KR100846884B1 - 헬리카제를 이용한 폴리뉴클레오티드 서열화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 방법으로 다음 단계들로 이루어진다: (i) 효소 활성에 적합한 조건하에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 헬리카제/프리마제 효소(고정화될 수 있는)와 반응시키는 단계; 및 (ii) 복사를 측정하여 효소와 표적상의 뉴클레오티드간의 상호작용을 탐지하는 단계.
Figure R1020017012361
폴리뉴클레오티드 서열화, 헬리카제, 복사, 고정화

Description

헬리카제를 이용한 폴리뉴클레오티드 서열화{Polynucleotide sequencing using a helicase}
본 발명은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드를 서열화하는데 상당한 관심이 모아져 왔다. 간단한 요약 및 효과적인 방법의 설명을 WO-A-99/05315에서 발견할 수 있을 것이다.
발명의 요약
본 발명은 NTP 가수분해에서 유래한 에너지를 사용하여, 헬리카제 및/또는 프리마제 단백질들이 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 단일-가닥(ssDNA)으로 풀 때 발생하는, 상기 단백질들의 입체 형태적 및/또는 질량 변화를 탐지하는데 전자기 복사(electromagnetic radiation)의 측정이 사용될 수 있다는 인식에 기초를 두고 있다.
본 발명에 따르면, 폴리뉴클레오티드를 서열화하는 방법은 다음 단계들로 이루어진다:
(i) 헬리카제 활성에 적합한 조건(즉, NTP 가수분해에서 유래한 에너지를 활용한 DNA 풀림)하에서, 표적 폴리뉴클레오티드를 헬리카제/프리마제 효소 및 NTP의 공급원과 반응시키는 단계; 및
(ii) 복사(radiation)를 측정하여 헬리카제의 활성을 통해 특정한 염기 또는 염기 쌍의 분리 및/또는 근접성을 탐지하는 단계.
폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하기 위해 헬리카제를 사용하는 것은 본 방법의 성공에 대해 여러 가지 이점을 제공한다. 첫째로, 헬리카제들은 그것들의 본래 환경내에서 2차 구조들과 직면하여 극복하기 때문에, 폴리뉴클레오티드 분자들 내에 존재하는 2차 구조들의 문제가 감소된다. 둘째로, 헬리카제들은 실온에서 이중-가닥 DNA를 직접 서열화하는 능력을 제공한다. 이 능력은 표적 폴리뉴클레오티드의 조작 용이성의 측면에서 이점 및 긴 폴리뉴클레오티드 주형을 서열화하는 가능성을 제공한다.
단단한 광학성 표면에서 광학적 반응의 변화가 상기 표면의 결합 상호작용을 나타내는데 사용되는 표면-민감성 탐지 기술(이때 헬리카제 효소가 고형 지지체에 결합될 것임)을 포함하는 다수의 기술을 사용하여 복사가 샘플에 적용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 사용되는 기술은 미소 파장 분광법으로, 특히 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법이다.
발명의 설명
본 발명의 한 구현예에서, 헬리카제에 유용한 에너지는 NTP의 형태로서 엄격한 조절하에 있다. 다시 말해서, 서열화될 DNA 가닥을 따르는 헬리카제의 움직임은 에너지 공급원 분자의 결합 부위의 영역내에서 상기 분자 농도의 직접적인 제어 및 그에 따른 헬리카제 분자에 대한 유용성을 통해 조절된다. 이것은 효소 활성이 조절되도록 하여 헬리카제 또는 헬리카제 복합체(complex)에 대한 근접성 내에 염기 또는 염기 쌍을 인식하기 위해 복사를 측정하는 작용을 증진시킨다.
