JP2001511358A

JP2001511358A - 核酸配列の解析

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Publication number: JP2001511358A
Application number: JP2000504282A
Authority: JP
Inventors: ダニエル・ヘンリー・デンシャム
Original assignee: Medical Biosystems Ltd
Current assignee: Medical Biosystems Ltd
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2001-08-14
Also published as: EP2267165A2; WO1999005315A2; AU735898B2; ATE225858T1; EP1017848A2; CA2294962A1; DE69808661T2; BR9812270A; EP2267164A3; US20040241719A1; EP1017848B2; KR20010022392A; EP2267165A3; IL133411A; IL133411A0; EP1229133A2; ES2183394T5; WO1999005315A3; US7008766B1; CN1265158A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ポリヌクレオチドの配列を決定する方法に関する。この方法は、工程（ｉ）標的ポリヌクレオチドを、固相支持体に固定化したポリメラーゼ酵素および別異のヌクレオチドと、ポリメラーゼ反応に十分な条件で反応せしめ、（ii）標的ポリヌクレオチドに相補的な特殊なヌクレオチドを放射の測定により検出することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ポリヌクレオチドの配列を決定する方法に関する。

【０００２】（発明の背景）ポリヌクレオチドの配列を決定する能力は、非常に科学的に重要である。例え
ば、ヒトゲノム計画は、国際的な大掛かりな実施であって、ヒトゲノムのコード
ＤＮＡについて３百万にもなる塩基のマップをつくり配列決定を行うものである
。完成すると、その配列データベースは、生物医学研究に他に比肩できない有用
な道具となる。この計画を成功裡に完成さすのに主な障害となるのは、配列決定
の過程で用いられる技術である。

【０００３】大規模なＤＮＡ配列決定について一般的に用いられる主な方法は、鎖終結法で
ある。この方法は、最初サンガーおよびクルソン(Sanger et al. Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 1977; 74: 5463-5467) により開発され、ポリメラーゼ反応において未完成ポリヌクレオチド鎖に組込まれる４ヌクレオシドトリホスフェートの
ジデオキシ誘導体を利用する。組込みに際し、ジデオキシ誘導体がポリメラーゼ
反応を終了し、産物をゲル電気泳動で単離し分析すると、特定のジデオキシ誘導
体の鎖中に組込まれた部位が明らかになる。

【０００４】この方法は、広く用いられ信頼できる結果をもたらすが、時間と人手がかかり
、費用が高くつく。

【０００５】別の配列決定方法がＥＰ−Ａ−０４７１７３２に提案されている。これは、分
光手段を用いて、ヌクレオチドが標的に相補的な未完成ポリヌクレオチド鎖に組
込まれるのを検出する。この方法は鋳型とプライマーとの固定複合体を基として
いる。複合体は別異のヌクレオチドの１つのみを含有する流れに接触する。分光
法を用いて、鋳型複製のポリメラーゼ触媒生成から起きる時間依存的シグナルを
測定する。記載の分光法は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分光法および蛍光測
定法である。前者はエバネセント波場内の分析物の変化を測定する。しかし、こ
の方法には限界がある。ＳＰＲ法で最も深刻な問題は、複製鎖の大きさが増すに
つれて、シグナルの絶対的な大きさもエバネセント波場からの鎖の運動により増
加して、増加量を検出するのが困難になることである。蛍光測定法は、増加しつ
つある未完成ポリヌクレオチド鎖上に組込まれた蛍光体からの背景干渉が増すと
いう欠点がある。鎖が増すにつれ、背景「ノイズ」が増加し、各ヌクレオチド組
込みの検出に要する時間が増加する。このことのために、大きいポリヌクレオチ
ドの配列決定について利用するのが制限される。

【０００６】したがって、ポリヌクレオチドの配列を決定するための改良法が求められてい
る。改良法は、ポリヌクレオチドの配列決定を行う速度が顕著に速くなったもの
であり、好ましくは自動的に実施できるものであって、既存の方法における複雑
さおよび費用を減少するべきである。

【０００７】（発明の要旨）本発明は、ヌクレオチドが未完成ポリヌクレオチド鎖に組込まれるときに生じ
るポリメラーゼ酵素における立体配座および／または質量の変化を、電磁波など
の放射の測定により検出し得たことに基づいている。

