MXPA00000715A - Analisis de secuencia de acido nucleico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para determinar la secuencia de un polinucleótido, el método comprende los pasos de:(i) hacer reaccionar un polinucleótido adjetivo con una enzima polimerasa inmovilizada en un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, bajo condiciones suficientes para la reacción de polimerasa;y (ii) detectar la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido objetivo, midiendo la radiación.

Description

ANÁLISIS DE SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención está relacionada con un método para determinar la secuencia de un polinucleótido. La habilidad para determinar la secuencia de un polinucleótido es de gran importancia científica. Por ejemplo, el Human Genome Project (Proyecto de Genoma Humano) es un esfuerzo ambicioso internacional para trazar y clasificar los tres billones de bases de ADN codificados en el genoma humano. Cuando está completa, la base de datos de secuencia resultante será una herramienta de poder sin paralelo para la investigación biomédica el obstáculo más importante para completar exitosamente este proyecto está relacionado con la tecnología usada en el proceso para ordenar en secuencia. El método principal generalmente usado para ordenar en secuencia el ADN a gran escala es el método de terminación de cadena. Este método fue desarrollado en principio por Sanger y Coulson (Sanger et al Proc. Nati Asad. Sci. USA 1977; 74: 5463-5467), y "se " basa en el uso de derivados didesoxi de dos, cuatro trifosfatos nucleácidos que están incorporados en la cadena polinucleótida naciente en una reacción polímerasa. Al ser incorporados, los derivados didesoxi terminan la reacción polimerasa y los productos entonces se separan por electroforesis de gel y se analizan para revelar la posición en la cual el derivado didesoxi particular fue incorporado en la cadena. Aunque este método es ampliamente usado y produce resultados confiables, se reconoce que es lento, laborioso y costoso. Un método para ordenar en secuencia alternativo es propuesto en EP-A-0471732, el cual utiliza medios espectroscópicos para detectar la incorporación de un nucleótido en un filamento polinucleótido naciente complementario a un objetivo. El método se basa en el complejo inmovilizado de plantilla e cebador, el cual expone a un flujo que contiene solamente uno de los nucleótidos diferentes. Las técnicas espectroscópicas entonces se utilizan para medir una señal que depende del tiempo que surge del crecimiento totalizado de la polimerasa de la copia de plantilla. Las técnicas espectroscópicas descritas son espectroscópicas de resonancia de plasma de superficie (SPR) , la cual mide los cambios en un analito dentro de un campo de onda evanesciente, y técnicas de medición de fluorescencia, sin embargo, se reconocen las limitantes de este método; las más serias para la técnica SPR siendo que, a medida que el tamaño del filamento de copia crece el tamaño absoluto de la señal también crece debido al movimiento del filamento fuera del campo de onda evanesciente, haciendo más difícil detectar los incrementos. Las técnicas de medición de fluorescencia tienen la desventaja de interferencia de fondo incrementada de los fluorofósforos incorporados en la cadena polinucleótida naciente en crecimiento. A medida que la cadena crece, el "ruido" de fondo aumenta y el tiempo requerido para detectar cada incorporación de nucleótido necesita hacer incrementado. Esto severamente restringe el uso del método para ordenar en secuencia grandes polinucleótidos . Por lo tanto existe la necesidad de un método mejorado para determinar la secuencia de polinucleótidos el cual significantemente aumente la velocidad a la cual un polinucleótido es ordenado en secuencia y el cual sea preferentemente llevado a cabo mediante un proceso automatizado, reduciendo la complejidad y el costo asociado con los métodos existentes. La presente invención está basada en la realización de que la medición de la radiación electromagnética u otro tipo de radiación se pueden utilizar para detectar un cambio en conformación y/o en masa en una enzima polimerasa el cual ocurre cuando un nucleótido es incorporado en un filamento polinucleótido naciente. De acuerdo con la presente invención, un método para ordenar en secuencia un polinucleótido comprende los pasos de: (i) hacer reaccionar un polinucleótido objetivo con una enzima polimerasa y movilizada en un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, bajo condiciones suficientes para la reacción polimerasa; y (ii) detectar la incorporación de un nucleótido especifico complementario al