CN102171368B - 在载体上固定化核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在载体上固定化核酸的方法，其包括提供带有仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸和通过光交联在载体上固定化所述核酸，其中，所述光交联在约300‑500nm的波长进行，优选在365nm的波长进行。本发明进一步涉及根据本发明固定化的核酸的分析方法，其包括固定化核酸与互补和错配片段的杂交。另外，本发明涉及通过本发明的方法可获得的固定化核酸，相应的固定化核酸在生产核酸阵列和诊断试剂盒中的应用，所述诊断试剂盒包含根据本发明固定化的核酸阵列。

Description

在载体上固定化核酸的方法

技术领域

本发明涉及在载体上固定化核酸的方法，其包括提供带有仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸以及通过光交联在载体上固定化所述核酸，其中所述光交联在波长约300-500nm，优选在波长365nm进行。

本发明进一步涉及根据本发明固定化的核酸的分析方法，其包括固定化核酸与包含互补片段的探针、包含单错配片段的探针、包含双错配片段的探针和/或包含携带更高数量错配片段的探针杂交，以及随后确定由固定化核酸和杂交探针形成的杂合体（hybrid）的解链点。

另外，本发明涉及通过本发明的方法获得的固定化核酸，相应的固定化核酸用于生产核酸阵列和诊断试剂盒的应用，所述诊断试剂盒包含根据本发明固定化的核酸阵列。

背景技术

在现代分子生物学和医学中，生物芯片或生物学微阵列，特别是DNA微阵列， 已经成为重要的工具。通常地，芯片由大量的核酸分子构成的显微点排列组成，每一个显微点包含小量的特异的核酸序列。这个可以是，例如，基因或其他DNA元件的短片段，在允许捕获探针和相应的靶标结合的情况下，该短片段被用于作为捕获探针以杂交cDNA 或 cRNA样品（靶标或靶探针）。捕获探针-靶标杂交通常通过荧光团标记靶标的基于荧光的检测来检测和定量，以确定核酸序列在靶标中的相对丰度。

微阵列技术由DNA印迹进化而来，在其中片段DNA附着在基片（substrate）上，然后用已知的基因或片段探测。1987年，首次描述了阵列上的独特DNA的集合用于表达谱，阵列DNA用于识别表达受到干扰素调节的基因。这些早期的基因阵列利用针点样装置，通过将cDNA点样到滤纸上来制作。小型化微阵列的应用，特别是在基因表达谱上的应用，在1990年首次被报道。在微阵列上的完整的真核基因组在1997年公布。

多种技术可以被用于制作这样的微阵列。这些技术包括用精细尖端的针点样(printing)，使用预制掩膜的光刻法，使用动态微镜装置的光刻法，喷墨点样(Lausted C等人，2004, Genome Biology 5: R58)或者电化学。

光刻技术通过直接在阵列表面合成序列，诉诸寡核苷酸阵列的生产。这种技术包括在硅基片上光刻合成，在基片上光和光敏掩膜剂被用于产生一条序列，每次通过全部阵列加一个核苷酸(Pease等人，1994, PNAS 91: 5022–5026)。每一条可用的探针在将阵列浸入单独一种核苷酸的溶液中之前选择性地去除掩膜，然后掩膜反应发生，下一套探针去除掩膜，为不同的核苷酸暴露做准备。几次重复之后，每条探针的序列完全构建。因此，构建的寡核苷酸可以较长（例如60-mers）或较短（例如25-mers），依赖于预期的目的。

在点样的微阵列中，寡核苷酸探针作为完整的序列被沉淀，即探针在沉淀到阵列表面前被合成，然后点样到基片上。通常的方法使用由机械臂控制的精细的针或针头构成的阵列，将其浸入含有DNA探针的孔中，然后在阵列表面上设定的位置沉淀每条探针，或者用喷墨点样装置，通过液滴喷射沉淀探针材料。产生的探针阵列代表了制备的捕获探针的核酸谱，并且可以与例如源自实验室和临床样品的互补的cDNA和cRNA靶探针相互作用。另外，这些阵列可以容易地为特别试验定制，因为探针和在阵列上的点样位置可以被特异地选择。

这些技术中的一些的关键是在载体或材料上有效地固定化核酸。在载体上固定化核酸的经典的方法是运用紫外光，即紫外交联。Church和Gilbert在1984年描述了运用波长为254nm的紫外光导致DNA片段固定化到尼龙滤膜上（Church和Gilbert， PNAS， 1984， 81，p: 1991-1995）。这种方法的高级版本是由Saiki 等人., PNAS, 1989, 86, p: 6230-6234提出的，其描述了当使用波长为254nm的紫外光时包含多聚脱氧胸腺嘧啶（poly(dT)）尾的寡核苷酸可以更容易地被固定到膜上。此效果归结于光激活的胸腺嘧啶碱基更有效的结合到膜上。