【０００８】本発明によると、ポリヌクレオチドの配列決定する方法は次の工程を含む。（ｉ）標的ポリヌクレオチドを、固相支持体に固定化したポリメラーゼ酵素およ
び別異のヌクレオチドと、ポリメラーゼ反応に十分な条件で反応せしめ、（ii）標的ポリヌクレオチドに相補的な特殊なヌクレオチドの組込みを放射の測
定により検出する。

【０００９】サンプルに適用される放射について多数の技法がある。その１つである表面感
度検出法においては、固相面での光応答の変化を用いて、表面での結合相互作用
を表示する。本発明の好ましい実施態様では、エバネセント波分光法、特に表面
プラズモン共鳴（ＳＰＲ)分光法が用いられる。

【００１０】本発明の実施態様において、その方法で使用されるヌクレオチドは、３’位お
よび選択的に５’位での遮断基を含む。この基はヌクレオチドのポリヌクレオチ
ド鎖への組込みを防止する。しかし、遮断基は選択的に除去されて、組込みが起
こり得るようになる。遮断されたヌクレオチドを用いることにより、方法の実施
が反応中に存在するすべてのヌクレオチドを１度に使用して可能となる。遮断基
の選択的除去は、各組込ヌクレオチドの検出ができるように行われる。従って、
“実時間”方式で方法が進められ、配列解析が高速で達成される。

【００１１】（図面の説明）本発明は、下記の図面を参考としてのみ例示的に記載される。図１は、ＳＰＲ分光法を用いたポリヌクレオチド配列解析の模式図である。図２は、別異のヌクレオチドの各々の重合について検出された異なる応答シグ
ナルを示す。図３は、二重遮断ヌクレオチドの合成方法を示す。

【００１２】（発明の説明）ポリヌクレオチドを配列決定するための本発明方法は、ポリメラーゼ酵素、標
的ポリヌクレオチドおよび相補的ヌクレオチドの間における速度論的相互反応の
解析を含む。速度論的相互反応の測定は、反応が進行すると生じる電磁波などの
放射の変化または吸収を監視することでなされる。

【００１３】本明細書での用語「ポリヌクレオチド」は、広く解釈されるべきで、ＤＮＡお
よびＲＮＡを含み、修飾ＤＮＡやＲＮＡ、さらに他のハイブリダイズ核酸様分子
、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）も含む。

【００１４】典型的には、方法の実施は、電磁波放射の利用、表面プラスモン共鳴または核
磁気共鳴の使用によりなされる。しかし、放射の変化を測定し得る他の技法、例
えば、全内部反射蛍光（ＴＩＲＦ）、減衰全反射（ＡＴＲ）、競合全反射（ＦＴ
Ｒ）の分光法、ブルースター角反射法、散乱全内部反射法（ＳＴＩＲ）またはエ
バーネセント波偏光解析法も考慮される。

【００１５】電磁波放射を要するこれらの方法以外の技法も用いられる。例えば、化学発光
法などの光化学技法、表面弾性波（ＳＡＷ）法および水晶振動子ミクロバランス
（ＱＣＭ）法などの共鳴系を含む重量測定法である。

【００１６】表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分光法は好ましい方法であって、溶液の性質の
測定が、溶液バルク相とエバーネセント波領域との間の屈折率の相違を検出して
なされる。付帯する単色光が、試験サンプルの反対側の固体光学的（センサーチ
ップ）表面から特殊な角度で反射される。光はサンプル中に非常に短い距離で伸
び、表面での相互作用により影響を受ける。

【００１７】適当なセンサーチップは本分野で知られている。典型的には、光学的に透明な
材料、例えばガラス、薄い反射膜、例えば銀または金がある。ＳＰＲの総説につ
いては、ＥＰ公開番号０６４８３２８を参照（出典明示により本明細書の一部と
する）。

【００１８】核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法は別の好ましい方法であって、化合物の磁気性質
が測定される。化合物の核は、適用の磁場および放射振動数照射の組み合せによ
りエネルギー的に方向付けられる。核に及ぶエネルギーがスピン状態間のエネル
ギー相違（適用場の方向に対する平行または反平行の間の相違）に等しいとき、
共鳴として知られる状態が達成される。あるスピン状態から別のスピン状態への
変化に関連するエネルギーの吸収および続く放出が、放射振動数受容器で検出さ
れる。

【００１９】本発明方法の重要な局面は、固相支持体に固定されたポリメラーゼ酵素の使用
である。ポリメラーゼの固定化は、本方法がうまくゆくためのいくつかの重要な
利点を提供する。第１に、可溶分子中のエネルギー吸収の測定に関連するでたら
めの「ノイズ」の問題がかなり削減される。第２に、ポリメラーゼと直接かかわ
りあわない基質（例えばヌクレオチド）の相互作用からのノイズの問題が、軽減
されて、ポリメラーゼが測定場に比較して特に設定された領域内で保持されるよ
うになる。このことが特に関連するのは、放射の変化の測定に用いる技術がＴＩ
ＲＦ中などの蛍光の測定を必要とするときであって、そこでは未完成鎖が生じる
にしたがって背景の蛍光が増加する。また、ＳＰＲ分光法を用いると、ポリメラ
ーゼ反応がエバネセント波場内に保持されて、ポリヌクレオチドのサイズに関係
なく緊急の測定をなし得る。最後に、標的ポリヌクレオチドもオリゴヌクレオチ
ドプライマーも固体表面に非可逆的に接着しないので、表面を再生するのが比較
的簡単であって、同じ固定化ポリメラーゼを用いて配列反応が生じるようになる
。

【００２０】固定化は関連技術で知られている標準的方法を用いて実施される。特に、標準
的アミンカップル法を使用する固定化が、デキストランまたはＮ−ヒドロキシサ
クシニミドエステル活性表面にリガンド結合アミンの接着とともに用いられる。
本発明の好ましい実施態様において、ポリメラーゼはＳＰＲセンサーチップ表面
に固定化される。この表面は、屈折率の変化が測定し得るセンサー表面の非常に
近くにポリメラーゼを保持するものである。光学センサーにバイオ分子を固定化
するのに用いられる手法の例は、ＥＰ−Ａ−０５８９８６７および Loefas et a
l., Biosens. Bioelectron. (1995) 10: 813-822 に開示されている。

【００２１】本発明で用いられるポリメラーゼは、いかなる既知のタイプでもあり得る。例
えば、そのポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。標的ポリ
ヌクレオチドがＲＮＡ分子であると、ポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメ
ラーゼすなわち逆転トランスクリプターゼ、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼすなわちＲＮＡレプリカーゼである。本発明の好ましい具体例において、ポ
リメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。さらに好ましい具体例において、ポリ
メラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼIIIホロ酵素 (McHenry, Ann. Rev. Bioc
hem. 1988; 57:519)、Ｔ７ポリメラーゼ (Schwager et al., Methods in Molecu
lara and Cellular Biology (1989/90); Vol.1(4): 155-159)またはＥ．ｃｏｌｉチオレドキシンに複合したバクテリオファージＴ７遺伝子５ポリメラーゼ(Tab
or et al., J. Biol. Chem. (1987); 262: 1612-1623)である。これらのポリメラーゼの各々は、標的のポリヌクレオチドと結合して、重合が活性的に起きない
ときでも、ポリメラーゼ−ポリヌクレオチド複合体を高い比率で生じ維持する。

【００２２】ポリメラーゼIIIホロ酵素は、進行型酵素をつくる機能を有する３種のサブ集合体からなる：（I)ポリメラーゼサブユニットαを含むポリメラーゼコア；（II
）ＤＮＡ周辺のブレスレット様構造として作用するβ二量体サブユニット；（II
I）２種のサブユニット、τおよびγのサブ集合体が用いられて、ＡＴＰを結合し、加水分解して、ＤＮＡのまわりにβ二量体を形成する。

【００２３】配列決定工程の第１段階として、標的ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーシ
ョン／重合化緩衝液中の適当なプライマーと接触され得る。典型的には、緩衝液
は十分高い温度であって、標的ポリヌクレオチド上に存在する２次構造を破壊（
融解）する。冷やすと、プライマーは標的上の補体にアニールする。このサンプ
ルを固定化ポリメラーゼに接触せしめると、標的のポリヌクレオチド／ポリメラ
ーゼ複合体を形成する。

【００２４】本発明の１つの実施態様において、ヌクレオチド追加の調節は、別異のヌクレ
オチドがポリメラーゼ／標的複合体に順次加えられるようになされる。例えば、
ｄＧＴＰを加えて、ポリメラーゼ／ポリヌクレオチド複合体上に送り、次いで組
込まれたかを調べる。未結合のｄＧＴＰを反応部位から流し出し、さらにヌクレ
オチドを導入する。このようにして、速度論的相互作用の検出がその時点で存在
する特定のヌクレオチドと相関し得るので、ポリヌクレオチド配列を決定できる
。

