WO2007007519A1 - エバネッセント光を利用する物質情報取得方法と物質情報測定装置、並びに塩基配列決定方法と装置 - Google Patents

エバネッセント光を利用する物質情報取得方法と物質情報測定装置、並びに塩基配列決定方法と装置 Download PDF

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evanescent light
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Yoichi Katsumoto
Noriyuki Kishii
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Definitions

  • the present invention relates to a technology for acquiring substance information using evanescent light. More specifically, the present invention relates to a technique for measuring or determining the structure, form, interaction, base sequence, and the like of a substance fixed to an interface, using evanescent light as fluorescence excitation light.
  • Electron microscopes and the like have problems such as measurement in vacuum and the need for vapor deposition, and it is impossible to measure dynamic changes in any state, for example, in liquid It is not possible to see the displacement caused by the structural change of protein or DNA. Only one atomic force microscope (AFM; Atomic Force Microscope) is capable of this, but has problems such as measurement accuracy and measurement accuracy depending on individual probes being difficult. Also, in the case of capturing a dynamic change with a short time scale, AFM, which requires several tens of minutes of measurement time to obtain an image, can not be applied.
  • AFM Atomic Force Microscope
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-294631 discloses a technique for observing the structure of a chromosome, the arrangement of genes on the chromosome, and the state thereof by irradiating evanescent light to a fluorescently labeled dye.
  • the present invention provides a novel technology for acquiring information on the position and displacement of a substance using the evanescent light illumination technology, in particular, information on the position and displacement on the nanoscale level, and utilizing these information. Its main purpose is to provide new technologies to accurately detect or measure the interactions, states, dynamics, etc. of substances.
  • the near field of the interface on the opposite side of the incident light traveling side Evanescent light is generated.
  • the present invention takes advantage of the fact that the intensity of this evanescent light decays exponentially with the distance from the interface.
  • a detection substance is present in an interface region capable of generating evanescent light, and the detection substance is determined based on the fluorescence intensity derived from the detection substance excited by the evanescent light.
  • the detection substance is present in the vicinity of the interface (the interface on the opposite side to the incident light side) which is the irradiation range of evanescent light, (2) evanet generated at the interface Using cent light as fluorescence excitation light, (3) A fluorescent color artificially labeled on a detection substance: The fluorescence possessed by the detection substance itself is excited by evanescent light, and detection is carried out from the intensity of the excitation fluorescence.
  • the main feature is to obtain location information of the substance. This position Information can be obtained at the nanoscale level, and it is useful information to investigate interactions between substances and states and dynamics of substances.
  • detection substance means a substance to be acquired as substance information, and is in a state of being temporally or temporarily present in an interface region where evanescent light is generated, for example, It is used while being fixed or held at the interface.
  • positional information is the distance information between the interface and the position at which the fluorescent substance which is artificially labeled on the detection substance or the fluorescence generation site of the detection substance is present (hereinafter referred to as “the fluorescence generation position”) Includes both information about changes in information.
  • the displacement information of the detection substance when the physical or chemical conditions of the reaction site where the detection substance is present change (for example, when it is changed by an artificial operation), before and after such a change of conditions.
  • the displacement information of the detection substance By acquiring the fluorescence intensity information of the detection substance, it is possible to know the displacement information of the detection substance, more specifically, the degree of change in the distance of the interfacial force of the fluorescence generation position of the detection substance.
  • this displacement information indicates that the physical or chemical condition change is caused by the structure or substance of the substance. It is information on the impact on the form.
  • the present invention by monitoring the intensity of excitation fluorescence in real time, it is possible to track the temporal change of the positional information of the detection substance.
  • the position data of the substance is determined by correcting the data relating to the measured fluorescence intensity based on standard data acquired in advance.
  • the reliability of measurement data may be improved.
  • the standard data is, for example, the required number of fluorescent labeling substances whose molecular length is accurately determined, and the necessary number of fluorescent labeling substances are prepared in advance, and fluorescence intensity data which changes according to the difference in the distance of the interface of these fluorescent labeling substances It is. This fluorescence intensity data accurately reflects the fluorescence intensity according to the distance from the interface.
  • a light source an interface from which the light emitted from the light source can generate evanescent light, and a fluorescence intensity excited by the evanescent light and emitted from a detection substance present at the interface
  • Fluorescence detection unit for detecting the fluorescence intensity, and the fluorescence intensity information and the distance from the interface
  • a substance information measuring device comprising at least an analysis unit for automatically analyzing a position or Z and a displacement of a detection substance in the reaction field based on the evanescent light attenuation factor information correlated with.
  • this apparatus may be provided with a reaction field condition control unit capable of changing the physical or chemical conditions of the reaction field facing the interface opposite to the side on which the light emitted from the light source travels.
  • the reaction site condition control unit of the present apparatus is a means capable of artificially controlling the physical or chemical conditions of the reaction site, and, for example, temperature, pH, pressure, substance concentration, salt concentration, solvent type And the like, means capable of freely operating the conditions such as, means for applying an electric field to the reaction field, and means capable of selectively operating these means freely.
  • a procedure for retaining a protein that undergoes a structural change when bound to a base or base pair of a nucleic acid strand in an interface region capable of generating evanescent light, the nucleic acid strand and the protein And the step of continuously measuring the intensity of the fluorescence derived from the protein excited by the evanescent light in time series, the fluorescence intensity data obtained by this measurement, and the type of base or base pair.
  • Proteins that can be adopted in the present method can be selected from those having a property of changing in structure upon binding to a nucleic acid chain, and for example, proteins in which structure changes can be adopted with multiple bases or base pairs as recognition units.
  • the detection of the fluorescence intensity of the protein force is carried out by labeling (labeling) the protein with a fluorescent substance, and detecting the fluorescence intensity of the fluorescent substance force, or the protein itself is constituted.
  • a method for detecting the intensity of fluorescence from amino acids can be appropriately adopted depending on the purpose.
  • a protein that changes its structure when bound to a base or base pair of a nucleic acid strand is fluorescently labeled and held, and an interface for generating evanescent light, and the above-mentioned.
  • a database storing the fluorescence intensity database of proteins which correlate the fluorescence intensity of the protein with the fluorescence detection unit which can continuously measure the fluorescence intensity of the protein based on the fluorescence excitation of the evanescent light and the type of base or base pair Automatically comparing the fluorescence intensity data obtained by the measurement with the fluorescence intensity database
  • a data processing unit that determines the base sequence of the nucleic acid strand according to the present invention.
  • the evanescent light illumination can acquire positional information and displacement information of a substance fixed to an interface, in particular, positional information and displacement information at a nanoscale level. More specifically, position information and displacement information at the nanoscale level of the target substance to be detected can be quantified with high accuracy without contact. In this way, it is possible to detect or measure the existence or progress of interaction between substances, and the state or dynamics of the structure or base sequence of a substance.
