DE4104076C2

DE4104076C2 - Vorrichtung zur kernresonanzspektrometrischen Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen

Info

Publication number: DE4104076C2
Application number: DE4104076A
Authority: DE
Inventors: Manfred Dipl Chem Dr Spraul; Martin Hofmann
Original assignee: Bruker Analytische Messtechnik GmbH
Current assignee: Bruker Biospin GmbH
Priority date: 1991-02-11
Filing date: 1991-02-11
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2011-02-12
Also published as: US5198766A; GB2254151B; DE4104076A1; GB2254151A; GB9201591D0

Description

Die Erfindung umfaßt eine Vorrichtung zur kernresonanzspektro metrischen (NMR) Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen mit einem Reaktionsweg der Länge l₇, einem Kernresonanzspektrometer, einer den Beginn des Reaktionswegs bildenden Reaktionskammer, der mindestens ein Reagent über mindestens eine Reagentzuleitung zugeführt wird, und einer Reagentableitung, die die Reaktionskammer mit einer NMR-Meß zelle des Kernresonanzspektrometers verbindet, wobei die Reak tionskammer sowie der Reaktionsweg in unmittelbarer Nähe eines Spektrometerprobenkopfs im Magnetfeld des Spektrometermagneten angeordnet sind, wobei die Reaktionskammer außerhalb des Proben kopfgehäuses und an dessen aus der Spektrometermagnetbohrung ragendem Ende befestigt ist, und wobei die Reagentableitung lösbar an der Reaktionskammer angebracht ist, sich vollständig im Magnetfeld des Spektro metermagneten befindet und gegen eine andere Reagentableitung mit einer unterschiedlichen Länge ausgetauscht werden kann.

In der Habilitationsschrift von K. ALBERT, "Durchfluß-NMR- Spektroskopie, Beiträge zur Entwicklung und Anwendung" der Fakultät für Chemie und Pharmazie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen, 1988, Seiten 75 bis 77 ist eine bekannte Meßvorrich tung für bio-medizinische Perfusionsmessungen an einer Ratten leber beschrieben. Die Beobachtung metabolitischer Vorgänge erfolgt mit Hilfe der NMR-Messung in einer NMR-Durchflußmeß zelle.

Ein NMR-Meßkreislauf und ein Leberkreislauf sind über eine als Ausgleichsgefäß ausgebildete Kammer miteinander verbunden. Zu sätzlich zu dem zu untersuchenden von der Rattenleber durch eine Pumpe in das Ausgleichsgefäß gepumpten Blut wird ein Ge misch von Sauerstoff und CO₂ in das Ausgleichsgefäß geleitet. Dabei ließ sich die Enzymaktivität der Leber durch NMR-Messung ermitteln.

Nachteilig ist, daß der Weg zwischen der als Ausgleichsgefäß ausgebildeten Kammer und dem NMR-Meßort sehr lang und fest vorgegeben ausgebildet ist. Daher ist es nicht möglich, in einer Reaktionskammer, d. h. an einem definierten Ort in min destens einem Reagenten eine Reaktion auszulösen, so daß der Reagent kontinuierlich und dennoch immer nach einer vorwähl baren, insbesondere sehr kurzen Zeit nach Start dieser Reaktion kernresonanzspektrometrisch untersuchbar ist.

Bei einer aus der DE-AS 20 04 973 bekannten Meßvorrichtung werden die austretenden Reagenten in einen Raum mit rückwärtigem Ausfluß gepumpt. Dadurch entstehen Ruhezonen, die auch durch Rotation des als Meßkammer dienenden Röhrchens schwer zu be seitigen sind. Folglich hat die aus der DE-AS 20 04 973 bekannte Meßvorrichtung den Nachteil, daß eine exakte Bestimmung des Zustands der Reaktion nach einer bestimmten Zeit nicht möglich ist.

Es ist jedoch besonders wünschenswert, eine chemische und/oder physikalische Reaktion bezüglich Ort und Zeit genau definiert vorgeben zu können und außerdem den Zustand des Reaktionspro dukts kontinuierlich und doch immer nach einer vorwählbaren, insbesondere auch sehr kurzen Zeit nach Start dieser Reaktion kernresonanzspektrometrisch untersuchen zu können.

Es ist ferner wünschenswert das Reaktionsprodukt und/oder den Reagenten oder die zur Reaktionskammer geleiteten Reagentien einer jeweils wählbaren Vormagnetisierungszeit in einem mög lichst starken Magnetfeld zu unterwerfen.

