추가 서열화 반응을 일으키게 해준다.
고정은 이 기술계통에 알려진 표준방법을 사용해서 행할 수 있다. 특히, 표준아민결합방법을 사용하는 고정은, 덱스트란 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-활성화 표면에 리간드 결합 아민을 부착해서 행할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 폴리머라제는, 굴절율의 변화가 측정될 수 있는 센서표면에 근접해서 폴리머라제를 유지하는 SPR 센서칩 표면상에 고정된다. 광학센서에 생체분자를 고정시키기 위하여 사용되는 방법의 예는 EP-A-0589867, 및 Lofas et al., Biosens. Bioelectron. (1995) 10 : 813-822 에 기재되어 있다.
본 발명에 사용된 폴리머라제는 어떠한 기지의 유형이어도 좋다. 예를 들면, 폴리머라제는 DNA 의존 DNA 폴리머라제일 수 있다. 목적 폴리뉴클레오티드가 RNA분자일 경우, 폴리머라제는 RNA 의존 DNA 폴리머라제, 즉 역전사효소(reverse transcriptase), 또는 RNA 의존 RNA 폴리머라제, 즉 RNA 복제효소일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 폴리머라제는 Taq 폴리머라제이다. 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 폴리머라제는 대장균 폴리머라제 Ⅲ 전효소(holoenzyme)(McHenry, Ann. Rev. Biochem. 1988 ; 57:519), T7 폴리머라제 (Schwager et al., Methods in Molecular and Cellular Biology (1989/90); Vol. 1(4) : 155-159, 또는 대장균 티오레독신으로 착화시킨 박테리오파지 T7 유전자 5 폴리머라제 (Tabor et al., J. Biol. Chem. (1987); 262 ; 1612-1623)이다. 이들 폴리머라제 효소의 각각은 높은 신뢰도로 목적 폴리뉴클레오티드와 결합을 허용하므로 중합이 활발히 일어나지 않은 경우라도, 폴리머라제-폴리뉴클레오티드 착체를 유지해준다.
폴리머라제 Ⅲ 전효소(holoenzyme)는 프로세시브 효소(Processive enzyme)를 만들도록 기능하는 하기 3개의 서브어셈블리로 구성된다; (Ⅰ) 폴리머라제 서브유니트 α를 포함하는 폴리머라제 코어, (Ⅱ) DNA 주위에서 팔찌와 같은 구조로서 작용하는 β-다이머 서브유니트, 및 (Ⅲ) DNA 주위에서 β-다이머를 형성하기 위하여 ATP와 결합해서 가수분해시키기 위하여 사용하는 두개의 서브유니트, T 및 Y의 서브어셈블리.
서열화 방법의 제 1단계로서, 목적 폴리뉴클레오티드를 보합결합 (hybridising)/ 중합 완충액 중에서 적당한 프라이머와 접촉시킬 수 있다. 전형적으로, 완충액은 목적 폴리뉴클레오티드상에 존재하는 이차 구조물 분열(또는 용융)시키기 위하여 충분히 높은 온도에서 있게 될 것이다. 냉각 후에, 프라이머를 목적물상에서 그의 보체로 어닐링(annealing)시킨다. 이어서, 이 샘플을 고정된 폴리머라제와 접촉해서 목적 폴리뉴클레오티드/폴리머라제 착체를 형성할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 뉴클레오티드의 첨가를 조절해서 서로 다른 뉴클레오티드를 폴리머라제/목적 착체에 연속적으로 첨가할 수 있다. 예를 들면, dGTP를 첨가해서 폴리머라제/폴리뉴클레오티드 착체 위로 유동시킬 수 있고, 이어서 그의 결합을 찾아낸다. 미결합 dGTP는 반응부위로 부터 유동하며, 추가로 뉴클레오티드가 도입된다. 이러한 방법으로, 운동 상호작용의 탐지는 그 때에 존재하는 특정 뉴클레오티드와 서로 관련될 수 있으며, 그러므로 폴리뉴클레오티드 서열은 결정될 수 있다.