  • FIG. 1 is a view for explaining the basic principle of evanescent light irradiation used in a substance information acquiring method and a substance information measuring device according to the present invention.
  • FIG. 2 is another diagram for explaining the principle.
  • FIG. 3 is an application example of the present invention and is a view showing an example of a concept of a method for detecting a change in nucleic acid strand into an extended state.
  • FIG. 4 is an application example of the present invention, showing an example of the concept of a method of detecting hybridization.
  • FIG. 5 is a view schematically showing the concept of an embodiment of the base sequence determination method or apparatus according to the present invention.
  • FIG. 6 is a drawing-substitute graph showing experimental results according to Example 1.
  • FIG. 7 is a drawing substitute graph showing experimental results according to Example 2.
  • FIG. 8 is a view schematically showing the structural change of ssDNA according to Example 2.
  • FIG. 1 and 2 are diagrams for explaining the basic principle of evanescent light irradiation used in the method and apparatus according to the present invention.
  • a light source Q an emission light P from the light source Q is excited by an interface S capable of generating evanescent light PE, and is excited by the evanescent light PE and is present in the near field A of the interface S.
  • the fluorescence detection unit D which detects the intensity of the fluorescence f emitted from the detection substance (not shown in FIG. 1), and the decay rate information of the evanescent light PE which correlates with the fluorescence intensity information and the distance from the interface S.
  • a substance information measuring device provided with an analysis unit C that automatically analyzes the position or Z and displacement of a detection substance in the reaction field R.
  • the detection of the fluorescence intensity of the detection substance force is carried out by labeling (labeling) the detection substance with a fluorescent substance and detecting the fluorescence intensity of the fluorescent substance force or the detection.
  • a method of detecting the intensity of fluorescence from a fluorescent substance that constitutes the substance itself can be appropriately adopted depending on the purpose.
  • a fluorescence detection unit D is a lens L1 that condenses fluorescence f and converts it into parallel light, a photodetector (photodetector) PD, a lens L2 that condenses fluorescence f onto the photodetector PD, fluorescence f
  • a filter H for cutting the light P traveling in a mixed manner, a mirror (for example, a dichroic mirror) (not shown) for changing the light traveling direction, and the like are provided as necessary.
  • the analysis unit C is a computer, and the attenuation rate information of the evanescent light PE correlated with the fluorescence intensity and the distance from the interface S is stored in advance as a database, and is actually measured with this database
  • a program is stored that is calculated by automatically calculating, as a distance from the interface S, the position where the fluorescent substance that is the generation source of the fluorescence f is present by comparing the fluorescence intensity.
  • the light P is emitted from the medium M1 having a larger refractive index to the medium M2 having a smaller refractive index under an incident angle condition (total reflection condition) at a critical angle or more from the light source Q.
  • incident angle condition total reflection condition
  • an evanescent light (evanescent wave) PE is generated in the near field A of the opposite interface S of the incident light P.
  • the intensity (square of the electric field) of this evanescent light PE decays exponentially rapidly with the increase of the distance Z from the interface S. It has a property (see FIG. 2), and this property can be specifically described using the following equation group. The meanings of the symbols shown in the following mathematical expression groups are described at the end of the sentence.
  • Equation 1 The basics of near-field light by Motokazu Otsu P. 26-29.
  • d depends on each medium, incident angle and wavelength, and as this is smaller, the intensity of the evanescent light PE is attenuated at a shorter distance.
  • the position (z) of the fluorescent substance in the same evanescent light field is Z
  • the positional change (displacement) of the fluorescent material can be calculated and analyzed as shown in the following Eq.
  • one end of the detection substance T which is a nucleic acid chain, is immobilized to the interface S capable of forming the evanescent light PE, and the other end of the detection substance T has a fluorescent substance.
  • fluorescent dye F is labeled.
  • the detection substance T (T1) is present in the form of a random coil, and the fluorescent substance F is present at a position close to the interface S.
  • the fluorescence intensity obtained by evanescent light at this time is temporarily assumed to be II.
  • the physical conditions or chemical conditions of the reaction site R are changed.
  • the detection substance ⁇ which is a nucleic acid strand
  • the distance from the interface S to the fluorescent substance F is It becomes longer (see code 2 in Figure 3).
  • the fluorescence intensity 12 obtained by the evanescent light at this time is a value attenuated more than the fluorescence intensity II (see again FIG. 2).
  • the detection substance can be obtained
  • the change in distance from the interface S of the fluorescent substance F labeled to ⁇ , ie, the amount of displacement ( ⁇ , see FIG. 2) can be quantified.
  • Nucleic acid molecules are known to elongate or move in the liquid phase under the action of an electric field.
  • the principle is considered to be that the ion cloud is formed by the phosphate ion (negative charge) which constitutes the skeleton and the hydrogen atom (positive charge) which is surrounded by the water force S ion and its surrounding, and these negative charge and positive charge
  • the polarization vector (dipole) produced by As a whole, it is oriented in one direction, and as a result, it stretches and forms a curl, and when an inhomogeneous electric field is applied, it moves toward a site where electric field lines concentrate (Seiichi Suzuki, Takeshi Y amanashi, Shin-ichi 1 azawa.Osamu Kurosawa and Masao Washizu: Quantitive analism on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy ”, IEEE Transaction on Industrial Applications, Vol. 34, No. 1, P 75— 83 (1 998)) .
  • FIG. 4 is a diagram for explaining another example of the embodiment for measuring the positional information of the fluorescent substance present in the near field A of the interface S, that is, an example to which the present invention is applied, It is a figure which shows the concept in the case of detecting hybridisation.
  • the other end of the probe nucleic acid strand X having a base sequence structure capable of taking a self-loop structure and having a fluorescent substance (fluorescent dye) F labeled at the end is immobilized on the interface S Keep it in mind. Since the probe nucleic acid strand XI in the state shown in (I) of FIG. 3 is in a state in which a self-loop structure is formed, the fluorescent substance F is present at a position close to the interface S. The fluorescence intensity obtained by the evanescent light PE at this time is temporarily assumed to be II.
  • the distance change from the interface S of the fluorescent substance F labeled to the probe nucleic acid strand X That is, the displacement amount ( ⁇ ) can be numerically calculated specifically.
  • the presence or progress of hybridization of probe nucleic acid strand X can be detected.
  • FIG. 5 schematically shows the concept of an embodiment of the base sequence determination method according to the present invention.
  • the fluorescent substance F is labeled on the protein E, which changes its structure when bound to the base or base pair of the nucleic acid strand, and then retained (for example, fixed) in the interface S region.
  • holding means such as fixation, can be suitably determined according to the objective etc.