다른 방법으로, DNA 풀림의 제어 및 그에 따른 서열화 진행은 헬리카제 효소가 가수분해의 수행 및/또는 폴리뉴클레오티드를 따라서 이동하게 하는 입체 형태적 변화를 겪는 능력을 조절하여서 달성될 수 있다. 이는, 분자가 복사를 입체 형태적 변화로 전환하거나 변환시킬 수 있는 화학적 기(들)/모이어티(moiety) 기(들)을 포함하는 식으로, 헬리카제(또는 그와 연관된 분자)를 가공(첨단의 유전학적 조작 기술을 통해)하여 달성될 수 있다. 헬리카제 활성의 선택적인 조절은 각 뉴클레오티드의 탐지를 보증하는 방식으로 수행된다. 따라서, 본 방법은 실시간 바탕으로 진행될 수 있고, 높은 서열 분석 속도를 달성할 수 있다. 조절의 바람직한 방법은 동일한 명칭으로 동일한 날에 출원되어 계류중인 PCT 출원에 기재되어 있다.
폴리뉴클레오티드를 서열화하는 본 방법은 헬리카제 효소와 표적 폴리뉴클레오티드간의 입체 형태적/동적인 상호작용을 분석하는 것을 포함한다. 입체 형태적/동적인 상호작용의 측정은 반응이 일어난다면 발생하는 전자기적 또는 다른 복사의 흡수 또는 이들의 변화를 모니터하여 수행된다.
"폴리뉴클레오티드"라는 용어는 본 발명에서 광범위한 해석을 위하여 사용되고, 변형된 DNA 및 RNA를 포함하는 DNA 및 RNA 뿐만 아니라 다른 혼성화 핵산과 유사한 분자들, 예를 들면 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다.
"헬리카제"라는 용어는 본 발명에서 광범위한 해석을 위하여 사용되고, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 단일-가닥 폴리뉴클레오티드로 풀고, 이것을 달성하기 위해 NTP 가수분해에서 유래한 에너지를 사용하거나 또는 사용하지 않는 편재한 단백질들과 관련되어 있다(Dean et al, J. Biol. Chem (1992) 267:14129-14137; Bramhill et al, Cell (1988) 54:915-918; Schions et al, Cell(1988) 52:385-395).
최초의 헬리카제는 20년 이상 이전에 발견되어 분류되었다(Abdel-Monem et al, Eur. J. Biochem. (1976) 65:411-449 & 65:431-440). 새로운 헬리카제들은 원핵 생물, 진핵 생물 및 바이러스계에서 계속해서 발견되어 특성화되었다. 모든 이 분자 시스템들은 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명에 사용된 헬리카제는 모든 공지된 유형이 될 수 있다. 예를 들어, 헬리카제는 모든 DNA-의존 DNA 헬리카제, 예를 들면 E. coli DnaB 헬리카제가 될 수 있다(Xiong et al, J. Mol. Biol. (1996) 259:7-14). 표적 폴리뉴클레오티드가 RNA 분자라면, 헬리카제는 RNA-의존 헬리카제 또는 폴리뉴클레오티드의 양쪽 형태들로 작용할 수 있는 헬리카제가 될 수 있다. 소화 효소, 예를 들어 엑소뉴클레아제 또는 토포이소머라제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 헬리카제는 박테리오파지 T7 gp4 헬리카제이다(Egelman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1995) 92:3869-3873). 본 발명의 또 다른 구현예에서 헬리카제는 E.coli RuvB 헬리카제(Stasiak et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994) 91:7618-7622), E.coli DnaB 헬리카제(Xiong et al, J. Mol. Biol. (1996) 259:7-14) 또는 시미안 바이러스 40 대형 T 헬리카제(Dean et al, J. Biol. Chem. (1992) 267:14129-14137)이다.
오늘날까지 특화된 대다수의 헬리카제들은 활성 형태인 올리고머로 알려져 왔거나 또는 그런 경우라고 가정된다.