【００２５】この方法は、存在するすべての別異のヌクレオチドについて実施できる。これ
をうまく行うために、ヌクレオチドが遮断基を、少なくとも３’位で、好ましく
は３’および５’位で組み込むことが必要である。遮断基は、光感受性であり、
一定の波長の光を用いて除去され活性分子を放出する。ヌクレオチドが遮断基を
３’と５’位の両方で組込むと、遮断基はその分光吸収に基づき識別可能なもの
であり、すなわち遮断基の１つを、他の遮断基を除去しない特殊な波長の光を用
いて選択的に除去できる。また望ましくは、３’位の遮断基が、５’位での遮断
基を除去するのに必要とするよりも長い時間用いられる光を必要とする。このこ
とから、遮断基の識別が分光的および時間的の両方の手段で可能となる。

【００２６】一般的に、光感受性遮断基は２００ｎｍ〜４５０ｎｍの波長で光分解を受ける
。遮断基は、式Ｒ¹−［Ｏ−ＣＯ−］Ｘ（式中、Ｒ¹は光反応活性基であり、Ｘは
離脱基である）から典型的には誘導される。例えば、Ｒ¹はＯ−ニトロベンジルである。特に好ましい遮断基には、Ｏ−ニトロベンジル保護基を含み、ＷＯ−Ａ
−９２／１００９２およびＷＯ−Ａ−９７／３９１５１に記載されている。これ
らの基には、ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、ニトロピペロニ
ルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）、α−メチルニトロベラトリルオキシカルボニ
ル（ＭｅＮＶＯＣ）、α−メチルニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰ
ＯＣ）および１−ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰＹＭＯＣ）がある。

【００２７】適切な３’遮断基は、ヌクレオチドと下記式（Ｉ）の化合物との反応で形成さ
れ得る（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシカルボニル基である
。

【００２８】

【式１】（式中、Ｒは適当なエステル化基、例えばメチルである）この遮断基は波長３６０ｎｍの光で選択的に除去し得る。

【００２９】５’位での適切な遮断基は、下記の１−（２−ニトロフェニル）エチル基（II
）である。

【００３０】

【式２】（式中、Ｒは適当な官能基、例えばハロゲンである）この遮断基は波長２６０ｎｍの光で選択的に除去し得る。

【００３１】例示的方法として、二重遮断ヌクレオチドをプライム標的ポリヌクレオチド（
高忠実度ポリメラーゼ複合体と一緒に保持されている）上に注入し、各ヌクレオ
チドの末端のリン酸から遮断基が離脱するのに十分な波長で、単色光をポリメラ
ーゼの上流に焦点を当てる。ヌクレオチドが結合ポリメラーゼ上に流れ得て、未
完成ポリヌクレオチド鎖への組込みが起きる。しかし、３’位の遮断基が結合し
たままであるので、１つのヌクレオチドのみが組込まれる。こうして、反応速度
相互反応を測定すると、未完成鎖中に組込まれた特定のヌクレオチドについての
情報が得られる。用いたポリメラーゼは、反応が停止したときに標的から容易に
は離脱しない高忠実度ポリメラーゼであり得る。あるいは、競合阻害剤を用いて
、ポリメラーゼが標的から離脱するのを防ぐことができる。

【００３２】組込まれたヌクレオチドを測定した後、単色光の焦点をポリメラーゼ触媒部位
内の遮断基に当て、３’位の遮断基を除去する。単色光を５’位での除去に要す
る以上の長い時間照射して、ポリメラーゼ複合体のヌクレオチドに結合している
遮断基のみの除去を行う。これはポリメラーゼ複合体に結合していないヌクレオ
チドが追加される可能性を減じる。

【００３３】３’遮断基が外れると、ポリメラーゼ反応が続いて、追加のヌクレオチドがポ
リメラーゼ反応部位に達する。非制御重合の防止は、遮断基を除去するのに要す
る光波動を変えることでなされる。