  • the protein E has a function of moving to force-slide the protein E (or nucleic acid strand N) when bound to the nucleic acid strand indicated by symbol N in FIG.
  • the protein E has a function of moving to force-slide the protein E (or nucleic acid strand N) when bound to the nucleic acid strand indicated by symbol N in FIG.
  • base or base pair
  • one having a property accompanied by a unique structural change is preferably employed.
  • DNA helicase or polymerase can be employed.
  • FIG. 5 (I) shows the appearance of a point in time when protein E (E1) binds to nucleic acid strand N introduced into reaction field R on interface S.
  • the fluorescent substance F labeled to the protein E1 is also present at the position of the interface S force at the distance zl, and emits fluorescence of intensity II by evanescent light PE (not shown in FIG. 5; see FIG. 1).
  • the nucleic acid strand N may be a force double strand shown as a single strand in FIG. Further, in the present embodiment, a method of labeling the fluorescent substance F to the protein E is exemplified, but the intensity of the fluorescence from the fluorescent amino acid (for example, tributophane etc.) constituting the protein E is detected. A method can also be suitably adopted according to the purpose.
  • ( ⁇ ) in Fig. 5 shows a state in which the nucleic acid strand N is slid in units of base or several bases relative to the protein E.
  • the structure of protein E changes when the base type or combination of bases to which protein E is bound (the type of base pair or the combination of base pairs when nucleic acid strand N is double-stranded) are different (FIG. The sign of) see E2).
  • the fluorescent substance F labeled to the protein E is present at a distance z 2 (for example, z 2 ⁇ z 1) from the interface S, and the intensity is measured by the evanescent light PE (not shown in FIG. 5. See FIG. 1). It emits fluorescence of intensity 12 (ie, 12> 11) attenuated more than II.
  • the fluorescence intensity of protein E (on interface S) correlated with the type or combination of bases or base pairs is measured in advance, and this is used as a database.
  • the data processing unit of the computer reads the database and the measured fluorescence intensity I.
  • the base sequence of the nucleic acid strand N is automatically determined by automatically collating 1 and 12 with a computer program stored in advance.
  • An apparatus capable of carrying out such a base sequence determination method has, for example, an apparatus configuration as shown in FIG. First, the apparatus labels the fluorescent substance F on a protein E that changes its structure when bound to the base or base pair of the nucleic acid strand N, and holds the same, as well as an interface S capable of generating evanescent light.
  • the fluorescent substance F labeled to the protein E is excited by the evanescent light PE, and a fluorescent detection part D capable of continuously measuring based on the generated fluorescent excitation light f is provided. Furthermore, a database storage unit for storing a fluorescence intensity database (basic database) of the protein E correlated with the type of base or base pair, fluorescence intensity data obtained by the measurement, and the fluorescence intensity database are automatically And a data processing unit that determines a base sequence of a nucleic acid strand by checking. The database storage unit and the data processing unit are provided in the analysis unit C shown in FIG.
  • single-stranded or double-stranded nucleic acid strand moves relative to protein E held (eg, fixed) in the interface S region.
  • the fluorescence intensity obtained by continuously tracking the change in fluorescence intensity (change in the position of the fluorescent substance (distance of interfacial force)) when the protein E undergoes a structural change.
  • the base sequence of the nucleic acid strand can be determined automatically and continuously by automatically collating the data with the fluorescence intensity database of the above-mentioned protein which correlates the data to the type of base or base pair previously acquired.
  • a cell having a counter electrode in the vertical direction (a reaction field with an aperture of 200 m and a height (depth) of 5 / z m) was formed, and evanescent light was generated at the bottom of this cell.
  • One end of DNA was fixed to the bottom of the cell by chemical binding, and the other end was labeled with a fluorescent dye (Cy3). Then, the fluorescence intensity that will change depending on the position of this fluorescent dye is measured before and after the application of the electric field. I decided. The measurement was performed on a microscope.
  • the experimental measurement system is further modified to simultaneously measure the vertical total incident light, thereby separating the change in the fluorescence intensity due to the temperature change. That is, in excitation by normal incident light, since the excitation light intensity does not change depending on the height from the substrate, the fluorescent dye (Cy3 molecule) in the reaction field emits the same fluorescence intensity regardless of the position. This fluorescence intensity is a function of temperature only. The results of measuring the change in fluorescence intensity depending on the height (distance from the interface) of the evanescent excitation light based on such a measurement system are shown in FIG.
  • FIG. 6 shows evanescent light excitation (corresponding to TIRF in FIG. 6) and vertical incidence when an electric field of 6.5 VppZ m is applied to lmer, 30 mer, and 90 mer three kinds of Cy3-modified synthetic oligo DNAs.
  • the change in the fluorescence intensity of excitation (corresponding to TRANS in FIG. 6) is shown.
  • Example 2 based on the measurement principle and method described above, the salt concentration ring of the biopolymer is An experiment was conducted on measurement of mean length change in boundary change.
  • One end of a 90-mer ssDNA was immobilized on the glass of a glass bottom dish, and the other end was labeled with a fluorescent dye (Cy3). There, pure water or salt water was filled. Excitation laser light was incident on the glass interface satisfying the total reflection conditions and evanescent light was generated.
  • the displacement before and after the salt drop of the fluorescence labeled with ssDNA was about 2 nm. Therefore, it has been found that the method according to the present invention enables measurement of extremely minute displacements of nanometer order. In addition, it was found that the method according to the present invention can be used to track changes in molecular structure due to salt concentration and the like, for example, changes in the higher order structure of nucleic acid.
  • the present invention relates to, for example, changes in the structure of a substance (for example, primary structure, secondary structure, tertiary structure, higher-order structure, etc. of a biological substance), morphological changes, hybridization 'antigen-antibody reaction' Interactions between proteins ⁇ Polymers-polymers ⁇ Polymers-small molecules ⁇ Small molecules-small molecules ⁇ Reactions such as reactions and their progress status, changes in protein unit structure, diffusion states of substances Etc. can be used as detection techniques for such as, and monitoring of these changes.

