JP2002345494A - ハイブリダイゼーションプローブ及びそれを用いた標的核酸検査キット、標的核酸検査装置、標的核酸検査方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＤＮＡハイブリッドの形成を高精度にかつ定
量的にしかも簡便に検査することができるハイブリダイ
ゼーションプローブ及びそれを用いた標的核酸検査キッ
ト、標的核酸検査装置、標的核酸検査方法の提供。 【解決手段】 棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と
特異的に結合する核酸とを有することを特徴とするハイ
ブリダイゼーションプローブ及びそれを用いた高感度な
標的核酸検査キット、標的核酸検査装置、標的核酸検査
方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高感度なハイブリ
ダイゼーションプローブ及びそれを用いた標的核酸検査
キット、標的核酸検査装置、標的核酸検査方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来から、核酸ポリマー中の目的遺伝子
配列を検索したり、又は複数の核酸ポリマーの異同及び
相同性を判定する方法としては、ターゲット核酸ポリマ
ーの一部配列と相補的な一本鎖核酸ポリマー（ＤＮＡ又
はＲＮＡ）をプローブとするハイブリダイゼーション法
が知られている。

【０００３】このハイブリダイゼーション法では、一本
鎖ターゲット核酸ポリマーをニトロセルロース膜又はナ
イロン膜に固定化し、放射性同位元素又は酵素でラベル
されたプローブ核酸ポリマー水溶液を膜上に加え、該プ
ローブ核酸ポリマーがターゲット核酸ポリマーにハイブ
リダイズした場合には、水洗後、膜にはハイブリダイズ
したプローブ核酸ポリマーだけが残存するので、プロー
ブ核酸ポリマーのラベル化された放射性同位元素からの
放射能又は酵素が産出する化学発光や沈殿物の色を検出
することにより、ターゲット核酸ポリマー中に目的とす
る塩基配列が存在するか否かを判定できるものである。

【０００４】しかしながら、放射性同位元素を扱うには
特別な免許や施設などが必要であり、一般向けではな
い。また、一本鎖プローブ核酸ポリマーを酵素、発光物
質等でラベルするには非常にコストと手間がかかり、測
定に時間がかかってしまうという問題点があった。

【０００５】例えば、特開平３−２１０１９８号公報に
は、目的ＤＮＡに相補的な塩基配列を有する抗原で修飾
されたＤＮＡがハイブリッド形成した後、酵素修飾抗体
を反応させることによる産生物を検出する方法が記載さ
れている。

【０００６】しかしながら、この方法では、酵素活性の
失活により定量性に乏しく、酵素修飾抗体作製などのた
めの操作、処理、測定に時間がかかってしまうという問
題があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況下、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達
成することを課題とする。即ち、本発明は、簡便にしか
も直接ＤＮＡハイブリッドの形成反応を顕在化すること
ができ、ＤＮＡハイブリッドの形成を簡便かつ高精度に
検査することができるハイブリダイゼーションプローブ
及びそれを用いた標的核酸検査キット、標的核酸検査装
置、標的核酸検査方法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決するため
の手段は、以下の通りである。 ＜１＞ 棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的
に結合する核酸とを有することを特徴とするハイブリダ
イゼーションプローブである。 ＜２＞ 核酸が、ＲＮＡ及び１本鎖ＤＮＡのいずれかで
ある前記＜１＞に記載のハイブリダイゼーションプロー
ブ。 ＜３＞ 標的核酸が、原核生物にのみ存在する塩基配列
の一部、真核生物（但し、ヒトを除く）にのみ存在する
塩基配列の一部及びヒトにのみ存在する塩基配列の一部
のいずれかから選択される前記＜１＞又は＜２＞に記載
のハイブリダイゼーションプローブである。 ＜４＞ 標的核酸が、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する
遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスク
ファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である前記＜
３＞に記載のハイブリダイゼーションプローブである。 ＜５＞ 標的核酸が、該標的核酸と共に存在する核酸で
ある前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のハイブリ
ダイゼーションプローブである。 ＜６＞ 棒状体が、らせん状有機分子である前記＜１＞
から＜５＞のいずれかに記載のハイブリダイゼーション
プローブである。 ＜７＞ らせん状有機分子が、α−ヘリックス・ポリペ
プチド、ＤＮＡ及びアミロースのいずれかである前記＜
６＞に記載のハイブリダイゼーションプローブである。 ＜８＞ 棒状体の長さが８１０ｎｍ以下である前記＜１
＞から＜７＞のいずれか１項記載のハイブリダイゼーシ
ョンプローブである。 ＜９＞ 構造性発色を示す前記＜８＞に記載のハイブリ
ダイゼーションプローブである。 ＜１０＞ 両親媒性である前記＜１＞から＜９＞のいず
れかに記載のハイブリダイゼーションプローブである。 ＜１１＞ 長さが８１０ｎｍ以下である棒状体と、該棒
状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸とを有
し、かつ、膜状に配向させることにより構造性発色を示
すハイブリダイゼーションプローブと、ディッシュ、プ
レート及びチューブのいずれかと、を含む標的核酸検査
キットである。 ＜１２＞ 試料中の標的核酸を検出するための標的核酸
検査装置であって、長さが８１０ｎｍ以下である棒状体
と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸
とを有し、かつ、膜状に配向させることにより構造性発
色を示すハイブリダイゼーションプローブと、該ハイブ
リダイゼーションプローブと前記試料とを接触させる試
料添加手段と、標的核酸にハイブリダイズした膜状ハイ
ブリダイゼーションプローブの構造性発色による波長の
変化を測定する発色波長測定手段とを備えた標的核酸検
査装置である。 ＜１３＞ 前記ハイブリダイゼーションプローブが、更
に両親媒性であり、前記試料添加手段が、ハイブリダイ
ゼーションプローブを油相と共に、水相の試料に添加し
てハイブリダイゼーションプローブと試料とを接触させ
る試料添加手段である前記＜１２＞に記載の標的核酸検
査装置である。 ＜１４＞ 棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異
的に結合する核酸とを有し、かつ、両親媒性であるハイ
ブリダイゼーションプローブを水晶発振子又は表面弾性
波素子に膜状に付着結合させてなるバイオセンサーと、
該バイオセンサーに標的核酸がハイブリダイズした際の
質量変化又は粘弾性変化を周波数として発振する発振回
路と、該発振回路から発振された前記振動の周波数を計
測する周波数カウンターとを備えた標的核酸検査装置で
ある。 ＜１５＞ ハイブリダイゼーションプローブを水晶発振
子又は表面弾性波素子に単分子膜状に付着させた前記＜
１４＞に記載の標的核酸検査装置である。 ＜１６＞ ハイブリダイゼーションプローブを水晶発振
子又は表面弾性波素子に二分子膜状に付着させた前記＜
１４＞に記載の標的核酸検査装置である。 ＜１７＞ 試料中の標的核酸を検出するための標的核酸
検査方法であって、長さが８１０ｎｍ以下である棒状体
と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸
とを有し、膜状に配向させることにより構造性発色を示
し、かつ、両親媒性であるハイブリダイゼーションプロ
ーブと試料とを接触させる接触工程と、標的核酸にハイ
ブリダイズした膜状ハイブリダイゼーションプローブの
構造性発色による波長の変化を測定する発色波長測定工
程と、を有する標的核酸検査方法である。

【０００９】本発明のハイブリダイゼーションプローブ
は、棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結
合する核酸とを有する。これにより、簡便にしかも直接
ＤＮＡハイブリッドの形成反応を顕在化することがで
き、ＤＮＡハイブリッドの形成を簡便かつ高精度に検査
することができる。

【００１０】本発明の標的核酸検査キットは、長さが８
１０ｎｍ以下である棒状体と、該棒状体に結合し標的核
酸と特異的に結合する核酸とを有し、かつ、膜状に配向
させることにより構造性発色を示すハイブリダイゼーシ
ョンプローブと、ディッシュ、プレート及びチューブの
いずれかと、を含む。

【００１１】前記膜状に配向させたハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、モルフォ蝶翅の鱗粉の発色基本原理で
ある多層薄膜干渉理論に基づく構造性発色を示す。前記
膜状ハイブリダイゼーションプローブと標的核酸とがハ
イブリダイズした際の屈折率又は長さの変化による構造
性発色に基づく波長変化を測定することにより、試料中
の標的核酸を迅速に、簡単な操作で確実に検出すること
ができる。

【００１２】本発明の標的核酸検査装置の第一の態様
は、長さが８１０ｎｍ以下である棒状体と、該棒状体に
結合し標的核酸と特異的に結合する核酸とを有し、か
つ、膜状に配向させることにより構造性発色を示すハイ
ブリダイゼーションプローブと、該ハイブリダイゼーシ
ョンプローブと試料とを接触させる試料添加手段と、標
的核酸にハイブリダイズした膜状ハイブリダイゼーショ
ンプローブの構造性発色による波長の変化を測定する発
色波長測定手段とを備える。

【００１３】前記膜状に配向させたハイブリダイゼーシ
ョンプローブは、モルフォ蝶翅の鱗粉の発色基本原理で
ある多層薄膜干渉理論に基づく構造性発色を示す。前記
膜状ハイブリダイゼーションプローブと標的核酸とがハ
イブリダイズした際の屈折率又は長さの変化による構造
性発色に基づく波長変化を測定することにより、標的核
酸の存在を検査することができる。

【００１４】本発明の標的核酸検査装置の第二の態様
は、棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結
合する核酸とを有し、かつ、両親媒性であるハイブリダ
イゼーションプローブを水晶発振子又は表面弾性波素子
に膜状に付着結合させてなるバイオセンサーと、該バイ
オセンサーに標的核酸がハイブリダイズした際の質量変
化又は粘弾性変化を周波数として発振する発振回路と、
該発振回路から発振された前記振動の周波数を計測する
周波数カウンターとを備える。

【００１５】これにより、前記バイオセンサーのハイブ
リダイゼーションプローブが標的核酸とハイブリダイズ
した際の質量変化又は粘弾性変化を周波数として高感度
に短時間で検出できるものである。

【００１６】本発明の標的核酸検査方法は、長さが８１
０ｎｍ以下である棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸
と特異的に結合する核酸とを有し、膜状に配向させるこ
とにより構造性発色を示し、かつ、両親媒性であるハイ
ブリダイゼーションプローブと試料とを接触させる接触
工程と、標的核酸にハイブリダイズした膜状ハイブリダ
イゼーションプローブの構造性発色による波長の変化を
測定する発色波長測定工程と、を有する。

【００１７】前記膜状に配向させたハイブリダイゼーシ
ョンプローブはモルフォ蝶翅の鱗粉の発色基本原理であ
る多層薄膜干渉理論に基づく構造性発色を示す。前記膜
状ハイブリダイゼーションプローブと標的核酸とがハイ
ブリダイズした際の屈折率又は長さの変化による構造性
発色に基づく波長変化を測定することにより、標的核酸
の存在を効率よく確実に検査することができる。

【００１８】

【発明の実施の形態】以下、本発明について更に詳しく
説明する。本発明のハイブリダイゼーションプローブ１
０は、図１に一例として示したように、棒状体１と、該
棒状体１に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸２と
を有する。なお、図１のハイブリダイゼーションプロー
ブ１０はα−ヘリックス構造の両親媒性ポリペプチドで
あり、棒状体の１ａ部分が疎水性、１ｂ部分は親水性を
示す。

【００１９】＜棒状体＞前記棒状体としては、棒状であ
れば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することが
でき、棒状無機物、棒状有機物のいずれであってもよい
が、棒状有機物であるのが好ましい。

【００２０】前記棒状有機物としては、例えば、生体高
分子、多糖類などが挙げられる。

【００２１】前記生体高分子としては、例えば、繊維状
蛋白、α−ヘリックス・ポリペプチド、核酸（ＤＮＡ、
ＲＮＡ）などが好適に挙げられる。該繊維状蛋白として
は、例えば、α−ケラチン、ミオシン、エピダーミン、
フィブリノゲン、トロポマイシン、絹フィブロイン等の
α−ヘリックス構造を有するものが挙げられる。

【００２２】前記多糖類としては、例えば、アミロース
などが好適に挙げられる。

【００２３】前記棒状有機物の中でも、安定に棒状を維
持することができ、また、目的に応じて内部に他の物質
をインターカレートさせることができる点で、分子がら
せん構造を有するらせん状有機分子が好ましく、該らせ
ん状有機分子には、上述したものの内、α−ヘリックス
・ポリペプチド、ＤＮＡ、アミロースなどが該当する。

【００２４】〔α−ヘリックス・ポリペプチド〕前記α
−ヘリックス・ポリペプチドは、ポリペプチドの二次構
造の一つであり、アミノ酸３．６残基ごとに１回転（１
らせんを形成）し、４番目ごとのアミノ酸のイミド基
（−ＮＨ−）とカルボニル基（−ＣＯ−）との間に螺旋
軸とほぼ平行な水素結合を作り、７アミノ酸を一単位と
して繰り返すことによりエネルギー的に安定な構造を有
している。

【００２５】前記α−ヘリックス・ポリペプチドのらせ
ん方向としては、特に制限はなく、右巻きであってもよ
いし、左巻きであってもよい。なお、天然には安定性の
点から前記らせん方向が右巻きのものしか存在しない。

【００２６】前記α−ヘリックス・ポリペプチドを形成
するアミノ酸としては、α−ヘリックス構造を形成可能
であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択するこ
とができるが、該α−ヘリックス構造を形成し易いもの
が好ましく、このようなアミノ酸としては、例えば、ア
スパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ア
ルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン
（Ｈｉｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇ
ｌｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ア
ラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅ
ｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙ
ｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フ
ェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）
などが好適に挙げられる。これらは、１種単独で使用さ
れてもよいし、２種以上が併用されてもよい。

【００２７】前記α−ヘリックス・ポリペプチドの親性
としては、前記アミノ酸を適宜選択することにより、親
水性、疎水性、両親媒性のいずれにも変え得るが、前記
親水性とする場合、前記アミノ酸としては、セリン（Ｓ
ｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒ
ｇ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グ
ルタミン（Ｇｌｎ）などが好適に挙げられ、前記疎水性
とする場合、前記アミノ酸としては、フェニルアラニン
（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、イソロイシン
（Ｉｌｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、メチオニン（Ｍｅ
ｔ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）などが挙
げられる。

【００２８】また、前記α−ヘリックス・ポリペプチド
においては、該α−ヘリックスを形成する前記アミノ酸
における、ペプチド結合を構成しないカルボキシル基
を、エステル化することにより疎水性にすることがで
き、一方、該エステル化されたカルボキシル基を加水分
解することにより親水性にすることができる。

【００２９】前記アミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸、Ｄ
−アミノ酸、これらの側鎖部分が修飾された誘導体など
のいずれであってもよい。

【００３０】前記α−ヘリックス・ポリペプチドにおけ
るアミノ酸の結合個数（重合度）としては、特に制限は
なく目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜
５０００であるのが好ましい。前記結合個数（重合度）
が、１０未満であると、ポリアミノ酸が安定なα−ヘリ
ックスを形成できなくなることがあり、５０００を超え
ると、垂直配向させることが困難となることがある。

【００３１】前記α−ヘリックス・ポリペプチドの具体
例としては、例えば、ポリ（γ−メチル−Ｌ−グルタメ
ート）、ポリ（γ−エチル−Ｌ−グルタメート）、ポリ
（γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）、ポリ（Ｌ−グル
タミン酸−γ−ベンジル）、ポリ（ｎ−ヘキシル−Ｌ−
グルタメート）等のポリグルタミン酸誘導体、ポリ（β
−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）等のポリアスパラギ
ン酸誘導体、ポリ（Ｌ−ロイシン）、ポリ（Ｌ−アラニ
ン）、ポリ（Ｌ−メチオニン）、ポリ（Ｌ−フェニルア
ラニン）、ポリ（Ｌ−リジン）−ポリ（γ−メチル−Ｌ
−グルタメート）などのポリペプチド、が好適に挙げら
れる。

【００３２】前記α−ヘリックス・ポリペプチドとして
は、市販のものであってもよいし、公知文献等に記載の
方法に準じて適宜合成乃至調製したものであってもよ
い。

【００３３】前記α−ヘリックス・ポリペプチドの合成
の一例として、ブロックコポリペプチド〔ポリ（Ｌ−リ
ジン）_２５−ポリ（γ−メチル−Ｌ−グルタメート）
_６０〕ＰＬＬＺ_２５−ＰＭＬＧ_６０の合成をここで示す
と次の通りである。即ち、ブロックコポリペプチド〔ポ
リ（Ｌ−リジン）_２５−ポリ（γ−メチル−Ｌ−グルタ
メート）_６０〕ＰＬＬＺ_２５−ＰＭＬＧ_６０は、下記式
で示したように、ｎ−ヘキシルアミンを開始剤として用
い、Ｎ^ε−カルボベンゾキシ Ｌ−リジン Ｎ^α−カル
ボキシ酸無水物（ＬＬＺ−ＮＣＡ）の重合を行い、続け
てγ−メチル Ｌ−グルタメート Ｎ−カルボキシ酸無
水物（ＭＬＧ−ＮＣＡ）の重合を行うことにより合成す
ることができる。

【００３４】

【化１】

【００３５】前記α−ヘリックス・ポリペプチドの合成
は、上記方法に限られず、遺伝子工学的方法により合成
することもできる。具体的には、前記目的とするポリペ
プチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターに
より宿主細胞を形質転換し、この形質転換体を培養する
こと等により製造することができる。

【００３６】前記発現ベクターとしては、例えば、プラ
スミドベクター、ファージベクター、プラスミドとファ
ージとのキメラベクター、などが挙げられる。

【００３７】前記宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等
の原核微生物、酵母菌等の真核微生物、動物細胞などが
挙げられる。

【００３８】また、前記α−ヘリックス・ポリペプチド
は、α−ケラチン、ミオシン、エピダーミン、フィブリ
ノゲン、トロポマイシン、絹フィブロイン等の天然の繊
維状蛋白からそのα−ヘリックス構造部分を切り出すこ
とにより調製してもよい。

【００３９】〔ＤＮＡ〕前記ＤＮＡは、１本鎖ＤＮＡで
あってもよいが、安定に棒状を維持することができ、内
部に他の物質をインターカレートできる等の点で２本鎖
ＤＮＡであるのが好ましい。

【００４０】前記２本鎖ＤＮＡは、一つの中心軸の回り
に、右巻きらせん状の２本のポリヌクレオチド鎖が互い
に逆方向に延びた状態で位置して形成された２重らせん
構造を有する。

【００４１】前記ポリヌクレオチド鎖は、アデニン
（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）及びシトシン
（Ｃ）の４種類の核酸塩基で形成されており、前記ポリ
ヌクレオチド鎖において前記核酸塩基は、中心軸に対し
て垂直な平面内で互いに内側に突出した形で存在して、
いわゆるワトソン−クリック型塩基対を形成し、アデニ
ンに対してはチミンが、グアニンに対してはシトシン
が、それぞれ特異的に水素結合している。その結果、前
記２本鎖ＤＮＡにおいては、２本のポリペプチド鎖が互
いに相補的に結合している。

【００４２】前記ＤＮＡは、公知のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣ
Ｒ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）法等により調製することができるが、こ
れらの中でもＰＣＲ法が好適である。

【００４３】また、前記ＤＮＡは、天然の遺伝子から制
限酵素により酵素的に直接切り出して調製してもよい
し、遺伝子クローニング法により調製してもよいし、化
学合成法により調製してもよい。

【００４４】前記遺伝子クローニング法の場合、例え
ば、正常核酸を増幅したものをプラスミドベクター、フ
ァージベクター、プラスミドとファージとのキメラベク
ター等から選択されるベクターに組み込み、大腸菌、枯
草菌等の原核微生物、酵母等の真核微生物、動物細胞な
どから選択される増殖可能な任意の宿主に導入すること
により前記ＤＮＡを大量に調製することができる。

【００４５】前記化学合成法としては、例えば、トリエ
ステル法、亜リン酸法などのような、液相法又は不溶性
の担体を使った固相合成法などが挙げられる。前記化学
合成法の場合、公知の自動合成機等を用い、１本鎖のＤ
ＮＡを大量に調製した後、アニーリングを行うことによ
り、２本鎖ＤＮＡを調製することができる。

【００４６】〔アミロース〕前記アミロースは、高等植
物の貯蔵のためのホモ多糖類であるデンプンを構成する
Ｄ−グルコースがα−１，４結合で直鎖状につながった
らせん構造を有する多糖である。前記アミロースの分子
量としては、数平均分子量で、数千〜１５万程度が好ま
しい。前記アミロースは、市販のものであってもよい
し、公知の方法に従って適宜調製したものであってもよ
い。なお、前記アミロースは、その一部にアミロペクチ
ンが含まれていても構わない。

【００４７】前記棒状体の長さとしては、特に制限はな
く目的に応じて適宜選択することができるが、構造性発
色を生じさせる観点からは、８１０ｎｍ以下であるのが
好ましく、１０ｎｍ〜８１０ｎｍであるのがより好まし
い。前記棒状体の径としては、特に制限はないが、前記
α−ヘリックス・ポリペプチドの場合には０．８〜２．
０ｎｍ程度である。

【００４８】前記棒状体は、その全部が疎水性又は親水
性であってもよく、また、その一部が疎水性又は親水性
であり、他の部分が該一部と逆の親性を示す両親媒性で
あってもよい。前記棒状体が前記両親媒性であると、油
相−水相界面での配向、油層又は水相中での分散、等が
容易である点で有利である。

【００４９】前記両親媒性の棒状体の場合、疎水性を示
す部分及び親水性を示す部分の数としては特に制限はな
く、目的に応じて適宜選択することができる。また、こ
の場合、疎水性を示す部分と親水性を示す部分とが交互
に位置していてもよいし、いずれかの部分が棒状体の一
端部にのみ位置していてもよい。

【００５０】＜標的核酸＞前記標的核酸は、特に制限は
なく、目的に応じて適宜選択することができるが、原核
生物にのみ存在する塩基配列の一部、真核生物（但し、
ヒトを除く）にのみ存在する塩基配列の一部、及びヒト
にのみ存在する塩基配列の一部のいずれかから選択され
る核酸であることが好ましい。前記標的核酸は、前記の
ような個々の目的における検出の最終的な標的である核
酸である必要はなく、検出の最終的な標的である核酸と
共に存在する核酸であってもよい。

【００５１】前記標的核酸としては、具体的には、癌関
連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、
細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型
性を示す遺伝子等が挙げられる。

【００５２】前記癌関連遺伝子としては、例えば、Ｋ−
ｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲ
ＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、ｓｒｃ遺伝子、ｒｏ
ｓ遺伝子、ＡＰＣ遺伝子などが挙げられる。

【００５３】前記遺伝病に関連する遺伝子としては、例
えば、各種先天性代謝異常症、例えばフェニールケトン
尿症、アルカプトン尿症、シスチン尿症、ハンチントン
舞踏病、Ｄｏｗｎ症候群、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジスト
ロフィー、血友病等の遺伝子が挙げられる。

【００５４】前記ウィルス及び細菌遺伝子としては、例
えば、Ｃ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、インフル
エンザウィルス、麻疹ウィルス、ＨＩＶウィルス、マイ
コプラズマ、リケッチア、レンサ球菌、サルモネラ菌等
の遺伝子が挙げられる。

【００５５】前記多型性を示す遺伝子とは、病気等の原
因とは必ずしも直接は関係のない個体によって異なる塩
基配列を持つ遺伝子を意味する。例えば、ＰＳ１（プリ
セリニン１）遺伝子、ＰＳ２（プリセリニン２）遺伝
子、ＡＰＰ（ベーターアミロイドプレカーサー蛋白質）
遺伝子、リポプロテイン遺伝子、ＨＬＡ（ＨｕｍａｎＬ
ｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）や血液型に関する
遺伝子、或いは高血圧、糖尿病等の発症に関係するとさ
れている遺伝子などが挙げられる。これらの遺伝子は通
常宿主の染色体上に存在するが、ミトコンドリア遺伝子
にコードされている場合もある。

【００５６】このような標的核酸を含む検体としては、
例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離され
た血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙
げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存
在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を
検体とすることもできる。また、これらの検体は直接、
又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮
した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、
超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破
壊処理を予め施したものを使用することができる。この
場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮ
Ａを顕在化させる目的で行われるものである。

【００５７】なお、核酸ではないが、ＤＮＡと特異的に
結合することが知られている細胞分裂に不可欠なたんぱ
く質であるチューブリン、キチンなども、本発明の標的
物質に含まれる。

【００５８】＜標的核酸と特異的に結合する核酸＞前記
標的核酸と特異的に結合する核酸とは、前記標的核酸と
塩基配列が相補であるＲＮＡ又は１本鎖ＤＮＡをいう。
このような核酸は、上記同様にＰＣＲ法、化学合成法な
どにより作製することができる。

【００５９】核酸の長さは、通常のハイブリダイゼーシ
ョン条件下で安定に標的分子とハイブリダイズできる限
り、制限されないが、必要以上に長くないことが好まし
く、１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３０塩基、
更に好ましくは１５〜２５塩基である。

【００６０】そして、得られる標的核酸と特異的に結合
する核酸を前記棒状体と結合させることにより本発明の
ハイブリダイゼーションプローブが得られる。

【００６１】前記結合方法は、前記核酸と前記棒状体と
に応じて適宜選択することができるが、エステル結合や
アミド結合等の共有結合を利用する方法、タンパク質を
アビジン標識し、ビオチン化した核酸と結合させる方
法、タンパク質をストレプトアビジン標識し、ビオチン
化した核酸と結合させる方法等の公知の方法が使用でき
る。

【００６２】前記共有結合法としては、ペプチド法、ジ
アゾ法、アルキル化法、臭化シアン活性化法、架橋試薬
による結合法、ユギ（Ｕｇｉ）反応を利用した固定化
法、チオール・ジスルフィド交換反応を利用した固定化
法、シッフ塩基形成法、キレート結合法、トシルクロリ
ド法、生化学的特異結合法などが挙げられるが、好まし
くは共有結合などのより安定した結合には、チオール基
とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオ
ール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応などを利
用して行うことができ、公知の方法あるいは当該分野の
当業者が容易になしうる方法、さらにはそれらを修飾し
た方法の中から適宜選択して適用できる。これらのなか
でも、より安定した結合を形成できる化学的結合剤・架
橋剤などが使用される。

【００６３】このような化学的結合剤・架橋剤として
は、カルボジイミド、イソシアネート、ジアゾ化合物、
ベンゾキノン、アルデヒド、過ヨウ素酸、マレイミド化
合物、ピリジルジスルフィド化合物などが挙げられる。
好ましい試薬としては、例えばグルタルアルデヒド、ヘ
キサメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソ
チオシアネート、Ｎ，Ｎ'−ポリメチレンビスヨードア
セトアミド、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスマレイミド、エチ
レングリコールビススクシニミジルスクシネート、ビス
ジアゾベンジジン、１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド、スクシンイミジル ３
−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ）、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメ
チル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、
Ｎ−スクシンイミジル （４−ヨードアセチル）アミノ
ベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（１−マレ
イミドフェニル）ブチレート、イミノチオラン、Ｓ−ア
セチルメルカプトコハク酸無水物、メチル−３−（４'
−ジチオピリジル）プロピオンイミデート、メチル−４
−メルカプトブチリルイミデート、メチル−３−メルカ
プトプロピオンイミデート、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ
−アセチルメルカプトアセテートなどが挙げられる。

【００６４】＜ハイブリダイゼーションプローブ＞本発
明のハイブリダイゼーションプローブ１０は、図１に示
したように、棒状体１と、該棒状体１に結合し標的核酸
と特異的に結合する核酸２とを有するものである。前記
ハイブリダイゼーションプローブ１０は、前記核酸部分
に前記標的核酸が結合することにより、ハイブリダイゼ
ーションプローブの光の屈折率、透過率、質量、粘弾
性、などの性質が変化するため、この変化を検出するこ
とにより、標的核酸の検出に利用することができる。

【００６５】前記検出方法は、目的に合わせて適宜選択
することができるが、例えば、肉眼により色の変化を観
察する、分光光度計により波長の変化を検出する、水晶
発振子や表面弾性波（ＳＡＷ）素子等の周波数の発振を
周波数カウンターにより検出する等の方法により、行う
ことができる。

【００６６】このハイブリダイゼーションプローブ１０
は単体でも用いることができるが、単体で用いる場合に
は、標的核酸を含む溶媒の表面や、前記溶媒と前記溶媒
とは逆の親媒性を有する液体との境界に、単層状又は複
層状に配向させて用いることが、波長の変化などを検出
し易い点で好ましい。

【００６７】また、例えば、ラングミュア・ブロジェッ
ト（ＬＢ）法などにより垂直配向させて基板上に単分子
膜、二分子膜等の膜状に形成して用いることが波長の変
化を検出し易い点、水晶発振子や表面弾性波（ＳＡＷ）
素子等を固定できる点、取り扱いが容易である点で好ま
しい。

【００６８】本発明のハイブリダイゼーションプローブ
は、視認性、識別性等の観点からは構造性発色を示し得
るのが好ましい。

【００６９】前記構造性発色は、モルフォ蝶翅の鱗粉の
発色基本原理である多層薄膜干渉理論に基づき、前記膜
に電場、磁場、温度、光（例えば自然光、赤外線光、紫
外線光）などの外部刺激を与えたときに、該膜の厚みと
その屈折率に応じて特定波長の光が反射する結果、該膜
の表面で生ずる発色であり、前記外部刺激によりカメレ
オンの表皮のようにその色調が任意に制御され得る。

【００７０】ここで、前記構造性発色の原理について下
記に示す。図２及び図３に示すように、前記棒状体の膜
に光が照射された際に該膜による干渉光の波長（λ）
は、下記（１）に示す条件で強められ、下記（２）に示
す条件で弱められる。

【００７１】

【数１】

【００７２】前記式（１）及び前記式（２）において、
λは、干渉光の波長（ｎｍ）を意味し、αは、前記膜へ
の光の入射（度）を意味し、ｔは、単一の膜の厚み（ｎ
ｍ）を意味し、ｌは、膜の数を意味し、ｎは、膜の屈折
率を意味し、ｍは、１以上の整数を意味する。

【００７３】前記構造性発色は、前記ハイブリダイゼー
ションプローブを膜状に配向させることにより得ること
ができる。

【００７４】前記単一の膜の厚みとしては、８１０ｎｍ
以下であるのが好ましく、１０ｎｍ〜８１０ｎｍである
のがより好ましい。前記厚みを適宜変更することによ
り、前記構造性発色の色（波長）を変化させることがで
きる。

【００７５】前記膜は、単分子膜であってもよいし、該
単分子膜による積層膜であってもよい。前記単分子膜又
はそれによる前記積層膜は、例えば、ラングミュア−ブ
ロジェット法（ＬＢ法）に従って形成することができ、
その際、公知のＬＢ膜形成装置（例えば、日本レーザー
＆エレクトロニクス・ラボラトリーズ社製のＮＬ−ＬＢ
４００ＮＫ−ＭＷＣなどが好適に挙げられる）を使用す
ることができる。

【００７６】前記単分子膜の形成は、例えば、親油性
（疎水性）若しくは両親媒性の前記棒状体を水面上（水
相上）に浮かした状態で、又は、親水性若しくは両親媒
性の前記棒状体を油面上（油相上）に浮かした状態で、
即ち図４に示すように、棒状体１を配向させた状態で押
出部材６０を用いて基板５０上に形成することができ
る。この操作を繰り返すことにより、基板５０上に該単
分子膜を任意の数だけ積層した前記積層膜を形成するこ
とができる。なお、前記単分子膜又は前記積層膜が基板
５０に固定されていると、該単分子膜又は積層膜による
構造性発色が安定して発現される点で好ましい。

【００７７】このとき、基板５０としては、特に制限は
なく、目的に応じてその材質、形状、大きさ等を適宜選
択することができるが、その表面は、適宜、棒状体１が
付着乃至結合し易くする目的で予め表面処理を行ってお
くのが好ましく、例えば、棒状体１（例えばα−ヘリッ
クス・ポリペプチド）が親水性である場合には、オクタ
デシル・トリメチルシロキサンなどを用いた親水化処理
等の表面処理を予め行っておくのが好ましい。

【００７８】なお、両親媒性の棒状体の単分子膜を形成
する際に、該棒状体を油相又は水相上に浮かべた状態と
しては、図５に示す通り、前記水相又は油相上で、棒状
体１の親油性部（疎水性部）１ａ同士が互いに隣接して
配向し、親水性部１ｂ同士が互いに隣接して配向してい
る。

【００７９】以上は前記棒状体が単分子膜の平面方向に
配向（横に寝た状態）した単分子膜又はそれによる積層
膜の例であるが、該棒状体が単分子膜の厚み方向に配向
（立設した状態）した単分子膜は、例えば、以下のよう
にして形成することができる。即ち、図６に示すよう
に、まず、両親媒性の棒状体１（α−ヘリックス・ポリ
ペプチド）を水面上（水相上）に浮かした状態（横に寝
た状態）で、該水（水相）のｐＨを１２程度のアルカリ
性にする。すると、棒状体１（α−ヘリックス・ポリペ
プチド）における親水性部１ｂが、そのα−ヘリックス
構造が解けてランダムな構造をとる。このとき、棒状体
１（α−ヘリックス・ポリペプチド）における親油性部
（疎水性部）１ａはα−ヘリックス構造を維持したまま
である。次に、該水（水相）のｐＨを５程度の酸性にす
る。すると、棒状体１（α−ヘリックス・ポリペプチ
ド）における親水性部１ｂが、再びα−ヘリックス構造
をとるようになる。このとき、棒状体１（α−ヘリック
ス・ポリペプチド）に対し、該棒状体１（α−ヘリック
ス・ポリペプチド）に当接させた押圧部材をその側面か
らエアーの圧力で押すと、該棒状体１は該水（水相）に
対し立設した状態のままその親水性部１ｂが水相中でそ
の水面と略直交する方向に向かってα−ヘリックス構造
をとるようになる。そして、図４を用いて上述したよう
に、棒状体１（α−ヘリックス・ポリペプチド）を配向
させた状態で押出部材６０を用いて基板５０上に押し出
すことにより基板５０上に単分子膜を形成することがで
きる。この操作を繰り返すことにより、基板５０上に該
単分子膜を任意の数だけ積層した前記積層膜を形成する
ことができる。

【００８０】前記構造性発色を示す単層膜又は積層膜を
得ることができる、前記ハイブリダイゼーションプロー
ブとしては、例えば、両親媒性であるハイブリダイゼー
ションプローブが挙げられ、棒状体が、αへリックス・
ポリペプチドである両親媒性ハイブリダイゼーションプ
ローブが好ましい。

【００８１】次に、本発明のハイブリダイゼーションプ
ローブを用いたハイブリダイズには、一般に、ＳＳＣ
（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン
酸ナトリウム）、ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：３．６Ｍ
塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２ｍＭ
ＥＤＴＡ）などの溶液が使われており、本発明において
もこれらの溶液を好適な濃度に希釈して使用することが
できる。また、必要に応じてジメチルスルフォキシド
（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）など
の有機溶媒、ホルムアミド、塩、蛋白質、安定剤、緩衝
剤等を含むハイブリダイゼーション溶液中で行うことが
好ましい。

【００８２】前記ホルムアミド濃度は０〜６０質量％、
好ましくは１０〜５０質量％、より好ましくは２０〜３
０質量％である。塩としては塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム等の無機塩、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリ
ウム等の有機酸塩が挙げられ、塩濃度としては０〜２．
０Ｍ、好ましくは０．１５〜１．０Ｍである。蛋白質と
しては血清アルブミン等が挙げられる。安定剤として
は、フィコール等が挙げられる。緩衝剤としては、リン
酸緩衝剤等が挙げられ、濃度としては１〜１００ｍＭが
好ましい。

【００８３】前記ハイブリダイゼーションプローブを用
いたハイブリダイズは、前記ハイブリダイゼーション溶
液中に前記ハイブリダイゼーションプローブと試料核酸
（一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡ）を等モル濃度となる
ように添加し、６０〜９０℃で１〜６０分加温した後、
０〜４０℃まで１〜２４時間かけて徐々に冷却すること
により行うことができる。

【００８４】＜標的核酸検査キット＞本発明の標的核酸
検査キットは、長さが８１０ｎｍ以下である棒状体と、
該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸とを
有し、かつ、膜状に配向させることにより構造性発色を
示す前記ハイブリダイゼーションプローブと、ディッシ
ュ、プレート及びチューブのいずれかとを含む。

【００８５】前記標的核酸検査キットは、前記ディッシ
ュ等の大きさに適した量の前記ハイブリダイゼーション
プローブを含む溶媒を前記容器とは別の容器に含んでい
てもよい。例えば、前記容器に水性の試料を添加し、該
試料に油性又は両親媒性の前記ハイブリダイゼーション
プローブを添加することにより、前記ハイブリダイゼー
ションプローブを試料上に膜状に配向させ、この膜状プ
ローブの構造性発色に基づく波長変化により標的核酸を
検出できる。

【００８６】前記検査キットには、必要に応じて、検体
前処理用の細胞破壊試薬、増幅反応生成物を洗浄するた
めの洗浄液、反応溶液の水分の蒸発を防止するためのオ
イルなどを組み合わせることもできる。

【００８７】本発明の標的核酸検査キットによれば、前
記膜状に配向させたハイブリダイゼーションプローブ
は、モルフォ蝶翅の鱗粉の発色基本原理である多層薄膜
干渉理論に基づく構造性発色を示すので、膜状ハイブリ
ダイゼーションプローブと標的核酸とがハイブリダイズ
した際の屈折率又は長さの変化による構造性発色に基づ
く波長変化を測定することにより、試料中の標的核酸を
簡単な操作で確実に検出することができる。

【００８８】＜標的核酸検査装置＞本発明の第１の態様
に係る標的核酸検査装置は、長さが８１０ｎｍ以下であ
る棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合
する核酸とを有し、かつ、膜状に配向させることにより
構造性発色を示すハイブリダイゼーションプローブと、
該ハイブリダイゼーションプローブと試料とを接触させ
る試料添加手段と、標的核酸にハイブリダイズした膜状
ハイブリダイゼーションプローブの構造性発色による波
長の変化を測定する発色波長測定手段とを備える。

【００８９】前記試料としては、標的核酸を含むか否か
の検査対象となっているものであれば特に制限はなく、
例えば前記検体や、標的核酸を含む核酸ライブラリー等
が挙げられる。

【００９０】前記標的核酸検査装置の好適な態様として
は、前記ハイブリダイゼーションプローブが、更に両親
媒性であり、前記試料添加手段が、ハイブリダイゼーシ
ョンプローブを油相と共に、水相の試料に添加してハイ
ブリダイゼーションプローブと試料とを接触させる試料
添加手段であることが好ましい。

【００９１】前記試料添加手段としては、一定量のハイ
ブリダイゼーションプローブを試料に添加する手段又は
一定量の試料をハイブリダイゼーションプローブに添加
する手段であれば特に制限はないが、前記ハイブリダイ
ゼーションプローブの量は、膜状に配向させることによ
り構造性発色を検出し易い量に設定することが好まし
い。

【００９２】前記ハイブリダイゼーションプローブが両
親媒性であることが、油相と水相との界面でプローブが
垂直配向して膜状となり、構造性発色による波長の変化
が測定し易い点で好ましい。

【００９３】前記第１の態様に係る標的核酸検査装置に
よれば、ハイブリダイゼーションプローブの標的核酸と
相補な塩基配列を有する核酸が標的核酸とハイブリダイ
ズすることにより、膜状に配向させたプローブの屈折率
又は長さが変化し、該プローブの構造性発色に基づく波
長変化を発色波長測定手段、例えば分光光度計で測定す
ることにより、特異的に標的核酸の存在の有無を検査す
ることができる。また、予め既知量の試料ＤＮＡを用い
て検量線を作成することにより、試料中の検出又は定量
すべきＤＮＡ濃度を検出又は定量することができる。

【００９４】本発明の第二の態様に係る標的核酸検査装
置は、前記本発明のハイブリダイゼーションプローブを
水晶発振子又は表面弾性波（ＳＡＷ）素子に膜状に付着
させてなるバイオセンサーと、該バイオセンサーに標的
核酸がハイブリダイズした際の質量変化又は粘弾性変化
を周波数として発振する発振回路と、該発振回路から発
振された前記振動の周波数を計測する周波数カウンター
とを備えたものである。

【００９５】この場合、ハイブリダイゼーションプロー
ブを水晶発振子又は表面弾性波（ＳＡＷ）素子に対し単
分子膜状に付着結合させるか、又は二分子膜状に付着結
合させることが好ましい。また、周波数カウンターとし
ては、水晶発振子又は表面弾性波（ＳＡＷ）素子からの
周波数を正確に測定できるものであれば特に限定されな
い。

【００９６】前記水晶発振子は、薄い水晶板の表面と裏
面とに金属電極を蒸着したものである。この水晶発振子
２０の一例を図７に示す。図７Ａが平面図、図７Ｂが正
面図である。水晶板２１の表面に電極１２が、裏面に電
極１４が蒸着されている。電極１２、１４からは左側に
電極が伸びており、その左端の部分を図示省略したクリ
ップ型のリード線を接続して、図示を省略している交流
電源に接続する。ここで、電極１２、１４の間に交流電
界を印加すると逆圧電効果により、水晶板２１は一定周
期の振動を発生する。

【００９７】前記水晶発振子２０の表面には図示を省略
しているが、ハイブリダイゼーションプローブ膜が付着
結合されている。このプローブ膜に標的核酸が吸着さ
れ、該吸着された標的核酸の質量だけ水晶発振子２０の
表面の質量が変化するため、共振周波数が変化する。

【００９８】ここで、厚み方向に垂直な平面に平行な振
動をする水晶発振子２０の表面に被覆したプローブ膜の
質量変化と共振周波数の変化量には、下記式（３）の関
係があり、質量変化を共振周波数の変化量で検出するこ
とができる。例えば、９ＭＨｚの共振周波数の振動子で
は（面積約０．５ｃｍ^２）１μｇの質量増加により、４
００Ｈｚの周波数低下を得ることができる。 ΔＦ＝−２．３×１０⁶（Ｆ²・ΔＷ／Ａ） （３） 但し、Ｆは水晶発振子の共振周波数（ＭＨｚ）を意味
し、ΔＦは質量変化による共振周波数の変化量（Ｈｚ）
を意味し、ΔＷは膜の質量変化（ｇ）を意味し、Ａは膜
の表面積（ｃｍ^２）を意味する。

【００９９】図８に標的核酸検査装置の一例を示す。水
晶発振子２０（表面にハイブリダイゼーションプローブ
１０が膜状に結合されている）は水晶発振子取付アーム
に取り付けられ恒温ヒートブロック２３中の溶液に浸さ
れている。恒温ヒートブロック２３は溶液の温度を一定
に保つためのものである。溶液は攪拌機（スターラー）
２４により攪拌される。また、サンプルインジェクショ
ン２５は溶液中に計測すべき試料を注入する。発振回路
２６は、水晶発振子２０の電極１２、１４に交流電界を
印加して水晶発振子２０を発振させる。発振回路２６の
発振周波数はカウンター２７によりカウントされ、コン
ピュータ２８により解析され、試料中の標的核酸の質量
が表示される。

【０１００】このように、ハイブリダイゼーションプロ
ーブの標的核酸と相補な塩基配列を有する核酸が標的核
酸とハイブリダイズすることにより、前記プローブの質
量が変化し、この質量変化を水晶発振子がとらえて周波
数に変換するので、この周波数変化を周波数カウンター
で測定することにより、特異的に標的核酸の存在の有無
を検査することができる。

【０１０１】また、予め既知量の試料ＤＮＡを用いて検
量線を作成することにより、試料中の検出又は定量すべ
きＤＮＡ濃度を検出又は定量することができる。

【０１０２】次に、前記表面弾性波（ＳＡＷ）素子と
は、固体の表面に一対の櫛形電極を設け、電気信号を表
面弾性波（固体表面を伝わる音波、超音波）に変換し
て、対向する電極まで伝達し、再び電気信号として出力
する素子であり、刺激に対応して特定の周波数の信号を
取り出すことができる。圧電効果を示すタンクル酸リチ
ウム、ニオブ酸リチウムなどの強誘電体や、水晶、酸化
亜鉛薄膜などが材料とされる。

【０１０３】前記ＳＡＷは、媒質の表面に沿って伝搬
し、媒質内部では指数関数的に減少する弾性波である。
ＳＡＷは伝搬エネルギーが媒質表面に集中するので、媒
質表面の変化を敏感に検出することができ、水晶発振子
と同様に表面の質量変化により、ＳＡＷ伝搬速度が変化
する。一般に、ＳＡＷ伝搬速度は発振回路を用いて発振
周波数の変化として測定されている。発振周波数の変化
は次式で与えられる。 Δｆ＝（ｋ₁ ＋ｋ₂）ｆ²ｈρ−ｋ₂ｆ²ｈ［（４μ／
Ｖ_r ²）（λ＋μ／λ＋２μ）］ 但し、ｋ₁ ，ｋ₂ は定数を意味し、ｈは固定化した膜の
厚さを意味し、ρは膜の密度を意味し、λ，μは膜のＬ
ａｍｅ定数を意味し、ＶｒはＳＡＷ伝搬速度を意味す
る。

【０１０４】図９は表面弾性波（ＳＡＷ）素子の要部構
成の一例を示す模式平面図である。この図９において、
このＳＡＷ素子センサ３０は、ＳＴカットの水晶製の共
振周波数９０ＭＨｚを持つＳＡＷ素子に、金電極３８と
その両端に櫛型電極３６、及び点線で示した表面波伝播
領域３７にハイブリダイゼーションプローブからなる膜
（図示せず）を形成してあり、各櫛型電極３６から高周
波増幅器３５を経て周波数カウンター３９に接続され、
試料中の標的核酸の質量が表示されるように構成されて
いる。

【０１０５】前記ハイブリダイゼーションプローブの標
的核酸と相補な塩基配列を有する核酸が標的核酸とハイ
ブリダイズすることにより、前記プローブの質量又は粘
弾性が変化し、この質量変化又は粘弾性変化を表面弾性
波（ＳＡＷ）素子がとらえ周波数に変換するので、この
周波数変化を周波数カウンターで測定することにより、
特異的に標的核酸の存在の有無を検査することができ
る。

【０１０６】また、予め既知量の試料ＤＮＡを用いて検
量線を作成することにより、試料中の検出又は定量すべ
きＤＮＡ濃度を検出又は定量することができる。

【０１０７】前記バイオセンサーを構成する水晶発振子
又は表面弾性波（ＳＡＷ）素子の電極上にハイブリダイ
ゼーションプローブを化学的に結合・固定する方法とし
ては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定すること
ができる。例えば、共有結合などの化学的結合により行
うことができる。

【０１０８】前記共有結合法としては、特に制限はな
く、上記ハイブリダイゼーションプローブにおける核酸
と棒状体との結合に用いたものと同じものを適宜選択し
て用いることができる。

【０１０９】具体的には、前記ハイブリダイゼーション
プローブの末端にチオール基を導入したものを合成し、
その溶液中に水晶発振子又は表面弾性波（ＳＡＷ）素子
を一定時間浸漬・反応させる。次いで該溶液からバイオ
センサーを取り出し、乾燥させる方法などが挙げられ
る。このチオール基としてはＳ−トリチル−３−メルカ
プトプロピルオキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノホスホルアミダイドなどが包含され、
該プローブの末端へのチオール基の導入はホスホルアミ
ダイド法により行うことができる。

【０１１０】＜標的核酸検査方法＞本発明の標的核酸検
査方法は、長さが８１０ｎｍ以下である棒状体と、該棒
状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸とを有
し、膜状に配向させることにより構造性発色を示し、か
つ、両親媒性であるハイブリダイゼーションプローブと
試料とを接触させる接触工程と、標的核酸にハイブリダ
イズした膜状ハイブリダイゼーションプローブの構造性
発色による波長の変化を測定する発色波長測定工程と、
を有する。

【０１１１】前記接触工程としては、特に制限はなく、
通常のハイブリダイゼーションと同じ条件及び方法で行
うことができる。

【０１１２】前記発色波長測定工程としては、膜状に配
向させたハイブリダイゼーションプローブが標的核酸と
ハイブリダイズした際の屈折率又は長さの変化による構
造性発色に基づく波長変化を測定することができる方法
であれば特に制限はなく、例えば分光光度計を用い波長
変化を測定する方法が挙げられる。

【０１１３】本発明の標的核酸検査方法によれば、前記
ハイブリダイゼーションプローブと標的核酸とがハイブ
リダイズした際の屈折率又は長さの変化による構造性発
色に基づく波長変化を測定することにより、標的核酸の
存在を迅速に、簡単な操作で確実に検出することができ
る。

【０１１４】

【実施例】以下、実施例を示し、本発明について更に具
体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるも
のではない。

【０１１５】〔実施例１〕ヒト正常染色体Ｋ−ｒａｓ遺
伝子と１塩基だけ異なる配列を有するＫ−ｒａｓ突然変
異配列を有するＤＮＡ鎖を、下記のヒト正常染色体Ｋ−
ｒａｓ遺伝子と１塩基のミスマッチを有する一対のプラ
イマーを用いて調製した。ｋ−ｒａｓ−５ｍ（変異塩基
を下線で示す） 配列番号：１ ５’−ＴＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＧＡＣ
ＣＴ−３’ｋ−ｒａｓ−３ 配列番号：２ ５’−ＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ−
３’

【０１１６】ヒト正常染色体Ｋ−ｒａｓ遺伝子１００ｎ
ｇをテンプレートとし、ビオチンを導入したＢｉｏ−ｋ
−ｒａｓ−５ｍ（１００ｎｇ）とビオチンを導入したＢ
ｉｏ−ｋ−ｒａｓ−３（１００ｎｇ）を一対のプライマ
ーとして用い、２００μＭのｄＮＴＰ存在下、１００μ
ｌの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０
ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．００１％ゼ
ラチン及び２ｕｎｉｔのＡｍｐｌｉ ｔａｑ^ＴＭＤＮＡ
ポリメラーゼを含む反応液中でＰＣＲ法により遺伝子増
幅反応を行った。ＰＣＲ法は、サーマルサイクラー（Ｔ
ｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ）ＰＪ２０００（パーキンエ
ルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製）を用い、９
４℃，３０秒、５６℃，３０秒のサイクルを３５回繰り
返した。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動によ
り分析し、そのサイズと増幅効率を測定した。

【０１１７】次に、ｎ−ヘキシルアミンを開始剤として
用い、Ｎ^ε−カルボベンゾキシ Ｌ−リジン Ｎ^α−カ
ルボキシ酸無水物（ＬＬＺ−ＮＣＡ）の重合を行い、続
けてγ−メチル Ｌ−グルタメート Ｎ−カルボキシ酸
無水物（ＭＬＧ−ＮＣＡ）の重合を行うことによりＰＬ
ＬＺ部の重合度が２０００、ＰＭＬＧ部の重合度が６０
０のブロックコポリペプチドＰＬＬＺ_２０００−ＰＭＬ
Ｇ_６００を調製した。その後、ＰＭＬＧセグメントを部
分的に加水分解してＬ−グルタミン酸（ＬＧＡ）とする
ことでα−ヘリックスコポリペプチドＰＬＬＺ_２５０−
Ｐ（ＭＬＧ_{４２ ０}／ＬＧＡ_１８０）を調製した。

【０１１８】このα−ヘリックスコポリペプチドにアビ
ジンを導入し、上記Ｋ−ｒａｓ突然変異配列を有するＤ
ＮＡ鎖のビオチンとを結合させてハイブリダイゼーショ
ンプローブを調製した。

【０１１９】次に、該ハイブリダイゼーションプローブ
を水面上（水相上）に浮かした状態（横に寝た状態）
で、該水（水相）のｐＨを１２程度のアルカリ性にす
る。すると、該プローブにおける親水性部が、そのα−
ヘリックス構造が解けてランダムな構造をとる。このと
き、該プローブにおける疎水性部はα−ヘリックス構造
を維持したままである。次に、該水（水相）のｐＨを５
程度の酸性にする。すると、該プローブにおける親水性
部が、再びα−ヘリックス構造をとるようになる。この
とき、該プローブに対し、該プローブに当接させた押圧
部材をその側面からエアーの圧力で押すと、該プローブ
は該水（水相）に対し立設した状態のままその親水性部
が水相中でその水面と略直交する方向に向かってα−ヘ
リックス構造をとるようになる。そして、上述したよう
に、該プローブを配向させた状態で押出部材を用いて基
板（板状体）上に押し出すことにより基板（板状体）上
に該プローブを立設させた単分子膜を形成することがで
きる。なお、この操作は、Ｌ−Ｂ膜形成装置（日本レー
ザー＆エレクトロニクス・ラボラトリー社製、ＮＬ−Ｌ
Ｂ４００ＮＫ−ＭＷＣ）を使用して行った。この単分子
膜の厚みを算出すると約１６ｎｍであった。

【０１２０】得られたハイブリダイゼーションプローブ
が単分子膜状に立設した基板を、ｃＤＮＡライブラリー
より調製したＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子を含む溶媒中に
配置し、構造性発色による波長変化を分光光度計を用い
て測定したところ、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子を含まな
い溶媒に添加した場合に比べて顕著な波長の変化が見ら
れた。

【０１２１】〔実施例２〕実施例１において、基板（板
状体）上にハイブリダイゼーションプローブが立設した
単分子膜を構造単位とし、これを２層積層することによ
り、ハイブリダイゼーションプローブが二分子膜状に立
設した基板を調製した。この基板に対し、ｃＤＮＡライ
ブラリーより調製したＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子を含む
溶媒中に配置し、構造性発色による波長変化を分光光度
計を用いて測定したところ、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子
を含まない溶媒に添加した場合に比べて顕著な波長の変
化が見られた。

【０１２２】〔実施例３〕水晶発振子（ＡＴカット、面
積０．５ｃｍ^２、基本周波数９ＭＨｚ）に面積０．２ｃ
ｍ^２の金電極及び金メッキを施したリード線を取り付け
たものを水晶発振子電極として用いた。

【０１２３】前記水晶発振子電極をアミノプロピルトリ
エトキシシラン（チッソ社製）を用い、この１体積％水
溶液に室温で１時間浸漬した後、純水中で２０ｋＨｚの
超音波を３０分間照射することによって洗浄し、余分な
アミノプロピルトリエトキシシランを除去した。次に、
水晶発振子電極を１１０℃の温度下で２０分間加熱処理
することによってアミノプロピルトリエトキシシランと
水晶発振子の表面との間に共有結合を形成させた。

【０１２４】次に、この水晶発振子を１体積％のグルタ
ールアルデヒド水溶液に１時間浸漬することにより、グ
ルタールアルデヒドとアミノプロピルトリエトキシシラ
ンとの間に共有結合を形成した後、水晶発振子を純水中
で２０ｋＨｚの超音波を３０分間照射することによって
洗浄し、余分なグルタールアルデヒドを除去した。

【０１２５】この水晶発振子電極を実施例１で作製した
ハイブリダイゼーションプローブを含む１００ｍｌのｐ
Ｈ７．２のリン酸緩衝液中に２時間浸漬した。これによ
りハイブリダイゼーションプローブがグルタールアルデ
ヒドを介して水晶発振子に固定された。未反応のプロー
ブは、ｐＨ７．２のリン酸緩衝液で洗浄することにより
除去した。

【０１２６】次に、作製した水晶発振子を図８に示した
標的核酸検査装置に取り付け、リン酸緩衝液にｃＤＮＡ
ライブラリーより調製したＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子を
含む溶媒を所定量添加し、１０分間の周波数変化量を調
べた。１分間以内に発振周波数の変化量がほぼ飽和にな
った。Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子を含む溶媒を添加した
ものは、添加しなかったものに比べて明らかな発振周波
数の低下が見られた。また、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子
の添加量を増加させると、発振周波数が一定の割合で減
少していくことが認められた。

【０１２７】〔実施例４〕実施例３において、水晶発振
子の代わりに図９に示したＳＴカットの発振周波数が１
０．３ＭＨｚの表面弾性波（ＳＡＷ）素子を用いた以外
は、実施例３と同様にして標的核酸検査装置を組み立て
た。

【０１２８】リン酸緩衝液にｃＤＮＡライブラリーより
調製したＫ−ｒａｓ突然変異遺伝子を含む溶媒を所定量
添加し、１０分間の発振周波数変化量を調べた。１分間
以内に発振周波数の変化量がほぼ飽和になった。Ｋ−ｒ
ａｓ突然変異遺伝子を含む溶媒を添加したものは、添加
しなかったものに比べて明らかな発振周波数の低下が認
められた。また、Ｋ−ｒａｓ突然変異遺伝子の添加量を
増加させると、発振周波数が一定の割合で減少していく
ことが認められた。

【０１２９】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
特殊技術を要することなく、短時間で、水相又は気相中
において、直接ＤＮＡハイブリッドの形成反応を測定し
得ると共に、ＤＮＡハイブリッドの形成を高精度にかつ
定量的にしかも簡便に検査することができる。

【０１３０】

【配列表】

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ <１１０>Ｆｕｊｉ Ｐｈｏｔｏ Ｆｉｌｍ Ｃｏ．，Ｌ
ｔｄ． <１２０>Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｅ ａ
ｎｄ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ｏｆ
ｔａｒｇｅｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ <１３０>ＦＦ００５−０２Ｐ <１５０>ＪＰ、２００１−０８６３０６ <１５１>２００１−０３−２３ <１６０>２ <２１０>１ <２１１>２４ <２１２>ＤＮＡ <２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ <２２０> <２２３>ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ <４００>１ tataaacttg tggtagttgg acct <２１０>２ <２１１>２１ <２１２>ＤＮＡ <２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ <２２０> <２２３>ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ <４００>１ tatcgtcaag gcactcttgc c

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の一実施例に係るハイブリダイ
ゼーションプローブの模式図である。

【図２】図２は、構造性発色の原理を説明する説明図で
ある。

【図３】図３は、同模式図である。

【図４】図４は、本発明の機能性分子による単分子膜の
形成を示す概略説明図である。

【図５】図５は、両親媒性の機能性分子が水（水相）上
で配向している状態の一例を示す概略説明図である。

【図６】図６は、両親媒性の機能性分子を水（水相）上
で立設させる方法の一例を示す概略説明図である。

【図７】図７は、水晶発振子の一例を示し、図７Ａは平
面図、図７Ｂは正面図である。

【図８】図８は、標的核酸検査装置の一例を示す概略図
である。

【図９】図９は、表面弾性波（ＳＡＷ）素子を示す模式
平面図である。

【符号の説明】 １ 棒状体 ２ 核酸 １０ ハイブリダイゼーションプローブ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９３ 33/543 ５９３ 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 BA80 CA04 CA05 GA30 HA14 4B029 AA07 BB20 CC08 FA15 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ43 QQ52 QQ58 QR32 QR35 QR55 QR84 QS25 QS34 QS39 QX04

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と
   特異的に結合する核酸とを有することを特徴とするハイ
   ブリダイゼーションプローブ。
2. 【請求項２】 核酸が、ＲＮＡ及び１本鎖ＤＮＡのいず
   れかである請求項１に記載のハイブリダイゼーションプ
   ローブ。
3. 【請求項３】 標的核酸が、原核生物にのみ存在する塩
   基配列の一部、真核生物（但し、ヒトを除く）にのみ存
   在する塩基配列の一部及びヒトにのみ存在する塩基配列
   の一部のいずれかから選択される請求項１又は２に記載
   のハイブリダイゼーションプローブ。
4. 【請求項４】 標的核酸が、癌関連遺伝子、遺伝病に関
   連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気の
   リスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子である
   請求項３に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
5. 【請求項５】 標的核酸が、該標的核酸と共に存在する
   核酸である請求項１から４のいずれかに記載のハイブリ
   ダイゼーションプローブ。
6. 【請求項６】 棒状体が、らせん状有機分子である請求
   項１から５のいずれかに記載のハイブリダイゼーション
   プローブ。
7. 【請求項７】 らせん状有機分子が、α−ヘリックス・
   ポリペプチド、ＤＮＡ及びアミロースのいずれかである
   請求項６に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
8. 【請求項８】 棒状体の長さが８１０ｎｍ以下である請
   求項１から７のいずれかに記載のハイブリダイゼーショ
   ンプローブ。
9. 【請求項９】 構造性発色を示す請求項８に記載のハイ
   ブリダイゼーションプローブ。
10. 【請求項１０】 両親媒性である請求項１から９のいず
    れかに記載のハイブリダイゼーションプローブ。
11. 【請求項１１】 長さが８１０ｎｍ以下である棒状体
    と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合する核酸
    とを有し、かつ、膜状に配向させることにより構造性発
    色を示すハイブリダイゼーションプローブと、ディッシ
    ュ、プレート及びチューブのいずれかと、を含む標的核
    酸検査キット。
12. 【請求項１２】 試料中の標的核酸を検出するための標
    的核酸検査装置であって、長さが８１０ｎｍ以下である
    棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合す
    る核酸とを有し、かつ、膜状に配向させることにより構
    造性発色を示すハイブリダイゼーションプローブと、該
    ハイブリダイゼーションプローブと前記試料とを接触さ
    せる試料添加手段と、標的核酸にハイブリダイズした膜
    状ハイブリダイゼーションプローブの構造性発色による
    波長の変化を測定する発色波長測定手段とを備えた標的
    核酸検査装置。
13. 【請求項１３】 前記ハイブリダイゼーションプローブ
    が、更に両親媒性であり、前記試料添加手段が、ハイブ
    リダイゼーションプローブを油相と共に、水相の試料に
    添加してハイブリダイゼーションプローブと試料とを接
    触させる試料添加手段である請求項１２に記載の標的核
    酸検査装置。
14. 【請求項１４】 棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸
    と特異的に結合する核酸とを有し、かつ、両親媒性であ
    るハイブリダイゼーションプローブを水晶発振子又は表
    面弾性波素子に膜状に付着結合させてなるバイオセンサ
    ーと、該バイオセンサーに標的核酸がハイブリダイズし
    た際の質量変化又は粘弾性変化を周波数として発振する
    発振回路と、該発振回路から発振された前記振動の周波
    数を計測する周波数カウンターとを備えた標的核酸検査
    装置。
15. 【請求項１５】 ハイブリダイゼーションプローブを水
    晶発振子又は表面弾性波素子に単分子膜状に付着させた
    請求項１４に記載の標的核酸検査装置。
16. 【請求項１６】 ハイブリダイゼーションプローブを水
    晶発振子又は表面弾性波素子に二分子膜状に付着させた
    請求項１４に記載の標的核酸検査装置。
17. 【請求項１７】 試料中の標的核酸を検出するための標
    的核酸検査方法であって、長さが８１０ｎｍ以下である
    棒状体と、該棒状体に結合し標的核酸と特異的に結合す
    る核酸とを有し、膜状に配向させることにより構造性発
    色を示し、かつ、両親媒性であるハイブリダイゼーショ
    ンプローブと試料とを接触させる接触工程と、標的核酸
    にハイブリダイズした膜状ハイブリダイゼーションプロ
    ーブの構造性発色による波長の変化を測定する発色波長
    測定工程と、を有する標的核酸検査方法。