【００３４】上記したように、二重遮断ヌクレオチドを用いるのが好ましいが、３’位のみ
に遮断基を有するヌクレオチドを用いる方法も実施できる。この場合、ポリメラ
ーゼの競合阻害剤を使用するのが望ましい。この阻害剤は、３’位に遮断基を欠
くヌクレオチドが未完成鎖に組込まれる可能性を低下せしめる。ポリメラーゼの
適切な競合阻害剤はカルボニルジホスホネート（ＣＯＭＤＰ）である。

【００３５】下記の実施例は、図面を参照して本発明を説明する。（実施例）下記の分析の実施は、光センサー表面としてセンサーチップＣＭ５（Research
grade, BIAcore AB)を有する修飾ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システム（Biacore A
B, UPPSALA, Sweden)で行った。器具は、一回のサンプル注入で４細胞での分析が可能な積分μm−流動カートリッジ（ＩＦＣ）とともに準備した。

【００３６】ポリメラーゼの調製Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼIIIホロ酵素を、（Millard et al., Methods Enzym
ol. (1995); 262: 22)にしたがってつくり、バリル−セファローズの疎水性相互
作用クロマトグラフィ−を用いて、高塩濃度でホロ酵素を精製した。精製後、ホ
ロ酵素を、Kirkegaard et al., Anal. Biochem. (1972); 50: 122に記載のイオン濾過法を用いて濃縮した。

【００３７】ポリメラーゼの固定化ポリメラーゼのセンサーチップ表面への固定化は、(Joensson et al., Biotec
hniques (1991); 11: 620-627)にしたがって実施した。簡単に言うと、センサー
チップの環境を、へペス緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ
、０．０５％界面活性剤Ｐ２０（BIAcore AB, Uppsala, Sweden)、ｐＨ７．４)
で平衡化した。等量のＮ−ヒドロキシサクシニミド（水中で０．１Ｍ)およびＮ −エチル−ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（水中
で０．１Ｍ)を混合し、チップ（ＣＭ５）表面中に注入して，カルボキシメチル化デキストランを活性にした。最後に、センサーチップ表面の残渣Ｎ−ヒドロキ
シサクシニミドエステルをエタノールアミン（３５μl、水中で１Ｍ、ｐＨ８．５) と反応せしめ、非結合のポリメラーゼを表面から洗い流した。固定化過程の
実施は、ヘペス緩衝液を温度２５℃で継続的に流して行った。

【００３８】オリゴヌクレオチド２種のオリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミジト化学を用いて合成した。
配列番号１として定義されるオリゴヌクレオチドは標的ポリヌクレオチドとして
用い、配列番号２として定義されるオリゴヌクレオチドはプライマーとして用い
た。

【００３９】 CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG 配列番号１

【００４０】 CTCTCCCTTCTCTCGTC 配列番号２

【００４１】この２種のオリゴヌクレオチドをハイブリド条件で反応せしめて、標的−プラ
イマー複合体をつくった。

【００４２】プライムＤＮＡを、２１μg のｓｓＤＮＡ結合タンパク質およびＤＮＡ pol I
IIサブ会合体を含有する緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＣ
ｌ₂、４％(v/v)グリセロール、５ｍＭのジチオトレイトール(ＤＤＴ)、４０μg
ウシ血清アルブミン）に懸濁し、ブレスレット様構造（１．６ｐｍｏｌのβ二量
体および１９５ｆｍｏｌのγサブユニット）を形成せしめた。０．５ｍＭのＡＴＰが６０μＭのカルボニルジホスホネート（ＣＯＭＤＰ）とともに存在した。
この反応において、γサブユニットは分子対形成剤として作用し、ＡＴＰを加水
分解してβ二量体サブユニットをＤＮＡ上に置き、ポリメラーゼサブ会合体を形
成する（Studwell et al., UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. New Ser. 1990; 127:
153)。

【００４３】プライムＤＮＡ／サブ会合体の複合体をセンサーチップ表面上のポリメラーゼ
IIIに５μｍ／分の流速で注入して、γサブユニットの反応を介してポリメラーゼとの結合を可能とした。

【００４４】この実験において、マグネシウムとＡＴＰは、ＰｏｌIIIがプライムＤＮＡに結合するのに必要である。しかし、マグネシウムはまた、プライマーの除去を校
正３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により促進する。この問題はカルボニルジ
ホスホネートを含めることで回避される。カルボニルジホスホネートはポリメラ
ーゼ活性の競合阻害剤である（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｏｌ
IIIはこの特定の問題を解決するのに用い得る)。

