KR20060058681A - 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 측정법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 공정의 분량측정에 관한 것으로, (ⅰ) 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭반응을 실행하는 단계와; (ⅱ) 분자가 공간적으로 한정된 위치에 위치되거나 비선형 또는 비형광기술을 수단으로 결정되되, 증폭반응 도중 또는 그 후에 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 결합되는 상기 분자와 증폭된 생성물을 접촉하는 단계 및; (ⅲ) 가해진 복사의 변화를 측정하여 분자와 증폭된 생성물 사이의 상호작용을 검출하는 단계;를 포함한다.

Description

폴리뉴클레오티드 증폭반응의 측정법{Measurement of a polynucleotide amplification reaction}
본 발명은 폴리뉴클레오티드 증폭반응을 감지하는 것이다.
증폭반응에 특정한 폴리뉴클레오티드를 다량으로 복제하는 기술은 일반적인 생물공학 공정에서 중요하게 여겨진다. 미국 특허출원 제US 4,683,202호로 공지된 폴리머라아제 효소 연쇄반응(polymerase chain reaction;이하 PCR)은 다량의 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해 폴리뉴클레오티드의 지수 증폭을 허용한다. 간단한 형태로, PCR은 다른 가닥을 하이브리드하고 표적(target) DNA에 관심영역에 측면에 위치하는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 특정한 DNA서열의 효소합성을 위한 방법이다. 템플릿 변성(template denaturation), 프라이머 결합 및 DNA 폴리머라아제 효소로 결합된 프라이머의 합성을 포함하는 반복적인 다수의 반응단계는 표적 폴리뉴클레오티드의 지수 축적을 이룬다.
PCR의 시작에서, 반응물은 초과되고 템플릿과 생성물은 충분히 낮은 농도상태로 생성변성이 프라이머결합을 완전하게 이루지 못하고 증폭반응은 일정한 지수 율로 진행한다.
대부분의 진단은 PCR을 사용하고 증폭생성물의 정량화에 의존하여 분석한다. 정확성과 정밀성을 위해, 시료가 증폭의 지수상태에 있는 지점에서 분량자료를 수집할 필요가 있다(지수상태는 복제결과를 제공하기에 중요하다). 증폭생성물의 시료를 채집하고 다른 상태에 있는 증폭된 생성물의 분량을 결정하는데 필요하기 때문에 증폭반응의 감지가 완벽하게 진단분석을 하는 데 걸리는 시간을 단축할 수 있다.
실시간 PCR은 매 증폭싸이클에 각 시료용 반응생성물을 분량화하는 공정을 자동화한다. 이러한 반응은 형광 리포터 분자의 검출 및 정량화에 의존하며, 이러한 신호는 반응에 증폭된 생성물의 양에 직접적으로 비례하여 증가한다.
현재 상업적으로 구매가능한 실시간 PCR장치는 특정한 형광분자에 의존하고 있다.
비록 실시간 PCR이 증가된 감도와 전형적인 (종말점) PCR에 도달하는 동적한계를 갖더라도, 본 시스템의 사용상에 다른 다수의 고유성을 갖는다. 단점은 우선적으로 실시간 PCR에 필요한 형광수치의 사용에 따른 기술과 이러한 수치가 사용될 방법 때문에 생긴다. 형광수치는 매우 화학적으로 안정화되야만 하고, 자극광선의 양에 기초로 하여 이들은 흡수할 수 있고 PCR공정에 필요한 온도를 견딜 수 있어야 한다. 그러므로, 이러한 공정에서 사용되는 염료는 제한적이고 다양한 가능성에 영향을 끼친다. 추가로, 형광을 기초로 한 종래의 시스템에서 다양한 성공을 위해서, 세트에 각 염료는 다른 염료에서 스펙트럼 분해되어야만 한다. 유기 형광염료용 전 형적인 방출밴드의 절반 너비는 대략 40~80 나모미터이고 사용가능한 스펙트럼의 폭은 자극공급원으로 제한되기 때문에 방출스펙트럼이 스펙트럼적으로 분해되는 염료의 수집을 찾기 어렵다. 각 염료의 형광신호는 충분히 세기 때문에 각 구성부재는 충분한 감도로 검출될 수 있다. 또한, 형광수치의 사용은 증폭된 생성물에 부착하는 탐지자(probe)로 사용되는 폴리뉴클레오티드 서열을 한정하되, 구아린 잔여물은 형광 공진에너지 전달공정에서 조질공(quencher)로서 작동하는 것으로 알려져 있고 그러므로 형광분자가 증폭된 생성물에 부착될는 위치에 즉각적으로 인접해 있는 서열을 선별할 때 보호가 실시되어야만 한다.
한정된 갯수의 형광분자가 사용되고 일반적인 단색에너지광(monochromatic energising light)의 사용은 다중의 실시간 PCR이 실행될 수 있는 정도를 한정하는바, 예컨대 이는 단일반응에서 증폭되고 검출된 다른 폴리뉴클레오티드의 갯수를 한정한다.
그러므로, 증폭공정을 감지할 수 있는 향상된 방법이 필요로 하게 된다. 특히, 자동화공정에서 매우 복잡한 반응을 실행하는 데에 사용되는 방법이 필요하다.
본 발명은, 증폭반응의 공정이 증폭된 생성물과 증폭된 생성물에 결합하거나 상호작용하는 분자 사이의 상호작용을 검출하도록 감지하는 것을 기초로 하며, 동일성은 비선형/비형광기술을 매개로 공간적으로 한정시키거나 결정된다.
본 발명의 제1양상에 따르면, 폴리뉴틀레오티드 증폭반응을 감지하는 방법은,
(ⅰ) 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭을 위한 반응을 실행하는 단계와;
(ⅱ) 증폭반응 도중에 또는 그 후에, 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 결합하는 분자를 증폭된 생성물과 접촉하는 단계, 상기 분자는 비선형 또는 비형광기술을 매개로 확인되거나 공간적으로 한정된 위치에 위치되며;
(ⅲ) 적용된 복사에서 변화를 측정하여 증폭된 생성물과 분자 사이의 상호작용을 검출하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 방법은 형광단에 대해 필요없이 실행될 수 있으므로 형광단의 사용과 병합된 단점을 극복한다. 선택가능하기로, 형광단이 사용되면, 복합체(multiplex)의 수치가 증가되어 공간적으로 한정된 위치에 위치된 폴리뉴클레오티드와 결합한 분자를 사용하여 성취될 수 있다. 덧붙여서, 본 발명의 방법은 실시간으로 실행될 수 있으며, 증폭공정 중에 시료를 획득할 필요가 없다. 증폭반응의 실시간 복합체 감지가 성취될 수 있다.
본 발명은 첨부도면을 참조로 하여 기술된다.
도 1은 PCR 바이오센서로 보정된 "벌크" 굴절지수의 개략도이다.
도 2는 상보 폴리뉴클레오티드의 연속적인 열"용융"과 하이브리드의 상보된 상보이동을 도시한 도면이다.
본 발명은 증폭된 폴리뉴클레오티드와 이 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 상호작용하는 분자 사이에 상호작용을 분석하는 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 공정을 감지하는 방법을 포함한다.
여기서 사용될 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 DNA와 RNA, 변형된 DNA와 RNA 뿐만 아니라 다른 하이브리드된 핵산과 같은 분자, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA)을 구비하고 광역적으로 해석된다. 올리고뉴클레오티드(olgonucleotide)라는 용어는 핵산 모노머의 짧은 서열로 이루어진 것이다.
본 발명은 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 이와는 달리 결합하는 분자의 사용에 의존한다. 분자는 특정방식 또는 비특정방식으로 폴리뉴클레오티드와 결합하는 임의의 분자를 의미한다. 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형태로 폴리뉴클레오티드와 상호작용한다. 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 분자는 당해분야의 숙련자들에게는 명백하게 알려져 있다. 한 실시예에서, 분자는 단백질로 되어 있고 DNA 또는 RNA와 결합한 단백질로 되어 있다. 적당한 단백질는 한 사이트를 갖는 특정한 폴리뉴클레오티드와 결합하는 도메인(domain)을 수용하여 변형된 유전자 재조합된 단백질일 것이다. 이러한 도메인은 당해기술에서는 널리 알려져 있으며, 던칸 등이 기술한 1994년 12월 Genes지의 8(4):465-80에 공지되었다. 폴리뉴클레오티드와 상호작용하고 본 발명의 범주 내에 있는 단백질의 실례는 헬리카제(helicase), 전사효소(trnascriptase), 시발효소(primase) 및 히스톤(histone)을 포함한다.
특히 바람직한 실시예에서, 분자는 증폭반응에 사용될 폴리머라아제 효소가 다. 따라서, 상호작용의 검출은 증폭반응공정과 동시에 실행된다.
이 실시예에서, 증폭반응용 프라이머가 식별된다. 바람직한 라벨은 라만산란라벨(예컨대, 미국 특허출원 제6,514,767호로 약술됨)를 구비하되, 이에 한정되지는 않는다. 선택가능한 라벨은 당해기술의 숙련자들에게 명백히 알려져 있다. 이러한 레벨은 유기 및 무기적인 형광염료, 예컨대 금속입자를 포함한다. 그러므로 이 실시예에서, 중합반응 중에 프라이머는 분자복합체의 형태 때문에 폴리머라아제 효소분자가 부착될 표면에 매우 인접하게 출현한다. 프라이머의 검출을 돕는 표면의 접근은 증폭된 반응에서 유발되어 송신된다. 이버네센트(Evanescent)분야의 사용에 필요한 기술이 본 발명의 바람직한 실시예이다. 라만산란의 경우에 있어서, 표면의 접근은 검출을 향상시킬 것이다.
이버네센트 분야의 자극기술은 표면에서 떨어진 분야의 지수적 붕괴 때문에 백그라운드 소음을 줄이는 장점을 제공한다.
라만 산란라벨이 사용될 때, 표면은 패턴화된 '자유전자' 금속표면으로, 국부적인 라만산란세기는 추가로 증가된다. 선택가능하기로, 금속층은 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance;이하 SPR)을 지지한다.
고정된 폴리머라아제 효소가 사용되는 전술된 실시예에서, '종래의' FRET를 기초로 한 실시간 PCR 라벨기술이 사용된다. 이러한 방식에서, 검출이 단순화되고 백그라운드가 줄어든다. 이러한 라벨개요는 상업적으로 구매가능한 핵산분해효소(nuclease)와 테크만방식(Taqman)을 구비한다. 다른 비FRET를 기초로 한 형광염료시스템은 본 발명의 범주 내에 있다.
추가적인 실시예에서, 분자는 증폭된 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부와 상호상보적인 서열( 또는 서열의 일부)을 갖는 단일가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 이 실시예에서, 이러한 다수의 폴리뉴클레오티드는 지지재료에 고정될 수 있고 고정된 폴리뉴클레오티드 상에 증폭된 폴리뉴클레오티드의 하이브리드가 하이브리드중에 발생하는 적용된 방사에 변화를 감지하여 감지될 수 있다. 서열은 증폭반응에 일부 중 하나 이거나 아닐수도 있다.
배열된 폴리뉴클레오티드는 당해분야의 숙련자들에 이미 널리 알려진 다양한 기술로서 기판(substrate)에 사용된다. 예컨대, 유전자표현을 위해 폴리뉴클레오티드를 만드는 시도가 일반적으로 사용될 수 있다.
2개의 유전자적 시도가 폴리뉴클레오티드 배열을 형성한다. 이는 사진석판방법과 "접촉"배열방법이다. 사진석판방법에서, 광화학적으로 제거할 수 있는 보호그룹으로 변형될 중합가교제는 실리콘표면에 부착된다. 빛은 사진석판마스크를 직접관통하여 표면의 특정부위에서 보호그룹을 제거한다. 그런 다음에, 표면은 4개의 하이드록실기로 보호된 데옥시뉴클레오티드 중 하나로 성장하고, 폴리뉴클레오티드 가닥과 연결되어 보호되지 않는다. 그런 다음에, 새로운 마스크가 사용되어 표면의 다른 부분이 비춰진다. 그런 다음에, 싸이클은 가닥이 바람직한 길이와 서열로 될 때까지 반복된다. "접촉"배열방법에서, 폴리뉴클레오티드는 바람직한 표면 상에 물리적으로 인쇄되되, 일반적으로 유리 현미경 슬라이드는 표면에 고정된 폴리뉴클레오티드를 만드는 poly-L-Lysine으로 코팅된다.
탐지자분자가 지지표면에 배열될 때, 공간위치는 종래의 표혐배열과 동일하 게 한정되어 사용된다. 그러므로, 분자는 지지부에 고정되는 단일분자로서 개별적으로 확인될 수 있거나 다른 유형의 분자가 지지부의 별도 영역에 위치된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 고정된 탐지자분자는 지지재료에 배열되고 증폭반응은 배열과 같은 동일한 용기에서 실행된다. 증폭된 생성물과 상보적 서열 사이의 하이브리드가 관심의 폴리뉴클레오티드의 농도에 대한 분량정보를 획득하기 위해 증폭반응(다시 말하자면, 연속적인 증폭반응 도중에 동일한 도온 사이)에 설정위치와 이외의 위치에서 감지된다. 실시예에서, 하이브리드의 감지를 위한 다수의 기술이 당해분야의 숙련자들에게 명백하게 사용된다. 예컨대, 삽입염료가 사용된다. 이러한 염료는 통상적으로 구전되어진, 이중의 인접한 한쌍의 베이스 사이에 위치된 이중가닥의 DNA 또는 RNA에 비공유되게 결합된 평편한 구조를 갖는 방향족 분자이다. 삽입형광염료는 일반적으로 용액에서 비형광성을 갖으며, 이중가닥의 폴리뉴클레오티드(예컨대 미국특허출원 제6,472,153호)와 결합할 때 형광된다. 그러므로, 송신된 형광모드에서, 본 발명은 상업적으로 구매가능한 다수의 염료와 폴리뉴클레오티드 하이브리드의 감지를 위한 염료시스템으로 성취된다. 삽입염료는 특히 저가로 구매가능하기 때문에 바람직한 실시예이다. 스펙트럼의 중복은 탐지자위치의 공간특성상 이 경우에 기술하지 않는다.
복합체에 공간적으로 한정된 시도의 로만식 실시예에서, 로만식 지지입자는 삽입분자와 결합한다. 바람직한 실시예에서, 삽입분자는 분자가교제를 매개로 로만식 지지입자와 공유되게 결합되어, 삽입분자가 이중가닥의 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성한다. 이러한 분자가교제는 당해분야의 숙련자들에게 명백해질 것이다.
추가적인 실시예에서, 고정된 탐지자분자와 증폭된 생성물 사이에 하이브리드의 검출은 전기전도성 또는 전기용량의 변화를 감지하여 실행된다. 배열위치에서 전기특성에 기초로 한 이러한 배열은 기술분야에서 출연되고 본 발명의 범주 내에 있다.
한 실시예에서, 분자는 증폭반응의 초기에 프라이머 분자와 같은 기능을 하는 짧은 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 실시예에 따르면, 원형의 표적 폴리뉴클레오티드 또는 증폭된 생성물은 발생하는 하이브리드에 적합한 상태로 프라이머 분자와 접촉시킨다. 프라이머 분자와 표적 사이의 상호작용은 증폭반응 전에 또는 도중에 감지될 수 있어서 분량측정이 이루어질 수 있다. 또한, 반응로 증폭된 생성물은 다른 "자유" 프라이머 분자와 하이브리드될 것이며, 그리하여 추가적인 증폭반응이 초기화된다. 이 실시예에서, 프라이머 합성이 프라이머와 같은 분자의 재사용을 방지하기 때문에 용액상태의 프라이머 분자가 상당히 초과된다.
또한, 고정된 올리고뉴클레오티드는 탐지자으로 사용되어 증폭된 생성물에 결합되며, 상호작용의 검출이 증폭반응공정처럼 실행된다.
표적 폴리뉴클레오티드(또는 증폭된 생성물)과 상호작용에 필요한 분자는 가해질 복사의 검출을 강화하는 라벨을 구비한다. 예컨대, 검출방법은 표면 전자기파(예컨대, SPR)를 사용하면, 플라즈몬-지지입자는 발생신호를 강화하는 분자에 부착된다. 적당한 입자는 금구체(gold sphere)(나노입자)를 포함한다.
라벨의 부착은 분자에 직접적인 공유부착 또는 간접부착을 매개로 한다. 예컨대, 증폭반응은 증폭된 생성물이 적당한 라벨과 병합되도록 실시된다. 이는 증폭 반응을 초기화하는 라벨화된 프라이머로 성취된다. 폴리뉴클레오티드의 부착용 기술은 당해분야의 숙련자들에게 명백하게 알려져 있다.
다수 유형의 분자가 사용되어 다중의 상호작용이 검출될 수 있다.
표적(또는 증폭생성물)과 상호작용하는 분자는 바람직하기로 지지재료에 고정된다. 검출은 고정된 위치에서 실시되게 하며, 이러한 검출기술에서는 검출신호를 발생하는 특정한 기판을 사용하는 것이 중요하다.
지지재료에 분자를 고정하는 기술은 당해분야의 숙련자들에게 널리 알려져 있다. 적합한 지지재료도 역시 알려져 있으며 적합한 재료의 선택은 특정한 기판에 필요한 복사의 변화를 감지하는 다양한 기술, 즉 검출기술에 종속된다. 예컨대, 로만식을 강화하기 위해서, 적당하게 거친 금, 은, 구리 또는 자유전자금속의 표면이 사용된다. 다른 기판이 로만활성도를 향상하는 지지표면을 포함한다. 이러한 활성도는 금속충돌입자, 절연성 기판에 금속필름 및 금속입자배열에서 관찰된다.
형광측정의 경우에 있어서, 다수의 기판이 형광체의 사용과 양립할지라도 유리 또는 실리콘 기판이 바람직하다. 플라즈몬을 지지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명에서 사용하기 위해, 금, 은 또는 다른 자유전자를 함유하는 기판들이 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
증폭된 생성물과 분자 사이의 상호작용의 검출은 가해질 복사의 변화를 측정하여 실행된다. 증폭된 생성물과 분자 사이의 상호작용으로 발생하는 복사의 변화측정은 종래의 장치를 사용하여 실행된다.
비선형 영상시스템(imaging system)은 당해분야에서 알려져 있다. 일반적으 로, 재료를 위한 비선형 분극은 다음과 같이 표현되되,
P = X(1)E1 + X(2)E2 + X(3)E3 + …
여기서, P는 유도분극이고, X(n)은 n차의 비선형 유전분극이며, E는 전기장 벡터이다. 제1용어는 빛의 일반적인 흡수와 반사를 기술하며; 제2용어는 제2고주파생성(SHG), 합과 상이한 주파수 생성이고, 제3용어는 광원의 산란, 로만식 공정, 제2고주파생성(TGH) 및, 2개와 3개의 광자 흡수를 기술한다.
본 발명의 바람직한 영상시스템은 제2 또는 제3고주파생성으로 야기하는 신호의 검출에 따른다.
제2 또는 제3고주파생성(여기서는 SHG로 언급됨)을 사용하는 단일분자용액해상도는 종래기술(페레그 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999;95;6700-6704와 페레그 외, Bioimaging, 1996;4:215-224)로 알려져 있다. 적당한 시스템은 국제특허출원 제WO 02/095070호로 기재되었다.
한 실시예에서, 검출은 라만산란 또는 LSPR기술을 사용하여 용액상태(예컨대, 분자가 고정되지 않음)에서 실행된다.
빛이 분자에서 검출될 때, 다량의 입사광자는 주파수의 변화없이 탄성적으로 산란된다. 이는 라이레히(Rayleigh)산란이라고 칭해진다. 그러나, 입사광자(광자 107 중 하나)의 에너지는 분자결합의 진동모드로 결합된다. 이러한 결합은 입사광선 의 영역과는 다른 주파수의 영역을 갖는 분자로 비탄성적으로 산란된 입사광선으로 야기된다. 이는 로만효과라고 칭해진다. 이러한 비탄성적으로 산란된 세기에 대한 광선의 주파수를 배치시켜, 관찰중에 있는 분자의 독특한 로만스펙트럼이 관찰된다. 알려지지 않은 시료의 로만스펙트럼의 분석은 시료의 분자조성에 대한 정보를 제공할 수 있다.
분광술이 현미경 구조에서 설치되면, 일반적으로 레이저로 제공되는 로만분광술을 위한 입사광원은 작은 점으로 농축될 수 있다. 로만스펙트럼이 레이저전원과 선형적으로 계량화되기 때문에, 시료에서 빛의 세기는 기계의 감도를 최적화시킬 수 있도록 매우 높아질 수 있다. 덧붙여서, 분자의 로만응답이 (중간상태의 높은 에너지 없이) 즉각적으로 발생하기 때문에, 심지어 높은 빛의 세기일지라도 활성분자인 로만의 광표백(photoblech)이 불가능해진다.
로만효과는 구조화된 금속표면에 근접하게(≤50Å) 로만 활성분자를 가져오도록 강화될 수 있으며, 이러한 분야는 표면에서 떨어져 지수적으로 붕괴된다. 금속표면에 근접하게 이끌려진 분자는 통상적으로 적당하게 거친 금, 은, 구리 또는 다른 자유전자 금속 상에 로마-활성분자의 흡착을 통해 성취된다. 로만활성도의 표면강화는 콜로이드입자, 절연기판에 금속필름과 금속입자 배열에서 관찰된다. 이 표면에서 강화된 라만산란이 발생되는 메카니즘은 잘 이해되지 않을 것이지만, (ⅰ) 빛의 국부적인 세기를 강화하는 금속에서 표면 플라즈몬 공명과; (ⅱ) 금속표면과 로만-활성표면 사이의 이송복합체의 변화의 형성과 연속적인 변이의 조합으로 결과를 갖는다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 표면 강화 라만산란(이하 SERS)은 단일 금 또는 은의 나노입자의 사용을 매개로 사용된다. 바람직한 실시예에서, 단일가닥의 폴리뉴클레오티드 탐지자가 단일 SERS의 나노입자와 결합된다. 로만활성분자와 결합되거나 병합되어진 로만강화금속의 나모입자는 광학표시로서 사용된다. 이러한 일반적인 개념은 미국 특허출원 제 6,514,767호로 약술되고, 그 내용은 참조로서 본 명세서와 병합된다. 한 실시예에서, 관심의 표적/탐지자가 단단한 지지부에 고정되면, 그런 다음에 단일 표적/탐지자 분자와 단일(예컨대, 증폭된) 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용은 로만활성분자의 독특한 로만스펙트럼을 조사함으로써 검출될 수 있다. 단일 로만스펙트럼(10~3500 cm-1)은 다른 많은 로만활성분자를 검출할 수 있기 때문에, 분자에 결합한 폴리뉴클레오티드와 결합되거나 병합된 SERS-활성나노입자는 복합된 배열형태를 갖는 본 발명의 내용에서 사용된다.
바람직한 실시예에서, 복사에 변화는 표면전자기파기술을 사용하여 감지된다.
표면전자기파기술와 결합된 바이오센서(및 특히 SPR-센서)는 표면전자기파를 증식하는 표면에 인접한 얇은 층의 굴절지수로 표면전자기파(surface electromagnetic wave;이하 SEW)의 감도를 기초로 한다. 바이오센서에서, 증폭된 생성물은 고정된 분자를 함유한 표면을 가로질러 흐르게 된다. 결합이 발생되므로써, 표면에 질량의 축적 또는 재분배는 센서를 통해 실시간으로 감지될 수 있는 국부적인 굴절지수를 변화한다.
SPR기술을 사용하는 다수의 방법들은 바이오센서로 제안되어 실현된다. 가장 유명한 방법은 크레취만-래더(Kretschmann-Raether) 구조를 기초로 하되, 센서로 굴절된 빛의 세기가 감지된다. 가장 민감한 중 하나로 평가되는 이 기술은 제이. 호모라(J. homola) 등이 센서와 액츄에이터 B 54,3~15쪽(1995년)에 기술되며 5×10-7 굴절지수유니트의 검출한계를 갖는다. 추가로, SPR측정상태변화는 하나 또는 2차의 크기로 센서의 감도를 증가시킬 수 있다. 이는 닐슨(Nelson) 등이 기술한 센서와 액츄에이터 B 35-36, 187쪽(1996년) 및 카바스킨(Kabashkin) 등이 광통신 150, 5쪽(1998년)으로 기재된다. Mach Zehnder 장치와 같은 종래의 간섭장치는 상변이를 매개로 센서표면에서 굴절지수에 변동을 측정할 수 있다. 이는 국제특허공보 제WO-A-0120295호로 공고된다. 이 구조는 4개의 독립부재를 필요하고 이러한 부재의 복위에 대한 미세파장(sub-wavelength)에 민감하여서 매우 작은 기계와 환경혼돈을 갖게 한다. 기계적으로 가장 견고한 간섭구조는 국제특허출원 제WO-A-03014715호로 약술된다.
바람직한 실시예에서, SEW센서시스템은 버퍼의 벌크굴절지수에 변화를 상보하거나 센서표면에 흡수된 분석에서 분리된 간섭패턴에 따른 벌크굴절지수에 따르도록 사용된다. 그러므로 바오이센서는,
입사파를 생성하는 결맞은 복사원(coherent radiation source)과;
기판에 고정되고 SEW를 지지할 수 있는 고정된 분자를 지지하는 캐리어표면;
SEW는 캐리어표면을 따라 증식되고 고정된 분자와 상호작용하기 위해, SEW에 입사파와 제1산란파를 산란하는 수단;
SEW로부터 제2산란파를 생성하는 수단 및;
제1산란파와 제2산란파 사이에 간섭을 감지하는 검출기;로 이루어진다.
실시예에서, 단색광 레이저로 생성된 결맞음 광학빔은 SEW를 지지할 수 있는 금속필름의 가장자리부 상에 렌지를 사용하여 촛점을 모은다. 광학빔은 금속필름이 장착된 유리프리즘을 관통하여 지나간다. 근적외선 레이저는 공급원으로 사용된다. 근적외선 공급원의 사용으로 금과 은에 표면 플라즈몬을 위한 긴 증식파의 장점을 갖으나, 종래의 광학장치는 영상과 광원으로 사용될 수 있다.
이는 도 1에서 개략적으로 도시된다. p-극성 근적외선 레이저빔(11)은 촛점렌즈(12)를 관통하여 지나간 다음에 유리프리즘(13)을 통과하는바, 마이크로 금속필름을 갖춘 기판(14)이 지수맞춤액체 또는 젤로 부착된다. 유리프리즘은 도시된 바와 같이 삼각형상의 프리즘 또는 반원통형상의 프리즘으로 되어 있다. 광원의 각도는 결합기판용액에 총 내부굴절의 각도보다 약간 크도록 선택된다. 레이저에 위해 비쳐지므로, 기판(14)은 산란파(15)와 부피파(17;volume wave)에서 연속적으로 산란되는 금속용액경계면을 따라 증식되는 SEW(16)을 발생한다. 이러한 파들은 액체셀을 관통하여 증식된 다음에 측정장치(18)에 간섭무늬패턴을 생성한다. 용액을 관통하여 증식되는 2개의 산란파 때문에, 벌크굴절지수는 실험상의 기하학적인 적당한 선택으로 상보된다.
금속구조는 금 또는 은, 또는 표면 플라즈몬을 지지할 수 있는 다른 금속, 이들의 조합 또는 SEW를 지지하는 절연성 다층으로 형성될 수 있다. 금 또는 금/은 다중층을 사용하여 표면 플라즈몬 증식길이를 증가시킨다. 금속구조는 석판공정을 사용하는 프리즘에 적층될 수 있다. 이러한 기술의 사용은 국제특허출원 제PCT/GB03/03803호로 기재되며, 그 내용은 본 명세서에 참조되어 병합된다.
증폭반응은 종래의 PCR 반응물과 상태를 사용하여 실행된다. 요약하자면, 표적 폴리뉴클레오티드는 폴리머라아제 효소, 필요한 프라이머 분자 및 다양한 핵산분자(염기)와 접촉하여, 표적 폴리뉴클레오티드에 모노머의 병합이 발생할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드에 상보하는 폴리뉴클레오티드는 그런 다음에 폴리머라아제 효소로 합성된다. 상보적 폴리뉴클레오티드가 합성된 후에, 실행된 반응온도가 증가되어 상보과 표적 사이에 하이브리드가 분리되고 분리가 발생된다. 그런 다음에, 표적와 상보는 추가적인 증폭을 위한 기판으로 사용된다.
증폭반응과, 분자와 임의의 증폭된 생성물 사이에 결합/상호작용의 검출은 예를 들자면 증폭과 검출이 동시에 발생하는 "실시간"과 동일한 반응용기에서 실시되는 경향이 있다. 증폭반응이 처리되면서, 증폭된 생성물의 양이 측정될 수 있다. 그러므로, 증폭된 생성물의 확인은 전체 또는 실제적인 PCR 열싸이클의 전체 도중에 실행될 수 있다. 증폭된 생성물의 확인으로, 허위 백그라운드 측정이 줄어들거거나 배제될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 중합반응은 밀봉된 마이크로 유체셀 내에서 실행된다. 반응물은 주입 및 배출밸브를 폐쇄하여 밀봉한 다음에 유체셀 내부로 주입된다. 바람직한 실시예에서, 일체형 펌프는 폐쇄형 셀에 반응물/PCR 유체흐름을 유지하기 위해 병합되므로, 증폭된 생성물의 검출을 위해서 검출면에 확산을 증가시킨다. 반 응혼합물은 고정된 분자로 흐르게 되어 증폭된 생성물은 분자와 상호작용할 수 있고 상호작용의 검출과 증폭된 생성물의 계량을 허용한다. 증폭반응이 처리되므로, 증폭된 생성물의 증가량은 추가로 고정된 분자와 상호작용할 것이며, 검출된 신호에 증가를 발생한다. 신호의 검출은 분량화될 증폭반응을 허용한다.
복합반응은 증폭생성물 중 하나와 상호작용하는 공간적으로 특정한 분자와 병합되어 실행된다. 예컨대, DNA결합 단백질은 다른 폴리뉴클레오티드결합 도메인을 수용하여 사용된다. 그러므로, 다른 결합단백질과 상호작용을 기초로 하는 증폭생성물을 구별할 수 있다. 선택가능하기로, 폴리뉴클레오티드는 결합분자로서 사용되면, 이들은 구조화될 수 있어서 다른 서열의 영역이 한정된 위치에 존재하게 되어 감지된 특정한 상호작용을 허용한다.
이러한 상호작용은 증폭사이클에 한 특정한 지점에서 측정되며 연속사이클(열순환반응의 경우에 동일한 온도)에 지점과 비교된다. 특히 바람직한 실시예에서, 상호작용 데이타는 전반적인 열사이클과 획득된 "용융"선으로 획득된다. 이 경우에서, 폴리뉴클레오티드는 탐지자분자로서 사용되며, 이러한 선은 공유하이브리드된 듀플렉스 사이를 더욱 효과적으로 분리하고 서열 상동(homolgy)의 영역보다 작게 수용하는 "허위"양서열 때문에 특정한 장점을 갖는다.
여기서 참조된 각 공보의 내용들은 참조되어 병합된다.
다음의 실례는 본 발명에 도시된다.
실례
50 나모미터의 두께와 70 마이크로 폭을 갖는 금의 마이크로구조는 국제특허출원 제PCT/GB03/03803호로 약술되고 석판인쇄술로 제작된다. 그럼 다음에, 칩은 아세톤에서 초음파처리되어 세정되고 약 20분 정도 오존세척기 안에 배치된다. 그런 다음에, 칩은 시스템(도 1)에 조립되고 자극 레이저가 마이크로구조의 안내가장자리에 촛점을 맞춘다. 그런 다음에, 레이저 점이 조정되어 최적의 벌크굴절지수상보가 성취된다(CCD카메라로 형성된 간섭패턴을 판독). 조립된 센서는 마이크로 유체셀을 구비하며, 시료를 센서칩의 표면 위로 주입되게 한다.
티올화된 올리고(thiolated oligo)는 HPLC정화 후에 QIAgen(5'-[ThiSS] TAAAACGACGGCCAGTGC-3')에서 획득된다. 5×세트버퍼에 티올화된 올리고의 1μM 용액이 20㎕ 시간-1의 흐름속도로 유체셀에서 밤새 배양된다. 그 다음날, 셀은 10분 동안 5×세트, 60분 동안 0.1% SDS, 5×세트, 10분 동안의 5×세트와, 60분 동안에 0.1%의 mercaptohexanol(메르캅토헥사놀), 5×세트로 5㎕ 분-1의 흐름속도로 세척된다. 유체셀은 5㎕ 분-1에서 2×세트의 흐름과 평행되고 20℃로 유지된다.
2×세트에서 상보DNA(5'-GCACTGGCCGTCGTTTA) 1μM이 5㎕ 분-1에서 흐름으로 주입된다. 센서표면위에 고정된 탐지자를 갖춘 상보서열의 결합은 간섭시스템으로 검출된다. 유체셀이 30초 동안 가열되면(50℃의 열전자쌍 온도), 이중가닥으로 된 DNA는 분리되고 바탕선은 예전 수준으로 복귀한다. 1mM NaNO2(아질산나트륨)이 흐름에 주입되고 센서표면에서 타올화된 올리고를 제거하며 상호변이를 줄인다. 그러므 로, 실험은 폴리뉴클레오티드 결합의 라벨자유 표면 플라즈몬 공명감지를 지배하고 온도의 기능과 가이 고정된 탐지자분자를 분해한다. 이는 실시간 PCR의 상황을 사용한다.

Claims (8)

  1. (ⅰ) 표적 폴리뉴클레오티드(target polynucleotide)의 증폭반응을 실행하는 단계와;
    (ⅱ) 분자가 공간적으로 한정된 위치에 위치되거나 비선형 또는 비형광기술을 수단으로 결정되되, 증폭반응 도중 또는 그 후에 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 결합되는 상기 분자와 증폭된 생성물을 접촉하는 단계 및;
    (ⅲ) 가해진 복사의 변화를 측정하여 분자와 증폭된 생성물 사이의 상호작용을 검출하는 단계;를 포함하는 폴리뉴클레오티디 증폭반응의 감지방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 분자는 지지재료에 고정되는 폴리뉴클레오티디 증폭반응의 감지방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분자는 폴리머라아제 효소(polymerase enzyme)로 된 폴리뉴클레오티디 증폭반응의 감지방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분자는 폴리뉴클레오티드이며, 이의 적어도 일부는 증폭된 생성물에 영역에서 상보되는 폴리뉴클레오티디 증폭반응의 감지방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분자는 증폭반응을 위한 프라이머(primer)로 작용하는 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 감지방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (ⅲ) 검출단계는 표면 전자기파에 가해지고 파의 변화를 감지하여 실행되는 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 감지방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 검출은 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 변화를 감지하여 실행되는 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 감지방법.
  8. 폴리뉴클레오티드와 상호작용하거나 결합될 수 있는 고정된 다수의 분자를 갖춘 지지소재와 적용된 복사의 변화를 검출하는 수단으로 이루어진 폴리뉴클레오티드 증폭반응의 감지장치.
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