但是，用254nm附近的短波长紫外光照射核酸通常引起核酸分子严重的损伤，其可影响分子与互补序列杂交的能力并可因此危害它们在微阵列系统中的应用。特别是这样的照射可引起嘧啶二聚体的产生，由于在相邻的嘧啶之间建立了环丁环，特别是在相邻的胸腺嘧啶残基之间。进一步的影响可以是产生相邻的胸腺嘧啶和胞嘧啶残基间的联合，导致TC（6,4）产物。

因此，存在对一种替代的核酸固定化方法的需求，其允许在载体上有效地固定核酸并克服伴随着在254nm周围的传统紫外交联带来的对分子不利的损伤。

发明内容

本发明满足这种需求并提供手段和方法，其允许在这种固定过程中有效地固定化核酸并伴随地使核酸分子的损伤最小化。

以上目的由通过使用约300-500nm的较长波长在载体上固定化核酸的方法来完成，在交联过程中其降低核酸分子的损伤。具体地，此目的由包括提供带有仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸和通过光交联在载体上固定化所述核酸的方法来完成，其中所述光交联在约300-500nm的波长进行，优选在365nm的波长进行。

根据本发明的方法的优势之一是可以避免固定化过程中的低波长紫外照射的有害效果，同时核酸仍有效地被固定化在适当的载体材料或基片上。本发明人已发现核苷酸或者仅一种碱基类型的核苷酸段可以被固定化在载体材料上，这不仅通过在254nm波长的紫外交联，还可通过在大于300nm的更高的波长特别是在365nm的波长来进行。因为大于300nm波长的光比传统使用的短波长紫外线C照射每光子传递低得多的能量剂量，这样的长波长光通常被认为对核酸分子不引起或引起显著降低的损伤。这种效果显然与对嘧啶残基（特别是对胸腺嘧啶）照射的分子影响有关。因此，与传统的紫外交联方法相反（传统方法为了有效固定化而基于短波长紫外光主要对胸腺嘧啶的效果和被迫接受的处理的核酸分子的结构和功能上的有害结果），本发明的方法依赖于不同的机制，其在载体材料的结构元件和主要不同于胸腺嘧啶的碱基（特别是鸟嘌呤和尿嘧啶）之间传递相互作用，引起核酸分子的有效和稳定的固定化。因此可以避免对核酸分子的损伤。反过来这可以被有利地用于微阵列系统的制备，因为相应的固定化的核酸显示了与互补的探针之间提高的相互作用行为，从而有助于微阵列操作中信号重获和信号评价的改进。另外，本发明可以被有利地用于不同的固定化方法，其利用两种不同波长的光和相应的反应核苷酸。这样的方法可以有助于微阵列系统的生产或为科学目的可用于不同的固定化模式的建立。

在本发明的优选的实施方案中，可被固定化的核酸是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，其寡核苷酸或其任何组合。

在本发明进一步优选的实施方案中，如上提到的所述核酸是双链或单链分子。

在本发明的另一个优选实施方案中，所述包含在被固定化的核酸中的仅一种碱基类型的核苷酸段是鸟嘌呤或尿嘧啶段。在本发明特别优选的实施方案中，所述仅一种碱基类型的核苷酸段是鸟嘌呤段。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述仅一种碱基类型的核苷酸段具有从约7到约10个核苷酸的长度。在特别优选的实施方案中，所述核苷酸段具有约16个核苷酸的长度。

在本发明还另一个优选的实施方案中，所述仅一种碱基类型的核苷酸段位于所述核酸的3'或5'端。

在本发明进一步优选的实施方案中，根据本发明可被固定化的核酸以下列分子式表示：

5’-Y_n-X_m-B_r-X_p-Z_q-3’

Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中Y和Z可以是相同或不同的碱基类型；X是间隔，优选由脱碱基核苷酸组成； B是多于一种碱基类型的序列，n、m、r、p和q是核酸中核苷酸的数量，其中以下情况可以应用：n、m、p、q、r >1； n、m、r > 1并且 p、q = 0； p、q、r >1并且 n、m = 0；n、q、r > 1并且 m、p = 0；n、r > 1并且m、p、q = 0；q、r > 1并且n、m、p = 0。