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Abstract

　エバネッセント光照明技術を利用した物質の位置情報や変位情報を提供すること。エバネッセント光ＰＥの強度が、界面Ｓからの距離Ｚの増加とともに指数関数的に急速的に減衰するという性質を利用して、エバネッセント光ＰＥを発生し得る界面Ｓに検出物質Ｔを固定しておき、前記エバネッセント光ＰＥによって励起された前記検出物質Ｔ由来の蛍光強度Ｉに基づいて、前記検出物質Ｔの位置情報Ｚや変位情報（Δｚ）を取得する。この位置情報Ｚや変位情報（Δｚ）を用いて、物質の構造又はその変化、塩基配列、物質間の相互作用の有無又は進行状況などを捉える。

Description

明 細 書
エバネッセント光を利用する物質情報取得方法と物質情報測定装置、並 びに塩基配列決定方法と装置
技術分野
[0001] 本発明は、エバネッセント光を利用する物質情報の取得技術に関する。より詳しく は、エバネッセント光を蛍光励起光として利用して、界面に固定ィ匕された物質の構造 、形態、相互作用、塩基配列などを測定又は決定する技術に関する。
背景技術
[0002] 物質の位置変化 (変位)を測定する手法は、その対象物の大きさにより様々である。
マイクロスケールまでのものは光学顕微鏡等でその長さ、変位を測定することが可能 である。しかしながら、光学顕微鏡の水平解像度の限界が数百ナノメートルであり、ナ ノスケールの物質の、物理的、化学的作用を与えられたときの大きさ等の変化を捉え ることは不可會である。
[0003] 電子顕微鏡等は、真空中で測定することや蒸着が必要である等の問題で、任意の 状態での動的な変化を測定することは不可能であり、例えば、液中でのタンパクや D NAの構造変化に伴う変位を見ることはできない。唯一、原子間力顕微鏡 (AFM ; At omic Force Microscope)は、これが可能であるが、測定準備と操作が難しぐ測定確 度が個々の探針へ依存してしまう等の問題がある。また、時間スケールの短い動的 変化を捉えた 、場合、一画像を得るのに測定時間が数十分単位で必要になる AFM は適用できない。
[0004] ここで、臨界角以上の入射角条件 (全反射条件)で、屈折率のより大きい媒質から 屈折率のより小さい媒質へ光が入射すると、入射光の反対側界面の近接場にエバネ ッセント光が発生することが知られている。このエバネッセント光の強度は、界面から の距離の増加とともに指数関数的に急速的に減衰する。
[0005] このエバネッセント光を利用して物質の挙動や状態を解析する技術が特開 2003— 294631号公報、特開平 10— 221339号公報に開示されている。より詳しくは、特開 2003— 294631号公報には、細胞中の検出物質に蛍光標識しておき、エバネッセ ント照明を行いながら前記検出物質力 発せられる蛍光信号を複数の時点で経時的 に検出し、この蛍光信号の変化を基に、検出物質の 1分子あたりの挙動や状態を解 析する技術が開示されている。特開平 10— 221339号公報には、蛍光標識した染 色体にエバネッセント光を照射する等して、染色体の構造や染色体上の遺伝子の配 列やその状態を観察する技術が開示されている。
[0006] 現在、物質間の相互作用、物質の状態 (例えば、構造や塩基配列など)や動態 (例 えば、構造変化、反応の進行状況など）〖こ係る情報を、水晶発振子原理、表面プラズ モン共鳴原理、励起蛍光検出原理などのような検出原理に基づいて検出又は測定 する技術が徐々に開発され始めている。し力しながら、いずれの技術においてもその 検出精度に関してはいまだ改良の余地がある段階であり、ナノスケールレベルで物 質の前記情報を正確に取得できる技術に至って 、るとは言えな 、。
[0007] そこで、本発明は、エバネッセント光照明技術を利用した物質の位置や変位に係る 情報、特にナノスケールレベルの位置や変位に係る情報を取得する新規技術、そし て、これらの情報を利用して物質の相互作用、状態、動態などを正確に検出又は測 定する新規技術を提供することを主な目的とする。
発明の開示
[0008] 臨界角以上の入射角条件 (全反射条件)で、屈折率のより大きい媒質から屈折率 のより小さい媒質へ光が入射すると、入射光が進行する側の反対側の界面の近接場 にエバネッセント光（エバネッセント波）が発生する。本発明は、このエバネッセント光 の強度が、界面からの距離の増加とともに指数関数的に減衰する性質を利用する。
[0009] 本発明は、まずエバネッセント光を発生し得る界面領域に検出物質を存在させてお き、前記エバネッセント光によって励起された前記検出物質由来の蛍光強度に基づ V、て、前記検出物質の位置情報を取得する物質情報取得方法を提供する。
[0010] 即ち、本発明では、（1)検出物質をエバネッセント光の照射範囲である界面 (入射 光側の反対側の界面)近傍に存在させておくこと、（2)当該界面で発生したエバネッ セント光を蛍光励起光として用いること、（3)検出物質に人為的に標識された蛍光色 素ゃ該検出物質それ自体が保有する蛍光をエバネッセント光で励起し、その励起蛍 光の強度から検出物質の位置情報を取得すること、を主な特徴としている。この位置 情報は、ナノスケールレベルで取得が可能であり、物質間の相互作用や物質の状態 や動態を調べるために有用な情報となる。
[0011] なお、本発明において「検出物質」とは、物質情報の取得の対象となる物質を意味 し、エバネッセント光が発生する界面領域に経時的又は一時的に存在させた状態、 例えば、該界面に固定又は保持させた状態で使用される。「位置情報」は、検出物質 に人為的に標識された蛍光色素や検出物質の蛍光発生部位が存在する位置 (以下 、「蛍光発生位置」と称する)と界面との間の距離情報ゃ該距離情報の変化に関する 情報の両方を含む。
[0012] 本発明では、検出物質が存在する反応場の物理的又は化学的な条件が変化する 場合 (例えば、人為的な操作によって変化させた場合)に、このような条件変化の前 後の検出物質の蛍光強度情報を取得することによって、該検出物質の変位情報、よ り詳しくは検出物質の蛍光発生位置の界面力 の距離の変化の程度を知ることがで きる。このような変位が物質の一次構造、二次構造、三次構造、高次構造などの構造 又は形態の変化によってもたらされる場合、この変位情報は、物理的又は化学的な 条件変化が物質の構造や形態へ与える影響に関する情報となる。
[0013] また、本発明では、励起蛍光の強度をリアルタイムでモニタリングすることによって、 該検出物質の位置情報の経時的変化を追跡することができる。これにより、例えば、 検出物質それ自体の外的条件変化による動態ゃ該検出物質が係る相互作用の進 行に係る情報などを取得できる。
[0014] さらに、本発明では、測定された前記蛍光強度に係るデータを、予め取得されてい る標準データに基づいて補正を行なうことで物質の位置情報を決定することによって
、測定データの信頼性を向上させてもよい。標準データとは、例えば、分子長が正確 に決定された蛍光標識物質を分子長違!、で必要数準備しておき、これらの蛍光標識 物質の界面力 の距離の違いによって変化する蛍光強度データである。この蛍光強 度データは、界面からの距離に応じた蛍光強度を正確に反映する。
