CN1890380A - 多核苷酸扩增反应的测量 - Google Patents

Abstract

多核苷酸扩增反应过程的定量测量方法，包括如下步骤：(i)进行扩增靶多核苷酸的反应；(ii)扩增反应进行之中或之后，将扩增产物与可与多核苷酸结合或相互作用的分子接触，所述分子位于空间上确定的位置，或通过非线性或非荧光技术鉴别；(iii)通过测量辐射的变化来检测扩增产物和所述分子之间的相互作用。

Description

多核苷酸扩增反应的测量

技术领域

本发明涉及监测多核苷酸扩增反应。

背景技术

扩增反应能够产生特定多核苷酸的多个拷贝，这在许多常规生物技术方法中非常重要。如US 4,683,202所公开的聚合酶链反应(PCR)可使多核苷酸指数扩增，以获得大量多核苷酸。最简单地说，PCR是使用可与靶DNA的相对链杂交且定位于所研究区域两侧的两段寡核苷酸引物，体外酶促合成特定DNA序列的方法。重复模板变性、引物退火和DNA聚合酶作用下退火引物延伸这一系列反应步骤，导致靶多核苷酸指数增加。

PCR反应初始，反应物过量，模板和产物浓度很低，产物变性不会与引物结合相竞争，扩增反应以恒定的指数速率进行。

有许多诊断实验需利用PCR并且需要对扩增产物进行定量。为准确和精确起见，需要收集当样本处于指数扩增阶段时的定量数据(这一点很重要，因为只有指数阶段提供可重复结果)。这一监测扩增反应的需要使得完成诊断实验的时间变长，因为需要在不同的时间阶段，对扩增产物进行取样，并测定扩增产物的存在量。

实时PCR通过在每一扩增循环中对各样本反应产物进行定量，从而将这一过程自动化。该反应依靠对荧光报告分子进行检测和定量实现，该荧光报告分子的信号与反应中扩增产物的量成正比增加。

现有许多使用特定荧光分子的市售实时PCR试剂盒。

尽管相对于常规(终点)PCR来说，实时PCR的灵敏度和动态范围大大增加，但使用该系统时仍有许多固有困难。这些缺点主要是实时PCR技术必需的荧光标记和/或这些标记的使用方式所致。荧光标记必须具有高度的化学稳定性，这既指它们能够吸收的激发光的量，也指它们能够经受PCR方法所需的温度。因此，这种方法中可用的染料数目有限，影响了多重扩增的最大项目数。而且，在现有基于荧光的系统中，为了成功进行多重扩增，组中的每一种染料必须在光谱上与其他染料分辨开来。很难找到其发射光谱在光谱上可以分辨的一组染料，这是因为有机荧光染料通常发射谱带半宽约为40～80纳米，可用光谱的宽度受到激发光源的限制。同时，每种染料的荧光信号必须足够强，以使每种组分以足够高的灵敏度被检测。使用荧光标记还限制了一些多核苷酸序列用作附着于扩增产物的探针，这是由于已知鸟嘌呤残基可作为荧光共振能量传递过程的猝灭剂，因而在选择与荧光分子结合扩增产物的位置直接相邻的序列时，必须小心谨慎。

可用的荧光分子种类有限，而且通常使用单色激励光源，这些还限制了多重实时PCR可进行的程度，即，限制了单个反应中可扩增和检测的不同多核苷酸的数目。

因而需要一种监测扩增过程的改进的方法。具体地说，需要一种可用来在自动化过程中进行高度多重反应的方法。

发明内容

本发明基于认识到可通过检测扩增产物和一种分子之间的相互作用来监测扩增反应过程，所述分子可与扩增产物相互作用或结合，且其身份可从空间位置上确定和/或通过非线性/非荧光技术确定。

根据本发明的第一方面，监测多核苷酸扩增反应的方法包括如下步骤：

(i)进行扩增靶多核苷酸的反应；

(ii)扩增反应进行之中或之后，将扩增产物与可与多核苷酸结合或相互作用的分子接触，所述分子位于空间上确定的位置，或通过非线性或非荧光技术鉴别；

(iii)通过测量施加的辐射(applied radiation)的变化来测定扩增产物和所述分子之间的相互作用。

本发明方法无需荧光团即可进行，因而克服了使用荧光团带来的缺点。另外，如果使用荧光团，可通过使用位于空间上确定位置的多核苷酸结合性分子实现多重水平的提高。而且，本发明方法可在实时系统中进行，扩增过程中无需取样。因而可实现对扩增反应的实时多重监测。