在本发明的另一个优选实施方案中，如上文所述定义的光交联使用能量为从约0.5 Joule/cm² 到约 10 Joule/cm²范围的量来进行。

在本发明进一步的优选实施方案中，如上所述固体载体包含胺官能化的基团。

在本发明的另一个优选实施方案中，如上所述固体载体或所述的包含胺官能化的基团的载体包含伯胺或仲胺。在本发明另一个相关的优选实施方案中，如上所述固体载体或所述包含胺官能化的基团的载体也可以或可选地包含补骨脂素。

在本发明进一步特别优选的实施方案中，所述包含有胺官能化的基团的载体包含多孔基片。在甚至更优选的实施方案中，上述多孔基片由尼龙构成。

在本发明进一步特别优选的实施方案中，所述包含有胺官能化的基团的载体包含无孔基片。在本发明甚至更优选的实施方案中，上述无孔基片由玻璃、聚- L -赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物（COC）、环烯烃聚合物（COP）、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯构成。

在另一方面，本发明涉及核酸的分析方法，所述核酸根据本发明被固定化，所述方法包括以下步骤：将所述固定化核酸与至少一种包含与所述固定化核酸的区域互补的片段的多聚核苷酸杂交探针，和至少一种包含携带与所述固定化核酸的区域相比单错配的片段的核酸杂交探针，和/或至少一种包含携带与所述固定化核酸的区域相比双错配的片段的核酸杂交探针，和/或至少一种包含携带更高数量的错配的片段的核酸杂交探针杂交；并确定由固定化核酸和所述杂交探针形成的杂合体的解链点，其中解链点与存在于核酸杂交探针中的错配的类型和/或数量以及在仅一种核苷类型的核苷酸段中仅一种碱基类型的核苷酸的数量相关。

在另一个方面，本发明涉及固定化核酸可通过根据如上文定义的本发明的方法的方法获得。

在还另一个方面，本发明涉及根据本发明被固定化的核酸用于生产核酸阵列的用途。

在还进一步的方面，本发明涉及诊断试剂盒，其包含核酸阵列和对照探针，所述核酸阵列根据如上文定义的本发明的方法被固定化，所述对照探针包含与至少一种所述固定化的核酸互补的确定数量的已知的标记核酸。

本发明的这些和其他特征、特点和目的将从以下结合附图和实施例的详细描述中变得显而易见，其通过说明本发明的原理来证明。描述仅用于举例目的，而不是限制本发明的范围。

附图说明

图1显示了通常用于核酸阵列或点微阵列的圆点样式。

图2显示了在Nytran SPC膜上使用的不同固定化方法的固定化效率（恢复）测定的结果。如在X轴上指出的，测试下列情况：在254nm波长的交联、无紫外、在320-500nm波长的2.5 Joule/cm²的暴露剂量和在320-500nm波长的10 Joule/cm²的暴露剂量。柱状表示由仅一种碱基类型的16个核苷酸组成的不同的寡核苷酸的恢复，每一个16-mer用Atto655染料标记。

图3A描述了不带T尾和带T16尾的捕获寡核苷酸（即包含16个胸腺嘧啶的延伸链）的实时杂交曲线。包含T16尾的寡核苷酸显示了增强的杂交信号，这要归因于较高的恢复（recovery）。

图3B显示了沉淀的捕获寡核苷酸（包含T或A核苷酸）的归一化的恢复，其作为碱基类型（T或A）和碱基数量（2、4、8、16或32）的函数。表明当T的数量从2增加到32时，恢复可以增加3-4倍。

图4描述具有0、4和16个 T的捕获探针与互补的、单错配（（AG）突变）和双错配（（AAGG）突变）杂合体（hybrid）的去结合曲线。捕获探针的固定化沿着曲线示意性地描述。图显示由于互补的探针相对于错配的探针增加的解链温度，获得增强的选择性。

图 5显示了脱碱基位点的数目（0、2、4或 8）对来自细菌物种的扩增子与互补及错配捕获探针的杂交强度的影响。

具体实施方式

发明人已发现仅一种碱基类型的核苷酸段可以通过在300-500nm波长的光交联（特别是在365nm波长）被固定化在载体材料上。

虽然本发明将用具体的实施方案描述，但是这种描述不以限制意义解释。

在详细描述本发明示例性实施方案之前，给出对于理解本发明重要的定义。

如本说明书和所附的权利要求书中使用的，“一”（“a”和“an”）的单数形式还包括各自的复数形式，除非上下文另有明确规定。

在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示精确度的间隔，本领域普通技术人员应理解其仍然保证提及特征的技术效果。该术语通常表示从指定数值偏差± 20％，优选± 15％，更优选± 10％，甚至更优选± 5％。