현재, 헬리카제들은 1차 구조에 따른 과(family)로 분류되어 왔지만 (Gorbalenya et al, Current Opin. Struct. Biol. (1993) 3:419-429), 올리고머 상태 또는 폴리뉴클레오티드 풀림의 극성에 기초하여 또한 그룹화될 수 있다(Lohman et al, Annu. Rev. Biochem (1996) 65:169-214 & Bird et al, Current. Opin. Struct. Biol (1998) 8:14-18). 다수의 공지된 헬리카제들은 원핵 생물, 진핵 생물 및 바이러스들에서 서열 상동성을 통하여 동정되어 왔다(Gorbalenya et al, Current Opin. Struct. Biol. (1993) 3:419-429). 많은 헬리카제들이 헥사머 또는 다이머로서 작용하는 것 같더라도(Lohman et al, Annu. Rev. Biochem (1996) 65:169-214), 일부는 PcrA 헬리카제(Bird et al, Nucleic acids Res. (1998) 26:2686-2693) 및 NS3 헬리카제(Porter et al, J. Biol. Chem. (1998) 273:18906-18914) 같은 모노머이다. Rep 헬리카제같은 다른 헬리카제들 또한 모노머의 형태(Bird et al, Nucleic acids Res. (1998) 26:2686-2993)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서 적당한 고온성 Bacillus stearothermophilus가 모노모성 시스템의 조작상의 안정성의 장점을 갖도록 하기 위하여 사용된다. PcrA 헬리카제는 수복 및 롤링 사이클 복제(Petit et al, Mol. Microbiol. (1998) 29:261-274 & Soultanas et al, Nucleic Acids Res. (1999) 256:350-355)에 포함되는 Bacillus subtilis(Petit et al, Mol. Microbiol. (1998) 29:261-274) 및 Staphylococcus aureus(Lordanescu et al, Mol. Gen. Genet. (1993) 241:185-192)내에 필수적인 효소로 알려져 왔다. PcrA는 또한 E.coli UvrD 및 Rep 모두와 현저한 상동성을 보인다.
전형적으로, 본 방법은 표면 플라즈몬 공명 또는 핵 자기 공명 기술의 사용함으로써, 전자기 복사를 적용하여 수행된다. 그러나 복사시에 변화를 측정하는 다른 기술들이 고려될 수 있는데, 예를 들어 총괄 내부 반사율 형광(total internal reflectance fluorescence, TIRF), 약화 총괄 반사(attenuated total reflection, ATR), 꺽임 총괄 반사(frustrated total reflection, FTR), 브루스터(Brewster) 각도 굴절률 측정법(reflectometry), 산란된 총괄 내부 반사(scattered total internal reflection, STIR) 또는 미소 파장 엘리프소미트리(ellipsometry)가 있다.
전자기 복사를 필요로 하는 것을 제외한 기술들이 또한 고찰되는데 특히, 화학 발광같은 광화학적 기술 및 표면 음향학적 파장(surface acoustic wave, SAW) 기술 및 석영 수정 미량 천칭(quartz crystal microbalance, QCM) 기술같은 공명 시스템을 포함하는 비중측정 기술들이 있다.
표면 플라즈몬 공명(SPR) 분광법이 바람직한 방법이고, 용액의 벌크 상(phase)과 미소 파장 영역사이의 굴절 지수의 차이를 탐지하여 용액의 성질을 측정한다. 입사 단색광은 연구되는 샘플의 반대편 쪽에 있는 단단한 광학적(센서 칩) 표면의 특정한 각도에서 반사된다. 광선은 샘플로 단거리 연장되고, 표면에서 상호작용에 의해 영향을 받는다.
적합한 센서 칩은 당기술 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 그것들은 광학적으로 투명한 물질, 예를 들면 유리 및 얇은 반사 필름, 예를 들면 은 또는 금으로 이루어진다. SPR 분광법은 EP-A-0648328에 기재되어 있다.