附图说明

本发明参照附图叙述，其中：

图1是“整体”折射率补偿的SPR生物传感器示意图；

图2显示互补多核苷酸的杂交和随后的热“解链”过程中的补偿关联位移(correlation shift)。

具体实施方式

本发明提供了一种监测多核苷酸扩增反应过程的方法，包括分析扩增的多核苷酸和一种分子之间的相互作用，所述分子可与多核苷酸相互作用或结合。

本文所用术语“多核苷酸”应从广义上解释，它包括DNA和RNA，包括修饰的DNA和RNA，以及其他杂合的核酸样分子，如肽核酸(PNA)。该术语涵盖了包括核酸单体短序列在内的寡核苷酸。

本发明需要使用可与多核苷酸结合或以其他方式与多核苷酸相互作用的分子。该分子可以是与多核苷酸特异性或非特异性结合的任何分子。该分子可与双链或单链形式的多核苷酸相互作用。对本领域技术人员来说，与多核苷酸相互作用的分子是显而易见的。在一个实施方案中，该分子为蛋白，可以是DNA或RNA结合蛋白。适合的蛋白可以是重组蛋白，其经过修饰含有位点特异性多核苷酸结合区域。这类区域在本领域已为公知，公开于Duncan等，Genes Dev.，1994；8(4)：465-80。可与多核苷酸相互作用因而涵盖于本发明范围之内的蛋白的实例包括：螺旋酶(helicase)、转录酶、引发酶和组蛋白。

在一个特别优选的实施方案中，所述分子是用于扩增反应的聚合酶。因此，可在扩增反应进行的同时检测所述的相互作用。

在该实施方案中，扩增反应的引物可以被标记。优选的标记包括但不限于拉曼散射标记(Raman scattering label，即美国专利6,514,767中所述)。其他标记对本领域技术人员来说是显而易见的。这些标记包括有机和非有机荧光染料，如金属粒子。因而在该实施方案中，由于形成分子复合物，在聚合反应过程中，引物被带到聚合酶分子附着的表面附近。邻近表面使得可以检测参与扩增反应的引物，并且可以读数。包括渐消失区(Evanescent field)应用的技术为本发明优选的实施方案。在拉曼散射的情况下，邻近表面可增强检测能力。

应用渐消失区激发技术，由于远离表面的该区的指数衰减，因而可提供背景噪音减少的优点。

当采用拉曼散射标记时，表面可以是模式化的“自由电子”金属表面，可使局部拉曼散射强度进一步增大。或者，金属层可为任何支持表面等离子共振(SPR)的金属层。

在一个使用固定聚合酶的预知实施方案中，采用“常规的”基于FRET的实时PCR标记技术。用这种方法可简化检测，减小背景。该标记方案包括市售的核酸酶和Taqman实验。其他基于非FRET的荧光染料系统也涵盖在本发明的范围内。

在另一个实施方案中，所述分子为单链多核苷酸，其具有与扩增的多核苷酸的至少一部分互补的序列(或序列的一部分)。在该实施方案中，多个此类多核苷酸固定于支持材料上，然后通过监测杂交时发生的施加的辐射的变化来监测扩增的多核苷酸与固定的多核苷酸之间的杂交。该序列可以是或不是参与扩增反应的序列。

阵列排布的多核苷酸可通过多种本领域技术人员已知的技术应用于基质。例如，制备基因表达的多核苷酸阵列的方法一般而言是可用的。

有两种制备多核苷酸阵列的常用方法。它们是光刻法(photolithographic method)和“接触”阵列法(”contact”arrayingmethod)。在光刻法中，将使用可通过光化学去除的保护性基团修饰的合成接头附着于硅表面。通过光刻蒙板照射，除去表面特定部分的保护性基团。然后将表面与四种羟基保护的脱氧核苷酸之一培育，其与去掉保护的多核苷酸链发生偶联。然后使用新蒙版，以照射表面的不同部分。然后重复这个循环，直至链成为所需长度和序列。在“接触”阵列法中，多核苷酸以物理方式印至目标表面上，目标表面通常为用聚l-赖氨酸涂布的玻璃显微镜玻片，以使多核苷酸附着于该表面。