[0015] 次に、本発明では、光源と、該光源からの出射光がエバネッセント光を発生し得る 界面と、前記エバネッセント光により励起され、前記界面に存在する検出物質から発 せられた蛍光強度を検出する蛍光検出部と、前記蛍光強度情報と界面からの距離 に相関する前記エバネッセント光の減衰率情報とに基づいて、前記反応場における 検出物質の位置又は Z及び変位を自動解析する解析部と、を少なくとも備える物質 情報測定装置を提供する。さらにこの装置では、光源からの出射光が進行する側の 反対側の界面が臨む反応場の物理的又は化学的条件を変化させ得る反応場条件 制御部を設けてもよい。
[0016] 本装置の反応場条件制御部は、反応場の物理的又は化学的条件を人為的に制 御できる手段であって、例えば、温度、 pH、圧力、物質濃度、塩濃度、溶媒種等の 条件を自在に操作できる手段、前記反応場に対する電界印加手段、これらの手段を 選択的に自在に操作できる手段などを挙げることができる。
[0017] 次に本発明では、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパ ク質をエバネッセント光を発生し得る界面領域に保持させておく手順と、前記核酸鎖 と前記タンパク質を結合させる手順と、前記エバネッセント光によって励起された前記 タンパク質由来の蛍光の強度を時系列で連続的に測定する手順と、この測定で得ら れた蛍光強度データと塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強 度データベースとを自動照合する手順と、を行うことによって一本鎖又は二本鎖の核 酸の塩基配列を決定する方法を提供する。本方法で採用し得るタンパク質は、核酸 鎖との結合によって構造変化する性質を有するものの中から選択でき、例えば、複数 の塩基又は塩基対を認識単位として構造変化するタンパク質を採用できる。なお、タ ンパク質力 の蛍光強度の検出は、当該タンパク質に蛍光物質を標識 (ラベル)して おいて、この蛍光物質力 の蛍光の強度を検出する方法、あるいは、当該タンパク質 それ自体を構成するアミノ酸からの蛍光の強度を検出する方法などを目的に応じて 適宜採用することができる。
[0018] また、本発明では、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパ ク質を蛍光標識した上で保持させておくとともに、エバネッセント光を発生させるため の界面と、前記タンパク質由来の蛍光強度を、前記エバネッセント光の蛍光励起に 基づいて連続的に測定可能な蛍光検出部と、塩基又は塩基対の種類に相関する前 記タンパク質の蛍光強度データベースを格納しておくデータベース格納部と、前記 測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合すること によって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、を少なくとも備える塩基配列 決定装置を提供する。
[0019] 即ち、これらの塩基配列決定に係る方法や装置では、界面領域に保持 (例えば、 固定)されているタンパク質が一本鎖又は二本鎖の核酸鎖に沿って移動していく際 に、塩基又は塩基対の種類によって構造変化するときの蛍光強度の変化 (蛍光物質 の位置変化）を連続的に追跡することによって得られた蛍光強度データを、予め取得 してある塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベース と自動照合することによって核酸鎖の塩基配列を決定することを特徴としている。
[0020] 本発明では、エバネッセント光照明によって、界面に固定された物質の位置情報や 変位情報、特にナノスケールレベルの位置情報や変位情報を取得できる。より詳しく は、対象となる検出物質のナノスケールレベルの位置情報や変位情報を、非接触で 、高精度に数値化することができる。これにより、物質間の相互作用の有無や進行状 況、物質の構造や塩基配列などの状態や動態を検出又は測定することができる。 図面の簡単な説明
[0021] [図 1]図 1は、本発明に係る物質情報取得方法や物質情報測定装置で用いるエバネ ッセント光照射の基本的な原理を説明するための図である。
[図 2]図 2は、同原理を説明するための他の図である。
[図 3]図 3は、本発明の適用例であって、核酸鎖が伸張状態へ変化することを検出す る方法の概念の一例を示す図である。
[図 4]図 4は、本発明の適用例であって、ハイブリダィゼーシヨンを検出する方法の概 念の一例を示す図である。
[図 5]図 5は、本発明に係る塩基配列決定方法又は装置の一実施形態例の概念を模 式的に示す図である。
[図 6]図 6は、実施例 1に係る実験結果を示す図面代用グラフである。
[図 7]図 7は、実施例 2に係る実験結果を示す図面代用グラフである。
[図 8]図 8は、実施例 2に係る ssDNAの構造変化の様子を模式的に示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0022] 以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説 明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明の代表的な実施形態の 一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
[0023] まず図 1、図 2は、本発明に係る方法や装置で用いるエバネッセント光照射の基本 的な原理を説明するための図である。
[0024] 図 1には、光源 Qと、該光源 Qからの出射光 Pがエバネッセント光 PEを発生し得る界 面 Sと、前記エバネッセント光 PEにより励起され、前記界面 Sの近接場 Aに存在する 検出物質 (図 1では示さず。）から発せられた蛍光 fの強度を検出する蛍光検出部 Dと 、この蛍光強度情報と界面 Sからの距離に相関する前記エバネッセント光 PEの減衰 率情報に基づ 、て、反応場 Rにおける検出物質の位置又は Z及び変位を自動解析 する解析部 Cと、を備える物質情報測定装置が示されて 、る。
[0025] なお、検出物質力 の蛍光強度の検出は、当該検出物質に蛍光物質を標識 (ラベ ル)しておいて、この蛍光物質力 の蛍光の強度を検出する方法、あるいは、当該検 出物質それ自体を構成する蛍光発光性の物質からの蛍光の強度を検出する方法な どを目的に応じて適宜採用することができる。
[0026] 蛍光検出部 Dは、蛍光 fを集光し平行光に変換するレンズ Ll、光検出器 (フォトディ テクタ) PD、該光検出器 PDへ蛍光 fを集光するレンズ L2、蛍光 fに混ざって進行して くる光 Pをカットするためのフィルター H、光進行方向を変更するための図示しないミ ラー（例えば、ダイクロイツクミラー）などを必要に応じて備えて 、る。
[0027] 解析部 Cは、コンピュータであって、蛍光強度と界面 Sからの距離に相関する前記 エバネッセント光 PEの減衰率情報がデータベースとして予め格納されているとともに 、このデータベースと実際に測定された蛍光強度とを照合して、蛍光 fの発生源であ る蛍光物質が存在する位置を、界面 Sから距離として自動演算して算出するプロダラ ムが格納されている。
