JP7348898B2 - 高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 - Google Patents

高い安定性を有する光開裂性ヌクレオチド試薬 Download PDF

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Description

本発明は、安定的なヌクレオチド試薬、それらの調製のための方法、それらの使用のための方法及びそれらを含むキットを提供する。そのヌクレオチド試薬は、多くのリコンビナントDNA技術、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸増幅において有用である。
核酸増幅試薬は典型的に温度感受性の成分を含み、それゆえ往々にして周囲温度より十分に低い温度で貯蔵及び輸送をしなければならない。これは特にデオキシヌクレオシド三リン酸又はそれらのリボヌクレオシド三リン酸類似体の場合である。これらの試薬はその末端から連なるリン酸基の欠失を介して分解する傾向があり、ヌクレオシド二リン酸及び一リン酸の形成をもたらし、それらの両方とも核酸ポリメラーゼの基質としてもはや活性ではない。ヌクレオシドポリリン酸の安定性はその末端のリン酸のエステル化によって大幅に改善されうる。例えば、γ-メチル-dNTP類似体は、通常のdNTPsが完全に分解されるのに十分な熱ストレスの状況下で完全に安定的であった。しかしながら、その末端リン酸のエステル化は、あるポリメラーゼ酵素に対する効果的な基質として寄与するための、これらのヌクレオチドのその能力に否定的な影響を有しえる。熱的に安定であり、かつ基質としてはじめは不活化状態であるが、単純なステップによってすぐに活性化される両方の性質をヌクレオシド三リン酸が有する需要が存在している。
本発明は、光開裂性の部分を有する修飾されたヌクレオシドポリリン酸を含むPCR及びRT-PCR(逆転写PCR)による核酸増幅のために用いる熱的に安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応における試料中の標的核酸配列の有無の検出のために修飾されたヌクレオシド三リン酸を用いるための方法を提供する。それゆえ、一つの側面では、本発明は、試料中の標的核酸配列の有無を検出する方法を含み、ここで当該方法は、前記試料と増幅試薬とを接触させて、前記標的核酸配列が前記試料中に存在した場合、増幅産物を産生するための増幅工程の実施と前記増幅産物の検出とを含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
Figure 0007348898000001
(式中、Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である)。一の態様において、増幅ステップに先立ち、前記修飾されたヌクレオシドポリリン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は染料を含む。
もう一つの側面は、本発明は、増幅試薬を用いた標的核酸配列の増幅方法を含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
Figure 0007348898000002
(式中、Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である)。一の態様において、増幅に先立ち、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は染料を含む。
もう一つの側面は、本発明は、増幅反応時の核酸の非特異的な増幅を減少又は予防する方法を含み、ここで当該方法は、標的核酸の増幅に用いられる増幅試薬を提供することを含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む
Figure 0007348898000003
(式中、Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である)。一の態様において、増幅に先立ち、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する。いくつかの態様において、前記増幅試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は染料を含む。
もう一つの側面では、本発明は光開裂性の部位を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸を含む組成物を含む
Figure 0007348898000004
(式中、Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又は類似体である)。一の態様において、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸は未修飾のヌクレオシド三リン酸と比較してより高い熱安定性を有することを特徴とする。いくつかの態様において、当該組成物はさらに、核酸ポリメラーゼからなるグループより選択された少なくとも一つの増幅試薬、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は染料を含む。
さらにもう一つの側面では、本発明は前述の修飾されたヌクレオシド三リン酸と、さらに増幅反応を実施するために必要な試薬とを含むキットを提供する。いくつかの態様において、前記試薬は少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、ヌクレオシド三リン酸、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー、検出可能なラベルをしたオリゴヌクレオチドプローブ及び/又は染料を含む。
本発明の態様及び利点は、発明の詳細な説明及び図面に詳細に記載されている。
前記光開裂性ヌクレオシド三リン酸、チオフェニルo-ニトロフェニルプロピルdNTPの構造及び一般概念を示す。 既知の光開裂性の(d)NTPsの分子構造を示す。 チオフェニルo-ニトロフェニルプロピルdATP(dATP-SPh-NPP)の調製方法の概略を示す。 チオフェニルo-ニトロフェニルプロピルdATP(dATP-SPh-NPP)と通常のdATPとを比較した熱安定性を示す。前記試料は120時間まで65℃条件下に曝露した。 チオフェニルo-ニトロフェニルプロピルdATP(dATP-SPh-NPP)と商業的に入手できる光開裂性のヌクレオチドであるDMNPE-ATPとを比較した光切断を、室温、100mM リン酸緩衝液 pH7.0、LED UVの照射を用いて示す。 通常のdGTP、dCTP、dUTPとケージ化されたdATP-SPh-NPPとを用いて8分間のUV照射無し(グラフの左カラム)、UV照射有り(グラフの右カラム)でのPCR増幅反応の結果を示す。
本発明は光開裂性の部位を有する熱安定的な修飾されたヌクレオシド三リン酸、それらの調製方法、それらの使用方法、及びそれらを含むキットを提供する。これらの熱安定的な修飾されたヌクレオシド三リン酸は、多くのリコンビナントDNA技術、特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による核酸増幅において有用である。
定義:
特に断りのない限り、本明細書で用いられる全ての技術と科学的な用語は本発明が属する業界における当業者により一般的に理解される意味を有する。本明細書に記載のものと類似の本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において用いることができるが、典型的な方法及び材料のみ記載してある。本発明の目的のために、つぎの用語が以下に定義される。
特に断りのない限り、「a」、「an」及び「the」という前記の用語は複数形も含む。
「周囲温度」という用語は、周囲の温度を称しており、温度制御された屋内での前記温度を称する時の「室温」と同義である。典型的には周囲温度は15℃から25℃の間の温度を意味するが、ごくわずかに冷たい又は暖かい温度も前記周囲温度の範囲内に考えられてもよい。
本明細書で用いられる、「光開裂性の部位」という用語は、その文章中にいくつかの同義語を有し、「光脱離性基」、「光で遮蔽される基」、「光惹起物質」、「ケージ化された化合物」、「感光性の基」、そして他の類似の用語としても称されうる。光開裂性の部位の利用の一つの利点は、高い選択性でその機能の一時的な阻害又は遮蔽により反応を制御する能力である。その光開裂性の部位はある波長、例えば約200nmから約450nm、例えば約200nmから約300nm、又は例えば約280nmから約315nm、又は例えば約300nmから約400nm、又は例えば約315nmから415nmの波長の光で、ヌクレオシド三リン酸から切断すなわち分離されるように選択することができる。定められた波長との関係で本明細書の「約」という用語は、その定められた波長を正確に含んでいても、1nm、2nm、3nm、4nm又は5nmのプラス又はマイナスの誤差の波長を有していてもよい。それゆえ、適切な波長の光を例えば輝き又は閃光により、修飾されたヌクレオシド三リン酸に導入した時、その光開裂性の部分が切断され、それは核酸ポリメラーゼによる反応から立体的又は他の障害を取り除く。光の導入は手動又は自動で行いうる。一旦その光が導入され、光開裂性の部位が取り除かれると、残されたヌクレオシド三リン酸はPCR反応中のポリメラーゼのための基質になりうる。
本発明でいう「リコンビナント」は、リコンビナント法により意図的に修飾されたアミノ酸配列又はヌクレオシド配列を称する。本明細書の「リコンビナント核酸」という用語は、自然には通常見いだせられない形態で、制限エンドヌクレアーゼにより、一般に核酸の操作によりin vitroで本来形成された核酸を意味する。従って、通常では連結されていないDNA分子をライゲーションすることによりin vitroで形成された、線形型又は、発現ベクターにおける、単離された変異型DNAポリメラーゼ核酸は、ともに本開示の目的ではリコンビナントと考えられる。一旦リコンビナント核酸が作製され、宿主細胞に再導入されると、非リコンビナント的に、すなわちin vitro操作ではなく、むしろ宿主細胞のin vivo細胞機構を用いて複製されるものと理解される。しかしながら、そのような核酸は、一旦リコンビナント的に作製されると、その後は非リコンビナント的に複製されるが、本開示の目的ではまだリコンビナントとして考えられる。「リコンビナントタンパク質」はリコンビナント技術を用いて、すなわち上記の通り、リコンビナント核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。
他の核酸配列と機能的な関係に配置された時、核酸は「作用可能式に連結」されている。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるならば、コード配列に作用可能式に連結されている。又は、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するために配置されているならば、リボソーム結合部位はコードされた配列に作用可能式に連結されている。
「宿主細胞」という上記の用語は、単細胞の原核生物及び真核生物の組織(例えば微生物、酵母及び放線菌)及び細胞培養物中で増殖する時の高次の植物又は動物由来の単細胞の両方を称する。
「ベクター」という用語は、DNA断片を称し、典型的には二本鎖で、それには外来のDNA断片が導入されていてもよい。ベクターは例えばプラスミド起源でよい。ベクターは宿主細胞での自律的な複製を促す「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含んでいる。宿主細胞内で見られる天然ではない異種DNAとして定義される外来のDNAとは、例えば、ベクター分子を複製する、選択可能なもしくは選別可能なマーカーをコードする、又は導入遺伝子をコードするものをいう。そのベクターは外来又は異種DNAを適当な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入ったら、そのベクターが独立して又はその宿主の染色体DNAと一緒に複製でき、そしてそのベクターとそれらの挿入されたDNAのいくつかのコピーとが発生する。加えて、そのベクターは、挿入されたDNAのmRNA分子への転写を可能にするか又は、そうでなければその挿入されたDNAのRNAの多数のコピーへの複製を引き起こす必須要素も含みうる。いくつかの発現ベクターは加えて、その発現されたmRNAの半減期の増大及び/又はmRNAのタンパク質分子への翻訳を可能にする配列要素を、その挿入されたDNAに隣接して含む。mRNA及び挿入されたDNAによりコードされるポリペプチドの多くの分子はそれゆえ素早く合成することができる。
「増幅試薬」は化学的又は生化学的な成分で核酸の複製を可能にする。そのような試薬は、限定することなく、核酸ポリメラーゼ、緩衝剤、モノヌクレオチド、例えばヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチドプライマー、例えばオリゴヌクレオチド、塩及びそれらのそれぞれの溶液、検出プローブ、染料、及びその他のものを含む。
当業界で周知のように、「ヌクレオシド」は塩基-糖の結合体である。ヌクレオシドの前記塩基の部分は、通常は複素環塩基である。そのような複素環塩基の二つの最も一般的な種類はプリンとピリミジンである。
「ヌクレオチド」はヌクレオシドの糖の部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基はその糖の2’-、3’-又は5’-ヒドロキシ基のいずれかに結合してよい。ヌクレオチドは、より一般的には「オリゴマー化合物」と称することのできる「オリゴヌクレオチド」の単量体ユニット、又はより一般的には「高分子化合物」と称される「ポリヌクレオチド」の単量体ユニットを意味する。上述に対する他の一般的な表現はデオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)である。
「オリゴマー化合物」はヌクレオチド単独又は天然でない化合物(以下参照)、より詳しくは修飾されたヌクレオチド(またはヌクレオチド類似体)又は非ヌクレオチド化合物の、それらの単独又は組み合わせである「単量体ユニット」からなる化合物である。
「オリゴヌクレオチド」及び「修飾されたオリゴヌクレオチド」(又は「オリゴヌクレオチド類似体」)はオリゴマー化合物のサブグループである。「オリゴヌクレオチド」という用語は、それらの単量体ユニットとしての複数のヌクレオチドから構成される成分を意味する。リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものを一般に意味する。RNA及びDNAの通常の結合又は骨格は3’から5’ホスホジエステル結合である。オリゴヌクレオチド及び修飾されたオリゴヌクレオチド(以下参照)は主に当業界で記載されるように合成でき、当業界分野の専門家に周知である。特異的な配列のオリゴマー化合物の作製方法は当業界において既知で、例えば適切な配列のクローニングや制限処理や直接的な化学合成などを含む。化学合成方法は、例えばNarang S.A.et.al.,Methods in Enzymology 68(1979)90-98に記載のホスホトリエステル法、Brown E.L.et.al.,Methods in Enzymology 68(1979)109-151に開示されたホスホジエステル法、Beaucage et al.,Tetrahedron Letters 22(1981)1859に開示されたホスホラミジット法、Garegg et al.,Chem.Scr.25(1985)280-282に開示されたH-ホスホネート法及び米国特許第4,458,066号に開示の固相支持体法を含んでよい。
上記のプロセスにおいて、前記オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されたものであってよく、すなわち修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含むプライマー及び/又はプローブであってよい。そのような場合、そのプローブ又はそのプライマーは修飾したオリゴヌクレオチドである。
「修飾されたヌクレオチド」(又は「ヌクレオチド類似体」)は任意の修飾により天然のヌクレオチドとは異なるが、それにしても、塩基、ペントフラノソール糖、リン酸部分、塩基様、ペントフラノソール糖様及びリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、ラベルをヌクレオチドの塩基部分に結合させてよく、それにより修飾されたヌクレオチドが得られる。ヌクレオチド内の天然の塩基は例えば7-デアザプリンにより置き換ることもあってよく、それにより修飾されたヌクレオチドが同様に得られる。
「修飾されたオリゴヌクレオチド」(又は「オリゴヌクレオチド類似体」)はオリゴマー化合物の別の特異的なサブグループに属し、一つ以上のヌクレオチドと一つ以上の修飾されたヌクレオチドを単量体ユニットとして有する。従って、「修飾されたオリゴヌクレオチド」(又は「オリゴヌクレオチド類似体」)という用語はオリゴヌクレオチドに実質的に似たように機能する構造体を意味し、そして本開示で同義語として用いることができる。合成の観点から、修飾されたオリゴヌクレオチド(又はオリゴヌクレオチド類似体)は例えばリン酸の骨格、リボースユニット又はそのヌクレオチド塩基の適切な修飾によるオリゴヌクレオチドの化学的な修飾によって作製できうる(Uhlmann and Peymen,Chem.Rev.90(1990)543;Verma S., and Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134)。代表的な修飾は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合に代わるホスホロチオエート、ジチオリン酸、メチルホスホナート、リン酸トリエステル又はホスホロアミダードヌクレオチド間結合;天然のプリン及びピリミジン塩基の代わりに、デアザ―又はアザプリン及び-ピリミジン;5位又は6位に置換基を有するピリミジン塩基;2位、6位もしくは8位の位置に変化した置換基を有するプリン塩基又は7位の位置の変化した置換基を有する7-デアザプリンとしてのプリン塩基;アルキル、アルケニル、アルキニル又はアリール部分、例えば低級アルキル基、メチル、エチル、プロピル、ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、又はアリール基、例えばフェニル、ベンジル、ナフチルを有する塩基;例えば2’位に置換基を有する糖;又はカルボキシル化又はアセチル化された糖類似体を含む。他の修飾は当業者に周知である。そのような修飾されたオリゴヌクレオチド(又はオリゴヌクレオチド類似体)は、天然のオリゴヌクレオチドとは構造的に異なるが、機能的に同義語として最もよく記載される。より詳細には、代表的な修飾は、Verma S.,and Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134又はWO 02/12263に開示されている。加えて、ヌクレオシドユニットが、ヌクレオシド間のリン酸又は糖リン酸結合にとって代わる基を介して結合した修飾を施すことができる。そのような結合はVerma S.,and Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134の開示にそれらを含む。リン酸結合以外をヌクレオシドユニットの結合に利用される時、そのような構造物も「オリゴヌクレオシド」として記載されている。
「核酸」及び「標的核酸」は当業者に周知のとおり、ヌクレオチドの重合化合物である。本明細書で用いられる「標的核酸」は分析すべき試料中の核酸を意味し、すなわち、試料中のその有無及び/又はその量が決定されるべきものを意味する。
「プライマー」という用語は本明細書で当業者に周知のとおりに用いられ、鋳型依存性DNAポリメラーゼによるDNA合成を開始させるオリゴマー化合物、主としてオリゴヌクレオチド、さらには修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。すなわち、例えばそのプライマーの3’末端は遊離した3’-OH基を提供し、それに対しさらなるヌクレオチドが鋳型依存性DNAポリメラーゼによって結合して3’-から5’-ホスホジエステル結合を形成し、それによってデオキシヌクレオチド三リン酸が用いられ、かつそれによってピロリン酸が放出される。
「プローブ」も天然又は修飾されたオリゴヌクレオチドを意味する。当業界で周知のように、プローブは分析物又は増幅物を検出する目的のために寄与する。上記のプロセスの場合において、プローブは標的核酸の増幅物を検出するために用いられる。この目的のためにプローブは典型的にラベルを有する。
「ラベル」は往々にして「レポーター基」と称され、一般的に、核酸特にオリゴヌクレオチド又は修飾されたオリゴヌクレオチド及びそこに結合する任意の核酸を試料の残りから区別できるようにする基である。(ラベルの結合した核酸は、ラベル化された化合物結合性核酸、ラベル化されたプローブ又は単にプローブと名付けることができる)。代表的なラベルは蛍光ラベルで、例えば蛍光色素、例えばフルオロセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、クマリン色素である。代表的な蛍光色素はFAM、HEX、JA270、CAL635、Coumarin343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-Red640、LC-Red705である。
任意のプライマー及び/又はプローブは化学的に修飾されてよい。すなわち前記プライマー及び/又は前記プローブは修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。そのような場合、前記プローブ又は前記プライマーは修飾されたオリゴヌクレオチドである。
核酸増幅の方法はとりわけその他の文献の中でも、米国特許第4,683,202号、4,683,195号、4,800,159号及び4,965,188号に開示されたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。PCRは典型的に、選択された核酸鋳型(例えばDNA又はRNA)に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを二以上使用する。核酸分析に役立つプライマーはその標的核酸の核酸配列内の核酸合成の開始点として働くことができるオリゴヌクレオチドを含む。そのプライマーは慣用な方法による制限消化により精製されてもよく、さもなくばそれは合成的に作製されてもよい。そのプライマーは増幅において最大の効率のために一本鎖とすることができるが、そのプライマーは二本鎖でもよい。二本鎖プライマーははじめに変性され、すなわち、鎖を分離させるために処理する。二本鎖核酸を変性させる一つの方法は加熱である。「熱安定性ポリメラーゼ」は熱で安定的なポリメラーゼ酵素で、すなわちそれは、鋳型に相補的なプライマーの伸長産物の形成を触媒し及び二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすために必要な時間の間温度上昇に従う時に不可逆的に変性しない酵素である。一般的に、その合成は各プライマーの3’末端から開始され、その鋳型の鎖に沿って5’から3’の方向に進む。熱安定性のポリメラーゼは例えばThermus flavus、T.ruber、T.thermophilus、T.aquaticus、T.lacteus、T.rubens、Bacillus stearothermophilus及びMethanothermus、fervidusから単離された。にもかかわらず、熱安定的でないポリメラーゼもその酵素を補充することを条件にPCRアッセイにおいて利用できる。
前記鋳型の核酸が二本鎖であれば、PCRにおいて鋳型として使用する前に、二本の鎖に分ける必要がある。鎖の分離は、物理的、化学的又は酵素学的な手法を含む、任意の適切な変性方法によって成し遂げられうる。核酸の鎖の分離方法の一つに、主に変性するまで前記核酸を加熱することを含む(例えば、50%、60%、70%、80%、90%又は95%変性以上)。鋳型の核酸を変性させるために必要なその加熱条件は、例えば緩衝剤中の塩濃度並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成物に依存するであろうが、温度及びその核酸の長さのようなその反応の特徴に依存した時間にわたって、典型的には約90℃から約105℃までの範囲である。変性は典型的に約5秒から9分行われる。それぞれのポリメラーゼ、例えばZ05 DNAポリメラーゼをそのような長時間の高温及びそれゆれ機能的な酵素の欠失する危機に曝露しないために、短い変性ステップを用いることが好まれうる。
前記二本鎖鋳型の核酸を熱により変性させる場合、反応混合物は、標的核酸上のその標的配列へのそれぞれのプライマーのアニーリングを促進する温度へと冷却させる。
アニーリングのための温度は、約35℃から約70℃、又は約45℃から約65℃、又は約50℃から約60℃、又は約55℃から約58℃であってよい。アニーリング時間は、約10秒から約1分(例えば約20秒から約50秒;約30秒から約40秒)であってよい。本明細書において、それぞれのアッセイの包括性を増やすために異なるアニーリング温度を用いることが利点になりえる。要するに、これは比較的低いアニーリング温度で、プライマーが一塩基ミスマッチを有している標的に結合して、ある一定の配列の変異が増幅されうることも意味している。これは例えば所定の有機体がさらに検出すべき既知又は未知の遺伝変異を有する場合に所望されうる。一方で、比較的高いアニーリング温度はより高い特異性を提供する利点を有し、より高い温度に向かえば、プライマーの標的配列への正しくない結合の可能性は減少し続ける。両方の現象からの利点のために、任意の例において、上記工程は異なった温度でのアニーリング、例えば開始時はより低温でその後より高温であることを含む。例えば開始時のインキュベーションが55℃で約5サイクルにより行われれば、正確ではない標的配列への結合が(事前に)増幅されうる。これは、例えば58℃で約45サイクルにより、実験の主要な部分を通してより高い特異性を提供し、続けて行うことができる。この方法は、潜在的に重要な遺伝的変異が見逃されない一方でその特異性が比較的高いまま維持される。
前記反応混合物は、前記ポリメラーゼ活性が促進又は最適化される温度、すなわち分析された核酸に相補的な産物を生じるためにアニール化されたプライマーにより起こる伸長のために十分な温度によってその時調整される。その温度は核酸鋳型へアニーリングされる各プライマーからの伸長産物の合成に十分であるべきだが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない。(例えば伸長のためのその温度は一般的に、約40℃から80℃の範囲である(例えば、約50℃から70℃;約65℃)。伸長時間は約10秒から約5分又は約15秒から2分又は約20秒から約1分、約25秒から約35秒でもよい。その新たに合成された鎖は、反応の継続するステップにおいて用いることができる二本鎖分子を形成する。鎖の分離、アニーリング及び伸長ステップは、前記標的核酸に対応する増幅産物の望まれた量を産生するために必要に応じて繰り返すことができる。前記反応のその限界因子は、その反応に存在するプライマー、熱安定性酵素及びヌクレオシド三リン酸の量である。そのサイクリングステップ(すなわち変性、アニーリング及び伸長)は少なくとも一回繰り返してもよい。検出に用いるために、サイクリングステップ数は例えばその試料の性質に依存する。前記試料が核酸の複雑な混合物であれば、より多くのサイクリングステップが標的配列を検出のために十分に増幅することが求められるだろう。一般的に、そのサイクリングステップは最低でも約20回繰り返されるが、40回、60回又は100回でさえも繰り返されてよい。
PCRは、アニーリング及び伸長のステップが同時のステップ(1ステップPCR)又は上記のように分かれたステップ(2ステップPCR)で行われることで実行されてもよい。アニーリング及び伸長を同時に、同じ物理的及び化学的条件下で、例えばZ05DNAポリメラーゼなどの適切な酵素を用いて行うことは、各サイクルにおいて加えられたステップの時間を省き、そしてまたアニーリングと伸長との間の加えられた温度調整の必要性も廃止する利点を有する。それゆえ、前記1ステップPCRは対応のアッセイのその全体の複雑性を減らす。
一般的には、結果までの時間を短くし、可能性のある早期診断を導くため、全体の増幅についてより短い時間が好まれうる。
使用された他の核酸増幅法は、リガーゼ連鎖反応(LCR;Wu D.Y.and Wallace R.B.,Genomics 4(1989)560-69;and Barany F.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応(Barany F.,PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)、ギャップLCR(WO 90/01069)、復旧連鎖反応(EP 0439182 A2)、3SR(Knoh D.Y.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177;Guatelli J.C.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878;WO 92/08808);及びNASBA(US 5,130,238)を含む。さらに、鎖置換増幅(SDA)、転写媒介性増幅(TMA)及びQb増幅(例えば、Whelen A.C.and persing D.H.,Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373;Abramson R.D.and Myers T.W.,Curr.Opin.Biotechnol.4(1993)41-47)参照)がある。
用語「Cp値」又は「Crossing Point」値は導入された標的核酸の定量化を可能にする値を意味する。前記Cp値は、二次微分最大値法に従って決定できる(Van Luu-The et.al.,「Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction.」BioTechniques,Vol.38,No.2,February 2005,pp.287-293)。二次微分法において、Cpは二次導関数曲線の第一のピークと相当する。このピークは対数直線増幅領域のその初期と相当する。二次微分法はそのリアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を計算し、そして一つの値のみが得られる。元々のCp法は、例えば多項式関数により、その強度の値を部分的に定義された微分近似に基づく。次に、三次導関数が計算される。前記Cp値は三次導関数の最小根である。前記Cpはまた、フィットポイント法を用いて決定でき、その中でそのCpは前記対数直線領域内の閾値線の平行線の交差により決定する。(Van Luu-The et.al.,BioTechniques,Vol.38, No.2,February 2005,pp.287-293)。Rocheにより提供されるLightCycler装置により提供される前記Cp値は、二次微分最大値法に従って計算される。
「PCR効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を意味する。PCR効率は式を用いて各条件で計算される:%PCR効率=(10(-slope)-1)×100、その中で、そのslopeはY軸上にプロットされたコピー数の対数とX軸上にプロットされたCpの線形回帰により計算された。PCR効率は完全適合又は不適合のプライマー鋳型を用いて測定できる。
「FRET」又は「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「Foster共鳴エネルギー移動」という用語は、少なくとも二つの発色団の間のエネルギー移動を意味し、当該二つの発色団は供与体の発色団及び受容体の発色団(消光剤として称される)である。その供与体は、当該供与体が適当な波長の光の照射により励起される時、典型的にそのエネルギーを受容体へ転移する。前記受容体は、典型的に異なった波長の光の照射の形式において転移されたエネルギーを再放出する。前記受容体が「dark」消光剤の時、光以外の形式において転移されたエネルギーを消散する。特定の蛍光色素が供与体又は受容体として働くかどうかは、前記FRETのペアの他のメンバーの特性に依存する。一般に用いられる供与体-受容体のペアはFAM-TAMRAのペアを含む。一般に用いられる消光剤はDABCYL及びTAMRAである。一般に用いられるdark消光剤はBlack Hole QuenchersTM(BHQ)、(Biosearch Technologies,Inc.,Novato,Cal.)、Iowa BlackTM(Integrated DNA Tech.,Inc.,Coralville,Iowa)及びBlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)(Berry&Assoc.,Dexter,Mich)を含む。
上記に述べたその方法は、供与体の蛍光部位と受容体の蛍光部位との間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に基づいてもよい。代表的な供与体の蛍光部位はフルオレセインであり、そして代表的な対応する受容体の蛍光部位はLC-Red 640、LC-Red 705、Cy5及びCy5.5を含む。典型的に、検出は供与体の蛍光部位により吸収された波長での試料を励起し、その対応する受容体の蛍光部位により発光された波長の可視化及び/又は測定を含む。本開示に従うプロセスにおいて、検出にFRETの定量化が続きうる。例えば検出は各サイクリングステップ後に行われる。例えば検出はリアルタイムに行われる。商業的に入手できるリアルタイムPCR装置(例えばLightCyclerTM又はTaqMan)の使用により、PCR増幅及び増幅産物の検出は、著しくサイクル時間を減らし、単一の閉鎖系のキュベット内で組み合わせることができる。検出が増幅と同時に行われるので、前記リアルタイムPCR法は前記増幅産物の操作の必要性を取り除き、そして増幅産物間の相互汚染のリスクを減少する。リアルタイムPCRは周回時間を大きく減らし、臨床検査室内の慣用なPCR技術の魅力的な代替物である。
下記の特許出願はLightCycler技術において使用されるものとしてのリアルタイムPCRを記載している:WO 97/46707、WO 97/46714及びWO 97/46712。前記LightCycler装置は高品質な光学機器を利用した微量蛍光光度計と組み合わされる迅速なサーマルサイクラーである。この迅速な熱サイクリング技術は反応容器として薄いガラスキュベットを用いている。反応容器の加温及び冷却は加熱及び周囲の空気の変化により制御される。キュベットの容量に対して低質量の空気及び高い割合の表面積により、非常に迅速な温度交換効率が温度容器内で成し遂げられえる。
TaqMan技術は二つの発色団部位をラベル化された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第一の蛍光部分は適当な波長の光により励起された時、その吸収されたエネルギーはFRETの原理に従い第二の蛍光に移送される。典型的な蛍光色素はこの方式では例えば、とりわけFAM、HEX、CY5、JA270、Cyan及びCY5.5が用いられる。前記第二の蛍光部分は一般的に消光分子である。PCR反応のアニーリング工程の間、そのラベル化されたハイブリダイゼーションプローブはその標的核酸(すなわちその増幅産物)に結合し、続く伸長工程の間、Taq又は当業者により周知の他の適当なポリメラーゼ、例えばZ05ポリメラーゼ変異体の5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。結果として、その励起された蛍光部位と消光部位は空間的に互いに離れる。結果として、消光剤の非存在において、第一の蛍光部位の励起時に第一の蛍光部位から蛍光発光が検出されえる。
上記の両方の検出方式において、放出されたシグナルの強度は元々の標的核酸分子の数に相関しうる。
FRETの代替物として、増幅産物は、二本鎖DNA結合色素、例えば蛍光DNA結合色素(例えばSYBRGREEN I又はSYBRGOLD(分子プローブ))を用いて検出してもよい。二本鎖核酸との相互作用上で、そのような蛍光DNA結合色素は適当な波長での光の励起後に蛍光シグナルを発する。二本鎖DNA結合色素、例えば核酸挿入色素も用いられうる。二本鎖DNA結合色素が用いられる時、融解曲線分析は通常、前記増幅産物の存在の確認のために行われる。
FRETと組み合わせて分子標識はまた本開示のリアルタイムPCR法を用いた増幅産物の存在の検出に用いてもよい。分子標識技術は第一の蛍光部位及び第二の蛍光部位にラベルされたハイブリダイゼーションプローブを用いる。その第二の蛍光部位は一般的には消光剤で、そしてその蛍光ラベルは典型的にそのプローブの各末端に位置する。分子標識技術は二次構造の形成を可能にする配列(例えばヘアピン)を有するプローブオリゴヌクレオチドを用いる。プローブ内の二次構造の形成の結果として、両方の蛍光部位はそのプローブが溶液中にある時、空間的に近位である。増幅産物にハイブリダイゼーションした後、そのプローブの二次構造は壊され、その蛍光部位は離れ離れになり、かくして、適当な波長の光で励起された後、第一の蛍光部位の発光が検出されうる。
それゆえ、本開示に従った方法は、FRETを用いた上記の方法であって、その中でそのプローブは二次構造の形成を可能にする核酸配列を含み、それにおいてその二次構造の形成がその第一と第二の蛍光部位との間で空間的に近位をもたらす。
効率的なFRETは、その蛍光部位が部分的に近位にある時及び供与体の蛍光部分の発光スペクトルが受容体の蛍光部分の吸収スペクトルに重なる時のみ起こりうる。
それゆえ、例えば、その供与体及び受容体の蛍光部分は、そのプローブ上でお互いに5ヌクレオチド以内にある。さらなる例において、その受容体蛍光部分は消光剤である。
上記のように、TaqManの方式において、PCR反応のアニーリング工程の間、そのラベル化されたハイブリダイゼーションプローブはその標的核酸(すなわちその増幅産物)に結合し、続く伸長工程の間、Taq又は当業者により周知の他の適当なポリメラーゼ、例えばZ05ポリメラーゼ変異体の5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性により分解される。それゆえ、一例において、上記のプロセスにおいて、増幅は5’から3’のエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。
上記のプロセスの結果として生じるアンプリコンの長さの注意深い選択はさらに利点がある。一般的に、比較的短い増幅産物はその増幅反応の効率を上げる。それゆえ、本開示の一つの側面は上記のプロセスであって、その中にその増幅断片は最大450塩基、最大300塩基、最大200塩基又は最大150塩基を含む。
「配列」は核酸の一次構造であり、すなわち対応の核酸からなる、単一の核酸塩基の特定の配置である。その「配列」という用語は例えばRNA又はDNAのような核酸の特定の型を意味せず、両方及び他の型の核酸、例えばペプチド核酸(PNA)又は他のものを適用すると理解される。核酸塩基がお互いに対応し合う場合、特にウラシル(RNAに存在)及びチミン(DNAに存在)のような場合において、当業者に周知のようにこれらの塩基はRNAとDNA配列との間で等価と考えられうる。
臨床的に関連性のある核酸はいわゆるDNAウイルスまたは細菌から由来しうるDNAであり、当該DNAウイルスは例えばB型肝炎ウイルス(HBV)、サイトメガロウイルス(CMV)及び他のものなどがあり、当該細菌は例えばクラミジア・トラコマチス(CT)、淋菌(NG)及び他のものなどがある。そのような場合において、標的核酸の性質を反映するために、DNAからなる内部のコントロール核酸を用いることは利点になりうる。
「細胞」、「株化細胞」及び「細胞培養物」という用語は互換的に用いることができ、全てのそのような表示は子孫を含む。それゆえ、「形質転換体」又は「形質転換細胞」という言葉は、導入の数に関わらず、その初代形質転換細胞及びその細胞から由来する培養物を含む。全ての子孫は、計画的又は偶発的な変異のために、DNA構成において正確に同一でないかもしれない。起源となる形質転換細胞において、スクリーニングされたものと同等の機能性を有する変異した子孫は、形質転換体の定義に含まれる。その細胞は原核生物又は真核生物であってもよい。
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主組織において作用可能式に連結するコード配列の発現のために必要なDNA配列を意味する。そのコントロール配列は、原核生物に適用可能で、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、positive retroregulatory elements(米国特許第4,666,848号)及び可能性のある他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが既知である。
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、典型的に細菌由来で、特定のヌクレオチド配列上で又は近くで二本鎖DNAを切断する酵素を意味する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは本明細書で規定される。これらのファミリーは塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、グリシン)、β-分岐鎖を有するアミノ酸(例えばトレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む。
「試薬溶液」という用語は、PCRの目的のために必要とされる又は用いられる少なくとも一つの試薬を含む任意の溶液である。最も典型的な成分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、二価の金属イオン(例えばマグネシウム)、塩、pH緩衝試薬、ヌクレオシド三リン酸(NTPs)又はデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTPs)、一つ以上のプローブ、蛍光色素(プローブに結合しうる)、核酸結合試薬及び一つ以上の核酸鋳型である。前記試薬は、ポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を有する他のポリメラーゼ反応の添加剤でもよい。
「マスターミックス」という用語はPCRを引き起こすために必要な成分又は因子の全て又は大半の混合物を意味し、そしてある場合において、試料及びアンプリコンに特異的な鋳型及びプライマーを除く全てを意味する。商業的に入手できるマスターミックスは通常濃厚な溶液である。マスターミックスは多数の試料に共通する全てのその試薬を含んでいてもよいが、一つの試料のみで構成されてもよい。マスターミックスの使用はピペット操作の誤差及びピペット量による試料間の差異を減らすことを手助けする。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に対して安定であり、熱耐性であり、かつ二本鎖DNAを変性させるのに必要な時間上昇した温度にさらされた後に、後続のプライマーの伸長反応をもたらすために十分な活性を保持する酵素を意味する。核酸変性のための必要な加熱条件は当該分野で十分に周知であり、米国特許第4,965,188号及び第4,889,818号で例証される。本明細書で用いられるように、熱安定性ポリメラーゼは温度サイクリング反応、例えばPCRでの使用に適用される。熱安定性核酸ポリメラーゼの例は、Thermus aquaticus Taq DNAポリメラーゼ、Thermus sp.Z05ポリメラーゼ、Thermus flavus ポリメラーゼ、Thermotoga maritima ポリメラーゼ、TMA-25及びTMA-30ポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ及びそのようなものが含まれる。
「逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ」は、RNA鋳型を基にDNA合成を可能にする核酸ポリメラーゼである。それはまた、RNAが一旦一本鎖cDNAに逆転写されると、一本鎖又は二本鎖DNAの複製を可能にする。例えば、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定的である。
DNAポリメラーゼによるRNA分子の増幅において、一度目の伸長反応はRNA鋳型を用いた逆転写であり、そしてDNA鎖が産生される。二度目の伸長反応は、そのDNA鋳型を用いて、二本鎖DNA分子を産生する。それゆえ、DNAポリメラーゼによるRNA鋳型から相補的なDNA鎖の合成は、増幅のための出発材料を提供する。
熱安定性DNAポリメラーゼは、一式の酵素の逆転写/増幅反応において用いられてもよい。本明細書の「均質」という用語は、逆転写及びRNA標的の増幅に対する二つのステップの単一の添加剤の反応を意味する。均質とは、逆転写(RT)ステップの後、増幅反応前に反応容器の開封又は他の反応成分の調節の必要がないことを意味する。非均質なRT/PCR反応において、逆転写に続き及び増幅前に、一つ以上の反応成分例えば増幅試薬が、例えば調節され、加えられ、希釈され、そのために反応容器は開けられるか又は少なくともその成分は操作されなければならない。均質及び不均質の両方の反応が本開示の例である。
逆転写はRT/PCTにおいて重要なステップである。それは例えば、RNA鋳型がプライマー結合及び/又は対応の逆転写因子によるcDNA鎖の伸長を妨害しうる二次構造形成への傾向を示すことは当該分野で周知のとおりである。それゆえ、RT反応のための比較的高い温度は転写効率に関しては利点がある。一方で、インキュベーション温度の上昇はまた、より高い特異性を意味し、すなわちそのRTプライマーは予想された配列にミスマッチを示す配列にはアニールしないだろう。特に、多数の異なる標的RNAの場合にはまた、例えば液体試料において未知又は希少な亜株又は亜種の有機体の存在する可能性がある場合に、単一のミスマッチ配列の転写及び続く増幅及び検出が所望されうる。
上記の両方の利点、すなわち二次構造及びミスマッチを有する鋳型の逆転写の減少から恩恵を被るため、そのRTインキュベーションは一つ以上の異なった温度で実行されてもよい。
それゆえ、本開示の一つの側面は上記のプロセスであって、その中で逆転写活性を有するポリメラーゼのそのインキュベーションは30℃から75℃又は45℃から70℃又は55℃から65℃の異なった温度で実行される。
逆転写のさらなる重要な側面として、長いRTステップは液体試料中に存在しうるDNA鋳型を傷つけうる。その液体試料がRNA及びDNA種の両方を含むなら、それゆえRTステップの時間を可能な限り短く保つこと、引き続く増幅及び任意の増幅物の検出のためにcDNAの十分な量の合成を保証することが好ましい。
それゆえ本開示の一つの側面は上記のプロセスであり、その中で逆転写活性を有するポリメラーゼのインキュベーションのための期間は、最大30分、20分、15分、12.5分、10分、5分又は1分である。
本開示のさらなる側面は上記のプロセスであり、その中で逆転写活性を有し、そして配列の変動を含んでおり、以下からなるグループから選択される。
a)CS5 DNAポリメラーゼ
b)CS6 DNAポリメラーゼ
c)Thermotoga maritima DNAポリメラーゼ
d)Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ
e)Thermus thermophilus DNAポリメラーゼ
f)Thermus flavus DNAポリメラーゼ
g)Thermus filiformis DNAポリメラーゼ
h)Thermus sp.sps17 DNAポリメラーゼ
i)Thermus sp.Z05 DNAポリメラーゼ
j)Thermotoga neapolitana DNAポリメラーゼ
k)Thermosipho africanus DNAポリメラーゼ
l)Thermus caldophilus DNAポリメラーゼ
これらの条件に特に適するものは、より迅速な伸長率という点でそれらの逆転写効率を促進するポリメラーゼドメイン内の配列変異を有する酵素である。
それゆえ、上記のプロセスにおいて、逆転写活性を有するポリメラーゼは対応の野生型のポリメラーゼと比較して改良された核酸伸長率及び/又は改良された逆転写活性を有するポリメラーゼ変異体である。
例えば、上記のプロセスにおいて、逆転写活性を有するポリメラーゼは対応の野生型ポリメラーゼと比較して改良された逆転写活性を有するポリメラーゼ変異体である。
それらに特に有用性を与える単一の配列変異を有するポリメラーゼはWO 2008/046612において開示される。特に、用いられるポリメラーゼは、少なくともそのポリメラーゼドメインに以下のモチーフを含む配列修飾されたDNAポリメラーゼであってもよい:T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N;式中で、Xb7はS又はTから選択されたアミノ酸であり;式中で、Xb8はG、T、R、K又はLから選択されたアミノ酸であって、その中でそのポリメラーゼは3’から5’エキソヌクレアーゼ活性を含み、野生型DNAポリメラーゼと比較して改良された核酸伸長率及び/又は改良された逆転写効率を有し、式中でその野生型DNAポリメラーゼにおいてXb8はD、E又はNから選択されたアミノ酸である。
一つの例は、Thurmus属Z05由来の熱安定性DNAポリメラーゼの変異体であり(例えば米国特許第5,455,170号に記載)、対応の野生型酵素Z05と比較してポリメラーゼドメイン内に前記配列の変異がある。本開示に従う方法の例は、580番目のアミノ酸がG、T、R、K及びLからなるグループから選択されるZ05 DNAポリメラーゼ変異体である。
熱安定性ポリメラーゼを用いた逆転写のために、Mn2+は二価カチオンであってもよく、そして典型的に塩、例えば、塩化マンガン(MnCl2)、酢酸マンガン[Mn(OAc)2]又は硫酸マンガン(MnSO4)として含まれる。MnCl2が50mM トリシン緩衝液を含む反応に含まれるなら、例えばMnCl2は一般的には0.5~7.0mMの濃度で存在する;各dGTP、dATP、dUTP及びdCTPが200μMで使用される時、2.5~3.5mMは一般的には存在する。
「修飾された」熱安定性ポリメラーゼは少なくとも一つの単量体が参照配列、例えば天然もしくは野生型のポリメラーゼ又は他の修飾された型のポリメラーゼから異なるポリメラーゼを意味する。見本となる修飾は単量体の挿入、欠失及び置換を含む。修飾されたポリメラーゼはまた、二以上の親から由来する同定可能な成分の配列(例えば、構造的な又は機能的なドメインなど)を有するキメラのポリメラーゼを含む。修飾されたポリメラーゼの定義には、参照配列の化学的な修飾を含むそれらも含まれる。
修飾された熱安定性ポリメラーゼの例は、G46E E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F CS5 DNAポリメラーゼ、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNAポリメラーゼ、G46E E678G CS6 DNAポリメラーゼ、Z05 DNAポリメラーゼ、ΔZ05ポリメラーゼ、ΔZ05-Goldポリメラーゼ、ΔZ05Rポリメラーゼ、E615G Taq DNAポリメラーゼ、E678G TMA-25ポリメラーゼ、E678G TMA-30ポリメラーゼ及びその他同様のものを含む。
「熱活性ポリメラーゼ」という用語は、特異的なプライミング及びプライマーの伸長を保証するために必要な上昇した温度(例えば55~80℃)で活性化する酵素を意味する。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は互換的に用いられる。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に用いられる。特に断りのない限り、アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシ末端へと記載される。特に断りのない限り、一本鎖核酸配列は5’から3’へと記載される。特に断りのない限り、二本鎖核酸配列のトップストランドは5’から3’へと記載され、そのボトムストランドは3’から5’へと記載される。
核酸増幅試薬は典型的に温度感受性の成分を含み、そしてそれゆえ往々にして周囲温度より十分に低い温度で貯蔵、輸送しなければならない。これは特にデオキシヌクレオシド三リン酸又はそれらのリボヌクレオシド三リン酸類似体の場合である。これらの試薬はその末端から連なるリン酸基の欠失を介して分解する傾向があり、ヌクレオシド二リン酸と一リン酸の形成をもたらし、それらは両方とも核酸ポリメラーゼの基質としてもはや活性ではない。
ヌクレオシドポリリン酸の安定性はその末端のリン酸のエステル化によって大幅に改善されうる。例えば、γ-メチル-dNTP類似体は、通常のdNTPsが完全に分解されるのに十分な熱ストレスの状況下で完全に安定的であった。しかしながら、この末端リン酸のエステル化は、あるポリメラーゼ酵素に対する効果的な基質として寄与するためのこれらのヌクレオチドのその能力に否定的な影響を有しえる。
本開示は改良された光開裂性(「ケージ化された」)ヌクレオシド三リン酸(dNTPs)を開示する。三リン酸の末端のリン酸へのチオフェニルo-ニトロフェニルプロピル基(SPh-NPP)の組み込みは加水分解を介する遅い分解に対してdNTPsを安定化する。さらに、前記SPh-NPP部位は酵素例えばポリメラーゼによるプロセシングを妨げる。これらの化合物のUV光の照射は、不可逆的にフリーなdNTPsを放出し、そして酵素学的な反応を開始する(「Photo-start PCR」、図1参照)。この戦略は、その酵素の残存する室温活性に起因する、非特異的なPCR産物の形成を抑制する。その酵素が熱により活性化されるホットスタートPCRとは対照的に、本明細書でその反応は、光誘発性のdNTPs基質の放出を介して制御される。
光開裂性の部位の連結はGhosn,et.al.,Control of DNA Hybridization with Photocleavable Adducts,Photochem.Photobiol.,2005,81:953-959に報告されており、その中で1-(4、5-ジメトキシ-2-ニトロフェニル)-エチルエステル(DMNPE)を介したDNAオリゴヌクレオチドのリン酸骨格と光開裂性の部位との間のエステル結合が報告された。さらに最近では、既知のo-ニトロフェニル発色団のチオフェニルの伸長がKretschy et.al.,Angew.Chem.Int.Ed.,2015,54Z:8555-8559で最初に導入された。その中で、チオフェニル-2-(2-ニトロフェニル)-プロポキシカルボニル(SPh-NPPOC)が光リソグラフィーマイクロアレイ合成のためのホスホロアミダイドの5’-ヒロドキシ基の保護基として用いられた。SPh-NPPOCの光分解は、ヌクレオチド、副産物のスチレン、そしてまたカーボネート結合のため1モルの二酸化炭素を放出する。前記SPh-NPPOC基は光脱保護効率において、従来法の2-(2-ニトロフェニル)-プロポキシカルボニルNPPOC(図2)と比較して12倍の増加を示す。
本開示のSPh-NPP-dNTPsの安定性は冷蔵の制限された又は冷蔵を利用できない場所での使用に適している。それゆえ、本開示の前記光開裂性dNTPsは「従来の」dNTPsよりもさらに長く及びさらに高い温度で保存できる。
以下の実施は、実施に現状好ましいものとして開示する。これらの実施例は例示として理解すべきであり、添付の特許請求の範囲に示されているもの以外、本発明を限定するものとして解釈されるべきである。
略称:ACN:アセトニトリル;CDI:1,1’-カルボニルジイミダゾール;DMF:ジメチルホルムアミド;DMSO:ジメチルスルホキシド;MeOH:メタノール;TBA:トリブチルアンモニウム;TEA:トリメチルアミン;TEAA:酢酸トリエチルアンモニウム;THF:テトラヒドロフラン
実施例1:チオフェニルo-ニトロフェニルプロピルdATP(dATP-SPh-NPP)の調製方法
dATP-SPh-NPPの合成を図3に概略的に示し、本明細書では簡潔に記載する。全ての工程は暗条件下で実施した。PhSNPP3OH
Figure 0007348898000005
をAr雰囲気下、そして0-4℃に冷やしてTHF(5mL、乾燥)に溶解した。220μLのTEA(乾燥)及び127μLのPOCl3を加え、その反応物を18時間撹拌し、水(8mL)でクエンチし1.5時間撹拌した。その水相を酢酸エチルで3回抽出した。その合わせた有機相をNa2SO4で乾燥した。その溶媒を減圧下で取り除いた。その残渣をACN/H2Oに溶解し、そして凍結乾燥して200mgのPhSNPP3MPが粘着性の樹脂として得られ、
Figure 0007348898000006
それを次工程に直接用いた。
200mgの未加工のPhSNPP3MPを6mLのDMF(乾燥)に溶解し、CDIを加え、混合物を乾燥条件下で4時間撹拌した。過剰なCDIをMeOHでクエンチし、30分間撹拌した。52mgのMgCl2、そして次に2.2等量のTBA-ADP溶液を加え、その反応物を3日間撹拌した。0.1MのTEAA緩衝液(pH4.1)を1:1の比で加えた。ダイヤイオンHP20吸着剤を加え、その反応物を30分間撹拌し、濾過した。その濾液を水で洗浄し、その生成物をMeOHで溶出した。その溶媒を次に吸引で取り除き、得られた残渣を水で溶解し、RP18-HPLCにより精製した。生成物画分を合わせ、凍結乾燥してPhSNPP3ATPを51%の収率で得た。
実施例2:dATP-SPh-NPPを用いた安定性の研究
300μMのdATP-SPh-NPP、40%のDMSO及び1.0Mの酢酸カリウムを含む水性混合物を調製した。対照のために、dATP-SPh-NPPの代わりに300μMのdATPを含む別の混合物を準備した。150μLの各混合物をサーモシェーカーで65℃でインキュベートした。0、2、18、25及び120時間後の各溶液(20μL)の試料をUPLC-MS(超高速液体クロマトグラフィー-質量分析)で分析した。260nmのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いられた。
結果:
使用した条件下では、質量分析で確認されたように、dATPはすぐに一リン酸及び二リン酸に分解した。dATP-SPh-NPPはdATPよりも著しく熱安定性があり、65℃で120時間、dATP-SPh-NPPの分解生成物は見られなかった(図4)。
実施例3:dATP-SPh-NPPの光開裂性
dATP-SPh-NPP及びATP-DMNPE(各300μM)の二つの水性混合物をリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH7.0)で調製した。両方の試料は振とう又は撹拌せずに開放系の容器でUV-LED光源(InGaN,Quantum well、λmax = 393nm、0.18 W/LED)からの光で同時に照射された。0、1、2、4、8及び16分後、試料の除去(20μL)及び続くUPLC-MS分析のためにその照射を一時的に停止した。260nmのピーク領域を出発材料及び分解生成物の割合を計算するために用いた。出発材料と開裂した生成物の分子の同一性は質量分析により確認された。
結果:
dATP-SPh-NPPに5分間以上照射した際に90%以上のdATPが遊離し、完全な開裂を8分間で達成した(図5)。dATP-SPh-NPPの光開裂は商用利用されているATP-DMNPE(Thermo-Fisher Scientific)よりも著しく早い。
実施例4:dATP-SPh-NPPを用いた増幅反応
PCRマスターミックス(20μL)、緩衝液ミックス(20μL)及びdNTPミックス(10μL)と名付けられる3つの成分の組み合わせにより、50μLの総量のリアルタイムPCR(TaqMan PCR)混合物を調製した。全てのPCR成分をDEPC処理水から調製した。前記PCRマスターミックスはトリシン緩衝液(pH8.2)、酢酸カリウム、グリセロール、DMSO、界面活性剤、標的DNA(400cp)、ポリメラーゼアプタマー、プローブ、プライマー、SYBR green染色剤及びポリメラーゼ酵素を含んでいた。前記緩衝液ミックスは酢酸マンガン(8.3mM)及びイミダゾール(0、3.0又は6.0mM)を含んでいた。前記dNTPミックスはdATP(400μM)、dCTP(400μM)、dGTP(400μM)及びdUTP(800μM)を含んでいた。別のdNTP混合物はdATPの代わりにdATP-SPh-NPP(400μM)を含んでいた。DNA標的の最終濃度は400cp/反応であった。
同じ組成物のTaqMan PCRを96穴プレートの二つの別々の区画に配置した。各区画は通常のdNTPsのPCR混合物及びdATP-SPh-NPPを含むPCR混合物を含んでいた。各PCRをトリプリケートで調製した。プレートの一区画をアルミホイルで覆い、一方で他の区画をUV-LED光源(InGaN,Quantum well、λmax = 393nm、0.18 W/LED)からの光で室温で8.0分間露光した。その後、カバーを取り外し、プレートをPCR増幅サイクルにかけ、その後LightCycler480システムでDNAを融解した。PCR増幅曲線の分析は、Cy5.5チャンネルで収集した蛍光データで実施し、一方で融解曲線の分析はFAMチャンネル(465-510nm)で収集した蛍光データに基づいていた。
結果:
SPh-NPPでケージ化されたdATPは、PCR増幅を妨げる(図6、グラフの左カラム;UV照射無し)。8.0分間のUV光の照射及び続くPCRサイクルはDNA増幅を導く(図6、グラフの右カラム)。イミダゾールの添加はPCR増幅曲線の形状には著しい影響を与えなかった。

Claims (7)

  1. 試料における標的核酸配列の有無を検出する方法であって、
    a)前記標的核酸配列が前記試料中に存在した場合の増幅産物を産生するための増幅試薬と前記試料との接触を含む増幅工程の実施と
    b)前記増幅産物の検出
    を含み、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
    (Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又はプリンもしくはピリミジン塩基類似体である)
    を含む方法であって、
    ここで、ステップa)の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。
  2. 増幅試薬を用いた標的核酸配列の増幅方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
    (Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又はプリンもしくはピリミジン塩基類似体である)
    を含む方法であって、
    ここで増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。
  3. 標的核酸の増幅のために用いられる増幅試薬の提供を含む増幅反応時に核酸の非特異的な増幅を減少又は予防する方法であって、ここで前記増幅試薬は光開裂性の部分を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
    (Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又はプリンもしくはピリミジン塩基類似体である)
    を含む方法であって、
    ここで増幅の前に、前記修飾されたヌクレオシド三リン酸に前記光開裂性の部位を切断可能な波長を有する光を照射する、方法。
  4. 光開裂性の部位を有し、つぎの構造を有する修飾されたヌクレオシド三リン酸:
    (Baseはプリンもしくはピリミジン塩基又はプリンもしくはピリミジン塩基類似体である)。
  5. 未修飾のヌクレオシド三リン酸と比較してより高い熱安定性を有することを特徴とする、請求項4の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸。
  6. 請求項4の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに核酸増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
  7. 請求項5の前記修飾されたヌクレオシド三リン酸を含み、さらに核酸増幅反応を実施するために必要な試薬を含むキット。
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