同常规表达阵列一样，当探针分子以阵列排布于支持表面时，其空间位置可用于确定其身份。因此，所述分子可以是固定于支持物的单一分子，以使它们可以被逐个识别，或者不同类型的分子位于支持物的不同区域。

在本发明优选的实施方案中，固定探针分子以阵列排布于支持材料上，扩增反应在与阵列同一个封闭容器内进行。然后，在扩增反应的整个过程或预设点(即在连续扩增循环的相同温度之间)监测扩增产物和互补序列之间的杂交，以获得所研究的多核苷酸浓度的定量信息。在该实施方案中，可应用多种杂交检测技术，它们对于本领域技术人员是显而易见的。例如，可以使用嵌入染料。这些染料通常为矛状、扁平的芳香族分子，它们可将自身置于双螺旋相邻的碱基对之间从而非共价结合于双链DNA或RNA。嵌入荧光染料通常在溶液中不产生荧光，当与双链多核苷酸结合时才产生荧光(如美国专利6,472,153)。这样，在荧光模式读数中，本发明可使用多种市售染料和染料系统对多核苷酸杂交进行检测。嵌入染料成本低，可用性好，是特别优选的实施方案。由于探针位置在空间上分开，这种情况下光谱重叠不再是问题。

在使用空间确定方法以实现多重扩增的拉曼实施方案中，支持拉曼的粒子结合于嵌入分子。在优选的实施方案中，嵌入分子通过接头分子共价连接于支持拉曼的粒子上，以使嵌入分子仍然与双链多核苷酸形成复合物。这些接头分子对本领域技术人员来说是显而易见的。

在另一个实施方案中，通过监测电导和/或电容的变化来检测固定的探针分子与扩增产物之间的杂交。这种基于阵列位置的电气特性的阵列在最新技术中已经存在，并且涵盖于本发明的范围之内。

在一个实施方案中，所述分子是用作引物分子以促进扩增反应起始的短多核苷酸。根据本实施方案，在适合发生杂交的条件下，使最初的靶多核苷酸或扩增产物与引物分子接触。可以在扩增反应之前或之中监测引物分子和靶标的相互作用，以进行定量测定。从反应扩增的产物还会与其他“游离”引物分子杂交，因而会继续引发扩增反应。在该实施方案中，由于引物延伸会使该分子不能重新用作引物，溶液相引物分子应该大大过量。

固定的寡核苷酸还可用作探针以结合扩增产物，在扩增反应进行中检测相互作用。

与靶多核苷酸(或扩增产物)相互作用所需的分子可包括标记，这样可增强施加的辐射的检测能力。例如，如果检测方法是基于使用表面电磁波(如SPR)，可将支持等离振子(plasmon)的粒子附着于分子上以增强产生的信号。适合的粒子包括金珠(gold sphere)(纳米粒子)。

可通过直接共价附着于分子或间接附着的方式附着标记。例如，进行扩增反应时，可使扩增产物引入适当的标记。这可通过使用标记的引物来引发扩增反应来实现。将标记附着于多核苷酸的技术对本领域技术人员是显而易见的。

通常可使用多种类型的分子，以便检测多个相互作用。

与靶标(或扩增产物)相互作用的分子优选固定于支持材料上。这样使得检测在固定位置进行，这对于使用特殊基质产生可检测信号的检测技术来说非常重要。

将分子固定于支持材料的技术已为本领域技术人员所知。适合的支持材料也已知，可根据检测技术选择适合的支持材料，这是由于许多监测辐射变化的技术需要特殊的基质。例如，在拉曼增强的情况下，可以采用适当粗糙的金、银、铜或其他自由电子金属表面。其他此类基质包括支持拉曼活性表面增强的基质。这种活性可在金属胶体粒子、电介质基质上的金属膜，以及金属粒子阵列中观察到。

在荧光测量的情况下，尽管大量基质与荧光的使用相兼容，但优选玻璃或硅基质。当使用表面等离子共振时，能够支持等离振子的金、银或其他含自由电子的基质已考虑在本发明的范围之中。

通过测量施加的辐射的变化对扩增产物和分子之间的相互作用进行检测。可使用常规设备测量扩增产物和分子相互作用时发生的辐射变化。

非线性成像系统为本领域所公知。一般地，物质的非线性极化可表示为：

       P＝X⁽¹⁾E¹+X⁽²⁾E²+X⁽³⁾E³+......