Bei der aus der DE-AS 20 04 973 bekannten Meßvorrichtung ist es dagegen nicht möglich, eine Wahl zwischen der Vormagnetisie rung des Reaktionsprodukts einerseits, oder der zugeleiteten Reagenten andererseits zu treffen.

Aus der US 4 246 537 ist bekannt, eine Temperiereinrichtung vorzusehen, die es ermöglicht, die Reaktion bei einer vorbe stimmten Temperatur ablaufen zu lassen.

In J. Phys. E. 1973, Vol. 6, Seiten 1009 bis 1014 ist eine Stop- Flow-Meßvorrichtung beschrieben, die auf der Basis einer Continuous-Flow-Vorrichtung aufgebaut ist, wobei die Beobachtung des Zerfalls von freien Radikalen mit einem ESR in einem vorgeb baren Zeitraum erfolgt. In dieser Druckschrift wird über die Einstellung der zu untersuchenden Startzeit eines Zerfalls nur von der unterschiedlichen Regelung des Flusses gesprochen. Auch hier wird die Reaktionsdauer gemessen und nicht der Zustand des Reaktionsprodukts nach vorgebbaren Zeitpunkten.

In Rev. Sci. Instrum., Vol. 45, No. 1, 1974, Seiten 84 bis 86 ist eine Variante der Apparatur nach der DE-PS 20 04 973 mit rotierendem Probenröhrchen beschrieben. Auch hier ist der Abfluß rückseitig zum Einfluß, und es besteht die gleiche Problematik des Störeinflusses der zuführenden Kapillare zur HF-Spule oder bei größerem Abstand die Gefahr der Nicht-Homogenität des HF- Spulenfelds. Ein definierter Reaktionspunkt wird gemäß dieser Druckschrift nur durch Variation des Flusses und des Innendurch messers des Reaktionsgefäßes eingestellt, nicht jedoch über die Länge der Zufuhr-Kapillare. Es wird auch nichts über Mög lichkeiten und Notwendigkeiten der Vormagnetisierung erwähnt.

Bei der NMR-Messung werden durch ein eingestrahltes HF-Feld Übergänge zwischen im Magnetfeld aufgespaltenen Kernniveaus angeregt. Die Aufspaltung ist proportional zur Magnetfeldstärke. Im thermischen Gleichgewicht sind die Niveaus nach einer Boltzmann-Verteilung besetzt, d. h. die Besetzungszahldifferenz zweier Kernniveaus ist, da man die Exponentialfunktion der Boltzmann-Verteilung entwickeln kann und der lineare Term aus reicht, proportional zum Quotienten aus Magnetfeldstärke und Temperatur. Je höher also bei vorgegebener Temperatur das Mag netfeld ist, desto größer ist die Besetzungszahldifferenz, die wiederum die Meßempfindlichkeit bestimmt. Allerdings stellt sich das thermische Gleichgewicht nicht unmittelbar ein, sondern der zeitliche Verlauf wird bestimmt durch die Relaxationszeit T₁, die üblicherweise im Bereich einiger Sekunden liegt.

Strömt nun ein Reagent aus einem Bereich verschwindender Feld stärke (Gleichbesetzung) in den Bereich des Magnetfelds des NMR-Spektrometers, so nähert sich die Besetzungszahldifferenz nur asymptotisch mit der Zeitkonstanten T₁ dem neuen Gleich gewichtswert an. Das führt dazu, daß bei relativ langen Relaxa tionszeiten T₁ und kurzen Reaktionswegen bzw. Reaktionszeiten, sich in der NMR-Meßzelle die dem dort wirkenden Feld ent sprechende Besetzungszahldifferenz noch nicht eingestellt hat, man also Meßempfindlichkeit verschenkt. Auch bei kurzen vor wählbaren Reaktionszeiten sind ausreichende Vormagnetisierungen zu erreichen. Dabei spielt es grundsätzlich keine Rolle, ob vor oder nach Beginn der Reaktion magnetisiert wird. Selbstverständ lich ist es wünschenswert, daß das Vormagnetisierungsfeld mög lichst hoch ist.

Es ist demnach Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur kernresonanzspektrometrischen Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen so zu verbessern, daß die Bedingungen zur kernresonanzspektrometrischen Erfassung des Zustands der Reaktion bei chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen nach vorwählbarem Zeitpunkt nach Start der Reaktion optimiert und eine bezüglich den Reaktionsbedingungen flexible und für die Vormagnetisierungszeit günstige Anordnung der Reaktionswege ermöglicht werden.