핵 자기 공명(NMR) 분광법은 또 다른 바람직한 구현예이고, 혼합물의 자기적 성질을 측정한다. 혼합물의 핵들은 부과된 자기장 및 무선 주파수 복사의 조합에 의해 왕성하게 배향된다. 핵에 부과된 에너지가 스핀 상태간의 에너지 차이(부과된 에너지 장의 방향에 평행하거나 평행하지 않은 배향 사이의 차이)와 같을때, 공명이라고 알려진 상태가 달성된다. 일반적으로 한 상태에서 다른 상태로의 변화와 관련된 에너지의 흡수 및 그에 따른 방출은 무선 주파수 수신기에 의해 탐지된다.
필수적이지는 않더라도, 본 발명의 한 중요한 측면은 단단한 지지체상에 고정화된 헬리카제 효소/복합체의 사용이다. 헬리카제의 고정화는 본 발명의 성공에 중요한 이점을 제공한다. 첫째로, 가용성 분자들에서 에너지 흡수의 측정에 관련된 임의의 "노이즈(noise)" 문제가 현저하게 감소된다. 둘째로, 헬리카제는 측정의 영역에 따라 특별히 정의된 구역내에 유지될 수 있기 때문에, 헬리카제와 직접적으로 연루되지 않은 어떠한 기질(예를 들면, NTP 공급원)의 상호작용에서 유래한 노이즈의 문제가 감소된다. 초기 사슬이 성장하는 동안 배경 형광이 증가하는 TIRF에서처럼, 복사 내에서 변화를 측정하기 위해 사용되는 기술들이 형광의 측정을 요구한다면 이것은 특히 적절하다. 또한, SPR 분광법이 사용된다면, 헬리카제 반응은 미소 파장 영역 내에 유지되고, 매우 정확한 측정이 폴리뉴클레오티드의 크기에 상관없이 이루어질 수 있다. 마지막으로, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 비가역적으로 단단한 표면에 부착될 수는 없기 때문에, 표면을 재생성하고 더 나아가 서열화 반응이 동일한 고정화된 헬리카제 또는 헬리카제 복합체를 사용하여 발생하도록 하기에 상대적으로 간단하다.
고정화는 당기술 분야에 공지된 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 표준 아민 결합 절차를 사용한 고정화는 리간드-관련 아민을, 말하자면, 덱스트란 또는 N-히드록시숙신이미드 에스테르-활성화된 표면에 부착하여 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 헬리카제는 굴절 지수에서 변화가 측정될 수 있는 SPR 센서 칩 표면상에 고정화된다. 생체 분자들을 광학 센서로 고정화하는데 사용되는 방법의 예는 EP-A-0589867 및 Lofas et al, Biosens. Bioelectron. (1995) 10:813-822에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, DNA 분자는 비드에 부착될 수 있다. 예를 들어, 한 쪽 말단이 비오틴화되고, 스트렙타비딘-코팅된 폴리스티렌 구(sphere)에 부착되고(Chu et al, Optical Society of America, Washington, DC, (1990), 8:202), 그리고 흐름 셀(flow cell) 내의 광학 트랩(trap)에 유지될 수 있다(Ashkin et al, Opt. Lett. (1986) 11:288). 헬리카제(외부적 조절 하에)가 서열화되는 폴리뉴클레오티드를 따라 진행되는 동안, 폴리뉴클레오티드는 광학 트랩(또는 광학 트위저로 또한 알려진)을 통해 공간 내로 이동될 수 있고, 따라서 헬리카제가 감지 영역내에 유지될 수 있다. 이 시스템은 결합된 헬리카제가 광학 트랩에 의해 유지되게 하여 역으로 작용할 수도 있다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예는 입체 형태적 변화가 표지와 함께 또는 표지없이 모니터될 수 있도록 단일 효소(들)/효소 시스템을 사용/탐지하는 것이다. 예를 들어, 단일 표지된 폴리머라제의 사용은 본 방법/구현예의 성공에 대해 중요한 이점을 제공한다. 첫째로, 단일 폴리뉴클레오티드 단편 환경내의 비-폴리머라제 분자들(예를 들어, 엑소뉴클리아제)의 간헐적인 처리성의 문제가 현저하게 감소된다. 둘째로, 흐르는 스트림내의 단일 표지된 분자들(즉, 뉴클레오티드)을 탐지해야 하는 문제 및 그에 따른 노이즈 문제를 피할 수 있다. 이것은 또한 주형 폴리뉴클레오티드 내 또는 이와 연관된 표면에 제어되지 않은 뉴클레오티드 결합의 문제를 제거한다. 단일 분자 입체 형태적 동역학, 분자 상호작용, 효소 활성, 반응 속도, 분자의 운동 자유도, 활성 및 화학적 정전기적 환경내에서의 변화를 결정/모니터하기 위해 당기술 분야에 공지된 어떠한 수의 기술들의 사용도 본 발명의 범주내에서 고려된다. 이러한 기술들은 다음에 한정되지는 않지만, 형광 에너지 전달 (Fluorescence energy transfer, FRET)(Ha et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:893), 형광 유효기간 현미경 검사(Fluorescence lifetime microscopy, FLIM), 단일 분자 편광/비등방성 측정 및 원자력 현미경 검사(Atomic force microscopy, AFM) 측정을 포함한다.