其中，P为诱导极化，X⁽ⁿ⁾为n阶非线性极化率(susceptibility)，E为电场矢量。第一项描述光的正常吸收和反射；第二项描述二次谐波发生(SHG)、和频及差频发生；第三项描述光散射、受激拉曼过程、三次谐波发生(THG)以及二光子和三光子吸收。

本发明优选的成像系统依靠检测起因于二次或三次谐波发生的信号。

使用二次或三次谐波发生(以下称SHG)的单分子解析已为本领域所公知(Peleg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999；95：6700-6704和Peleg等，Bioimaging，1996；4：215-224)。适当的系统记载于WO02/095070。

在一个实施方案中，使用拉曼散射和/或LSPR技术在溶液相(即未将分子固定)中进行检测。

当光线照射于分子时，大量入射光子被弹性散射，而频率不发生变化。这叫做瑞利散射(Rayleigh scattering)。然而，一些入射光子(大约每10⁷个光子中有1个)的能量与分子键的不同振动模式发生偶联。这种偶联导致一些入射光线被分子非弹性散射，散射光线的频率范围与入射光线的频率范围不同。这叫做拉曼效应。作出这种非弹性散射光线频率对强度的曲线，就可获得所研究分子的独特拉曼光谱。分析未知样本的拉曼光谱可获得样本的分子组成信息。

如果拉曼光谱仪内置于显微镜构造之中，拉曼光谱法所用的入射光(一般由激光提供)可会聚于一个小点。由于拉曼光谱随激光功率呈线性变化，可使用高强度光照射样本，以提供最佳的仪器灵敏度。而且，因为分子的拉曼响应基本在瞬间发生(没有长时间存在的高能中间态)，所以即使使用高强度光，也不可能发生拉曼活性分子的光漂白。

通过将拉曼活性分子置于结构金属表面附近(≤50)，拉曼效应可显著增强，与表面距离增加该效应场(filed)呈指数衰减。将分子带到金属表面邻近一般通过将拉曼活性分子吸附至适当粗糙的金、银、铜或其他自由电子金属来实现。拉曼活性的表面增强可在金属胶体粒子、电介质基质上的金属膜，以及金属粒子阵列中观察到。不很清楚发生表面增强的拉曼散射机制，但被认为由以下因素相结合而产生：(i)金属的表面等离子共振，可增强局部光密度；(ii)在金属表面和拉曼活性分子之间形成导电复合物并随后跃迁。

在本发明优选的实施方案中，通过使用单一金或银纳米粒子来使用表面增强拉曼散射(SERS)。在优选的实施方案中，单链多核苷酸探针结合于单一SERS纳米粒子。关联于或结合于拉曼活性分子的拉曼增强金属纳米粒子可用作光标记。其一般概念在美国专利6,514,767中记载，其内容通过援引的方式纳入本文。在一个实施方案中，如果所研究的靶标/探针固定于固体支持物上，单个靶标/探针分子和单个(即扩增的)多核苷酸之间的相互作用可通过搜索拉曼活性分子的特征拉曼光谱检测。因为单个拉曼光谱(从100至3500cm-1)可检测许多不同的拉曼活性分子，结合于或关联于多核苷酸结合分子的SERS活性纳米粒子可以多重检测方式用于本发明环境中。

在优选的实施方案中，通过使用表面电磁波技术监测辐射变化。

使用表面电磁波技术的生物传感器(特别是表面等离子共振-SPR-传感器)是基于表面电磁波(SEW)对传播SEW的表面的邻近薄层的折射率的敏感性。在生物传感器中，使扩增产物流经含固定分子的表面。由于发生结合，表面上物质的积聚或重新分布会改变局部折射率，而折射率可由传感器实时监测。