이 방법은 또한 존재하는 다른 뉴클레오티드 모두를 사용해서 수행할 수 있다. 이 방법을 성공적으로 수행하기 위하여, 뉴클레오티드가 적어도 3'위치, 바람직하기로는 3' 및 5'위치에서 보호기를 결합할 필요가 있다. 보호기는 감광성일 수 있고, 일정한 파장의 광선을 사용해서 활성분자를 방출해서 제거할 수 있다. 뉴클레오티드가 3' 및 5'위치에서 보호기와 결합하는 경우에, 보호기들은 이들의 분광흡수능에 기초해서 구별될 수 있는데, 즉 다른 보호기를 제거하지 않는 특정 파장의 광선을 사용해서 보호기 중 하나를 선택적으로 제거할 수 있어야 한다. 3'위치에서 보호기는 5'위치에서 보호기를 제거하기 위하여 요구되는 것 보다 긴 시간동안 사용될 광선을 요구하는 것이 또한 바람직하다. 이것은 분광 및 임시 수단 모두에 의해서 보호기를 구별되게 해준다.
일반적으로, 감광성 보호기는 200 내지 450㎜ 범위의 파장에서 광분해를 행한다. 보호기는 전형적으로 구조식 R1-[O-CO-]X(여기서, R1은 빛에 의해 변화를 일으키기 쉬운 기이고, X는 이탈기임)의 화합물로 부터 유도된다. 예를 들면, R1은 o-니트로벤질기이다. 특별히 바람직한 보호기는 WO-A-92/10092 및 WO-A-97/3915/에 기재된 o-니트로벤질보호기를 포함한다. 이들 기들은 니트로베라트릴옥시카보닐 (NVOC), 니트로피페로닐옥시카보닐(NPOC), α-메틸니트로베라트릴옥시카보닐 (MeNVOC), α-메틸니트로피페로닐옥시카보닐(MeNPOC) 및 1-피레닐메틸옥시카보닐 (PYMOC)을 포함한다.
적합한 3'보호기는 뉴클레오티드와 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물과의 반응에 의해서 형성될 수 있는 (4,5-디메톡시-2-니트로벤질)옥시카보닐기이다.
화학식(Ⅰ)
식 중, R는 적당한 에스테르화기, 예를 들면 메틸기이다.
이 보호기는 파장 360nm를 갖는 광선의 펄스에 의해서 선택적으로 제거될 수 있다.
5'위치에서 적합한 보호기는 하기 화학식(Ⅱ)의 1-(2-니트로페닐)에틸기이다.
화학식(Ⅱ)
식 중, R는 적당한 기능기, 예를 들면 할로겐이다.
이 보호기는 260nm의 파장에서 선택적으로 제거될 수 있다.
예로서, 이중 보호 뉴클레오티드를 준비된 목적 폴리뉴클레오티드 위에 놓으며(고신뢰성 폴리머라제 착체와 관련해서 유지됨), 단색광은 각 뉴클레오티드의 말단 포스페이트로 부터 보호기를 방출하기에 충분한 파장에서 폴리머라제 위로 유동시킬 수 있으며, 발생기 폴리뉴클레오티드 스트랜드로의 결합이 일어날 수 있다. 그러나, 3'위치에서 보호기가 결합된 채로 남아있으므로, 1개의 뉴클레오티드만이 결합된다. 그러므로, 운동 상호작용의 측정은 발생기 체인에 결합된 특정 뉴클레오티드에 대하여 정보를 제공할 것이다. 사용한 폴리머라제는 반응이 멈출 때에 목적물로 부터 쉽게 해리하지 않는 고신뢰성 폴리머라제일 수 있다. 다른 방법으로, 목적물로 부터 폴리머라제의 해리를 방지하기 위하여 경쟁 억제제를 사용할 수 있다.
결합된 뉴클레오티드를 측정한 후에, 단색광의 펄스를 폴리머라제 촉매부위내에서 보호기상에 집중해서 3'위치에서 보호기를 제거한다. 단색광은 5'위치에서 제거에 요구되는 것보다 긴 시간동안 펄스시킬 수 있으므로, 폴리머라제 착체에서 뉴클레오티드와 연합된 보호기만이 제거될 것이다. 이것은 폴리머라제 착체와 연합되지 않은 뉴클레오티드 첨가의 가능성을 줄여준다.