다음의 실시예가 본 발명을 예시한다.
도 1은 반응(RU) 대 시간(T; sec)의 도면으로 서열화 실험으로부터 나온 결과를 나타낸다. 이것은 초기 사슬로 혼입되는 각 뉴클레오티드의 탐지를 보여준다. 결과는 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 나타낸다.
하기의 분석은 변형된 BIAcore
Figure 112006059346568-pct00001
2000 시스템(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)에서 광학 센서 표면으로서 센서 칩 CM5 (연구 등급, BIAcore AB)을 이용하여 수행되었다. 장치에는 한번 시료 주입에 의해 4개의 셀을 분석할 수 있는 통합 m-유동성 카트리지(IFC)가 설치되어 있다.
PcrA 헬리카제의 제조
Bird et al, Nucleic Acids Res. (1998) 26:2686-2693에 따라서 낮은 염 농도에서 헬리카제를 정제하기 위해 헤파린-세파로제 상에서 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여 PcrA 헬리카제를 제조하였다. 미량의 단백질 오염물을 겔 여과에 의해서 제거하였다. PcrA 농도는 Dillingham et al, Biochemistry(2000) 39:205-212에 의해 설명된 바와 같이, 280 nM에서 0.76 OD mg-1 mL-1 cm-1의 계산된 흡광 계수를 사용하여 분광학적으로 결정되었다.
헬리카제의 고정화
센서 칩으로의 헬리카제의 고정화는 Jonsson et al, Biotechniques (1991); 11:620-627에 따라서 수행되었다. 이를 요약해서, 센서 칩 환경은 헤페스 완충액(10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0.05% 계면활성제 P20(BIAcore AB, Uppsala, Sweden), pH 7.4)와 평형을 이루었다. 동일 부피의 N-히드록시숙신이미드(물 중 0.1M) 및 N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)(물 중 0.1M)를 함께 혼합하고 카르복시메틸화된 덱스트란을 활성화하기 위해서 칩(CM5) 표면을 통하여 주입하였다. PcrA 헬리카제(160 ㎕)를 10 mM 아세트산 나트륨(100 ㎕, pH 5)과 혼합하고 활성화된 표면을 통하여 투입하였다. 마지막으로, 센서 칩 표면상의 잔여 N-히드록시숙신이미드 에스테르를 에탄올아민(35 ㎕, 물 중 0.1M, pH 8.5)과 반응시키고, 비결합 헬리카제를 표면으로부터 제거하였다. 고정화 방법은 25℃의 온도에서 헤페스 완충액(5 ㎕/min)의 연속적인 흐름에 의해서 수행되었다.
올리고뉴클레오티드
WO-A-99/05315에서 SEQ ID No.1 및 SEQ ID No.2로 정의된 표적 및 프라이머 올리고뉴클레오티드들을 사용하였다. 두 폴리뉴클레오티드들은 표적-프라이머 복합체를 형성하기 위한 혼성화 조건하에서 반응되었다.