已经提出几项利用SPR技术的方法并在生物传感器中实现。应用最广的方法基于Kretschmann-Raether构造，其可监测传感器反射的光强度。该技术被认为是最灵敏的技术之一，记载于J.Homola等，Sensors and Actuators B 54，p.3-15(1999)，其具有5×10^-7折射率单位的检测极限。测量SPR相变化可使传感器的灵敏度进一步提高一个或两个数量级。该技术记载于Nelson等，Sensors and Actuators B 35-36，p.187(1996)和Kabashkin等，Optics Communications 150，p.5(1998)。已对现有的干涉测量装置如Mach Zehnder干涉仪进行改造，使之可通过相改变测量传感器表面的折射率变化。该技术公开于国际专利申请WO-A-0120295。该装置需要四种独立组分，并且对这些组分的亚波长相对替换敏感，因此对微小的机械和环境微扰敏感。机械上更为牢固的单块干涉测量装置记载于WO-A-03014715。

在优选的实施方案中，所使用的表面电磁波(SEW)传感器系统能够补偿缓冲液整体折射率的改变，或者将整体折射率的影响转为干扰模式，从而使之与吸附于传感器表面的分析物的影响区分开来。因此，生物传感器包括：

相干辐射源，以产生入射波；

支持固定分子的载体表面，载体表面载有基质，能够支持表面电磁波(SEW)；

将入射波分为SEW和一次散射波的装置，其中SEW沿载体表面传播并与固定分子相互作用；

从SEW产生二次散射波的装置；以及

监测一次散射波和二次散射波之间干涉的检测器。

在该实施方案中，由单色激光产生的相干光束使用透镜来聚焦于能够支持表面电磁波(SEW)的金属膜边缘。光束透过安装有金属膜的玻璃棱镜。使用近红外激光作为光源。使用近红外光源的优点是金和银中的表面等离振子具有较长的传播长度，同时仍可使用常规光学器件来成像和照明。然而，其他单色光源也适合并且可以使用。

这在图1中进行了示意性显示。p-极化的近红外激光束11穿过聚焦透镜12，然后穿过玻璃棱镜13，玻璃棱镜13附着有带有显微装配(microfabricated)金属膜的基质14，还有折射率匹配的液体或凝胶。玻璃棱镜可为所示的三棱镜或半圆柱棱镜。所选照射角度比基质-溶液界面的全内反射角度略高。被激光照射后，结构14产生散射波15和SEW16，后者沿金属-溶液界面传播，并相继散射成体波17。这些波在液体槽中传播，并在测量装置18上产生干涉条纹图案。由于两列散射波都在溶液中传播，整体折射率的影响可通过适当地选择实验几何形状来补偿。

制备金属结构的材料可以是金或银，或其他任何支持表面等离振子的金属，或者它们的结合，或者支持SEW的多层电介质。优选使用金或金/银多层，以增大表面等离振子的传播长度。金属结构可使用石版印刷工艺沉积于棱镜上。该技术的修改记载于共同未决的国际专利申请PCT/GB03/03803，其内容通过援引的方式纳入本文。

扩增反应使用常规PCR试剂和条件进行。概括地说，将靶多核苷酸与聚合酶、必需的引物分子和各种核酸单体(碱基)接触，以便将单体引入靶多核苷酸上。然后通过聚合酶合成靶多核苷酸的互补多核苷酸。互补多核苷酸合成后，提高反应温度，以使互补链和靶标的杂交中断，发生离解。然后靶标和互补链在下一步扩增反应中用作基质。

扩增反应和检测分子与任何扩增产物之间的结合/相互作用预期在同一反应容器内进行，并且为“实时”进行，即扩增和检测同时进行。当扩增反应进行时，可测量扩增产物的量。因此，在PCR热循环的全部或基本全部过程中，可进行扩增产物的鉴定。由于鉴定只针对扩增产物，因此减少或避免了无意义的背景测量。