일단 3'보호기가 방출되면, 폴리머라제 반응은 추가 뉴클레오티드가 폴리머라제 반응부위에 도달할 때 까지 계속시킨다. 조절되지 않은 중합은 보호기의 제거에 필요한 광선의 펄스를 변경해서 방지한다.
상기한 바와 같이, 이중 보호 뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하는한, 이 방법은 3'위치에서만 보호기를 갖는 뉴클레오티드를 사용해서 또한 행할 수 있다. 이 경우에 있어서, 뉴클레오티드가 발생기 체인에 도입되는 3'위치에서 보호기가 없을 가능성을 줄여주는, 폴리머라제의 경쟁 억제제를 사용하는 것이 바람직하다. 폴리머라제의 적합한 경쟁 억제제는 카보닐디포스포네이트(COMDP)이다.
이하, 본 발명을 도면을 참조해서 실시예에서 구체적으로 설명한다.
광학표면센서로서 센서칩 CM5(연구등급, BIAcore AB)를 갖는 변형 BIAcore 2000 시스템(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)에 관해서 다음과 같은 분석을 행했다. 이 기구에 단일 샘플주입으로 4개의 셀에서 분석을 허용하는 집적 ㎛-유체 카트리지(IFC)를 장지했다.
폴리머라제의 제조
대장균 폴리머라제 Ⅲ 전효소는, 높은 염농도에서 전효소를 정제하기 위하여, 발릴-세파로즈상에서 소수성 상호작용 크로마토그라피를 사용하는 밀라드(Millard)등에 의한 방법 엔자이몰(Methods Enzymol. (1995) ; 262:22)에 따라서 제조했다. 정제 후에, 전효소를 키르케가드(Kirkegaard)등에 의한 Anal. Biochem. (1972); 50:122에 기재된 이온-여과 기술을 사용해서 농축시켰다.
폴리머라제의 고정
센서칩 표면에 폴리머라제의 고정은 죈슨 등의 Biotechniques(1991; 11 :620-627)에 따라서 수행했다. 간단하게 센서칩 환경은 헤피스 완충액(Hepes buffer)(10mM Hepes, 150mM Nacl, 0.05% 계면활성제 P20(BIAcore AB, Uppsala, Sweden), pH 7.4)과 평형시켰다. N-히드록시숙신이미드(수 중에서 0.1M)와 N-에틸-n'-(디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)(수 중에서 0.1M)의 같은 용적을 함께 혼합하고, 칩(CM5) 표면 전체에 주입해서 카복시메틸화 덱스트란을 활성화시켰다. 폴리머라제 Ⅲ 서브어셈블리 코어(160㎕ 500∪)를 10mM 아세트산 나트륨(100㎕, pH5)과 혼합하고, 이어서 활성 표면 전체에 주입했다. 최종적으로, 센서칩 표면상의 잔류 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 에타놀아민(35㎕, 수 중 1M, pH8.5)과 반응시킨 후, 비결합 폴리머라제를 표면으로 부터 세척해 버렸다. 고정과정을 25℃온도에서 헤피스 완충액(5㎕/분)을 연속적으로 유동시켜서 수행했다.
올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드를 표준 포스포아미디트 화학을 사용해서 합성했다. 서열번호 1로서 정의한 올리고뉴클레오티드를 목적 폴리뉴클레오티드로서 사용했고, 서열번호 2로서 정의한 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용했다.
CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG 서열번호 1
CTCTCCCTTCTCTCGTC 서열번호 2
2개의 올리고뉴클레오티드를 보합결합 조건하에서 반응시켜서 목적-프라이머 착체를 형성했다.
이어서, 준비한 DNA를 SS DNA 결합 단백질 21㎍을 함유하는 완충액(20mM Tris-HCl, pH7.5, 8mM MgCl2, 40%(v/v)글리세롤, 5mM 디티오트레이톨(DDT), 40㎍ 소혈청 알부민)중에 현탁시키고, 팔찌와 같은 구조체(β-다이머 1.6pmol 및 γ서브유니트 195fmol)를 형성하기 위하여 DNA PO1 Ⅲ 서브어셈블리가 필요했다. 0.5mM ATP를 60μM 카보닐디포스네이트(COMDP)와 함께 존재시켰다. 이 반응에서, γ서브유니트는 분자 매치메이커(matchmaker)로서 작용해서 ATP를 가수분해해서 β-다이머 서브유니트를 DNA상에 매치시켜서 폴리머라제 서브어셈블리를 형성한다(Studwell et al, UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. New Ser. 1990 ; 127:153).