Eine die obige Erfindungsaufgabe lösende Vorrichtung weist die eingangs genannte Merkmalskombination auf.

Die Reaktionskammer befindet sich mit ihren Reagentzu- und -ableitungen im Bereich des Spektrometermagneten jedoch außerhalb des Probenkopfgehäuses an einem Ort, an dem eine genügend hohe Feldstärke herrscht und ist gut zugänglich.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht also die Erfassung des Zustands der Reaktion an einem vorwählbaren Zeitpunkt nach dem Start der Reaktion dadurch, daß kontinuierlich frische Reagentien in die Reaktionskammer nachströmen und dort an einem definierten Punkt jeweils die Reaktion gestartet wird. Die NMR-Messung erfolgt kontinuierlich, wobei der vorwählbare Zeit punkt nach dem Start der Reaktion insbesondere durch Aus tausch der Leitungen im Reaktionsweg verändert werden und insbesondere auch sehr kurz eingestellt sein kann. Die NMR- Messung kann deshalb bei immer gleichen Bedingungen in der NMR- Meßzelle sehr lange andauern. So lassen sich z. B. ohne weiteres zweidimensionale NMR-Messungen ausführen, die sich über viele Stunden erstrecken.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Reagentzu- und -ableitungen jeweils durch Schraubmuffen lösbar an der Reaktionskammer befestigt und haben variable Längen. Die Reagentzu- und -ableitungen stehen über jeweilige durch die Wandungen der Reaktionskammer führende Kanäle mit einem Reaktionsraum im Inneren der Reaktionskammer in Verbindung. Im Reaktionsraum ist ein Filterelement vorgesehen, welches den Reaktionsraum in einen zuleitungsseitigen Abschnitt und einen ableitungsseitigen Abschnitt teilt und optimale Durchmischung gewährleisten.

Dieses Filterelement ist bevorzugt ein Glas- oder Keramikfilter mit Poren vorgegebener Weite.

Die Reaktionskammer ist bevorzugt so gestaltet, daß das Filter element auswechselbar ist und daß der zuleitungsseitige Ab schnitt und der ableitungsseitige Abschnitt des Reaktionsraums durch ein Dichtungselement gegeneinander und gegenüber der Reaktionskammerwand abgedichtet sind.

Die Reaktionskammer ist unmagnetisch.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsart sind Steuer ventile jeweils in den Reagentzu- und ableitungen vor und nach der Reaktionskammer zu Beginn und Ende des Reaktionswegs vor gesehen.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung wird im fol genden anhand der Zeichnung näher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 eine grundsätzliche erfindungsgemäße Meßanordnung zur kernresonanzspektrometrischen Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen;

Fig. 2 eine bevorzugte Ausführungsart einer Reaktionskammer; und

Fig. 3 eine bevorzugte Ausführungsart der erfindungsgemäßen Vorrichtung am Ort des NMR-Spektrometerprobenkopfs.

In Fig. 1 ist schematisch eine erfindungsgemäße Ausführungsform einer Vorrichtung zur kernresonanzspektrometrischen Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen darge stellt. Von einem ersten und zweiten Aufgabebehälter 3 und 3′ werden ein Reagent A und ein Reagent B mittels einer ersten und zweiten Pumpe 4 und 4′ jeweils über Reagentzuleitungen 5 und 6 zu einer Reaktionskammer 10 gepumpt, in der die Reagentien A und B zur Reaktion gelangen. Das Reaktionsprodukt wird durch eine Reagentableitung 7 zu einem NMR-Spektrometerprobenkopf 8 eines NMR-Spektrometers 2 geleitet, in dem in einer NMR-Meßzelle 90 kernresonanzspektroskopisch der Reaktionsverlauf und die Reaktionsprodukte erfaßt werden.

Anstelle der Mischung zweier Reagentien kann auch nur ein Rea gent in der Reaktionskammer physikalisch oder chemisch beein flußt werden, z. B. durch eine Temperieranordnung oder durch eine Laseranregung.

Nachdem das Reaktionsprodukt durch eine Meßkammer im Inneren des NMR-Spektrometerprobenkopfs 8 geführt wurde, wird es in einem Abfallbehälter 28 aufgefangen.

Allgemein beeinflußt die Anordnung der Reaktionskammer 10 sowie der Reagentableitung 7 in dem zwischen den Punkten I und II definierten Reaktionsweg 1 die Dauer und den Verlauf der Reak tion. Wesentliche Parameter dafür sind unter anderem die Länge l₇, der Durchmesser und der Druck in der Reagentableitung 7 sowie Ort, Größe und Beschaffenheit der Reaktionskammer 10. Eine weitere wichtige Reaktionsbedingung ist die Umgebungstem peratur am Ort des Reaktionswegs 1.

Für die kernresonanzspektrometrische Messung des Reaktionsver laufs und der Reaktionsprodukte ist eine Vormagnetisierung sowohl der zur Reaktionskammer 10 geführten Reagentien A und B als auch der Reaktionsprodukte in und nach der Reaktionskammer 10 vorteilhaft, weshalb es zweckmäßig ist zumindest einen Teil des Reaktionswegs 1 im Magnetfeld des NMR-Spektrometermagneten anzuordnen, insbesondere die Reaktionskammer 10, die Reagent ableitung 7 und gegebenenfalls auch einen Teil der Länge der Zuleitungen 5 und 6.

Die in Fig. 2 gezeigte bevorzugte Ausführung der Reaktionskammer 10 besteht aus Kammerwänden 11 und 11′ durch die Zuleitungs kanäle 25 und 26 zu einem im Inneren der Kammerwände 11 und 11′ befindlichen Reaktionsraum 12 und 13 führen. Durch ein Filterelement 19 ist der Reaktionsraum 12, 13 in einen zulei tungsseitigen Abschnitt 12 und einen ableitungsseitigen Ab schnitt 13 eingeteilt. Das Filterelement 19 besteht vorzugsweise aus einem Glas- oder Keramikfilter mit vorbestimmter Porenweite. Das Material der Kammerwandung 11 und 11′ ist bevorzugt ein unmagnetisches, beispielsweise Keramikmaterial PEEK.

Die Reagentzuleitungen 5 und 6 sind mit HPLC-Fittings 15 und 16 lösbar mit der Reaktionskammer 10 so verbunden, daß die Innenbohrungen der Standardfittings 15 und 16 jeweils mit den Kanälen 25 und 26 fluchten. Die Kanäle 25 und 26 münden gemein sam am linken Ende des zuleitungsseitigen Reaktionsraums 12. Der ableitungsseitige Abschnitt 13 des Reaktionsraums führt über einen Ableitungskanal 27 zu einer Reagentableitung 7, die ebenfalls durch ein HPLC-Standard-Fitting lösbar an der Reak tionskammer 10 befestigt ist.

In der in Fig. 2 gezeigten Ausführungsart ist das im Inneren des Reaktionsraums befindliche Filterelement 19 auswechselbar und mittels eines Dichtungselements 14 zu den Kammerwandungen 11 bzw. 11′ hin abgedichtet.

Ferner besteht die Reaktionskammer 10 aus zwei Wandteilen 11 und 11′, welche mittig am Ort des Filterelements 19 geteilt sind. Das Dichtungselement 14 hat demnach ebenfalls die Funktion die Kammerwandungsteile 11 und 11′ nach außen abzudichten.

Die beiden Wandungsteile 11 und 11′ werden durch Schraubbolzen 18 zusammengepreßt, wodurch sich durch die Dichtungswirkung des Dichtungselements 14 der nach außen abgedichtete Reaktions raum 12, 13 ergibt.

Obwohl die in Fig. 2 dargestellte Ausführungsart der Reaktions kammer 10 nur zwei Reagentzuleitungen 5 und 6 mit entsprechenden Kanälen 25 und 26 und eine Reagentableitung 7 in Verbindung mit dem entsprechenden Kanal 27 aufweist, ist es dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich, daß auch mehr als zwei Reagentzu leitungen und mehr als eine Ableitung vorgesehen sein können, falls dies erforderlich ist.

Der Meßraum im Inneren der in Fig. 2 gezeigten Meßkammer 10 kann ebenfalls an die gewünschten Reaktionsbedingungen angepaßt werden und eine andere Form haben, als die in Fig. 2 gezeigte.

Es ist ferner möglich, die Reaktionskammer 10 mit einer Tempe riervorrichtung zu versehen, die es ermöglicht, die Reaktion im Reaktionsraum 12, 13 bei einer vorbestimmten Temperatur ablaufen zu lassen. Auch die Reagentzuleitungen 5, 6 und der Reaktionsweg 7 können jeweils temperiert sein.

Erfindungsgemäß ist die in Fig. 2 dargestellte Reaktionskammer 10 sowie deren Reagentzu- und -ableitungen 5 bis 7 in unmittel barer Nähe des Spektrometerprobenkopfes 8 im Magnetfeld des Spektrometermagneten vorgesehen.