[0028] ここで、エバネッセント光照射原理について説明すると、光源 Qから臨界角以上の 入射角条件 (全反射条件)で、屈折率のより大きい媒質 Mlから屈折率のより小さい 媒質 M2へ光 Pが入射されると、この入射光 Pの反対側界面 Sの近接場 Aにエバネッ セント光（エバネッセント波） PEが発生する。このエバネッセント光 PEの強度（電場の 二乗）は、界面 Sからの距離 Zの増加とともに指数関数的に急速的に減衰するという 性質を有しており（図 2参照）、この性質は、以下の数式群を用いて具体的に説明す ることができる。なお、以下の数式群に示された符号の意味は、文末にまとめて記載 する。
[0029] まず、電場分布は、次の「数式 1」で示すことができる（大津元一著近接場光の基 礎 P.26- 29)。
[数 1] (x?∑) = /。 exp | - ιωί + ik2
Figure imgf000009_0001
[0030] エバネッセント光 PEを照明源に用いることによって、例えば、固液界面近傍のみの 蛍光情報を取り出すことができることが知られており、この手法は、実際に TIRF (Total internal reflection fluorescence)顕微鏡などに応用されている。ここで、蛍光強度は エバネッセント光 PEの線形関数であり、その時間平均を考える場合、位置 (X)に依ら ないので、前掲した電場分布の「数式 1」から、次の「数式 2」のように書き換えることが できる。
[数 2]
I(z) = /。 exp
Figure imgf000009_0002
[0031] さらに、次の「数式 3」のように dを定義することで、さらに続く「数式 4」を導くことがで きる。
[数 3]
Figure imgf000009_0003
上記数式 3, 4の dは、各媒質と入射角と波長に依存し、これが小さいほどより短距 離でエバネッセント光 PEの強度は減衰する。ここで、エバネッセント光 PEを蛍光励 起光として用いる場合、同じエバネッセント光場中で、蛍光物質の位置 (z)が、 Zの 状態から Zの状態へ変化するような現象の前後で、蛍光強度 (=kl(z))の変化を得る
2
ことができると、先の数式 4力 次の数式 5のように、蛍光物質の位置変化 (変位)を算 出し解析することができる。
[数 5]
Figure imgf000010_0001
[0033] 次に、エバネッセント光 PEを蛍光励起光として用いて、前掲の数式 5などに基づ 、 て、界面 Sの近接場 Aに存在する蛍光物質の位置情報を測定することを利用する測 定系の実施形態例について、図 3、図 4に基づいてより具体的に説明する。
[0034] まず、図 3に示す実施形態例では、エバネッセント光 PEを形成し得る界面 Sに対し て核酸鎖である検出物質 Tの一端が固定され、この検出物質 Tの他端部に蛍光物質 (蛍光色素) Fが標識されている。初期状態 (I)では、この検出物質 T(T1)がランダム コイル状に絡みあって存在し、蛍光物質 Fは界面 Sに近接した位置に存在している。 このときのエバネッセント光 ΡΕによって得られる蛍光強度を仮に IIとする。
[0035] 次に、反応場 Rの物理的条件又は化学的条件を変化させる。例えば、反応場尺に 電界を印加させると、核酸鎖である検出物質 Τが、その一端が固定された状態のまま で伸張させることが可能であるため、界面 Sから蛍光物質 Fまでの距離が長くなる（図 3中の符号 Τ2参照）。このときのエバネッセント光 ΡΕによって得られる蛍光強度 12は 、前記蛍光強度 IIよりも減衰した値となる (再び、図 2参照)。
[0036] ここで、初期状態 (I)で得られた蛍光強度 IIと反応場 Rの物理的条件又は化学的 条件を変化させた後の蛍光強度 12とを上記数式 5に代入すると、検出物質 Τに標識 された蛍光物質 Fの界面 Sからの距離変化、即ち変位量（Δ ζ、図 2参照)を数値化す ることができる。このような測定系では、例えば、外的条件の変化が核酸鎖の高次構 造などの物質の構造や形態などに及ぼす影響を知ることができる。
[0037] なお、核酸分子は、液相中において電界の作用を受けると伸張又は移動すること が知られている。その原理は、骨格をなすリン酸イオン (陰電荷)とその周囲にある水 力 Sイオンィ匕した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これら の陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル (双極子）が、高周波高電圧の印加に より全体として一方向を向き、その結果として伸張し、カロえて、不均一電界が印加さ れた場合、電気力線が集中する部位に向かって移動する（Seiichi Suzuki, Takeshi Y amanashi, Shin-ichi 1 azawa.Osamu Kurosawa and Masao Washizu: Quantitative anal ysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluoresc ence anisotropy",IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.l,P75— 83(1 998))。
[0038] 次に、図 4は、界面 Sの近接場 Aに存在する蛍光物質の位置情報を測定する他の 実施形態例を説明するための図、即ち、本発明を適用した一例であり、ハイブリダィ ゼーシヨンを検出する場合の概念を示す図である。
[0039] まず、この実施形態例では、自己ループ構造をとり得る塩基配列構造を有し、蛍光 物質 (蛍光色素) Fが末端に標識されたプローブ核酸鎖 Xの他端を界面 Sに固定して おくようにする。図 3の（I)に示す状態のプローブ核酸鎖 XIは自己ループ構造を形 成した状態にあるため、蛍光物質 Fは、界面 Sに近接した位置に存在する。このとき のエバネッセント光 PEによって得られる蛍光強度を仮に IIとする。
[0040] 次に、界面 S上の反応場 Rに対して、プローブ核酸鎖 Xと相補的な塩基配列部位を 備える核酸鎖 Yを導入すると、核酸鎖 X (XI)の自己ループ構造が解け、核酸鎖 Yと 二本鎖を形成する。このとき、核酸鎖 X (X2)の蛍光物質 Fと界面 Sとの距離は長くな る（図 4 (II)参照)。このときのエバネッセント光 PEによって得られる蛍光強度を仮に I 2 (12< 11)する。
[0041] ここで、初期状態 (I)で得られた蛍光強度 IIと前記蛍光強度 12を上記数式 5に代入 すると、プローブ核酸鎖 Xに標識された蛍光物質 Fの界面 Sからの距離変化、即ち変 位量（Δ ζ)を具体的に数値ィ匕することができる。このような測定系では、例えば、プロ ーブ核酸鎖 Xのハイブリダィゼーシヨンの有無や進行状況を検出することができる。