【００４５】６０μＭのカルボニルジホスホネートの継続的流れをチップ表面上に維持し、
エキソヌクレアーゼ活性がプライマーを標的ＤＮＡから除去するのを防止した。

【００４６】２種の遮断基を組み込んだヌクレオチド各ヌクレオチド（ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ）は、図３に
示すように、５’位に１−（２−ニトロフェニル）エチル遮断基および３’位に
（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシカルボニル遮断基を含有し
た。二重遮断ヌクレオチドを以下のように合成した。

【００４７】段階１：（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシカルボニルヌクレ
オシド・トリホスフェートの合成同じ全方法をｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰに適用した。ｄＡＴＰに水和
物（０．４ｍｍｏｌ）と約３ｍｍｏｌの４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニ
ルジアゾメタンとの混合物を１５ｍｌのＤＭＳＯ中、室温で暗闇で４０時間攪拌
した。なお、４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニルジアゾメタンは、９００
ｍｇ（４ｍｍｏｌ）の４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニルヒドラゾン（６
−ニトロベルアルデヒドをヒドラジン一水和物でクロロフォルム中、Wootton an
d Trentham, Photochemical Probes in Biochemistry (Nielsen, P.E., Ed,) NA
TO ASI Ser. C, Vol. 272, p277-296 (1989)記載の方法で合成した）から新たに
調製した。クロロフォルム／メタノール（５：１ｖ／ｖ）溶媒系においてＴＬ
Ｃで反応を監視すると、ケージヌクレオチドに対応するＲｆ０．５４のスポット
が現れた。ＤＭＳＯ、未反応ジアゾ化合物および低極性の反応産物を６０ｍｌの
エーテルでの反復抽出により除去した。残渣は、他の物質とともに未反応ヌクレ
オチドおよび所望の産物を含む。この残渣を少量のクロロフォルムに溶解し、シ
リカカラム上フラッシュクロマトグラフィ−（３ｘ３０ｃｍ）で分離した。１０
０％クロロフォルムおよびメタノール／クロロフォルム（９５：５ｖ／ｖ）用
いた溶出で、４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニルジアゾメタンの疎水性副
産物をカラムから除去した。フラクションを回転蒸留器で乾燥した。７８ｍｇの
ケージ産物を凍結乾燥した。全体の収率は４５％であった。３’遮断４，５−ジ
メトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニルｄＡＴＰを、粗産物から調製逆
相ＨＰＬＣで高純度でもって直接単離した。

【００４８】段階２：５’遮断１−（２−ニトロフェニル）エチル基の３’４，５−ジメトキ
シ−２−ニトロベンジルオキシカルボニル遮断ｄＡＴＰへの添加４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニル５’ｄＡＴＰ（０
．４ｍｍｏｌ）と約３ｍｍｏｌの１−（２−ニトロフェニル）ジアゾエタンとの
混合物を１５ｍｌのＤＭＳＯ中、室温で暗闇で４０時間攪拌した。なお、１−（
２−ニトロフェニル）ジアゾエタンは、７１６．７ｍｇ（４ｍｍｏｌ）の２−ニ
トロアセトフェノンのヒドラゾン（２−ニトロアセトフェノンをヒドラジン一水
和物でエタノール中で処理して合成した）および２．９ｇ（３０ｍｍｏｌ）のＭ
ｎＯ₂（９０％）から２０ｍｌのクロロフォルム中でウオーカらの方法（Walker
et al., Methods Enzymol. 1989; 172: 288-301)により新たに調製した。クロロ
フォルム／メタノール（５：１ｖ／ｖ）溶媒系においてＴＬＣで反応を監視す
ると、４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオキシカルボニル５’ｄＡＴＰ
の１−（２−ニトロフェニル）エチルエステルのそれぞれアキシアル型の２種ジ
アステレオーマーおよびエクアトリアル型の２種のジアステレオーマーに対応す
るＲｆ０．６８およびＲｆ０．５８のスポットが現れた。ＤＭＳＯ、未反応ジア
ゾ化合物および低極性の反応産物をエーテル５０ｍｌでの反復抽出により除去し
た。

【００４９】残渣は、他の物質とともに未反応４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジルオ
キシカルボニル５’ｄＡＴＰおよび所望の二重遮断産物を含む。この残渣を少量
のクロロフォルムに溶解し、シリカカラム上フラッシュクロマトグラフィ−（３
ｘ３０ｃｍ）で分離した。１００％クロロフォルムを用いた溶出で、１−（２−
ニトロフェニル）ジアゾエタンの疎水性副産物をカラムから除去した。産物を回
転蒸留器で乾燥した。凍結乾燥で７８ｍｇのケージ産物を得た。全体の収率は４
５％であった。

【００５０】０．２ｍＭの各ヌクレオチドが重合化緩衝液（１ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８
．８、５ｍＭのＫＣｌ、０．１５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中に存在した。

【００５１】ＤＮＡ配列決定図１は、ＳＰＲ感知系および流動性細胞（７）を示し、センサー表面での固定
化ポリメラーゼ（３）を有するセンサーチップ（２）に電磁波放射を行う手段、
別異のヌクレオチドを細胞に導入するための入り口（４）および単色光と細胞に
送り込むための２つの焦点会合体（５）および（６）がある。

【００５２】別異のヌクレオチドは、流動性細胞に流速３０μｌ／分、温度２５℃およびデ
ータ収集速度１０Ｈｚで導入される。ヌクレオチドが焦点会合体（５）を通過す
ると、波長２６０ｎｍの単色光が送り込まれて５’位の遮断基を除去する。次い
でヌクレオチドがセンサーチップ（２）上に流れ、β二量体サブ会合体により保
有されている標的ポリヌクレオチド／ポリメラーゼ複合体（３）と接触する。プ
ライマー配列上の３’位が空いていて反応するので、重合が起こりヌクレオチド
を標的ポリヌクレオチド上の補体に組込み得る。この組込みはＳＰＲ装置の単色
ｐ極性光により検出される。組込ヌクレオチドが３’位に遮断基を有するので、
もはや重合は起きない。波長３６０ｎｍの単色光が重合部位の焦点会合体（６）
により送り込まれる。流動性細胞での高流速でもって、十分なエネルギーが吸収
されて３’遮断基を離脱する前に、ポリメラーゼに結合していないヌクレオチド
が細胞から除去される。

【００５３】３’遮断基が重合ヌクレオチドから離脱すると、重合がさらに起きる。図２は、未完成鎖に組込まれた各ヌクレオチドの検出についての配列決定の実
験結果を示す。結果は配列番号１の配列に相補的な配列を示す。

【００５４】

【配列表】

配列表 (1)一般的情報: (i) 出願人: (A) 名称: メディカル・バイオシステムズ・リミテッド (B) 通り: ビーストン・クロス、ジ・オールド・ミル (C) 市: ニアー・トトネス、ブロードヘンプストン (D) 州: デボン (E) 国: イギリス (F) 郵便番号 (ZIP): TQ9 6BX (ii) 発明の名称: 核酸配列の解析 (iii) 配列の数: ２ (iv) コンピューター読み取り可能形式: (A) 媒体形：フロッピーディスク (B) コンピューター：ＩＢＭＰＣ互換性 (C) オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ (D) ソフトウェア：PatentIn Release #1.0、Version#1.30 (EPO) (2) 配列番号１の情報: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: ５３塩基対 (B) 配列の型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: 他の核酸 (A) 記載: /desc＝ "オリゴヌクレオチド" (xi) 配列番号１の記載: CAAGGAGAGG ACGCTGTCTG TCGAAGGTAA GGAACGGACG AGAGAAGGGA GAG 53 (2) 配列番号２の情報: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: １７塩基対 (B) 配列の型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: 他の核酸 (A) 記載: /desc＝"オリゴヌクレオチド" (xi) 配列番号２の記載: CTCTCCCTTC TCTCGTC 17

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＰＲ分光法を用いたポリヌクレオチド配列解析の模式図。

【図２】別異のヌクレオチドの各々の重合について検出された異なる応答
シグナル。

【図３】二重遮断ヌクレオチドの合成方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ダニエル・ヘンリー・デンシャムイギリス、ティキュー９・６ビーエックス、デボン、ニアー・トトネス、ブロードヘンプストン、ビーストン・クロス、ジ・オールド・ミルＦターム(参考） 2G045 AA35 BB01 BB03 BB14 BB46 BB48 BB50 BB51 DA13 FB01 FB02 FB06 4B024 AA11 AA20 CA01 CA20 HA08 HA19 4B063 QA13 QQ42 QR08 QR62 QS02 QS25 QS39 QX07