Fig. 3 zeigt eine bevorzugte Ausführungsart der erfindungs gemäßen Vorrichtung am Ort des NMR-Probenkopfs. Die Reaktions kammer 10 ist außerhalb des Probenkopfgehäuses 9 an dessen aus der Spektrometermagnetbohrung ragendem Ende mittels eines Mon tagewinkels 29 befestigt, welcher auch Durchführungen für die von den Pumpen 4 bzw. 4′ (Fig. 1) kommenden Reagentzuleitungen trägt.

Durch den durch die HPLC-Standard-Fittings ausgeführten lösbaren Anschluß der Reagentzu- und -ableitungen an der Reaktionskammer 10 lassen sich die die Längen l₅, l₆ und l₇ (Fig. 1) jeweils der Reagentzu- und -ableitungen variieren. Diese Veränderbarkeit der Längenmaße l₅, l₆ und l₇ der Zu- und Ableitungen 5, 6 und 7 dient, wie schon eingangs erwähnt, zur Veränderung sowohl der Reaktionszeit, als auch der Vormagnetisierungszeit.

Durch die Anordnung der Reaktionskammer 10 in unmittelbarer Nähe des aus dem NMR-Spektrometer ragenden Endes des Proben kopfgehäuses 9 herrscht an dem Ort der Reaktionskammer 10 noch eine beträchtliche hohe Feldstärke, wie sie zur Vormagne tisierung wünschenswert ist. Diese Feldstärke liegt beispiels weise in der Größenordnung 4 Tesla, wenn die Magnetfeldstärke im Inneren der Magnetbohrung des NMR-Magneten 12 Tesla beträgt. Das für die Reagentzu- und -ableitungen 5 bis 7 gewählte Ma terial ist vorzugsweise Teflon, welches auch auf kleinem Raum, beispielsweise durch eine Wendelung einen relativ großen Varia tionsbereich der Längenmaße l₅, l₆ und l₇ der Reagentzu- und -ableitungen gestattet.

Aus Fig. 3 ist ersichtlich, daß die Erfindung nicht auf die Anordnung nur einer Reaktionskammer 10 am dargestellten Ort beschränkt ist. Es können auch noch mehr als eine Reaktions kammer, z. B. zu einer Kaskadenschaltung verbunden sein und in derselben erfindungsgemäßen Weise in unmittelbarer Nähe des Spektrometerprobenkopfs mit den entsprechenden Zu- und Ablei tungen angebracht sein.

Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf die in der Zeich nung beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Vielmehr können die beschriebenen Merkmale der Ausführungsformen sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination in der Erfindung verwirklicht sein.

Claims

1. Vorrichtung zur kernresonanzspektrometrischen (NMR) Messung von chemischen und/oder physikalischen Reaktionsabläufen mit
einem Reaktionsweg (1) der Länge l₇,
einem Kernresonanzspektrometer (2),
einer den Beginn des Reaktionswegs bildenden Reaktions kammer (10), der mindestens ein Reagent über mindestens eine Reagentzuleitung (5, 6) zugeführt wird, und
einer Reagentableitung (7), die die Reaktionskammer (10) mit einer NMR-Meßzelle (90) des Kernresonanzspektrometers (2) verbindet, wobei die Reaktionskammer (10) sowie der Reaktionsweg (1) in unmittelbarer Nähe eines Spektrometer probenkopfs (8) im Magnetfeld des Spektrometermagneten angeordnet sind,
wobei die Reaktionskammer (10) außerhalb des Probenkopf gehäuses (9) und an dessen aus der Spektrometermagnet bohrung ragendem Ende befestigt ist,
und wobei die Reagentableitung (7) lösbar an der Reaktions kammer (10) angebracht ist, sich vollständig im Magnetfeld des Spektrometermagneten befindet und gegen eine andere Reagentableitung mit einer unterschiedlichen Länge ausge tauscht werden kann.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß auch die mindestens eine Reagentzuleitung (5, 6) lösbar an der Reaktionskammer (10) angebracht ist und gegen eine andere Reagentzuleitung mit einer unterschiedlichen Länge ausgetauscht werden kann.

3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (10) und/oder die Reagentzu- und/oder -ableitungen (5, 6, 7) eine Temperiereinrichtung aufweisen.

4. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionskammer (10) einen Reaktionsraum (12, 13) aufweist, der zur Mischung zweier oder mehrerer Komponenten eingerichtet ist.