JP7348898B2 - 高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 - Google Patents
高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7348898B2 JP7348898B2 JP2020528446A JP2020528446A JP7348898B2 JP 7348898 B2 JP7348898 B2 JP 7348898B2 JP 2020528446 A JP2020528446 A JP 2020528446A JP 2020528446 A JP2020528446 A JP 2020528446A JP 7348898 B2 JP7348898 B2 JP 7348898B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amplification
- nucleic acid
- polymerase
- dna
- nucleoside triphosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
特に断りのない限り、本明細書で用いられる全ての技術と科学的な用語は本発明が属する業界における当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載のものと類似の本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において用いることができるが、典型的な方法及び材料のみ記載してある。本発明の目的のために、つぎの用語が以下に定義される。
a)CS5 DNAポリメラーゼ
b)CS6 DNAポリメラーゼ
c)Thermotoga maritima DNAポリメラーゼ
d)Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ
e)Thermus thermophilus DNAポリメラーゼ
f)Thermus flavus DNAポリメラーゼ
g)Thermus filiformis DNAポリメラーゼ
h)Thermus sp.sps17 DNAポリメラーゼ
i)Thermus sp.Z05 DNAポリメラーゼ
j)Thermotoga neapolitana DNAポリメラーゼ
k)Thermosipho africanus DNAポリメラーゼ
l)Thermus caldophilus DNAポリメラーゼ
dATP-SPh-NPPの合成を図3に概略的に示し、本明細書では簡潔に記載する。全ての工程は暗条件下で実施した。PhSNPP3OH
300μMのdATP-SPh-NPP、40%のDMSO及び1.0Mの酢酸カリウムを含む水性混合物を調製した。対照のために、dATP-SPh-NPPの代わりに300μMのdATPを含む別の混合物を準備した。150μLの各混合物をサーモシェーカーで65℃でインキュベートした。0、2、18、25及び120時間後の各溶液(20μL)の試料をUPLC-MS(超高速液体クロマトグラフィー-質量分析)で分析した。260nmのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いられた。
使用した条件下では、質量分析で確認されたように、dATPはすぐに一リン酸及び二リン酸に分解した。dATP-SPh-NPPはdATPよりも著しく熱安定性があり、65℃で120時間、dATP-SPh-NPPの分解生成物は見られなかった(図4)。
dATP-SPh-NPP及びATP-DMNPE(各300μM)の二つの水性混合物をリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH7.0)で調製した。両方の試料は振とう又は撹拌せずに開放系の容器でUV-LED光源(InGaN,Quantum well、λmax = 393nm、0.18 W/LED)からの光で同時に照射された。0、1、2、4、8及び16分後、試料の除去(20μL)及び続くUPLC-MS分析のためにその照射を一時的に停止した。260nmのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いた。出発材料と開裂した生成物の分子の同一性は質量分析により確認された。
dATP-SPh-NPPに5分間以上照射した際に90%以上のdATPが遊離し、完全な開裂を8分間で達成した(図5)。dATP-SPh-NPPの光開裂は商用利用されているATP-DMNPE(Thermo-Fisher Scientific)よりも著しく早い。
PCRマスターミックス(20μL)、緩衝液ミックス(20μL)及びdNTPミックス(10μL)と名付けられる3つの成分の組み合わせにより、50μLの総量のリアルタイムPCR(TaqMan PCR)混合物を調製した。全てのPCR成分をDEPC処理水から調製した。前記PCRマスターミックスはトリシン緩衝液(pH8.2)、酢酸カリウム、グリセロール、DMSO、界面活性剤、標的DNA(400cp)、ポリメラーゼアプタマー、プローブ、プライマー、SYBR green染色剤及びポリメラーゼ酵素を含んでいた。前記緩衝液ミックスは酢酸マンガン(8.3mM)及びイミダゾール(0、3.0又は6.0mM)を含んでいた。前記dNTPミックスはdATP(400μM)、dCTP(400μM)、dGTP(400μM)及びdUTP(800μM)を含んでいた。別のdNTP混合物はdATPの代わりにdATP-SPh-NPP(400μM)を含んでいた。DNA標的の最終濃度は400cp/反応であった。
SPh-NPPでケージ化されたdATPは、PCR増幅を妨げる(図6、グラフの左カラム;UV照射無し)。8.0分間のUV光の照射及び続くPCRサイクルはDNA増幅を導く(図6、グラフの右カラム)。イミダゾールの添加はPCR増幅曲線の形状には著しい影響を与えなかった。
Claims (7)
- 試料における標的核酸配列の有無を検出する方法であって、
a)前記標的核酸配列が前記試料中に存在した場合の増幅産物を産生するための増幅試薬と前記試料との接触を含む増幅工程の実施と
b)前記増幅産物の検出
を含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
を含む方法であって、
ここで、ステップa)の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。 - 増幅試薬を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
を含む方法であって、
ここで増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。 - 標的核酸の増幅のために用いられる増幅試薬の提供を含む増幅反応時に核酸の非特異的な増幅を減少又は予防する方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
を含む方法であって、
ここで増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。 - 光開裂性の部位を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
- 未修飾のヌクレオシド三リン酸と比較してより高い熱安定性を有することを特徴とする、請求項4の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸。
- 請求項4の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに核酸増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
- 請求項5の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに核酸増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762590972P | 2017-11-27 | 2017-11-27 | |
US62/590,972 | 2017-11-27 | ||
PCT/EP2018/082692 WO2019102034A1 (en) | 2017-11-27 | 2018-11-27 | Photocleavable nucleotide reagents with high stability |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021505127A JP2021505127A (ja) | 2021-02-18 |
JP7348898B2 true JP7348898B2 (ja) | 2023-09-21 |
Family
ID=64564863
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020528446A Active JP7348898B2 (ja) | 2017-11-27 | 2018-11-27 | 高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11078534B2 (ja) |
EP (1) | EP3717501B1 (ja) |
JP (1) | JP7348898B2 (ja) |
CN (1) | CN111417645B (ja) |
WO (1) | WO2019102034A1 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001511358A (ja) | 1997-07-28 | 2001-08-14 | メディカル・バイオシステムズ・リミテッド | 核酸配列の解析 |
JP2014516923A (ja) | 2011-04-07 | 2014-07-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基 |