[0042] 図 3や図 4に示した実施形態例から明らかなように、本発明によれば、物質の構造 変化や物質間の相互作用に係る情報を得ることができ、また、蛍光強度をリアルタイ ムでモニタリング測定することによって、物質の経時的な動態変化や相互作用の進 行状況などを知ることができる。
[0043] 次に図 5は、本発明に係る塩基配列決定方法の一実施形態例の概念を模式的に 示す図である。
[0044] 本実施形態では、まず、核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化する タンパク質 Eに蛍光物質 Fを標識した上で界面 S領域に保持 (例えば、固定)させて おくようにする。なお、固定などの保持手段は目的などに応じて適宜決定できる。
[0045] タンパク質 Eは、図 5中に符号 Nで示した核酸鎖に結合するときに、該タンパク質 E ( 又は核酸鎖 N)力スライドするように移動する機能を有するもので、核酸鎖 Nに結合し たときに、その結合する塩基 (あるいは、塩基対)の種類によって特有の構造変化を 伴う性質を有するものが好適に採用される。例えば、 DNAヘリカーゼゃポリメラーゼ を採用できる。
[0046] 図 5の（I)は、タンパク質 E (E1)が界面 S上の反応場 Rに導入された核酸鎖 Nに結 合しているある時点の様子が示されている。このとき、タンパク質 E1に標識された蛍 光物質 Fは、界面 S力も距離 zlの位置に存在し、エバネッセント光 PE (図 5では示さ ず。図 1参照）によって、強度 IIの蛍光を発する。
[0047] なお、核酸鎖 Nは、図 5においては一本鎖で示されている力 二本鎖であってもよ い。また、本実施形態では、タンパク質 Eに蛍光物質 Fを標識する方法が例示されて いるが、該タンパク質 Eを構成する蛍光発光性のアミノ酸 (例えば、トリブトファン等)か らの蛍光の強度を検出する方法も目的に応じて適宜採用することができる。
[0048] 図 5の (Π)は、タンパク質 Eに対して核酸鎖 Nがー塩基分又は数塩基単位でスライ ドした状態を示して 、る。このときにタンパク質 Eが結合する塩基種又は塩基の組み 合わせ (核酸鎖 Nが二本鎖では塩基対の種類や塩基対の組み合わせ)が異なると、 タンパク質 Eの構造が変化する（図 5 (11)の符号 E2参照)。このとき、タンパク質 Eに 標識された蛍光物質 Fは、界面 Sから距離 z2 (例えば、 z2く zl)の位置に存在し、ェ バネッセント光 PE (図 5では示さず。図 1参照）によって、強度 IIよりも減衰した強度 12 (即ち、 12>11)の蛍光を発する。
[0049] このような蛍光強度測定を行う前に、塩基又は塩基対の種類や組み合わせに相関 する（界面 S上での）タンパク質 Eの蛍光強度を予め測定しておいて、これをデータべ ース化しコンピュータ（図 1の解析部 Cに相当）の記憶部に格納しておく。そして、前 記コンピュータのデータ処理部にぉ 、て、前記データベースと測定された蛍光強度 I 1や 12とを予め格納されているコンピュータプログラムに基づいて自動的に照合する ことにより、当該核酸鎖 Nの塩基配列を自動的に決定する。
[0050] このような塩基配列決定方法を実施できる装置は、例えば、図 1に示すような装置 構成を備える。まず、当該装置は、核酸鎖 Nの塩基又は塩基対と結合したときに構造 変化するタンパク質 Eに蛍光物質 Fを標識した上で保持させておくとともに、エバネッ セント光を発生させることができる界面 Sを有して 、る。
[0051] そして、前記タンパク質 Eに標識された蛍光物質 Fを前記エバネッセント光 PEによ つて励起し、発生した蛍光励起光 fに基づいて連続的に測定することができる蛍光検 出部 Dを備え、さらに、塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質 Eの蛍光 強度データベース (基礎データベース）を格納しておくデータベース格納部と、前記 測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合すること によって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、を少なくとも備える塩基配列 決定装置を提供する。なお、データベース格納部とデータ処理部は、図 1に示す解 析部 Cに設けられている。
[0052] 即ち、これらの塩基配列決定に係る方法や装置では、界面 S領域に保持 (例えば、 固定)されているタンパク質 Eに対して一本鎖又は二本鎖の核酸鎖が移動していく際 に、塩基又は塩基対の種類によって、該タンパク質 Eが構造変化するときの蛍光強度 の変化 (蛍光物質の位置 (界面力 の距離)変化)を連続的に追跡することによって 得られた蛍光強度データを、予め取得してある塩基又は塩基対の種類に相関する前 記タンパク質の蛍光強度データベースと自動照合することによって、核酸鎖の塩基 配列を連続的に自動決定することができる。
実施例 1
[0053] 上記説明した測定原理や方法に基づいて、短鎖の DNAに対して電界を印加した ときの該 DNAの平均長変化測定に関する実験を行った。
[0054] より具体的には、垂直方向に対向電極を持つセル（口径 200 m、高さ（深さ） 5 /z mの反応場）を形成し、このセルの底面にエバネッセント光を発生させた。 DNAの一 端をこのセル底面に化学結合により固定し、他端を蛍光色素 (Cy3)で標識した。そし て、この蛍光色素の位置に応じて変化するであろう蛍光強度を、電界印加前後で測 定した。測定は顕微鏡上で行った。
[0055] ここで、全反射入射だけでの測定では、エバネッセント光の強度変化に起因する蛍 光強度変化と電界印加による温度変化に起因する蛍光強度変化とを分離することが できな 、と 、う問題が生じると考えられる。
[0056] そこで、本実施例では、さらに実験測定系に変更を加えて、垂直全入射光での測 定も同時に行うことで、温度変化による蛍光強度の変化を分離するように工夫した。 すなわち、垂直入射光による励起では、基板からの高さによって励起光強度は変化 しないため、反応場での蛍光色素 (Cy3分子)は位置に関係なく同じ蛍光強度を発す る。この蛍光強度は、温度のみの関数となる。このような測定系に基づいて、エバネッ セント励起光の高さ (界面からの距離)に依存する蛍光強度変化を測定した結果を図 6に示す。
[0057] この図 6は、 lmer、 30mer、 90merの 3種類の Cy3修飾合成オリゴ DNAに対し、 6 . 5VppZ mの電界を印加したときのエバネッセント光励起 (図 6中の TIRFに対応)と 垂直入射励起 (図 6中の TRANSに対応)の蛍光強度の変化を示している。
[0058] lmerの場合では、エバネッセント励起 (TIRF)と垂直入射励起 (TRANS)とで、蛍光 強度の変化は、ノイズレベル程度の差しかないが（図 6中の一番下のグラフ参照）、 3 Omer、 90merの場合では、ノイズレベル以上の明確な差が得られた（図 6参照）。な お、それぞれ、温度上昇による強度変化は 2. 5〜3. 0%程度であり、これは別途蛍 光強度温度特性の結果より算出すると、 1°C弱の温度上昇に対応する。