이어서, 준비한 DNA/서브어셈블리 착체를 센서칩 표면상의 폴리머라제 Ⅲ 위에 유속 5㎛/분으로 주입하고, γ-서브유니트의 작용에 의해서 폴리머라제에 결합되게 한다.
이 실험에서, PolⅢ을 준비한 DNA에 결합시키기 위해서 마그네슘 및 ATP가 필요하다. 그러나, 마그네슘은 또한 교정 3'-5' 엑소뉴클리아제 작용에 의한 프라이머의 제거를 촉진시킨다. 이 문제는 폴리머라제 작용의 경쟁 억제제인 카보닐디포스포네이트를 포함해서 회피할 수 있다(이 특별한 문제를 회피하기 위하여 3'-5' 엑소뉴클리아제 작용이 없는 PolⅢ이 사용될 수 있다)
60μM 카보닐디포스포네이트의 연속적인 유동을 칩표면에서 유지해서, 엑소뉴클리아제 작용이 목적 DNA로 부터 프라이머가 제거되는 것을 방지해준다.
2개의 보호기를 결합하는 뉴클레오티드
각 뉴클레오티드(dCTP, dTTP, dGTD 및 dATP)는 도 3에 나타낸 바와 같이 5'위치에서 1-(2-니트로페닐)에틸 보호기를, 그리고 3'위치에서 (4,5-디메톡시-2-니트로벤질) 옥시카보닐 보호기를 가졌다. 이중 보호 뉴클레오티트의 합성은 다음과 같이 행했다.
단계 1 : (4,5-디메톡시니트로벤질)옥시카보닐-뉴클레오시드 트리포스페이트의 합성
dGTP, dCTP 및 dTTP에 대해서 동일한 전반적인 방법을 사용했다. dATP 디하이드레이트(0.4m㏖)과 4ㅡ5-디메톡시-2-니트로페닐히드라존[6-니트로베르알데히드를 우튼(Wotton) 및 트렌탐(Trentham)의 방법, Photochemical Probes in Biochemistry(Nielsen, P.E.Ed,) NATO ASI Ser. C, Vol. 272, p277-296(1989)에 의해서 클로로포름 중에서 히드라진 모노하이드레이트로 처리하여 합성함] 900㎎(4m㏖)으로 부터 새로이 제조한 4,5-디메톡시-2-니트로페닐디아조메탄 약 3m㏖의 혼합물을 어두운 곳에 40시간 동안 실온에서 DMSO 15㎖ 중에서 교반시켰다. 클로로포름/메타놀(5:1v/v) 용매계에서 TLC에 의한 반응의 감시결과 바구니 뉴클레오티드에 대응하는 Rf0.54를 갖는 점이 나타났다. DMSO, 미반응 디아조화합물, 및 낮은 극성을 갖는 반응 생성물을 에테르 60㎖로 반복적으로 추출해서 제거했다. 다른 물질 중에서도 미반응 뉴클레오티드 및 목적 생성물을 함유하는 잔류 물질을 최소량의 클로로포름에 용해시키고, 실리카 컬럼(3×30㎝) 플래쉬크로마토그라피로 분리시켰다. 100% 클로로포름 및 메탄올/클로로포름(95:5 v/v)을 사용하는 용출로 컬럼으로 부터 4,5-디메톡시-2-니트로페닐디아조메탄의 소수성 부산물을 제거했다. 분류물을 회전증발기에서 건조시켰다. 이어서, 바구니 생성물 78㎎을 동결건조시켰다.
전체 수율은 45%이였다. 3'보호 4,5-디메틸옥시-2-니트로벤질옥시카보닐 dATP를 조생성물로 부터 예비 역상 HPLC에 의해서 고순도로 직접 단리시켰다.
단계 2 : 3' 4,5-디메톡시-2-니트로벤질옥시카보닐 보호 dATP에 5' 1-(2-니트로페닐)에틸기의 부가
4,5-디메톡시-2-니트로벤질 옥시카보닐 5'dATP(0.4m㏖)과 2-니트로아세토페논의 히드라존(2-니트로아세토페논을 에타놀 중의 히드라진 모노하이드레이트로 처리해서 합성했음) 716.7㎎(4m㏖) 및 워커(Walker)등의 방법(Method Enzymol. 1989., 172: 288-301)에 의해서 클로로포름 20㎖ 중의 MnO2(90%) 2.9g(30m㏖)의 혼합물을 어두운 곳에서 40시간 동안 실온에서 DMSO 15㎖ 중에서 교반시켰다. 클로로포름/메타놀(5:1v/v) 용매계에서 TLC에 의해 반응을 모니터링한 결과, 4,5-디메톡시-2-니트로벤질 옥시카보닐 5'dATP의 1(2-니트로페닐)에틸 에스테르의 축형의 2개의 부분입체이성질체 및 적도형의 2개의 부분입체이성질체에 각각 대응하는, Rf0.68 및 Rf0.58을 갖는 한쌍의 점이 나타났다. DMSO, 미반응 디아조화합물 및 낮은 극성을 갖는 반응 생성물을 에테로 50㎖로 반복해서 추출해서 제거했다.
다른 물질 중에서, 미반응 4,5-디메톡시-2-니트로벤질옥시카보닐 5'dATP 및 목적 이중보호 dATP를 함유하는 잔류물질을 최소량의 클로로포름 중에 용해시키고, 실리카컬럼(3×30㎝) 플래쉬 크로마토그라피에 의해서 분리시켰다. 100% 클로로포름을 사용하는 용출로 컬럼으로부터1-(2-니트로페닐)디아조에탄의 소수성 부산물을제거했다. 생성물을 회전증발기에서 건조시켰다. 동결건조해서 바구니 화합물 74㎎을 얻었다. 전체 수율은 57% 이였다.
각 뉴클레오티드 0.2mM가 중합완충액(1mM Tris-HCL, pH8.8, 5mM KCl, 0.15mM MgCl2, 0.01%(w/v)젤라틴) 중에 존재했다.
DNA 서열화
도 1은 센서 표면에 고정폴리머라제 효소(3)를 갖는 센서칩(2)에 전자기방사(1)를 적용하는 수단, 셀에 다른 뉴클레오티드를 도입하기 위한 입구(4) 및 셀에 단색광을 펄싱하기 위한 두개의 집중 어셈블리(5) 및 (6)를 갖는, SPR 감응시스템 및 유체 셀(7)을 나타낸 것이다.
서로 다른 뉴클레오티드를 온도 25℃ 및 데이타수집속도 10㎐에서, 유속 30㎕/분에서 유체셀(7)에 도입시킨다. 뉴클레오티드가 집중어셈블리(5)를 통과하므로, 파장 260㎚에서 단색광은 펄스되어 5'위치에서 보호기를 제거한다. 이어서, 뉴클레오티드를 센서칩(2)위로 흐르게 하고, β-다이머 서브어셈블리에 의해서 적소에 유지된 목적 폴리뉴클레오티드/폴리머라제 착체(3)와 접촉시킨다. 프라이머 서열상에서 3'위치는 자유롭게 반응하므로, 뉴클레오티드가 목적 폴리뉴클레오티드 상의 뉴클레오티드의 보체와 결합할 때에 중합이 일어날 수 있다. 이어서, 이 결합은 SPR장치의 단색 P-편광에 의해 알아낼 수 있다. 결합된 뉴클레오티드는 3'위치에서 보호기를 가지므로, 중합은 더 일어나지 않는다. 이어서, 파장 360㎚의 단색광을 중합 위치에서 집중어셈블리(6)에 의해서 펄스시킨다. 유체셀에서 높은 유속은, 폴리머라제에 결합하지 않은 뉴클레오티드가 그의 3'보호기가 해방되도록 충분한 에너지가 흡수되기 전에 셀로 부터 제거되는 것을 보장해준다.
일단 3'보호기가 중합된 뉴클레오티드로 부터 해방되면, 추가 중합이 일어날 수 있다.