WO2017156218A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | President And Fellows Of Harvard College | Method of making polynucleotides using closed-loop verification |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4666848A (en) | 1984-08-31 | 1987-05-19 | Cetus Corporation | Polypeptide expression using a portable temperature sensitive control cassette with a positive retroregulatory element |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US5455170A (en) | 1986-08-22 | 1995-10-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05 |
US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
US5130238A (en) | 1988-06-24 | 1992-07-14 | Cangene Corporation | Enhanced nucleic acid amplification process |
WO1990001069A1 (en) | 1988-07-20 | 1990-02-08 | Segev Diagnostics, Inc. | Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences |
AU635105B2 (en) | 1990-01-26 | 1993-03-11 | Abbott Laboratories | Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
WO1992008808A1 (en) | 1990-11-14 | 1992-05-29 | Siska Diagnostics, Inc. | Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor |
ATE295427T1 (de) | 1996-06-04 | 2005-05-15 | Univ Utah Res Found | Überwachung der hybridisierung während pcr |
EP0906449B1 (en) | 1996-06-04 | 2004-03-03 | University Of Utah Research Foundation | System and method for carrying out and monitoring polymerase chain reactions |
EP1307469B1 (en) | 2000-08-03 | 2008-01-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo¬3,4-d pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses |
DE10209203A1 (de) | 2002-03-04 | 2003-09-25 | Ulrich Steiner | Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus chemischen Verbindungen |
DE10227814A1 (de) | 2002-06-21 | 2004-01-08 | Chemogenix Gmbh | Verfahren zur Abspaltung von labilen funtionellen Gruppen aus chemischen Verbindungen |
US8962293B2 (en) | 2006-10-18 | 2015-02-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases and related methods |
US9745618B2 (en) | 2014-11-19 | 2017-08-29 | Roche Molecular Systems, Inc. | Photoblocked probes and methods for sequential detection of nucleic acids |
CN108117587B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-08-10 | 中南大学 | 光敏肽核酸单体及其合成方法 |
-
2018
- 2018-11-26 US US16/199,757 patent/US11078534B2/en active Active
- 2018-11-27 CN CN201880076192.0A patent/CN111417645B/zh active Active
- 2018-11-27 JP JP2020528446A patent/JP7348898B2/ja active Active
- 2018-11-27 WO PCT/EP2018/082692 patent/WO2019102034A1/en unknown
- 2018-11-27 EP EP18811779.0A patent/EP3717501B1/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001511358A (ja) | 1997-07-28 | 2001-08-14 | メディカル・バイオシステムズ・リミテッド | 核酸配列の解析 |
JP2014516923A (ja) | 2011-04-07 | 2014-07-17 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | ジアリールスルフィド骨格を含有する光解離性保護基 |
WO2017156218A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-09-14 | President And Fellows Of Harvard College | Method of making polynucleotides using closed-loop verification |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3717501B1 (en) | 2024-03-06 |
US11078534B2 (en) | 2021-08-03 |
CN111417645B (zh) | 2023-05-16 |
WO2019102034A1 (en) | 2019-05-31 |
EP3717501A1 (en) | 2020-10-07 |
JP2021505127A (ja) | 2021-02-18 |
US20190161797A1 (en) | 2019-05-30 |
CN111417645A (zh) | 2020-07-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10253308B2 (en) | Reaction mixtures | |
WO2011060014A1 (en) | Small rna detection assays | |
US20120219945A1 (en) | Use of single-stranded binding protein in amplifying target nucleic acid | |
US20230220464A1 (en) | Modified nucleoside phosphates with high thermal stability | |
JP7348898B2 (ja) | 高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 | |
CN110099914B (zh) | 具有高热稳定性的可逆保护的核苷酸试剂 | |
US20180363044A1 (en) | Compositions and methods for improving the thermal stability of nucleic acid amplification reagents | |
ES2886605T3 (es) | Procedimiento genérico para la estabilización de ARN específico |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211122 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220921 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221227 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20230328 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230727 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20230802 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230829 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230908 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7348898 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |