DE10227814A1

DE10227814A1 - Verfahren zur Abspaltung von labilen funtionellen Gruppen aus chemischen Verbindungen

Info

Publication number: DE10227814A1
Application number: DE10227814A
Authority: DE
Inventors: Klaus-Peter Stengele
Original assignee: Chemogenix GmbH
Current assignee: Nimblegen Systems GmbH
Priority date: 2002-06-21
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2004-01-08
Also published as: AU2003278505A1; WO2004001033A3; EP1519941A2; AU2003278505A8; WO2004001033A2; US20050170281A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus Molekülen durch die Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung zur Verfügung, wobei die Moleküle mit einer chemischen Verbindung zusammengebracht werden, deren Triplett-Zustand energetisch höher liegt als der Triplett-Zustand der labilen funktionellen Gruppe und anschließend elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt werden, wobei die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung aufweisen. Weiter stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von DNA Chips durch räumlich adressierte lichtgesteuerte Nukleotidsynthese auf festen Substraten zur Verfügung, welches die folgenden Schritte umfasst: DOLLAR A a) Umsetzen der ungeschützten terminalen 3' oder 5' Hydroxygruppe eines auf dem festen Substrat angeordneten Nukleosids und/oder Nukleotids unter üblichen Bedingungen mit einer photolabilen Schutzgruppe und gegebenenfalls Aufreinigung des Reaktionsprodukts, DOLLAR A b) Aufbringen einer Lösung, Suspension oder Dispersion einer chemischen Verbindung, deren Triplett-Zustand energetisch höher liegt als der Triplett-Zustand der photolabilen Schutzgruppe auf der Oberfläche des Trägers, die die in Schritt a) modifizierten Nukleotide und/oder Nukleoside aufweist, DOLLAR A c) räumlich selektive Bestrahlung der in Schritt b) behandelten Oberfläche des Trägers mit elektromagnetischer Strahlung im UV/VIS Bereich ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus Molekülen durch die Einwirkung von elektromagnetischer Strahlung sowie ein Verfahren zur Herstellung von DNA Chips durch räumlich adressierte, lichtgesteuerte Nukleotidsynthese auf festen Substraten, des weiteren eine chemische Zusammensetzung sowie die Verwendung dieser chemischen Zusammensetzung zur Herstellung von DNA Chips.

Die leichte Abspaltung von funktionellen Gruppen aus Molekülen spielt auf vielen Gebieten der Chemie und Biologie eine wichtige Rolle, so auch beispielsweise beim Aufbau größerer chemischer Einheiten, wie etwa bei der Synthese von Polymeren, Naturstoffen usw. Dabei werden besonders reaktive Gruppen, die die jeweilige beabsichtige Verknüpfung zweier Moleküle beeinträchtigen oder durch unerwünschte Nebenreaktionen stören können durch chemisch oder physikalisch wieder abspaltbare funktionelle Schutzgruppen zeitweilig gezielt „maskiert" bzw. geschützt, damit sie nicht an der erwünschten Verknüpfungsreaktion teilnehmen.

Für ein vergleichendes Studium der molekularen Erkennung zwischen Biomolekülen der gleichen oder verschiedener Strukturklassen, ist der Einsatz großer kombinatorischer Bibliotheken von auf einem Substrat immobilisierten Bindungspartnern der in Lösung angebotenen Biomoleküle von großem Vorteil.

Unter dem Begriff "Biomoleküle" versteht der Fachmann Verbindungen aus den Klassen der Nukleinsäuren und deren Derivate, Proteine, Peptide und Kohlenhydrate.

Dieses Prinzip der wechselseitigen molekularen Erkennung findet insbesondere beim gezielten Aufbau von Polynukleotiden aus Nukleosidbausteinen und/oder Oligonukleotidbausteinen Anwendung. Der gezielte Polynukleotidaufbau wiederum ist für die Herstellung von DNA Chips, die eine hohe Dichte („high-density DNA-chip") von darauf angeordneten Polynukleotiden aufweisen von entscheidender Bedeutung.

DNA Chips, d.h. sogenannte Microarrays von Feldern auf einem Glas- oder Polymersubstrat immobilisierter DNA oder beliebig ausgewählter Oligonukleotide, die als Super-multiplex-Sonden der molekularen Erkennung durch Hybridisierung fungieren, (S.P.A. Fodor, Science 277 (1997) 393, DNA Sequencing Massively Parallel Genomics) werden schon seit längerem beispielsweise in der Medizin und der pharmazeutischen Forschung eingesetzt.

Dort nehmen DNA-Chips wiederum eine wichtige Rolle bei der genetischen Analytik und Diagnostik ein. Die am weitesten verbreitete Technik zur Herstellung derartiger DNA-Chips ist die sogenannte räumlich adressierte, parallele, lichtgesteuerte Oligonukleotidsynthese auf festen Substraten (siehe z.B. S.P.A. Fodor et al., Nature 364 (1993) 555, Multiplexed Biochemical Arrays with Biological Chips) unter Verwendung photolabiler Schutzgruppen, d.h. Schutzgruppen für reaktive Funktionalitäten der Nukleosid- bzw. Nukleotidbausteine, die unter der Einwirkung von zumeist UV-Licht bestimmter Wellenlänge gezielt wieder abgespalten werden können, so dass die geschützten Funktionalitäten für eine Weiterreaktion wieder zur Verfügung stehen.

Zur Herstellung der DNA Chips dient dabei die vorstehend angesprochene sogenannte photolithographische Technik. Dabei wird der synthetische Aufbau der gewünschten Oligonukleotidketten auf dem Substrat durch geeignete labile Schutzgruppen kontrolliert, die beispielsweise bei Belichtung (zumeist wird dazu elektromagnetische Strahlung im UV/VIS Bereich verwendet) die Anknüpfungsstelle für das jeweils nächste Nukleotid freigeben. Bislang sind diese Schutzgruppen bevorzugt photolabil. Mit Hilfe dieser photolabilen Schutzgruppen läßt sich durch eine räumliche selektive Belichtung eine kombinatorische Strategie entwickeln, mit der man extrem dichte, räumlich adressierbare Microarrays von Oligonukleotiden erzeugen kann, deren Anzahl mit der Zahl der Synthesezyklen („split and pool") exponentiell anwächst. Bei einer derzeit erreichbaren Fläche jedes Elements von weniger als 50 μm² lassen sich theoretisch mehr als 10⁶ Sondenfelder auf 1 cm² unterbringen. Bislang erfolgt die Belichtung mit Hilfe von Mikrospiegel-Arrays (S. Singh-Gasson, et al, Nature Biotechn. 17 (1999) 974, Maskless Fabrication of Light Directed Olignucleotide Microarrays using a Digital Micromirror Array), wie sie in der Digital-Projektionstechnik verwendet werden. Damit wird die zeit- und kostenaufwendige Herstellung von Belichtungsmasken erspart und erlaubte die Möglichkeit einer schnelleren Herstellung der DNA Chips mittels der photolithographischen Technik.

Derzeit eingesetzte photolabile Schutzgruppen weisen noch keine befriedigenden Ergebnisse in Bezug auf die Fehlerrate der derart synthetisierten DNA Chips auf (D.J. Lockheart and E.A. Winseler, Nature 405 (2000) 827, Genomics, Gene expression and DNA arrays). Die Abspaltung der Schutzgruppen verläuft nicht vollständig genug, da sie zumeist nur eine geringe Absorptionsfähigkeit für die eingesetzten UV/VIS Wellenlängen aufweisen. Außerdem treten dabei durch partiell oder ganz angeregte Schutzgruppen störende Nebenreaktionen mit unerwünschten Reaktionsprodukten auf, so dass ein Großteil der Oligonukleotide auf den DNA-Chips nicht verwendet werden kann.

Ein zentraler Punkt der photolithographischen Synthese besteht im Einsatz der photolabilen Schutzgruppen, die in vielfältigen chemischen Varianten in der organischen und bioorganischen Chemie eingesetzt werden (V.N.R. Pillay, Photolithic Deprotection and Activation of Functional Groups; in: Organic Photochemistry, Vol. 9 ed. A. Padwa (Marcel Dekker, New York and Basel, 1987), Seite 225 ff.). Am Weitesten verbreitet sind photolabile Schutzgruppen auf der Basis der 2-Nitrobenzyl-Gruppe. (J.E.T. Correy and E.R. Trenton, Caged Nucleotides and Neurotransmitters; in: Biological Applications of Photochemical Switches, in: Bioorganic Photochemistry Series, Vol. 2 ed. Harry Morrison (Wiley Interscience, 1993), Seite 243 ff.).

Bei der Herstellung von DNA Chips, beispielsweise beim Schutz der terminalen 5'-OH Gruppe beim Oligonukleotidaufbau vom 3' zum 5' bzw. vom 5' zum 3' Ende wird von den Schutzgruppen des 2-Nitrobenzyltyps bislang vor allem die MeNPOC (α-Methyl-Nitropiperonyloxycarbonyl-) Schutzgruppe bevorzugt, die seit längerem die Standardschutzgruppe bei der DNA-Chip Herstellung ist (S.P.A. Fodor, et al, Science 251 (1991), 767, Light Directed, Spatially Adressible Parallel Chemical Synthesis).

Nachteilig bei dieser Art der Schutzgruppen ist die Bildung des aromatischen Nitrosoketons nach der Bestrahlung, das eine sehr reaktive Abgangsgruppe darstellt. Dadurch treten unerwünschte Folgereaktionen auf, die oftmals Fehler im Nukleotidaufbau des resultierenden Oligo- bzw. Polynukleotids hervorrufen.

Seit kurzem wurde auch die DMBOC Gruppe (3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-) als Schutzgruppe (M.C. Pirrung et al, J. Org. Chem. 63 (1998), 241, Proofing of Photolithographic DNA Syntheses with 3',5'-Dimethoxybenzoinyloxycarbonyl-protected Deoxynucleosidephosphoramidites) bei der gezielten Polynukleotidsynthese verwendet.

Vorteilhafterweise entsteht bei der Abspaltung der DMBOC Schutzgruppe ein Benzofuranderivat, dessen intensive Fluoreszenz beispielsweise als Indikator für den Fortgang der Photoreaktion genutzt werden kann.

Beide der derzeit bekannten photolabilen Schutzgruppen erfordern unter den üblichen Bestrahlungsstärken mit der 365 nm Linie einer Quecksilberdampflampe Bestrahlungszeiten von einigen Minuten, um quantitativ abreagieren zu können.

Weiter sind 2-(2-Nitrophenyl)-ethoxycarbonyl Verbindungen bei der Herstellung von DNA-Chips bekannt, bei denen die Schutzgruppen als 2-Nitrostyrolderivate abgespalten werden ( DE-PS 44 44 996 , DE-PS 196 20 170 und US-5,763,599 ). Auch sind diese Verbindungen durch die Abspaltung von im allgemeinen etwas reaktionsträgeren 2-Nitrostyrolen im Hinblick auf störende Nebenreaktionen etwas weniger störanfällig als die vorerwähnten Verbindungen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein Verfahren zu finden, bei dem die Abspaltung labiler Gruppen bezüglich der Reaktionszeit der Abspaltungsreaktion deutlich verringert wird und die Abspaltungsreaktion in Bezug auf ihre Ausbeute optimiert werden kann. Eine weitere Aufgabe bestand darin, das Risiko unerwünschter Nebenreaktionen bei der Abspaltung der labilen Schutzgruppe zu verringern.

Die Eingangs genannte Aufgabe der vorstehenden Erfindung wird dadurch gelöst, daß das erfindungsgemäße Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus Molekülen folgende Schritte umfaßt:

a) Wahl einer geeigneten chemischen Verbindung deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der labilen funktionellen Gruppe
b) Zusammenbringen mit den Molekülen, die die labilen funktionellen Gruppen umfassen
c) Einwirken von elektromagnetischer Strahlung, wobei die Abfolge der Schritte b) und c) beliebig ist,

und wobei die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung aufweisen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erreicht, daß eine Anregung des Triplettzustands der erfindungsgemäßen ausgewählten geeigneten chemischen Verbindung erfolgt, und die von der ausgewählten chemischen Verbindung derart absorbierte elektromagnetische Strahlung über einen Triplett-Triplett Übergang auf die labile funktionelle Gruppe übertragen wird, die anschließend effizient und schnell abgespalten werden kann. Die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung weisen unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung auf, d.h. nur die geeignete chemische Verbindung wird durch die elektromagnetische Strahlung angeregt, nicht jedoch die labile funktionelle Gruppe. Der Triplett-Triplett Übergang findet wegen der unterschiedlichen Energielücken beider Verbindungen noch effizienter statt, aber es werden vorteilhafterweise unerwünschte Nebenreaktionen vermieden. Diese entstehen dadurch, daß ein Teil der vorhandenen labilen funktionellen Gruppen zwar durch die elektromagnetische Strahlung angeregt wird, wenn die labile funktionelle Gruppe ein gleiches oder ähnliches Absorptionsmaximum wie die Sensibilisatorverbindung aufweist, jedoch nicht in den Triplettzustand übergehen und im angeregten Zustand eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen, wie z.B. Zerfall, intra- und intermolekulare Umlagerungen usw. hervorrufen können. Dabei ist es für die vorliegende Erfindung gleichgültig, ob das Verfahren in Lösung oder in fester Phase, beispielsweise auf einem festen Träger, auf dem die Moleküle, die die labilen funktionellen Gruppen enthalten aufgebracht sind, durchgeführt wird. Damit ist das Verfahren für eine Vielzahl von Reaktionen, beispielsweise bei der Synthese von Oligonukleotiden oder Oligomeren bzw. Polymeren gut geeignet, da insbesondere bei der Polymerherstellung und der Oligonukleotidsynthese oftmals eine Vielzahl von unerwünschten Nebenreaktionen auftritt.

Unter dem Begriff "sehr ähnlicher Triplettzustand" wird vorliegend verstanden, dass "sehr ähnlich" einen Energiebereich um den Triplett Zustand umfaßt, der ein Mehrfaches n der mittleren thermischen Energie RT mit einer Größenordnung von ca. 2,5 kJ des Triplettzustandes der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung ist, wobei n = 8, bevorzugt 4 ist.

Bei der Schrittabfolge b)–c) wird die Strahlungsenergie besonders gut genutzt, da neben der üblichen Reaktion der photolabilen Gruppe zusätzlich auch die Sensibilisierung über die Triplett-Triplett-Energieübertragung zur Abspaltung genutzt wird.

Das Zusammenbringen erfolgt über dem Fachmann bekannte Verfahren, wobei es von Vorteil ist, wenn beide Verbindungen, d.h. die Moleküle mit den labilen funktionellen Gruppen und die erfindungsgemäße chemische Verbindung (im folgenden auch „Sensibilisatorverbindung" genannt) in der gleichen Phase vorliegen.

Je nach Wahl der funktionellen Schutzgruppe und der entsprechenden Sensibilisatorverbindung, wird jeweils deren Absorptionsmaximum für elektromagnetische Strahlung bestimmt. Damit ist auch eine gezielte Auswahl der entsprechenden Wellenlänge elektromagnetischer Strahlung aus dem elektromagnetischen Wellenlängenspektrum möglich.

Die Abspaltung gelingt jedoch auch dann, wenn nur die Sensibilisatorverbindung durch die elektromagnetische Strahlung aktiviert wird, d.h. bei einer Schrittfolge c)–b) des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Sensibilisatorverbindung überträgt dann ihre Triplettenergie sehr effektiv auf die funktionelle Schutzgruppe. Dies führt vorteilhafterweise dazu, dass auch ansonsten für derartige Reaktionen ungeeignete, mit funktionellen Schutzgruppen versehene Moleküle, die beispielsweise durch elektromagnetische Strahlung definierter Wellenlänge, die eine Abspaltung initiieren würde, zerstört würden, oder die eine Vielzahl unerwünschter Folgereaktionen initiieren würden, einer Abspaltungsreaktion unterzogen werden können. Dies geschieht durch Wahl der geeigneten Sensibilisatorverbindung und Bestrahlung mit einer unkritischen Wellenlänge, die die Moleküle nicht zerstört und nur die Sensibilisatorverbindung aktiviert, die anschließend diese Energie durch die Triplett-Triplett Übertragung auf die empfindlichen Moleküle überträgt, so dass trotzdem die funktionellen Gruppen abgespalten werden können. Beispielsweise läßt sich die Sensibilisatorverbindung durch Vorabbestrahlung mit einem Laser oder anderer energiereicher, Strahlung wie Röntgen-, Elektronen- oder Partikelstrahlen z.B. α oder γ-Strahlen aktivieren.

Ebenso ist es in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform möglich, dass die Schritte b) und c) zeitgleich ablaufen.

Besonders bevorzugt weist die elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge auf, die im Bereich des Absorptionsmaximums der Sensibilisatorverbindung liegt. Damit wird gewährleistet, daß ausschließlich die geeignete chemische Verbindung angeregt wird, nicht jedoch die labile funktionelle Gruppe. Damit werden unerwünschte Nebenreaktionen der partiell oder ganz angeregten labilen funktionellen Gruppe vermieden. Dies führt weiter zu einer effizienteren Energieübertragung von der geeeigneten angeregten chemischen Verbindung auf die labile funktionelle Gruppe, so daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltung steigt und sich die Ausbeute durch das Fehlen unerwünschter Folgereaktionen verbessert. Außerdem entfallen dadurch eventuell notwendige Reinigungsschritte des durch Reaktionsprodukte von unerwünschten Nebenreaktionen verunreinigten gewünschten Hauptreaktionsproduktes.

Bevorzugt ist die labile Gruppe photolabil, so dass das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere einfach beispielsweise in bekannten Verfahren zur Herstellung von DNA, Protein und Peptid-Chips eingesetzt werden kann. Aber auch in photoinduzierten Polymerisationsreaktionen in der klassischen Polymerchemie oder in durch elektromagnetische Strahlung anderer Wellenlängen, wie beispielsweise IR-induzierte Polymerisationsreaktionen ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft einsetzbar. Vorzugsweise liegt die elektromagnetische Strahlung im Wellenlängenbereich von UV/VIS Strahlung (210–450 nm). Damit läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren beispielsweise bei der Herstellung von DNA und Peptid Chips unter Verwendung herkömmlicher Quecksilber Dampflampen einsetzen. Natürlich sind auch andere, dem Fachmann an sich bekannte geeignete Lichtquellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung einsetzbar.

Besonders vorteilhaft ist, wenn der Singulettzustand der chemischen Verbindung gleich hoch oder tiefer liegt als der Singulettzustand der labilen funktionellen Gruppe. Unter diesen Voraussetzungen kann die Wellenlänge und damit die Energie des eingestrahlten Lichtes in einem bestimmten Bereich, d.h. in ein sogenanntes "Fenster" des elektromagnetischen Spektrums verschoben werden, in dem die zu erwartenden Nebenreaktionen, insbesondere bei der Herstellung von DNA Chips, weiter minimiert werden können.

Insbesondere ist bevorzugt, wenn die Triplett-Singulett-Energielücke der chemischen Verbindung kleiner ist als die Triplett-Singulett-Energielücke der labilen funktionellen Gruppe. Bevorzugt besitzt die chemische Verbindung weiterhin eine hohe Triplettbildungsquantenausbeute φ_T in der Nähe der maximal möglichen Größe von 1.

Die Aufgabe der vorstehenden Erfindung wird weiter durch ein Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken enthaltend Biomoleküle, insbesondere zur Herstellung von DNA-Chips und Peptid-Chips sowie deren Analoga und Mimetika durch räumlich adressierte lichtgesteuerte Synthese auf festen Substraten gelöst, welches die folgenden Schritte umfaßt:

a) Umsetzen der ungeschützten terminalen 3' oder 5' Hydroxygruppe eines auf dem festen Substrat angeordneten Nukleosids und/oder Nukleotids oder eines Nukleinsäureanalogon oder einer -COOH oder Aminogruppe eines geeigneten Peptids unter üblichen, dem Fachmann bekannten Bedingungen mit einer photolabilen Schutzgruppe oder Umsetzen einer -OH, -COOH, -NHR Gruppe, wobei R = H, Alkyl, Aryl, Aralkyl sein kann mit einem Baustein, der eine photolabile Schutzgruppe umfaßt und gegebenenfalls Aufreinigung des Reaktionsproduktes
b) Aufbringen einer chemischen Verbindung (Sensibilisator), deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der photolabilen Schutzgruppe auf die Oberfläche des Trägers, die die in Schritt a) modifizierten Nukleotide und/oder Nukleoside oder Nukleinsäureanaloga oder Peptide oder Peptidmimetika aufweist
c) räumlich selektive Bestrahlung der in Schritt b) behandelten Oberfläche des Trägers mit elektromagnetischer Strahlung im UV/VIS Bereich
d) Umsetzung mit einem Nukleosid und/oder Nukleotid, bei dem eine freie 5' oder 3'OH Gruppe durch eine photolabile Gruppe geschützt oder mit einem entsprechenden geeigneten Peptid oder mit einer geeigneten Aminosäure
e) gegebenenfalls Wiederholung der Schritte b) bis d) und

wobei die photolabile Schutzgruppe und der Sensibilisator unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung im UV/VIS Bereich aufweisen.

Das Aufbringen erfolgt über gängige Verfahren wie Rakeln, Sprühen, Aufspritzen, Zutropfen etc., wobei die chemische Verbindung im Reinzustand, in Lösung, Suspension oder als Dispersion zugegeben werden kann.

Damit wird erreicht, dass die Absorption elektromagnetischer Strahlung insgesamt gesteigert wird, da das vom Sensibilisator absorbierte Licht durch Übertragung seiner Triplettenergie auf die labile Schutzgruppe sehr effektiv für die Abspaltungsreaktion zur Wirkung kommt. Bei einer gegebenen Strahlungsintensität verläuft die Abspaltung in Gegenwart des Sensibilisators deshalb schneller.

Die photolabile Schutzgruppe und der Sensibilisator weisen unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung auf, d.h. nur der Sensibilisator wird durch die elektromagnetische Strahlung angeregt, nicht jedoch die photolabile Schutzgruppe.

Bei unterschiedlichen Absorptionsmaxima des Sensibilisators und der photolabilen Schutzgruppe findet der Triplett-Triplett Übergang wegen der unterschiedlichen Energielücken noch effizienter statt, aber es werden vorteilhafterweise unerwünschte Nebenreaktionen vermieden, die danjn auftreten, wenn Sensibilisator und photolabile Schutzgruppe gleiche oder ähnliche Absorptionsmaxima aufweisen. Diese Nebenreaktionen werden dadurch hervorgerufen, daß ein Teil der vorhandenen labilen funktionellen Gruppen zwar durch die elektromagnetische Strahlung angeregt wird, jedoch nicht in den Triplettzustand übergeht und im angeregten Zustand eine Vielzahl unerwünschter Nebenreaktionen, wie z.B. Zerfall, intra- und intermolekulare Umlagerungen usw. hervorrufen können. Dabei ist es für die vorliegende Erfindung gleichgültig, ob das Verfahren in Lösung oder in fester Phase, beispielsweise auf einem festen Träger, auf dem die Moleküle, die die photolabilen Schutzgruppen enthalten aufgebracht sind, durchgeführt wird.

Selbstverständlich ist dieses Verfahren genauso vorteilhaft für die Synthese von Polypeptiden, und anderen Molekülen geeignet.

Besonders bevorzugt weist die elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge auf, die im Bereich des Absorptionsmaximums der Sensibilisatorverbindung liegt. Damit wird noch effektiver gewährleistet, daß ausschließlich die Sensibilisatorverbindung angeregt wird, nicht jedoch die photolabile Schutzgruppe. Damit werden unerwünschte Nebenreaktionen der partiell oder ganz angeregten labilen funktionellen Gruppe vermieden. Dies führt weiter zu einer effizienteren Energieübertragung von der Sensibilisatorverbindung auf die photolabile Schutzgruppe, so daß die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltung steigt und sich die Ausbeute durch das Fehlen unerwünschter Folgereaktionen verbessert. Außerdem entfallen dadurch eventuell notwendige Reinigungsschritte des durch Reaktionsprodukte von unerwünschten Nebenreaktionen verunreinigten gewünschten Hauptreaktionsproduktes.

Des Weiteren wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch die Bereitstellung einer chemischen Zusammensetzung gelöst, die ein Molekül mit einer labilen funktionellen Gruppe, sowie eine geeignete chemische Verbindung, deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der labilen funktionellen Gruppe, umfasst und wobei die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung aufweisen.

Die Kombination zweier verschiedender Verbindungen mit unterschiedlichen Triplettzustand, wobei der eine Triplettzustand höher oder sehr ähnlich liegt wie der andere Triplettzustand, ermöglicht den nahezu verlustfreien Transfer von Triplettanregungsenergie von der einen Verbindung zur labilen funktionellen Gruppe, die die Energie aufnimmt und dann leichter abgespalten wird, ohne selbst durch elektromagnetische Strahlung angeregt werden zu müssen. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung findet bevorzugt Verwendung in einem der vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren, die dadurch effizient und einfach ablaufen.

Bevorzugt ist die funktionelle Gruppe eine photolabile Gruppe, da die Möglichkeit der zur Verfügung stehenden Wellenlängen bzw. der Bestrahlungswellen einfacher zur Verfügung zu stellen ist. Jedoch können auch sämtliche anderen Gruppen verwendet werden, die mit anderer elektromagnetischer Strahlung, beispielsweise IR, oder länger- bzw. kürzerwelliger Strahlung bestrahlt werden können.

Bevorzugt ist die labile, insbesondere bevorzugt die photolabile Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPPOC, MeNPOC, MeNPPOC, DMBOC, NPES, NPPS und deren substituierten Derivaten, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroaryl)ethoxycarbonyl oder -thiocarbonyl-Verbindungen, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-Nitrobenzyl-, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl bzw. thiocarbonyl Verbindungen, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroheterocycloaryl)ethoxycarbonyl, oder -thiocarbonyl Verbindungen, sowie substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroheterocycloalkyl)ethoxycarbonyl/thiocarbonyl Verbindungen, substituierten und unsubstituierten 2-Nitro-N-Methylanilincarbonyl- bzw. thiocarbonylderivaten.

Die vorstehend genannten Abkürzungen bedeuten dabei folgendes:

NPP: OC 2-(2-Nitrophenyl)propyloxycarbonyl
MeNPP: OC 2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)propyloxycarbonyl
MeNP: OC 2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)oxycarbonyl
DMB: OC Dimethoxybenzoinylyloxycarbonyl
NPES: 2-(2-Nitrophenyl)ethylsulfonyl
NPPS: 2-(2-Nitrophenyl)propylsulfonyl

Vorzugsweise enthält die chemische Verbindung das Strukturmotiv

wobei Y = O, S, N, Se oder Te ist, n = 1 oder 2 bedeutet, C Bestandteil eines aromatischen, heteroaromatischen oder kondensierten aromatischen oder heteroaromatischen Systems und wobei im Falle, dass n = 2 ist, das aromatische, heteroaromatische oder kondensierte aromatische oder heteroaromatische System gleich oder verschieden sein kann.

Vorteilhaft ist insbesondere das Vorhandensein konjugierter n-Systeme bzw. konjugierter Doppelbindungen.

Besonders bevorzugt werden Benzophenon- und Thioxanthonderivate eingesetzt.

Das erfindungsgemäße Strukturmotiv ermöglicht ein effektives Intersystem-Crossing in den Triplett Zustand, eine lange Triplett Lebensdauer von mehr als 0,6 Mikrosekunden (μs), insbesondere von mehr als 1 Mikrosekunde (μs). Außerdem bewirkt es, daß die chemische Verbindung im Triplett Zustand chemisch weitgehend stabil ist, so daß die Verbindung im Triplett Zustand sehr reaktionsträge ist.

Natürlich kann nicht nur die erfindungsgemäße chemische Verbindung allein, sondern auch als als angeregtes oder nicht angeregtes Dimer, Oligomer, Multimer, Assoziat, als Komplex mit Verbindungen die ein Element des Periodensystems, vorzugsweise ein Metall oder ein Halbmetall, umfassen, eingesetzt werden. Selbstverständlich können auch zwei oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße Verbindungen eingesetzt werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Bevorzugt werden Lösungen umfassend 0.001 bis 5 Gew%, bezogen auf das eingesetzte Lösungsmittel, besonders bevorzugt umfassend zwischen 0.005 und 0.05 Gew% der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung bezogen auf das eingesetzte Lösungsmittel eingesetzt.

Mehr als 5 Gew% Anteil der erfindungsgemäßen chemischen Verbindung führt in vielen Fällen zu chemischen Reaktionen mit dem Molekül, das die funktionelle Gruppe umfaßt, insbesondere bei der Synthese von Oligonukleotiden und DNA Sequenzen und kann diese zerstören. Von daher sind geringere Konzentrationen zumeist vorzuziehen. Die genaue Wahl der geeigneten Konzentration kann der Fachmann mithilfe weniger, ihm an sich bekannter Vorabversuche einfach ermitteln.

Bevorzugt wird die erfindungsgemäße chemische Zusammensetzung zur Herstellung von Oligonukleotiden , beispielsweise von DNA Chips, in einem dem Fachmann an sich bekannten lichtgesteuerten Verfahren verwendet, wie sie beispielsweise in der Einleitung erläutert worden sind, da damit in einfacher Weise ein Energietransfer zwischen dem Triplettzustand der Sensibilisatorverbindung und der photolabilen Schutzgruppe ermöglicht wird und somit die photochemische Abspaltungsreaktion besonders schnell und vollständig in Gang gesetzt werden kann. Die Synthese der Oligonukleotide kann dabei selbstverständlich sowohl in Lösung als auch auf einem festem Substrat, wie z.B. einem bekannten Chipsubstrat erfolgen.

Unter dem Begriff „Nukleotid" werden erfindungsgemäß sowohl Polynukleotide mit zwei bis zu 10 Nukleoside verstanden, die untereinander sowohl über 3'-5' als auch über 5'-3' Phosphorsäureesterbindungen verbunden sind. Jedoch umfassen die erfindungsgemäßen Nukleotide ebenfalls Polynukleotide aus mehr als 10 Nukleosid-Bausteinen.

Die erfindungsgemäßen Verfahren sind nicht nur zur DNA- und RNA Nukleotidsynthese geeignet. Auch die Synthese von Polynukleotiden aus Nukleinsäureanaloga, wie PNA, LNA oder Chimären von diesen mit DNA, RNA oder Nukleinsäureanaloga sind selbstverständlich in Lösung, wie auch auf einem Substrat bzw. Chip möglich. Weiter können damit auch Polypeptide hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verfahren sind besonders gut zur Durchführung in einem automatisierten Verfahren geeignet. Vorzugsweise ist ein solches automatisiertes Verfahren als Parallelsynthese in Lösung oder auf einem Substrat zur Herstellung einer Nukleotid-Bibliothek ausgestaltet, bei der die eingesetzten chemischen Verbindungen bzw. die labilen Schutzgruppen gezielt oder zufällig ausgewählt werden können.

In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung einen Kit, der einen Teil oder alle Reagenzien und/oder Hilfsstoffe und/oder Lösungsmittel und/oder eine Arbeitsanweisung zur Durchführung eines der erfindungsgemäßen Verfahren in einer räumlichen Einheit enthält, wobei der Kit mindestens ein oder mehrere ausgewählte Nukleotide enthält, die vorzugsweise eine freie 5'-Hydroxy-Funktion und eine geschützte 3'-Hydroxy-Funktion oder aber eine freie 3'-Hydroxyfunktion und eine geschützte 5'-Hydroxyfunktion aufweisen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Kit entsprechende Peptide und/oder Aminosäurederivate mit geschützter Amino- und freier Carboxylgruppe oder umgekehrt. Dies Kits ermöglichen die einfache Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren in Lösung oder auf Substraten.

In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und/oder des oben genannten Kits zur Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips, vorzugsweise zur automatisierten Herstellung von Oligonukleotiden oder Nukleinsäurechips.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Figur.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der nachstehenden Figuren und einiger nicht einschränkender Ausführungsbeispiele erläutert.

1 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit einer Abspaltungsreaktion gemäß einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einem herkömmlichen Verfahren in Lösung,

2 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit einer Abspaltungsreaktion gemäß einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einem herkömmlichen Verfahren in Lösung,

3 zeigt die Reaktionsgeschwindigkeit in einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einem herkömmlichen Verfahren auf einem festen Substrat.

Die Abszisse in 1 gibt die relative Konzentration der mit einer Schutzgruppe versehenen Verbindung, bestimmt über HPLC, aufgetragen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdauer (t_R/min) in Minuten (Ordinate) an. Kurve 1 stellt die Bestrahlung der Verbindung T07 (2-(5-Iodo-2-nitrophenyl)propylthymidin-5'-yl-carbonat) (0,096 mM) bei 366 nm mit einer Intensität von 4,98 × 10^–3 W/cm^–2 dar. Kurve 2 stellt die Bestrahlung der Verbindung T01 (2-(5-Chloro-2-nitrophenyl)ethylthymidin-5'-yl-carbonat) (0,091 mM) bei derselben Wellenlänge mit einer Intensität von 6,39 × 10^–3 W/cm^–2 in Gegenwart des Sensibilisators Thioxanthon (0,113 mM) in Ammoniak-gesättigtem Acetonitril dar. Obwohl die Lichtintensität im Fall des Experiments mit Kurve 2 nur um 25% höher ist, beträgt die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion mit Sensibilisator dargestellt in Kurve 2 gegenüber der Abspaltungsreaktion einer nichtsensibilisierten Verbindung dargestellt in Kurve 1 ein sechsfaches.

2 stellt die graphische Auswertung des Ausführungsbeispiels 1 dar. Die Abszisse in 2 gibt die relative Konzentration der mit einer Schutzgruppe versehenen Verbindung, bestimmt über HPLC, aufgetragen in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdauer (t_R/s) in Sekunden (Ordinate) an. Kurve 1 stellt die Bestrahlung der Verbindung T02 (2-(2-nitrophenyl)propylthymidin-5'-yl-carbonat) (0,091 mM) bei 366 nm mit einer Intensität von 6,39 × 10^–3 W/cm^–2 dar. Kurve 2 stellt die Bestrahlung der Verbindung T02 (2-(2-nitrophenyl)propylthymidin-5'-yl-carbonat) (0,091 mM) bei derselben Wellenlänge mit einer Intensität von 6,39 × 10^–3 W/cm^–2 in Gegenwart des Sensibilisators Thioxanthon (0,113 mM) in Ammoniak-gesättigtem Acetonitril dar. Obwohl die Lichtintensität im Fall des Experiments gemäß Kurve 2 gleich wie im Experiment gemäß Kurve 1 ist, beträgt die Reaktionsgeschwindigkeit der Abspaltungsreaktion gemäß Kurve 2, d.h. in Gegenwart eines Sensibilisators ein zehnfaches der Abspaltungsreaktion gemäß Kurve 1 ohne Sensibilisator.

3 zeigt in der Abszisse die relative Intensität RI der absorbierten Lichtenergie als Funktion der eingestrahlten Lichtenergie LE in Joule (Ordinate) in einem erfindungsgemäßen Verfahren auf einem festen Substrat. Das Verfahren wurde gemäß den Bedingungen des Beispiels 2 durchgeführt. Nur wurde statt der Oligomere die Verbindung T02 (2-(2-nitrophenyl)propylthymidin-5'-yl-carbonat) und die Verbindung 2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)propylthymidin-5'yl-carbonat verwendet. Kurve 1 zeigt die Bestrahlung der Spots mit Verbindung T02 ohne Sensibilisator, Figur die Bestrahlung der Spots mit 2-(3,4-Methylendioxy-2-nitrophenyl)propylthymidin-5'yl-carbonat ohne Sensibilisator und Kurve 3 die Bestrahlung der Verbindung T02 mit Sensibilisator. Daraus ist zu ersehen, daß die Abspaltung mit Sensibilisator gemäß Kurve 3 zweimal schneller als ohne Sensibilisator gemäß den Kurve 2 und dreimal schneller als gemäß Kurve 1 erfolgt. Außerdem ist zu sehen, daß die vollständige Abspaltung mit Sensibilisator gemäß Kurve 3 auch bei einer geringeren Lichtenergie als ohne Sensibilisator gemäß den Kurven 2 und 1 erfolgt Eine nicht einschränkende Auswahl erfindungsgemäßer labiler reaktiver Gruppen, d.h. sogenannter "Schutzgruppen", ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Verbindungen wurden über dem Fachmann bekannte Synthesen hergestellt.

Tabelle 1: Erfindungsgemäße labile, reaktive Schutzgruppen bzw. Moleküle enthaltend derartige Schutzgruppen

Die generischen Namen der Verbindungen aus Tabelle 1 lauten wie folgt:

L01: 2-(2-Chloro-6-nitrophenyl)ethanol
L02: 2-(2-Nitrophenyl)propanol
L03: 2-(2-Nitrophenyl)ethanol
L04: 2-(4-Bromo-2-nitrophenyl)propanol
L05: 2-(5-Chloro-2-nitrophenyl)propanol
L06: 2-(5-Bromo-2-nitrophenyl)propanol
L07: 2-(5-Iodo-2-nitrophenyl)propanol
M01: 2-(2-Chloro-6-nitrophenyl)ethyl methyl carbonat
M02: Methyl 2-(2-nitrophenyl)propyl carbonat
M03: Methyl 2-(2-nitrophenyl)ethyl carbonat
M04: 2-(4-Bromo-2-nitrophenyl)propyl methyl carbonat
M05: 2-(5-Chloro-2-nitrophenyl)propyl methyl carbonat
M06: 2-(5-Bromo-2-nitrophenyl)propyl methyl carbonat
M07: 2-(5-Iodo-2-nitrophenyl)propyl methyl carbonat
T01: 2-(2-Chloro-6-nitrophenyl)ethyl thymidin-5'-yl carbonat
T02: 2-(5-Nitrophenyl)propylthymidin-5'-yl carbonat
T04: 2-(4-Bromo-2-nitrophenyl)propyl thymidin-5'-yl carbonat
T05: 2-(5-Chloro-2-nitrophenyl)propyl thymidin-5'-yl carbonat
T06: 2-(5-Bromo-2-nitrophenyl)propyl thymidin-5'-yl carbonat
T07: 2-(5-Iodo-2-nitrophenyl)propyl thymidin-5'-yl carbonat

Tabelle 2: Halbwertszeiten t_H, photochemische Quantenausbeute φ und Absorptionskoeffizienten ε₃₆₅ einiger Verbindungen aus Tabelle 4

In Tabelle 2 wurden die Geschwindigkeiten der durch Licht induzierten Abspaltungsreaktionen, mittels ihrer Halbwertszeiten t_H charakterisiert und es wurden die Quantenausbeuten Φ einiger der Verbindungen aus Tabelle 1 bestimmt:
Der Vergleich der Quantenausbeuten zeigt, dass diese beim Übergang vom Chlor- (T05) zum Bromderivat (T06) zunimmt, jedoch dann vom Brom- (T06) zum Iodderivat (T07) nicht mehr anwächst. Die erste Beobachtung kann als Spin-Bahn Kopplungseffekt interpretiert werden. Die Spin-Bahn Kopplung wächst mit der Ordnungszahl eines Elements an und führt zu einer höheren Effizienz der intramolekularen Triplettbildung. Dies wirkt sich auf die Photoreaktion günstig aus, da der Triplettzustand eine längere Lebensdauer besitzt. Dass die Quantenausbeute beim Übergang zum Iodderivat (T07) nicht weiter steigt liegt daran, dass bereits beim Bromderivat (T06) eine nahezu vollständige Triplettbildung erreicht wird, die durch eine Erhöhung der Spin-Bahn Kopplung nicht weiter gesteigert werden kann. Dennoch weist die Iodverbindung (T07) eine höhere Lichtempfindlichkeit auf, was in der gegenüber dem Bromderivat (T06) nochmals verkürzten Halbwertszeit zum Ausdruck kommt. Dieser Effekt lässt sich auf die Steigerung des Absorptionskoeffizienten ε bei der gewählten Bestrahlungswellenlänge zurückführen. Die Lichtempfindlichkeit wird insgesamt bestimmt durch das Produkt aus dem Lichtabsorptionsvermögen und der Effizienz, mit der jedes absorbierte Photon zur Produktbildung führt. Als Kenngröße der Lichtempfindlichkeit kann daher das Produkt φ × ε aus photochemischer Quantenausbeute φ und Absorptionskoeffizient ε dienen. Da die Quantenausbeute nicht über einen Wert von 1 gesteigert werden kann, liegt das größte Potential zur Verbesserung der Lichtempfindlichkeit in einer Steigerung des Lichtabsorptionsvermögens. Elektronische Effekte, die bei einer chemischen Strukturvariation der photolabilen Schutzgruppe einen höheren Absorptionskoeffizienten verursachen, führen gleichzeitig wieder zu einer Absenkung der Photoreaktivität und damit der photochemischen Quantenausbeute. Erfindungsgemäß lässt sich jedoch der wirksame Absorptionskoeffizient erhöhen ohne dass man die Photoreaktivität vermindert, wenn man Verbindungen zusetzt, welche die Energie des von ihnen absorbierten Lichts auf die photolabilen Schutzgruppe übertragen können. Eine Energieübertragung auf den Triplettzustand ist dabei von Vorteil, da dieser, wie oben ausgeführt, eine längere Lebensdauer besitzt und daher mit größerer Wahrscheinlichkeit die gewünschte Abspaltungsreaktion eingehen kann.

Es wurde gefunden, dass erfindungsgemäße chemische Verbindungen, die geeignet sind zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, folgende nicht einschränkende Charakteristika aufweisen:
Die erfindungsgemäße chemische Verbindung absorbiert bevorzugt längerwellig als die labile Schutzgruppe selbst, das heißt, ihr Singulett- (S₁) Zustand liegt unterhalb des Singulett (S₁) Zustandes der Schutzgruppe.

Weiterhin besitzt die chemische Verbindung in ihrer langwelligsten Absorptionsbande einen möglichst hohen Absorptionskoeffizienten.

Ihr Triplett Zustand liegt oberhalb des Triplett Zustandes der labilen Schutzgruppe, allenfalls liegt er energetisch ähnlich wie letzerer. Damit ist die Singulett-Triplett Energielücke des Sensibilisators bevorzugt kleiner, als die der labilen Schutzgruppe. Unter Verwendung von Nitrophenylchromophoren in der labilen Schutzgruppe ist diese Energielücke im allgemeinen etwa bei 130 kJ/mol, so daß eine Vielzahl erfindungsgemäßer Sensibilisatoren eingesetzt werden kann.

Die chemische Verbindung weist weiter eine hohe Triplettbildungsquantenausbeute φ_T auf, da dieser als Faktor in die Sensibilisierungseffizienz linear eingeht.

Weiterhin weist die chemische Verbindung eine möglichst lange Triplettlebensdauer auf, um eine hohe Energieübertragungseffizienz zu gewährleisten. Für eine quantitative intermolekulare Energieübertragung bei günstiger Energielage des T₁ wurde gefunden, daß eine Lebensdauer von mehr als 0,6 μs ausreichend ist, ganz besonders bevorzugt ist eine Lebensdauer von mehr als 1 μs.

Die Quantenausbeute φ der chemischen Reaktion gemäß einem der vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren bei Abspaltung der labilen funktionellen Gruppe ist in ganz besonders vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung größer als 0.5.

Beispiele derartiger erfindungsgemäßer Verbindungen sind in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3: Erfindungsgemäße Chemische Verbindungen ("Sensibilisatorverbindungen") mit höherem Triplettzustand als eine photolabile Schutzgruppe erfindungsgemäßer Moleküle

Die Energie (E) des Singulett- und Triplettzustandes ist in kJ/mol angegeben. Der Absorptionskoeffizient ε ist in M^–1 × cm^–1 bei der jeweiligen Wellenlänge angegeben. n bedeutet nichtpolares, p polares Lösungsmittel, b benzolartiges Lösungsmittel
τ bedeutet die Lebensdauer des Triplettzustandes in μs

Weitere erfindungsgemäße Verbindungen umfassen beispielsweise N-Methylacridon, 2-Ethylthioxanthon, 2-Anilino-naphthol, Naphtho-[1,2-c][1,2,5]-thiadiazol, Benzo-[b]-fluoren, 5,7-Dimethoxy-3-thionyl-coumarin, 1,2-Cycloheptandion, 3-Acetyl-6-bromo-coumarin, 2-Bromo-9-acridinon, 4,4'-Dibenzylbiphenyl, 2,6-Dithiokoffein, 1,4-Dibromonaphthol, Dibenzo-[fg,op]-naphtol, 10-Phenyl-9-acridinon, 2-Methyl-5-nitro-intidazol-1-ethanol, 1-(2-Naphthoyl)-aziridin, 9-(2-Naphthoyl)-carbazol, 4,6'-Diamino-2-phenyl-benzooxazol, p-Thiophenyl, 3-Acetyl-phenanthren, Dinaphtho-[1,2-b:2',1'-]-thiophen, (E)-Piperylen, (β-Methyl-(E)-styrol, 2-Phenyl-benzothiazol, Chinoxalin, 9,9'-Biphenantryl, Naphtho-[1,2-c] [1,2,5]-oxabiazol, Phenothiazin, 2-Ethoxy-naphthol, 9-Phenyl-9-stibafluoren, 9,10-Antrachinon, 4,4'-Dichlorodiphenyl, wobei diese Auswahl jedoch nicht beschränkend ist.

Weitere Verbindungen sind beispielsweise im Buch von S. L. Murov, I. Carmichael and G. L. Hug, Handbook of PhotoChemistry, Marcel Dekker, Inc., New York 1993 zu entnehmen, auf dessen Offenbarungsgehalt hier vollumfänglich Bezug genommen wird.

Experimentelle Bedindungen:

Der Begriff "übliche, dem Fachmann bekannte Bedingungen" wie er vor- und nachstehend verwendet wird, ist beispielsweise in der US-5,763,599 oder der DE 4444956 beschrieben.

UV-VIS-Absorptionsmessungen wurden mit einem unter der Software UV Winlab laufenden UV-VIS Spektrometer Lambda 18 (Perkin-Elmer), Fluoreszenzmessungen mit einem unter der Software FL Winlab laufenden Lumineszenzspektrometer LS 50 (Perkin-Elmer) durchgeführt.

Die Bestrahlungsapparatur bestand aus einer Quecksilber-Hochdrucklampe (200 W), einem Wärmefilter (optische Weglänge 5 cm, gefüllt mit 0.3 M CuSO₄-Lösung in Wasser), einer Sammellinse, einem elektronisch gesteuerten Shutter, einem 366 nm-Interferenzfilter (Schott) und einem temperierbaren Küvettenhalter für Belichtungsküvetten (Hellma QS, 1 cm).

Die HPLC-Untersuchungen erfolgten mit einer Anlage der Firma Merck-Hitachi. Sie bestand aus einer Pumpe L-7100, einem Autosampler L-7200, einem UV-Diodenarraydetektor L-7450A und einem Interface L-7000. Als Säule wurde eine LiChrospher 100 RP-18 (5 μm) der Firma Merck verwendet. Die Steuerung erfolgte durch den HSM-Manager mit einem Compaq Computer.

Die Bestimmung der Absorptionsmaxima der labilen funktionellen Gruppen bzw. der photolabilen Schutzgruppen und der Sensibilisatorverbindungen erfolgte je nach verwendeter Wellenlänge der zur Aktivierung eingesetzten elektromagnetischen Strahlung mittels dem Fachmann bekannter Methoden, wie beispielsweise UV/VIS Absorption etc. Die Messung der Absorptionsmaxima der labilen funktionellen Gruppe(n) erfolgte sowohl am Molekül, das die labile(n) funktionelle(n) Gruppe(n) enthält (beispielsweise NPPOC geschütztes Thymidin), und an der Ausgangsverbindung zur Einführung der labilen funktionellen Gruppe beispielsweise der entsprechende Alkohol oder das Halogenid (beispielsweise NPPOH) in das Molekül selbst, wobei jedoch die Unterschiede der jeweils gemessenen Werte nicht wesentlich voneinander abwichen.

Beispiel 1:
Abspaltungsreaktion mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens einer labilen funktionellen Gruppe aus einem Molekül in Lösung
3 ml Lösung des Thymidins T02 (Tabelle 2) (0.091 mM) und Thioxanthon (0.113 mM) wurden in eine Küvette pipettiert und ca. 15 Minuten mit Ammoniak begast, indem das Gas durch die Lösung geleitet wurde. Die Lösung wurde für verschiedene Zeiten mit Licht der Wellenlänge 366 nm bestrahlt. Vor und nach Bestrahlung wurden jeweils Absorptionsspektren gemessen. Die gleiche Reaktion wurde mit dem Thymidin T02 ohne Zugabe eines Sensibilisators durchgeführt.
Die Ergebnisse des Ausführungsbeispiels 1 sind in 2 erläutert und in einem Schaubild dargestellt.
Die Lösung wurde daraufhin für ca. 15 Minuten mit Stickstoff (gesättigt mit Acetonitril) begast. Nach der Stickstoffbegasung wurde nochmals ein Absorptionsspektrum gemessen, und die Lösung schließlich in der HPLC in ihre Komponenten getrennt. Diese wurden mit einem UV-Diodenarray-Detektor charakterisiert. Dabei wurde gefunden, daß die Entschützungsreaktion mit Sensibilisator zu 99% vollständig ablief und keine Nebenprodukte außer dem Ausgangsprodukt und dem gewünschten Endprodukt sowie der abgespaltenen Schutzgruppe aufgefunden wurden. Die Entschützungsreaktion ohne Sensibilisatorzugabe verlief dagegen nur zu 75% vollständig.
Beispiel 2
Herstellung von DNA Chips mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
Die Entschützungsreaktion wurde unter Standardprüfbedingungen für DNA-Chipsynthesen in einem MAS 2.0 oder 3.0 der Firma Nimblegen Systems, Madison durchgeführt. Das Design der herzustellenden DNA-Chips wies ein Standardarray auf, das üblicherweise zu Qualitätskontrollversuchen eingesetzt wird.
Es lag eine typische Dichte von einigen 10.000 bis 100.000 Oligonukleotiden (Oligomeren), zumeist vorliegend als 18–25 mere vor. Die Größe bzw. Fläche eines einzelnen Synthesespots betrug 15 μm × 15 μm. Er bestand aus der Abbildung (l : 1) von 4 im Quadrat angeordneten Mikrospiegeln (Texas Instrument Digital Light Processor) (jeder mit einer Kantenlänge von 7 μm × 7 μm), die je 1 μm voneinander entfernt angeordnet waren.
Es wurden 0.01 Gew% Thioxanthon als Sensibilisator bezogen auf das eingesetzte Lösungsmittel DMSO verwendet. Dies führte dazu, dass die Lichtdosis bis zur vollen Abspaltung der Schutzgruppe von 7.5 W/cm² ohne Sensibilisatormolekül auf einen Wert von 3 W/cm² verringert wurde bei einer effektiven Lampenleistung von ca. 0.2–0.6 W/cm². Die Lampenleistung ist abhängig vom MAS Typ und wird jeweils während der Bestrahlung bestimmt.
Dauer der Entschützungsreaktion:
Aus vorstehenden Angaben ist ersichtlich, dass die Zugabe von Thioxanthon als Sensibilisator zu einer deutlichen Geschwindigkeitssteigerung der Abspaltungsreaktion auch bei niedrigen Lampenleistungen führt.