도 2는 검출될 발생기 체인에 결합한 각 뉴클레오티드로 행한 서열화 실험에서 얻은 결과를 나타낸 것이다. 결과는 서열번호 1의 것에 상보하는 서열을 나타냈다.

Claims (29)

  1. 다음과 같은 단계, 즉 (ⅰ) 목적 폴리뉴클레오티드를 고체 지지체상에 고정된 폴리머라제 효소와, 폴리머라제 반응에 충분한 조건하에서 다른 뉴클레오티드와 반응시키고, (ⅱ) 목적 폴리뉴클레오티드에 상보성인 특정 뉴클레오티드의 결합의 결과로서 생기는 효과를 측정하는 단계로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 서열화 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 단계 (ⅱ)의 효과를 방사선을 측정해서 측정하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 결합이 탐지될 때까지 서로 다른 뉴클레오티드로 차례차례로 행하고, 이어서 반복하는 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단계 (ⅰ)를 존재하는 뉴클레오티드 모두로 행하는 방법.
  5. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 뉴클레오티드가 중합반응 후 제거되는 3'보호기로 이루어지는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 보호기를 펄스시킨 단색광에 의해서 선택적으로 제거할 수 있는 방법.
  7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 뉴클레오티드가 트리포스페이트 체인의 말단 포스페이트기에서 추가 보호기로 이루어지고, 이 추가 보호기를 3'보호기를 제거하기 전에 제거하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 추가 보호기를 3'보호기를 제거하기 위해 필요한 조건과 다른 조건하에서 펄스된 단색광에 의해서 선택적으로 제거할 수 있는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 추가 보호기를 3'보호기를 제거하기 위해 필요한 기간과 다른 기간 동안 단색광을 펄스해서 제거하는 방법.
  10. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (ⅰ)가 추가로 폴리머라제 효소의 경쟁 억제제를 도입하는 것으로 이루어지는 방법.
  11. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (ⅰ)의 목적 폴리뉴클레오티드가 β2다이머 착체에 의해서 폴리머라제 효소에 결합되는 방법.
  12. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리머라제가 대장균 DNA 폴리머라제 Ⅲ 또는 T7 폴리머라제인 방법.
  13. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리머라제가 Taq 폴리머라제인 방법.
  14. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리머라제가 역전사효소 인 방법.
  15. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계(ⅱ)가 시간에 따른 응답 신호의 변화를 측정하는 것으로 이루어지는 방법.
  16. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 방사가 전자기 방사인 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 전자기 방사가 적외선 스펙트럼내에 있는 방법.
  18. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계(ⅱ)가 표면 플래즈몬 공명을 사용하는 것으로 이루어진 방법.
  19. 제 16항에 있어서, 전자기 방사가 고주파 스펙트럼내에 있는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 뉴클레오티드의 결합을 NMR를 사용해서 측정하는 방법.
  21. 상기 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 DNA인 방법.
  22. 그 위에 고정된 폴리머라제 효소로 이루어진 센서칩.
  23. 3'위치 및 트리포스페이트 체인의 말단 포스페이트기에서 보호기로 이루어지고, 두개의 보호기가 다른 파장의 단색광에 의해 제거될 수 있는 뉴클레오티드.
  24. 제 23항에 있어서, 보호기가 하기 구조식의 화합물에서 유도되는 뉴클레오티드.
    R1-[O-CO-]X
    식 중, R1은 빛에 의해 변화를 일으키기 쉬운 기이고, X는 이탈기이다.
  25. 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 3'위치에서 보호기가 o-니트로벤질옥시카보닐기인 뉴클레오티드.
  26. 제 23항 내지 제 25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 말단 포스페이트에서 보호기가 o-니트로벤질기인 뉴클레오티드.
  27. 제 23항 내지 제 26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 3'위치에서 보호기가 (4,5-디메톡시-2-니트로벤질)옥시카보닐기인 뉴클레오티드.
  28. 제 23항 내지 제 27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 말단 포스페이트에서 보호기가 1-(2-니트로 페닐)에틸기인 뉴클레오티드.
  29. 광학 센서칩, 광원, 영상장치 및 광전 변환기로 구성되고, 상기 센서 칩이 제22항에 정의한 것과 같은 폴리뉴클레오티드의 서열화 장치.
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