polinucleótido, objetivo, midiendo la radiación. La radiación se puede aplicar a una muestra utilizando un numero de técnicas, incluyendo las técnicas de detección sensibles a la superficie, donde un cambio en la respuesta óptica en una superficie óptica sólida se utiliza para indicar una interacción de unión en la superficie. En una modalidad preferida de la invención, la técnica utilizada es la espectroscopia de onda evanesciente, en particular una espectroscopia de resonancia de plasma de superficie (SPR) . En una modalidad de la invención, los nucleótidos utilizados en el método incluyen un grupo de bloque en la posición 3' y opcionalmente en la posición 5', lo cual evita la incorporación de nucleótidos dentro del filamento polinucleótido. Sin embargo, los grupos de bloqueo se pueden remover selectivamente para permitir que la incorporación ocurra. Al utilizar los nucleótidos bloqueados, es posible que el método se pueda llevar a acabo utilizando todos los nucleótidos presentes en la reacción a cualquier hora. La remoción selectiva de los grupos de bloque se lleva a acabo en una manera que asegura la detección de cada nucleótido incorporado. El método, por lo tanto, puede proceder en base al "tiempo real", para lograr una alta velocidad de análisis de secuencia. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención será descrita por medio del ejemplo solamente haciendo referencia a los siguientes dibujos, en donde : la Figura 1 es una ilustración esquemática de un análisis de secuencia polinucleótida utilizando una espectroscopia SPR; y la Figura 2. ilustra las diferentes señales de respuesta detectada para la polimerización de cada uno de los diferentes nucleótidbs; la Figura 3 ilustra el procedimiento de síntesis para los nucleótidos bloqueados dobles; el presente método para ordenar en secuencia un polinucleótido involucra el análisis de la interacción cinética entre una enzima polimerasa, un polinucleótido objetivo y un nucleótido complementario. La medición de la interacción cinética se lleva a acabo verificando los cambios en la absorción de radiación electromagnética u otro tipo de radiación que ocurra si la reacción procede. El término "polinucleótido", como se utiliza aquí deberá ser interpretado ampliamente, e incluye ADN y ARN, incluyendo ADN y ARN modificados, al igual que otras moléculas tipo ácido nucleico hibridizadas, por ejemplo ácido nucleico péptido (PNA) . Típicamente, el método se lleva a cabo aplicando radiación electromagnética, utilizando las técnicas de resonancia de plasmón de superficie o resonancia magnética nuclear. Sin embargo, otras técnicas las cuales miden los cambios en la radiación se pueden considerar por ejemplo, la espectroscopia mediante florescencia de reflexión interna total (TIRF) , reflexión total atenuada (ATR) , reflexión total frustrada (FTR) , reflectometria de ángulo Bre ster, reflexión interna total esparcida (STIR) o elipsometria de onda evanesciente . Otras técnicas diferentes a aquellas que requieren radiación electromagnética también se pueden imaginar, en particular técnicas fotoquímicas como la quimioluminiscencia, y las técnicas grabimétricas incluyendo sistemas resonantes como técnicas de onda acústica de superficie (SAW) y técnicas de micro equilibrio de cristal de cuarzo (QCM) . La espectroscopia de resonancia de plasmón de superficie (SPR) es un método preferido, y mide las propiedades de una solución detectando las diferencias en el índice de refracción entre la fase de volumen de la solución y la región de onda evanesciente. La luz monocromática incidente se refleja en un ángulo específico en una superficie óptica sólida (chip sensor) en el lado opuesto a una muestra bajo estudio. La luz se extiende dentro de la muestra por una distancia muy corta y es afectada por la interacción en la superficie. Los chip de sensor adecuados se conocen en la técnica. Típicamente, comprenden un material ópticamente transparente, por ejemplo vidrio, y una película delgada reflectora, por ejemplo, plata u oro. Para un resumen de la espectroscopia SPR ver la Patente Europea con numero de Publicación No. 0648328 (toda la descripción de la cual se incorpora aquí por referencia) . La espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR) es otro método preferido, y mide las propiedades magnéticas de los compuestos. Los núcleos de los compuestos se orientan energéticamente mediante una combinación de radiación de radiofrecuencia y de campo magnético aplicadas. Cuando la energía ejercida sobre un núcleo es igual a la diferencia de energía entre los estados espín (la diferencia entre la orientación paralela o antiparalela a la dirección de los campos aplicados), una