Claims

Verfahren zur Abspaltung von labilen funktionellen Gruppen aus Molekülen durch Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, umfassend folgende Schritte: a) Wahl einer geeigneten chemischen Verbindung deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der labilen funktionellen Gruppe b) Zusammenbringen mit den Molekülen, die die labilen funktionellen Gruppen umfassen c) Einwirken von elektromagnetischer Strahlung, wobei die Abfolge der Schritte b) und c) beliebig ist dadurch gekennzeichnet, daß die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) zeitlich vor Schritt c) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) zeitlich vor Schritt b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) und Schritt b) gleichzeitig erfolgen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich des Absorptionsmaximums der geeigneten chemischen Verbindung liegt.
Verfahren nach einem der Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung im Wellenlängenbereich von UV/VIS Strahlung liegt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß, dass die labile Gruppe photolabil ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Singulettzustand der chemischen Verbindung energetisch gleich hoch oder tiefer liegt als der Singulettzustand der labilen funktionellen Gruppe.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Triplett-Singulett Energielücke der chemischen Verbindung kleiner ist als die Triplett-Singulett Energielücke der labilen funktionellen Gruppe.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorption der langwelligsten Absorptionsbande der elektromagnetischen Strahlung der chemischen Verbindung längerwellig als 280 nm ist.
Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung von räumlich adressierten Molekülbibliotheken.
Verfahren zur Herstellung von räumlich adressierten Molekülbibliotheken enthaltend Biomoleküle, durch räumlich adressierte lichtgesteuerte Synthese aus Einzelbausteinen der Biomoleküle auf festen Substraten umfassend die folgenden Schritte: a) Umsetzen der ungeschützten terminalen 3' oder 5' Hydroxygruppe eines auf dem festen Substrat angeordneten Nukleosids und/oder Nukleotids oder eines Nukleinsäureanalogon oder der terminalen Amino- oder Carboxygruppe eines entsprechenden Peptids unter üblichen Bedingungen mit einer photolabilen Schutzgruppe oder Umsetzen einer -OH-Gruppe, einer substituierten oder unsubstituierten Amino oder Carboxygruppe mit einem Baustein, der eine photolabile Schutzgruppe umfaßt und gegebenenfalls Aufreinigung des Reaktionsproduktes, b) Aufbringen einer geeigneten chemischen Verbindung, deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der photolabilen Schutzgruppe auf die Oberfläche des Trägers, die die in Schritt a) modifizierten Nukleotide und/oder Nukleoside und/oder entsprechend modifizierten Peptide oder Proteine aufweist, c) räumlich selektive Bestrahlung der in Schritt b) behandelten Oberfläche des Trägers mit elektromagnetischer Strahlung im UV/VIS Bereich d) Umsetzung mit einem Nukleosid und/oder Nukleotid bei dem eine freie 5' oder 3'OH Gruppe durch eine photolabile Gruppe geschützt ist und/oder mit einem entsprechenden Peptid, das an der Aminogruppe- oder an der Carboxygruppe durch eine photolabile Gruppe geschützt ist e) gegebenenfalls Wiederholung der Schritte b) bis d), dadurch gekennzeichnet, daß die photolabile Schutzgruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung im UV/VIS Bereich aufweisen .
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt b) zeitlich vor Schritt c) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) zeitlich vor Schritt b) durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt c) und Schritt b) gleichzeitig erfolgen
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete UV/VIS Strahlung eine Wellenlänge aufweist, die im Bereich des Absorptionsmaximums der geeeigneten chemischen Verbindung liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Singulettzustand der chemischen Verbindung energetisch gleich hoch oder tiefer liegt als der Singulettzustand der photolabilen Schutzgruppe.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Triplett-Singulett Energielücke der chemischen Verbindung kleiner ist als die Triplett-Singulett Energielücke der photolabilen Schutzgruppe.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorption der langwelligsten Absorptionsbande der elektromagnetischen Strahlung der chemischen Verbindung längerwelliger als 280 nm ist.
Chemische Zusammensetzung umfassend ein Molekül mit einer labilen funktionellen Gruppe, sowie eine chemische Verbindung deren Triplettzustand energetisch höher oder sehr ähnlich liegt wie der Triplettzustand der labilen funktionellen Gruppe, dadurch gekennzeichnet, daß die labile funktionelle Gruppe und die geeignete chemische Verbindung unterschiedliche Absorptionsmaxima für elektromagnetische Strahlung aufweisen.
Chemische Zusammensetzung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die labile funktionelle Gruppe eine photolabile Gruppe ist.
Chemische Zusammensetzung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Singulettzustand der chemischen Verbindung energetisch gleich hoch oder tiefer liegt als der Singulettzustand der photolabilen Gruppe.
Chemische Zusammensetzung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Triplett-Singulett Energielücke der chemischen Verbindung kleiner ist als die Triplett-Singulett Energielücke der photolabilen Gruppe.
Chemische Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 23 dadurch gekennzeichnet, dass die photolabile Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NPPOC, MeNPOC, NPES-NPPS MeNPPOC, DMBOC und deren substituierten Derivaten, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroaryl)ethoxycarbonyl oder -thiocarbonyl-Verbindungen, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-Nitrobenzyl-, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl bzw. thiocarbonyl Verbindungen, substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroheterocycloaryl)ethoxycarbonyl, oder -thiocarbonyl Verbindungen, sowie substituierten und unsubstituierten, kondensierten und nichtkondensierten 2-(Nitroheterocycloalkyl)ethoxy-carbonyl/thiocarbonyl Verbindungen, substituierten und unsubstituierten 2-Nitro-N-Methylanilincarbonyl- bzw. thiocarbonylderivaten.
Chemische Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Verbindung das Strukturmotiv
aufweist, wobei Y = O, S, N, Se oder Te ist, n = 1 oder 2 bedeutet, C Bestandteil eines aromatischen, heteroaromatischen oder kondensierten aromatischen oder heteroaromatischen Systems ist und wobei im Falle, dass n = 2 ist, das aromatische, heteroaromatische oder kondensierte aromatische oder heteroaromatische System gleich oder verschieden sein kann.
Verwendung einer chemischen Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 20 bis 25 zur Herstellung von DNA-Chips.
Kit umfassend eine chemische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 25.
Kit, der einen Teil oder alle Reagenzien und/oder Hilfsstoffe und/oder Lösungsmittel und/oder eine Arbeitsanweisung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einer der Ansprüche 1 bis 10 und/oder 12 bis 19 in einer räumlichen Einheit enthält.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19 und/oder eines Kits gemäß Anspruch 27 und/oder 28 zur Herstellung von Oligonukleotiden, Polypeptiden, oder Nucleinsäure-, oder Peptidchips.
Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 und/oder eines Kits gemäß Anspruch 27 und/oder 28 zur Herstellung von räumlich adressierten Molekülbibliotheken und/oder von Polymeren.