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヌクレオチドの配列を決定する方法であって、下記：（ｉ）標的ポリヌクレオチドを、固相支持体に固定化したポリメラーゼ酵素およ
び別異のヌクレオチドと、ポリメラーゼ反応に十分な条件で反応せしめ、（ii）標的ポリヌクレオチドに相補的な特殊なヌクレオチドの組込みによる効果
を検出する、工程を含む方法。
【請求項２】工程（ii）の効果が放射測定により検出される、請求項１の
方法。
【請求項３】工程（ｉ）および（ii）が別異のヌクレオチドの各々につい
て入れ替わり、組込みが検出されるまで行われ、次いで繰り返される、請求項１
または２の方法。
【請求項４】工程（ｉ）が、存在するすべてのヌクレオチドについて行わ
れる、請求項１または２の方法。
【請求項５】ヌクレオチドが、ポリメラーゼ反応後に除去される３’遮断
基を含む、請求項１−４の方法。
【請求項６】遮断基が振動単色光により選択的に除去され得る、請求項５
の方法。
【請求項７】ヌクレオチドがトリホスフェート鎖の末端ホスフェート基に
追加の遮断基を含み、追加の遮断基が３’遮断基の除去前に除去される、請求項
５または６の方法。
【請求項８】追加の遮断基が振動単色光により、３’遮断基の除去に要す
る条件と異なる条件で選択的に除去され得る、請求項７の方法。
【請求項９】追加の遮断基が振動単色光により、３’遮断基の除去に要す
る時間と異なる時間で選択的に除去され得る、請求項８の方法。
【請求項１０】工程（ｉ）がポリメラーゼ酵素の競合阻害剤を導入するこ
とをさらに含む、請求項１−９の方法。
【請求項１１】工程（ｉ）の標的ポリヌクレオチドがポリメラーゼ酵素に
、β₂二量体複合体により結合している、請求項１−１０の方法。
【請求項１２】ポリメラーゼがＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼIIIまたはＴ７ポリメラーゼである、請求項１−１１の方法。
【請求項１３】ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、請求項１−１
１の方法。
【請求項１４】ポリメラーゼが逆転トランスクリプターゼである、請求項
１−１１の方法。
【請求項１５】工程（ii）が時間上の共鳴シグナルの変化の検出を含む、
請求項１−１４の方法。
【請求項１６】放射が電磁波である、請求項１−１５の方法。
【請求項１７】電磁波放射が赤外スペクトルにある、請求項１６の方法。
【請求項１８】工程（ii）が表面プラスモン共鳴の使用を含む、請求項１
−１７の方法。
【請求項１９】電磁波放射が放射周波数スペクトルにある、請求項１６の
方法。
【請求項２０】ヌクレオチドの組込みがＮＭＲを用いて検出される、請求
項１９の方法。
【請求項２１】ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１−２０の方法
。
【請求項２２】センサーチップ上に固定化されたポリメラーゼ酵素を含有
するセンサーチップ。
【請求項２３】トリホスフェート鎖の３’位および末端ホスフェート基に
遮断基を含有するヌクレオチドであって、この２つの遮断基が異なる波長の単色
光により除去され得るものである、ヌクレオチド。
【請求項２４】遮断基が式：Ｒ¹−［Ｏ−ＣＯ−］Ｘ（式中、Ｒ¹は光反応
活性基であり、Ｘは離脱基である）の化合物から誘導される、請求項２３のヌク
レオチド。
【請求項２５】３’位の遮断基がＯ−ニトロベンジルオキシカルボニル基
である、請求項２３または２４のヌクレオチド。
【請求項２６】末端ホスフェートの遮断基がＯ−ニトロベンジル基である
、請求項２３−２５のヌクレオチド。
【請求項２７】３’位の遮断基が（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベン
ジル）オキシカルボニル基である、請求項２３−２６のヌクレオチド。
【請求項２８】末端ホスフェートの遮断基が１−（２−ニトロフェニル）
エチル基である、請求項２３−２７のヌクレオチド。
【請求項２９】ポリヌクレオチドの配列決定のための機器であって、光学
センサーチップ、光源、影像装置および光検出器を含み、センサーチップが請求
項２２に定義されたものである、機器。