condición conocida como resonancias es lograda. La absorción y la emisión subsecuente de energía asociada con el cambio de un estado espín al otro, se detecta mediante un receptor de radiofrecuencia. Un aspecto importante del método de la presente invención es el uso de una enzima polimerasa inmovilizada sobre un soporte sólido. La inmovilización de la polimerasa ofrece varias ventajas importantes para el éxito de este método. Primero, el problema de "ruido" aleatorio asociado con la medición de absorción de energía en moléculas solubles se reduce considerablemente. Segundo, el problema de ruido de la interacción de cualquier substrato (por ejemplo, nucleótidos) que no están directamente implicados con la polimerasa se reduce, ya que la polimerasa se puede mantener dentro de un área específicamente definida con relación al campo de medición. Esto es particularmente relevante si la técnica utilizada para medir los cambios en la radiación requiere la medición de fluorescencia, como en TIRF, donde la fluorescencia de fondo aumenta a medida que la cadena naciente crece. También, si la espectroscopia SPR es utilizada, las reacciones polimerasas se mantienen dentro del campo de onda evanesciente y de está manera se pueden lograr mediciones exactas sin tomar en cuenta el tamaño del polinucleótido. Finalmente, ya que ni el polinucleótido objetivo y el cebador polinucleótido están irreversiblemente unidos a la superficie sólida, es relativamente simple regenerar la superficie, para permitir que reacciones de ordenamiento de secuencia adicionales se lleven a acabo utilizando la misma polimerasa inmovilizada. La inmovilización se puede llevar a acabo utilizando procedimientos estándar conocidos en al técnica. En particular, la inmovilización utilizando procedimientos de acoplamiento de amina estándar se pueden utilizar, con la unión de aminas asociadas ligandos a, digamos, una superficie activa por éster N-hidroxisuccinamida o dextrano. En una modalidad preferida de la invención, la polímerasa se inmoviliza sobre la superficie del chip sensor SPR el cual mantiene la polimerasa en proximidad cercana a la superficie del sensor donde los cambios en el índice de reflexión se pueden medir. Ejemplos de procedimientos usados para inmovilizar las biomoléculas en sensores ópticos se describen en EP-A-0589867 y Lofas et al . , Biosens. Bioelectron. (1995) 10:813-822. La polimerasa utilizada en la invención puede ser de cualquier tipo conocido por ejemplo, la polimerasa puede ser cualquier polimerasa ADN dependiente de ADN. Si el polinucleótido objetivo es una molécula de ARN, entonces la polimerasa puede ser una polimerasa ADN dependiente de ARN, es decir replicasa ARN. En una modalidad preferida de la invención, la polimerasa es la polimerasa Taq. En una modalidad preferida adicional de la invención, la polimerasa es ya sea E. Coli polymerase III holoenzyme (McHenry, Ann. Rev. Biochem. 1988; 57:519), T7 polimerasa (Schwager et al . , Methods in Molecular y Cellular Biology (1989/90); Vol.1(4) : 155-159, o polimerasa de Bacteriofaga T7 gen 5 complexada con E. Coli Thioredoxin (Tabor et al . , J.Biol Chem. (1987); 262:1612-1623). Cada una de estas enzimas polimerasas permite que la unión con el polinucleótido objetivo ocurra con una alta fidelidad y por lo tanto mantiene un complejo de polimerasa-polinucleótido, aún cuando la polimerización no se está llevando a cabo activamente. La haloenzi a polimerasa III está compuesta de tres subensambles que funcionan para crear la enzima procesiva: (I) el núcleo de polimerasa, incluyendo la subunidad de polimerasa ; (II) la subunidad ß-dímero la cual actúa como una estructura en forma de brazaleta alrededor del ADN; (III) un subensamble de dos subunidades, t y ?, utilizado para unir e hidrolizar el ATP para formar el ß-dímero alrededor del ADN. Como primer paso en el proceso de ordenamiento por secuencia, el polinucleótido objetivo puede encontrarse en contacto con un cebador apropiado en el amortiguador de hibridización/polímerización. Típicamente, el amortiguador estará a una temperatura suficientemente alta para romper (o fundir) cualquier estructura secundaria que exista en el polinucleótido objetivo. Al enfriarse, el cebador se templará a su complemento en el objetivo. Está muestra entonces se puede poner en contacto con la polimerasa inmovilizada, para formar el complejo de polinucleótido/polimerasa objetivo. En una modalidad de la invención, la adición de los nucleótidos se controla para que los diferentes nucleótidos sean adicionados secuencialmente al complejo de polimerasa objetivo. Por ejemplo, dGTP se puede adicionar, y se permite que fluya sobre el complejo de polimerasa/nucleótido; cualquier incorporación entonces es detectada. El dGTP no unido fluye fuera del sitio de reacción y se introduce un nucleótido adicional. De está manea, la detección de una interacción cinética se puede correlacionar con el nucleótido particular presente a esa hora y la secuencia de polinucleótido por lo tanto se puede determinar. El método también se puede llevar a cabo con todos los nucleótido diferentes presentes. Para que esto se lleve a cabo exitosamente, es necesario que los nucleótidos se incorporen en un grupo de bloque por lo menos en la posición 3', pero preferentemente en las posiciones 3 'y 5'. Los grupos de bloque pueden ser sensibles a la luz y se pueden remover aplicando luz de una longitud de onda definida, para liberar la molécula activa. Si los nucleótidos incorporan los grupos de bloqueo tanto en la posición 3' como en la 5', los grupos de bloque deberán ser capaces de ser distinguidos en base a su absorbencia espectral, es decir, deberá ser posible remover selectivamente uno de los grupos de bloqueo aplicando una longitud de onda especifica de luz la cual no remueva otro grupo de bloqueo. También es deseable que el grupo de bloqueo en la posición 3' requiera que la luz sea aplicada durante un periodo más largo de tiempo que lo que es requerido para remover el grupo de bloqueo en la posición 5'.

Esto permite que los grupos de bloqueo sean distinguidos tanto por medios espectrales como temporales. Generalmente, los grupos de bloqueo sensibles a la luz sufren fotolisis a longitudes de onda en el rango de 200nm a 450nm. Los grupos de bloqueo típicamente se derivarán de un compuesto de la formula R1 - [O-CO-jX en donde R1 es un grupo fotolabil y X es un grupo de salida. Por ejemplo, R1 es o-nitrobencilo . Los grupos de bloqueo particularmente preferidos incluyen los grupos de protección de o-nitrobencilo descritos en O-A-92/10092 y WO-A97/39151. Estos grupos incluyen nitroveratriloxicarbonilo (NVOC) , nitropipe-roniloxicarbonilo (NPOC) , a-metil-nitroveratriloxicarbonilo (MeNVOC) , a-metil- nitropiperoniloxicarbonilo (MeNPOC) y 1-pirenilmetiloxicarbonil (PYMOC) . - Un grupo de bloqueo 3 'adecuado es un grupo (4,5-dimethoxi-2-nitrobenzil) oxicarbonilo el cual debe estar formado por la reacción del nucleótido con un compuesto de la formula (I) : (i ) en donde R es cualquier grupo de esterificación adecuado, por ejemplo metilo. Este grupo de bloqueo se puede remover selectivamente mediante una pulsación de luz con una longitud de onda de 360 nm. Un grupo de bloqueo adecuado en la posición 5' es el grupo 1- (2-nitrofenil) etilo de la formula ( II) : en donde R es cualquier grupo funcional adecuado, por ejemplo, halógeno. Este grupo de bloqueo puede ser selectivamente removido a una longitud de onda de 260 nm. Amanera de ejemplo, los nucleótidos bloqueados dobles se inyectan sobre el polinucleótido objetivo cebador (que se mantiene en asociación con un complejo de polimerasa de alta fidelidad) , y se enfoca luz monocromática corriente arriba de la polimerasa a una longitud de onda suficiente para liberar el grupo de bloqueo del fosfato terminal de cada nucleótidos-. Los nucleótidos entonces son capaces de fluir sobre la polimerasa unida, y la incorporación dentro de el filamento polinucleótido naciente puede ocurrir. Sin embargo, a medida que el grupo de bloqueo en la posición 3' permanece unido, solamente un nucleótido es incorporado. Una medición de interacción cinética por lo tanto, proporcionara la información en cuanto al nucleótido particular incorporado dentro de la cadena naciente. La polimerasa utilizada puede ser una polimerasa de alta fidelidad la cual no se separa fácilmente del objetivo cuando la reacción se detiene alternativamente, un inhibidor competitivo puede ser utilizado para evitar que la polimerasa se separe del objetivo. Después de medir el nucleótido incorporado, se enfoca una pulsación de luz monocromática en el grupo de bloqueo dentro del sitio catalítico de polimerasa, para remover el grupo de bloqueo en la posición 3'. La luz monocromática puede ser pulsada durante un periodo de tiempo más largo que aquel requerido para la remoción en la posición 5', y de está manera solamente el grupo de bloqueo asociado con el nucleótido en el complejo de polimerasa sufrirá la remoción. Esto reduce la probabilidad de la adición de n'ucleótidos no asociados con el complejo de polimerasa. Una vez que el grupo de bloqueo 3' es. liberado, se permite que la reacción de polimerasa continúe hasta que los nucleótidos alcancen el lugar de reacción de la polimerasa. Se evita la polimerización no controlada alternando las pulsaciones de luz requeridas para remover los grupos de bloqueo.