在优选的实施方案中，聚合酶反应在密封的微流量池中进行。将反应物加入流量池，关闭输入和输出阀使之密封。在优选的实施方案中，具有内置的水泵以维持密封池中反应/PCR流体的流动，这样可增强检测表面的漫射，更有利于检测扩增反应产物。使反应混合物流过固定的分子，以使扩增产物与分子相互作用，这就使得可以检测相互作用，进而对扩增过程进行定量。随着扩增反应的进行，更多的扩增产物与更多的固定分子相互作用，可导致检测信号的增强。检测该信号可对扩增反应进行定量。

可通过引入空间上分离的分子进行多重反应，所述分子与一种扩增产物特异性相互作用。例如，可以使用包含不同多核苷酸结合域的DNA结合蛋白。因而可根据与不同结合蛋白的相互作用来分辨扩增产物。或者，如果使用多核苷酸作为结合分子，可将它们设计成不同序列范围存在于特定位置，这样即可监测序列特异性相互作用。

该相互作用可在扩增循环的特定点测量，并在连续循环的相同点(即，热循环反应情况下的相同温度)进行比较。在特别优选的实施方案中，获得整个热循环的相互作用数据，由此获得“解链”曲线。在使用多核苷酸作为探针分子的情况下，由于这些曲线能够更有效地区分共价杂交的双螺旋与含小区域序列同源性的“错误”阳性序列，因而特别有用。

本文提及的每一出版物的内容，通过援引的方式纳入。

下述实施例举例说明本发明。

实施例

如共同未决的国际专利申请PCT/GB03/03803中所述，使用石版印刷工艺制造一个50纳米厚、70微米宽的金制微结构。然后将该基片在丙酮中超声清洁，并置于一个臭氧清洁器中约20分钟。然后，将基片组合到系统中(图1)，并将激发激光聚焦在微结构的前沿。而后校正激光斑点以获得最佳的整体折射率补偿(为了读数，在CCD相机上形成干涉图案)。组合传感器包括一个微流量池，以使样品注入到传感器基片的表面上。

QlAgen(5’-[ThiSS]TAAAACGACGGCCAGTGC-3’)经HPLC纯化后获得硫醇化寡核苷酸(thiolated oligo)。硫醇化寡核苷酸在5×SET缓冲液中的1μM溶液以20μl/小时的流速在微流量池中保温过夜。第二天，该池用5×SET以5μl/分钟的流速清洗10分钟，5×SET、0.1％SDS清洗60分钟，5×SET清洗10分钟，5×SET、0.1％巯基己醇清洗60分钟。该微流量池用2×SET以5μl/分钟平衡并置于20℃下。

在2×SET中1μM的互补DNA(5’-GCACTGGCCGTCGTTTTA)以5μl/分钟的流速注入到液流中。通过干涉测量系统检测互补序列与传感器表面的固定探针的结合。当液流池加热30秒钟时(到50℃的热偶温度)，双链DNA解链，基线返回到初始水平。将1mM NaNO₂注入到液流中，导致硫醇化寡核苷酸从传感器表面脱离，同时使关联位移减少。因此，该实验显示使用无标记的表面等离子共振监测在温度作用下的多核苷酸与固定探针分子之间的结合和解离。这在实时PCR条件下特别有用。

Claims (8)

1.一种监测多核苷酸扩增反应的方法，包括如下步骤：

(i)进行扩增靶多核苷酸的反应；

(ii)扩增反应进行之中或之后，将扩增产物与可与多核苷酸结合或相互作用的分子接触，所述分子位于空间上确定的位置，或通过非线性或非荧光技术鉴别；

(iii)通过测量施加的辐射的变化来检测扩增产物和所述分子之间的相互作用。

2.根据权利要求1的方法，其中所述分子固定于支持材料上。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述分子是聚合酶。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述分子是多核苷酸，所述多核苷酸的至少一部分与扩增产物上的区域互补。

5.根据权利要求4的方法，其中所述分子作为扩增反应的引物。

6.根据前述任一权利要求的方法，其中步骤(iii)中的检测通过应用表面电磁波并且监测波的变化来进行。

7.根据权利要求6的方法，其中所述检测通过测量表面等离子共振的变化进行。

8.一种监测多核苷酸扩增反应的装置，包括：支持材料，有多种分子固定于其上；能够与多核苷酸结合或相互作用的分子；和检测施加的辐射变化的装置。