그리고 나서, 프라임된 DNA를 0.5 mM 1-(니트로페닐)에틸-케이지된(caged) ATP (5'위치에서 케이지된)를 함유하는 완충액(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 8mM MgCl2, 4% (v/v) 글리세롤, 5mM 디티오트레이톨(DDT), 40mg 소 혈청 알부민)에 재현탁하였다. 이 NPE-케이지된 ATP는 비-가수분해성이고 ATP의 광활성화된 유사체이다.
그리고 나서, 프라임된 DNA 및 NPE-케이지된 기질 용액을 5㎕/min의 유속으로 센서 칩 표면상의 PcrA 헬리카제 위에 주입하고, PcrA/DNA/NPE-ATP 복합체의 형성을 통해 헬리카제에 결합하도록 하였다.
헬리카제/칩 표면으로부터 주형 분리를 방지하기 위해, 0.5 mM ADP를 함유하는 헤페스 완충액의 연속적인 흐름을 칩 표면상에 유지하였다.
DNA 서열화
DNA 서열화는 WO-A-99/05315에 설명된 방법에 의해, 상기 문헌의 도 1에 나타낸 장치를 사용하지만 셀 내로 단색광을 파동시키기 위해 단지 하나의 포커싱 어셈블리(focusing assembly)만을 사용하였다.
실험 초기에, 0.5 mM을 함유한 헤페스 완충액의 흐름은 25℃의 온도 및 30 ㎕/min의 유속으로 칩 표면을 가로지르도록 하였고, 데이터 수집은 10Hz의 속도로 기록하였다. 헬리카제 반응 지점내의 ATP 분자상에 차단(blocking) 기를 제거하기 위해서 포커싱 어셈블리를 통하여 260nm의 파장 길이인 단색광을 파동으로 전달하였다. 이것은 한 염기 쌍을 이동시켜 폴리뉴클레오티드를 허용하기 위해 방출되는 에너지를 사용하여 헬리카제가 ATP를 ADP로 가수분해하도록 한다. 그리고 나서, SPR 스펙트럼을 생성하기 위해서 파장-조절된 SPR 장치의 p-편광된 광선에 의해서 염기 이동과 연관된 입체 형태적 변화를 탐지하였다. 에너지 공급원으로 가수분해되는, 헬리카제에 유용한 ATP 기질이 없기 때문에, 더 이상의 이동/풀림이 발생하지 않는다.
그리고 나서, 0.5 mM NPE-케이지된 ATP를 함유하는 헤페스 완충액는 일시적으로 유동성 셀 내에 25℃의 온도 및 30 ㎕/min의 유속으로 도입하였다. 이것은 칩 표면에 고정화된 헬리카제 내에 형성되는 새로운 ATP-기질 복합체를 허용한다. 그리고 나서, 0.5 mM ADP를 함유한 헤페스 완충액을 다시 흐름 셀 내로 도입하고, 다시 화합물 결합 ATP를 탈-케이지(uncage)하고, 그리고 기질 dsDNA를 단일 염기 쌍 및 그것의 결정된 동일성(identity)에 의해 다시 풀었다.

Claims (6)

  1. 다음 단계들로 이루어지는, 폴리뉴클레오티드의 서열화 방법:
    (i) 표적 폴리뉴클레오티드를 헬리카제 또는 프리마제 효소와 반응시키는 단계; 및
    (ii) 반응이 진행될 경우 발생하는 전자기 복사의 변화 또는 흡수를 측정하여, 상기 표적의 뉴클레오티드와 효소 사이의 상호작용을 탐지하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 (ii) 단계는 표면 플라즈몬 공명을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 (ii) 단계는 핵 자기 공명을 사용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항, 제 3항, 또는 제 4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 효소는 고형 지지체상에 고정화된 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 삭제
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