Mientras que se prefiere utilizar los nucleótidos bloqueados dobles, como se describió anteriormente, el procedimiento también se puede llevar a cabo utilizando nucleótidos que tienen un grupo de bloqueo en l'a posición 3' solamente. En este caso, es deseable utilizar un inhibidor competitivo de la polimerasa, el cual reducirá la probabilidad de que un nucleótido que carece de un grupo de bloqueo en la posición 3' se a incorporado dentro de la cadena naciente. Un inhibidor competitivo adecuado de la polimerasa es carbonildifosfonato (COMDP) . El siguiente ejemplo ilustra la invención haciendo referencia a los dibujos. Ej emplo El siguiente análisis se llevo a cabo en un sistema BIAcore 2000 modificado (BIAcore AB, UPPSALA, S.weden) con un chip de sensor CM5 (Grado de Investigación, BIAcore AB) como la superficie sensora óptica. El instrumento fue proporcionado con un cartucho µm-fluídico integrado (IFC) el cual permite el análisis en cuatro celdas mediante una sola inyección de muestra. Preparación de la polimerasa Se preparo la holoenzima de polimerasa III E. Coli de acuerdo con (Millard et al . , Methods Enzymol . (1995); 262: 22) utilizando la cromatografía de interacción hidrofóbica en valyl-Sefaróse, para purificar la holoenzima a altas concentraciones de sal. Después de la purificación, la enzima hueca se concentro utilizando la técnica de filtración de ion descrita por Kirkegaard et al, Anal Biochem. (1972); 50:122. Inmobilización de la Polimerasa La inmobilización de la polímerasa en la superficie del chip sensor se llevo a cabo de acuerdo con (Jónsson et al., Biotechniques (1991); 11:620-627). Brevemente, el medio del chip sensor equilibrado con un amortiguador (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% agente tensoactivo P20 (BIAcore AB, Uppsala, Sweden) , pH 7.4) . Volúmenes iguales de N-hidroxisuccinimida (0.1 M en agua) y N-etil-n'- (dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (0.1 M en agua) se mezclaron y se inyectaron a través de la superficie del chip (CM5), para activar, el dextranocarboximetilatado . El núcleo de Subensamble de polimerasa III (160 µl, 500 U) se mezcló con 10 mM de acetato de sodio (100 µl, pH 5) y se inyecto a través de la superficie activada. Finalmente, los esteres N-hidroxisuccinimida residuales en la superficie del chip sensor se hicieron reaccionar con etanolamida (35 µl, 1 M en agua, pH 8.5), y la polimerasa no unida se lavo de la superficie. El procedimiento de inmovilización se realizo con un flujo continuo de amortiguador Hepes (5 µl/min) a una temperatura de 25 °C. Oligonucleótidos Se sintetizaron dos oligonucleótidos utilizando la química de fosforamidita estándar. Los oligonucleótidos definido como SEC. DE IDENT. NO. 1 se utilizó como el polinucleótido objetivo, y el oligonucleótido definido como SEC. DE IDENT. NO. 2 se utilizó como el cebador. CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTA?GGAACGGACGAGAGAAGGGAG?G SEC.IDENT.NO. 1 CTCTEEETTCTCTCGTC SEC. IDENT. NO. 2 Los dos oligonucleótidos se hicieron reaccionar bajo condiciones de hibridización para formar el complejo de cebador objetivo. El ADN cebador entonces fue suspendido en un amortiguador (20 mM tris-HCl, pH 7.5, 8 mM MgCl2, 4% (v/v) glicerol, 5 mM ditiotreitol (DDT) µg albúmina de suero bovino) conteniendo 21 µg de proteína de unión ssADN y el subensamble de ADN pol III, requerido para formar la estructura en forma de brazalete (1.6 pmol ß-dímero y 195 fmol Y subunidades) . 0.5 mM ATP estuvieron presentes junto con 60 µM carbonildisfosfonato (COMDP) . En esta reacción, la subunidad Y actúa como un promotor molecular, hidrolizando el ATP para colocar las subunidades ß-dímero sobre el ADN para formar el subensamble de polimerasa (Studwell et al, UCLA Symp. Mol Cell. Biol. New Ser. 1990; 127: 153). El complejo cebado de ADN/sub-ensamble entonces fue inyectado sobre la polimerasa III en la superficie del chip sensor a una velocidad de flujo de 5 µm/min, y se permitió que se uniera a la polimerasa mediante la acción de las subunidades Y.