[0059] このベースラインから、 30mer、 90merの場合は、それぞれ 1. 7%程度がエバネッ セント励起 (TIRF)の場合に蛍光強度はさらに低下する。この結果を基に、 DNAの伸 張した長さを算出したところ、 30mer、 90merの DNAでは、双方とも 3nm程度平均 長が変化したことがわ力つた。
[0060] 即ち、本実験により、電界印加による反応溶液の温度変化による蛍光強度の変化 を排除した上で、エバネッセント光の強度変化に起因する蛍光強度変化に基づいて 、DNAの高次構造変化 (電界による伸張)を検出することができた。
実施例 2
[0061] 実施例 2では、上記説明した測定原理や方法に基づいて、生体高分子の塩濃度環 境変化における平均長変化測定に関する実験を行った。
[0062] ガラスボトムディッシュのガラス上に、 90merの ssDNAの一端を固定し、他端を蛍 光色素（Cy3)で標識した。そこに、純水あるいは塩水を満たした。ガラス界面に全反 射条件を満足させて励起レーザー光を入射し、エバネッセント光を発生させた。
[0063] 純水環境のとき（I)、純水環境にあった系に対し 15秒経過後に 10mMの NaClを滴 下し終濃度 2mMにしたとき（11)、 2mM NaCl環境にあった系に対し更に 15秒経過 後に 2mMの NaClを滴下したとき（III)の蛍光色素の位置に応じて変化する蛍光強 度を時系列測定した。結果を図 7に示す。
[0064] 図 7に示す通り、純水中の ssDNAを標識する蛍光の強度が、塩滴下後に増大する ことが分かる。すなわち、塩滴下に伴い、蛍光標識が、ガラス界面に接近したことが分 かる。これは、図 8に示すように、純水中では DNA鎖を構成するイオン同士の静電的 反発により、鎖が伸張した状態であるが（図 8 (1)参照）、塩滴下により、ガラス上に満 たされた溶液のイオン強度が増すことで、 DNA鎖を構成するイオンが遮蔽され、鎖 内の反発力が低減し、構造が縮退することによると考えられる（図 8 (II)参照)。
[0065] 蛍光強度変化を前述した数式 5により計算すると、 ssDNAを標識した蛍光の塩滴 下前後の変位は、約 2nmであった。従って、本発明に係る方法により、ナノメートル オーダーの極めて微小な変位の測定が可能であることが分かった。また、本発明に 係る方法を利用し、塩濃度等による分子構造の変化、例えば、核酸の高次構造の変 化を追跡できることが分力つた。
産業上の利用可能性
[0066] 本発明は、例えば、物質の構造 (例えば、生体物質の一次構造、二次構造、三次 構造、高次構造など)の変化、形態変化、ハイブリダィゼーシヨン'抗原抗体反応'タ ンパク質間相互作用 ·高分子-高分子間 ·高分子-低分子 ·低分子-低分子間の反 応などの相互作用の発生やその進行状況、タンパク質のユニット構造の変化、物質 の拡散状態などの検出技術やこれらの変化のモニタリング技術として利用できる。
[0067] 数式群に示された符号の意味は以下のとおりである。
[0068] I 蛍光強度
P 光 (入射光） PE エバネッセント光（エバネッセント照明光）
S 界面
T 検出物質
Z 界面 (S)からの蛍光物質の位置 (距離)情報 Δ ζ 変位情報
Ε (χ, ζ) (χ, ζ)における電場強度
To 電場振幅
ω 角周波数
k2 媒質 2中の波数
n 屈折率比
Θ 1 入射角
Io 蛍光強度の基準強度 (規格化強度） nl 媒質 Mlにおける屈折率
n2 媒質 M2における屈折率
d 蛍光強度 (エバネッセント光強度の厚み基準) zl 1の状態での位置 (界面力 の距離） z2 2の状態での位置 (界面力 の距離）
II 1の状態における蛍光強度
12 2の状態における蛍光強度

Claims

請求の範囲
[1] エバネッセント光を発生し得る界面領域に検出物質を存在させておき、
前記エバネッセント光によって励起された前記検出物質由来の蛍光強度に基づい て、前記検出物質の位置情報を取得する物質情報取得方法。
[2] 前記検出物質は、前記界面に固定されていることを特徴とする請求項 1記載の物 質情報取得方法。
[3] 前記検出物質が存在する反応場の物理的又は化学的な条件の変化する前後の蛍 光強度情報を取得することにより、該検出物質の変位情報を得ることを特徴とする請 求項 1記載の物質情報取得方法。
[4] 前記変位情報は、物質の構造又は形態の変化によってもたらされるものであること を特徴とする請求項 3記載の物質情報取得方法。
[5] 前記励起蛍光の強度をリアルタイムでモニタリングすることを特徴とする請求項 1記 載の物質情報取得方法。
[6] 前記位置情報は、ナノスケールの位置情報であることを特徴とする請求項 1記載の 物質情報取得方法。
[7] 測定された前記蛍光強度に係るデータを、予め取得されている標準データに基づ いて補正を行なうことによって前記位置情報を決定することを特徴とする請求項 1記 載の物質情報取得方法。
[8] 光源と、
該光源力 の出射光がエバネッセント光を発生し得る界面と、
前記エバネッセント光により励起され、前記界面に存在する検出物質から発せられ た蛍光強度を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光強度情報と界面からの距離に相関する前記エバネッセント光の減衰率情 報に基づいて、前記反応場における検出物質の位置又は Z及び変位を自動解析す る解析部と、
を少なくとも備える物質情報測定装置。
[9] 前記出射光が進行する側の反対側の界面が臨む反応場の物理的又は化学的条 件を変化させ得る反応場条件制御部を備えることを特徴とする請求項 8記載の物質 情報測定装置。
[10] 前記反応場条件制御部は、前記反応場に対する電界印加手段を有することを特 徴とする請求項 9記載の物質情報測定装置。
[11] 核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質を、エバネッセ ント光を発生し得る界面領域に保持させておく手順と、
前記核酸鎖と前記タンパク質を結合させる手順と、
前記エバネッセント光によって励起された前記タンパク質由来の蛍光の強度を時系 列で連続的に測定する手順と、
この測定で得られた蛍光強度データと塩基又は塩基対の種類に相関する前記タン パク質の蛍光強度データベースとを自動照合する手順と、
を行うことによって一本鎖又は二本鎖の核酸の塩基配列を決定する方法。
[12] 前記タンパク質は、複数の塩基又は塩基対を認識単位として構造変化することを特 徴とする請求項 11記載の方法。
[13] 核酸鎖の塩基又は塩基対と結合したときに構造変化するタンパク質を蛍光物質に より標識した上で保持させておくとともに、エバネッセント光を発生させるための界面 と、
前記タンパク質由来の蛍光強度を、前記エバネッセント光の蛍光励起に基づいて 連続的に測定可能な蛍光検出部と、
塩基又は塩基対の種類に相関する前記タンパク質の蛍光強度データベースを格 納しておくデータベース格納部と、
前記測定で得られた蛍光強度データと前記蛍光強度データベースとを自動照合す ることによって核酸鎖の塩基配列を決定するデータ処理部と、
を少なくとも備える塩基配列決定装置。
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