En este experimento, se necesita magnesio y ATP para que el Pol III se una al ADN cebado. Sin embargo, el magnesio también promueve la remoción del cebador mediante el cotejo de la actividad exonucleasa — >5 ' este problema se evita incluyendo el carbonildifosfonato, el cual es un inhibidor competitivo de la actividad polimerasa (un pol III que carece de la actividad exonucleasa 3—»5 ' se puede utilizar para evitar este problema particular) . Un flujo continuo de 60 µM de carbo?ildifosfonato se mantuvo sobre la superficie del chip, para evitar que la actividad dexonucleasa removiera el cebador del ADN objetivo. Nucleótidos que Incorporan dos Grupos de Bloqueo Cada nucleótido (dCTP, dTTP, dGTP y dATP) contenía un grupo de bloqueo 1- (2-nitrofenil) etilo en la posición 5', y un grupo de bloqueo (4, 5-dímethoxi-2-nitrobenzil) oxicarbonilo en la posición 3' como se muestra en la Figura 3. La síntesis de los nucleótidos bloqueados dobles fue como sigue: etapa 1: - Síntesis de trifosfato (4, 5-dimethoxi-n'itrobenzyl) oxicarbonil-núcleosido. El mismo método general se aplicó a .dGTP, dCTP y dTTP. Una mezcla de dihidrato de dATP (0.4mmol) y aproximadamente 3mmol de 4 , 5-dimethoxi-2-nitrofenil-diazomethano, frescamente preparada a partir de 900mg (4 mmol) de 4 , 5-dimethoxi-2-nitrofenilhydrazone (sintetizada por tratamiento de 6-nitroveralidehido con monohidrato de hidrazina en cloroformo mediante el procedimiento de ootton and Trentham, Photochemical Probes in Biochemistrry (Nielsen, P.E., Ed) NATO ASI Ser. C, Vol. 272, p277-296 (1989), se agitó en 15 ml de DMSO a temperatura ambiente en la obscuridad durante 40 horas. La verificación de la reacción mediante TLC en un sistema de solvente de cloroformo/metanol (5:1 v/v) reveló la aparición de una mancha con Rf 0.54 que corresponde al nucleótido inmovilizado. El DMSO, el compuesto diazo sin reacción, y los productos de la reacción con baja polaridad se removieron mediante la extracción repetitiva con 60 ml de éter. El material residual, el cual, junto con otras sustancias, contenía el nucleótido no reaccionado y el p'roducto deseado, se disolvió en una cantidad mínima de cloroformo y se separo mediante una cromatografía rápida en una columna de sílice (3 x 30 cm) . La elución utilizando 100% de cloroformo y metanol/cloroformo (95:5 v/v) removió los productos secundarios hidrofóbicos de 4, 5-dimethoxi-2-nitrofenildiazomethano de la columna. Las fracciones se secaron en un evaporador giratorio. 78 mg del producto inmovilizado entonces se liofilizaron. La producción general fue de 45%. El 4, 5-dimetiloxi-2-nitrobenzil oxicarbonilo dATP de bloqueo 3 ' fue aislado directamente con más pureza mediante el HPLC de fase inversa preparatoria del producto crudo . Etapa 2:- Adición del grupo 5 ' 1- (2-nitrofenil ) etilo a dATP bloqueado 4 , 5-dimetiloxi-2-nitrobenzil oxicarbonilo.

Una mezcla de 5' dATP 4 , 5-dimetiloxi-2-nitrobenzil oxicarbonilo (0.4 mmoles) y aproximadamente 3mmol de 1- (2-nitrofenil) diazoethano, frescamente preparada a partir de 716.7 mg (4mmol) de hidrazona de 2-nitroacetofenona (sintetizada por el tratamiento de 2-nitroacetofenona con monohidrato de hidrazina- en etanol) y 2.9g (30mmol) de Mn02 (90%) en 20 ml de cloroformo mediante el procedimiento de Waiker et al (Waiker et al, Methods Enzy ol . 1989; 288-301), se agitó en 15 ml de DMSO a temperatura ambiente en la obscuridad durante 40 horas. La verificación de la reacción por TLC en un sistema de solvente de cloroformo/metanol (5:1 v/v) revelo la aparición de un par de manchas con Rf 0.68 y Rf 0.58, correspondientes a los dos diastereoisómeros de la forma axial y los dos diastereoisómeros de la forma ecuatorial del 1 (2-nitrofenil) etil éster del 4 , 5-dimetiloxi-2-nitrobenzyl oxicarbonilo 5' dATP, respectivamente. El DMSO, el compuesto d'iazo sin reacción, y los productos de reacción con baja polaridad se removieron mediante la extracción repetitiva con 50 ml de éter. El material residual, el cual contenía entre otras sustancias 4 , 5-dimetiloxi-2-nitrobenzyl oxicarbonilo 5' dATP sin reacción y el dATP bloqueado doble deseado se disolvió en una cantidad mínima de cloroformo y fue separado mediante una cromatografía instantánea en una columna de sílice de 3 x 30 cm. La elución utilizando 100% cloroformo removió los productos secundarios hidrofóbicos de 1- (2-nitrofenil) diazoetano de la columna. El- producto se seco en un evaporador giratorio. La liofilización proporcionó 74 mg del compuesto inmovilizado. El rendimiento general fue de 57%. 0.2 mM de cada nucleótido estuvo presente en el amortiguador de polimerización (1 mM Tris-HCL pH 8.8, 5 mM KCL, 0.15 mM MgCl2, 0.01 % (w/v) gelatina). Ordenamiento por Secuencia del ADN La Figura 1 muestra un sistema sensor SPR y una celda (7), fluídica que tiene un medio para aplicar radiación (1) electromagnética a un chip 2 sensor con una enzima (3) de polimerasa inmovilizada en la superficie del* sensor, una entrada (4) para introducir los diferentes nucleótidos en la celda y dos ensambles (5) y (6) de enfoque para pulsar luz monocromática dentro de la celda. Los diferentes nucleótidos introducen dentro de la celda (7) fluídica a una velocidad de flujo de 30 µl/min., a una temperatura de 25°C y a una velocidad de recolección de datos de 10 Hz. A medida que los nucleótidos pasan por el ensamble (5) de enfoque de luz, la luz monocromática a una longitud de onda de 260 nm se pulsa para remover el grupo de bloqueo en la posición 5'. Los nucleótidos entonces fluyen sobre el chip (2) sensor y hacen contacto con el complejo (3) de polinucleótido/polimerasa objetivo el cual se mantiene en su lugar mediante el subensamble de ß-dímero. Ya que la posición 3' en la secuencia de cebación está libre para reaccionar, la polimerización puede llevarse a acabo a medida que un nucleótido se incorpora en su complemento en el polinucleótido objetivo. Esta incorporación entonces se detecta mediante la luz monocromática p-polarizada del dispositivo SPR. No sucede ninguna polimerización adicional, ya que el nucleótido incorporado tiene un grupo de bloqueo en la posición 3'. La luz monocromática con longitud de onda de 360 nm entonces se hace pulsar mediante el ensamble (6) de enfoque en el sitio de polimerización. La alta velocidad de flujo de la celda fluídica asegura que los nucleótidos no unidos a la polimerasa se remuevan de la celda antes que la suficiente energía ha sido absorbida para liberar sus grupos de bloqueo 3'. Una vez que el grupo de bloqueo 3' ha sido liberado del nucleótido polimerizado, una polimerización adicional puede ocurrir. La Figura 2 muestra los resultados del experimento de ordenamiento por secuencia siendo detectado cada nucleótido incorporado en la cadena naciente. Los resultados muestran una secuencia complementaria a aquella de la SEQ ID NO. 1.

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. Método para ordenar por secuencia un polinucleótido, que comprende los pasos de: (i) hacer reaccionar un polinucleótidd objetivo con una enzima polimerasa inmovilizada en un soporte sólido, y los diferentes nucleótidos, bajo condiciones suficientes para la reacción polimerasa; (ii) detectar un efecto " consecuente en la incorporación de un nucleótido específico complementario al polinucleótido objetivo.
2. 2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el efecto en el paso (ii) es detectado midiendo la radiación.
3. 3. Método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque los. pasos (i) y (ii) se conducen con cada uno de los nucleótidos diferentes en turno¿ hasta que se detecta la incorporación, y luego se repite .
4. 4. Método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el paso (i) es conducido con todos los nucleótidos presentes.
5. 5. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los nucleótidos comprenden un grupo de bloqueo 3 ' el cual se remueve después de la reacción polimerasa.
6. 6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el grupo de bloqueo se puede selectivamente remover mediante la pulsación de luz monocromática .
7. 7. Método de conformidad con la reivindicación 5 o reivindicación 6, caracterizado porque los nucleótidos comprenden un grupo de bloqueo adicional en el grupo fosfato terminal de la cadena trifosfato, y el grupo de bloqueo adicional se remueve antes de la remoción del grupo de bloqueo 3 ' .
8. 8. Método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el grupo de bloqueo adicional se puede selectivamente remover mediante la pulsación de luz monocromática bajo condiciones diferentes aquellas requeridas para remover el grupo de bloqueo 3'.
9. 9. Método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el grupo de bloqueo adicional se remueve mediante la pulsación de luz monocromática por una duración diferente a aquella requerida para remover el grupo de bloqueo 3 ' .
10. 10. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (i) además comprende introducir un inhibidor competitivo para la enzima polimerasa.
11. 11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polinucleótido objetivo del paso (i) se une a la enzima polimerasa mediante un complejo ß2 dímero.
12. 12. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la polimerasa es polimerasa (III) ADN E. Coli o polimerasa T7.
13. 13. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la polimerasa es una polimerasa Taq.
14. 14. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque en donde la polimerasa es transcriptasa inversa.
15. 15. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (ii) comprende la detección de un cambio en una señal de resonancia sobre tiempo.
16. 16. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la radiación es electromagnética.
17. 17. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la radicación electromagnética está en el espectro infrarrojo.
18. 18. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el paso (ii) comprende utilizar una resonancia de plasmón de superficie .
19. 19. Método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la radiación electromagnética está en el espectro de radio frecuencia.
20. 20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la incorporación de un nucleótido se detecta utilizando NMR.
21. 21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polinucleótido es ADN.
22. 22. Un chip sensor que comprende una enzima polimerasa inmovilizada sobre este.
23. 23. Nucleótido que comprende un grupo de bloqueo en la posición 3' y en el grupo fosfato terminal de la cadena de trifosfato, en donde los dos grupos de bloqueo se pueden remover mediante la luz monocromática de diferentes longitudes de onda.
24. 24. Nucleótido de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque los grupos de bloqueo -se derivan de un compuesto de la formula en donde R1 es un grupo fotolabil y X es un grupo de salida.
25. 25. Nucleótido de conformidad con la reivindicación 23 o reivindicación 24, caracterizado porque el grupo de bloqueo en la posición 3' es un grupo o-nitrobenziloxicarbonilo.
26. 26. Nucleótido de conformidad con la reivindicación 23 a 25, caracterizado porque el grupo de bloqueo en el fosfato terminal es un grupo s-nitrobenzilo.
27. 27. Nucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 caracterizado porque el grupo de bloqueo en la posición 3 'es un grupo (4 , 5-dimetoxi-2-nitrobenzil) oxicarbonilo .
28. 28. Nucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27 caracterizado porque el grupo de bloqueo en el fosfato terminal es un grupo 1- (2-nitrofenil) etil.
29. 29. Aparato para ordenar en secuencia un polinucleótido, que comprende un chip sensor óptico, una fuente de luz, un dispositivo formador de imágenes y un fotodetec-tor, en donde el chip sensor es como se define en la reivindicación 22.