可以理解的是术语“包含” （“comprising”）是非限制性的。对于本发明的目的，术语“由……组成”（“consisting of”）被认为是术语“包含”（“comprising of”）的优选实施方案。如果在下文中，一组（a group）被定义为包含至少某种数量的实施方案，这意味着还包括优选只由这些实施方案组成的一组。

此外，在说明书和权利要求书中，术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”等以及相似术语被用于区别相似的要素，而不必须用于描述顺序或时间顺序排列。应理解的是如此使用的术语是在适当情况下可以互换的，并且本文所述的发明的实施方案能够按不同于本文中描述或说明的其他顺序操作。

在术语“第一”、“第二”、“第三”或“（a）”、“（b）”、“（c）”、“（d）”等涉及方法或使用的步骤的情况下，步骤之间没有时间或时间间隔一致性，即步骤可以同时进行或这些步骤之间可以存在几秒钟、几分钟、几小时、几天、几周、几个月甚至几年的时间间隔，除非在如本文下述的应用中另外指出。

如以上已陈述的，在一方面，本发明涉及在载体上固定核酸的方法，其包括提供带有仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸以及通过光交联在载体上固定化所述核酸，其中所述光交联在约300-500nm的波长进行，优选在365nm的波长进行。

术语“将核酸固定化在载体上”涉及核酸分子通过分子相互作用结合到支持的基片上，这种相互作用将核酸定位在支持基片上的特定区域，并随即阻止了例如在洗涤、漂洗或化学杂交步骤中核酸的分离。通常地，这种分子相互作用基于载体材料结构元件或官能团与要被固定化的核酸例如核酸相应的官能团之间的共价化学键，如本领域普通技术人员已知的。

术语“固体载体”表示载体材料以非液体坚固性为主，从而允许核酸在载体材料上的精确和可追踪的定位。

术语“提供核酸”涉及供给核酸到或进入反应环境，所述反应环境为固定化反应组成适当和足够的环境。相应的环境参数涉及例如温度、pH或湿度或特异性缓冲溶液或额外的成分的存在，如本领域普通技术人员已知的。术语“提供”也涉及在载体上核酸的固定化反应和沉淀的开始。另外，提供核酸也可以包括任何对随后成功的固定化过程必要的预备步骤。应知道的是，与载体材料的照射相关的一个关键问题是它们的水分含量。由于水吸收光照射，尤其是紫外线照射，干燥过程中的变化可以对交联过程的结果有影响。载体材料的水分含量可以根据本领域普通技术人员已知的任何合适的手段调节。优选地，提供核酸可包括预先干燥过程进行一段时间以调整存在的水或液体的量。

在本发明的上下文中，术语“仅一种碱基类型的核苷酸段”涉及核酸分子的部分，其由仅一种碱基如胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶或本领域普通技术人员已知的能够与互补的碱基相互作用的任何其化学衍生物组成。核酸分子的所述部分可以具有仅几个碱基到多于100个碱基之间的可变的长度。术语“仅一种碱基类型”不仅包含相同的碱基，还包含在与互补碱基相互作用方面显示可比较的化学行为的碱基及其衍生物。因此，该术语在鸟嘌呤的示例性情况中不仅涉及仅鸟嘌呤的碱基类型或核苷酸，还涉及其功能上等同的衍生物或修饰。术语“功能上等同”涉及碱基与互补碱基建立非共价连接的能力，其在化学上相似于其衍生自的核苷酸或碱基的非共价连接。这样的功能上等同或修饰的碱基仍可结合互补碱基进行杂交。

术语“光交联”涉及所述载体材料和所述核酸之间通过形成分子相互作用或键的相互作用，其在能量源光提供的能量的影响或驱动下将两种结构元件连接在一起。在本发明的上下文中，光交联通过使用在约300nm到约500nm之间的常用波长的光来进行，对核酸分子优选在365nm进行以便引起分子和载体材料之间的相互作用。通常地，分子和载体材料之间引起的相互作用是核酸和材料的共价结合。在约300nm到约500nm范围内的光交联可以例如通过使用近或长波紫外光、UVA光或不可见光（black light）进行。基本上，连接通过核酸分子的碱基例如鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶和在某种程度上还有胞嘧啶或腺嘌呤残基来进行，其与载体材料上相应并适当的功能性化学基团反应，如本领域普通技术人员已知的。术语“约300nm到约500nm的范围”是指在300nm到500nm之间的每一个单波长。也优选是指其某些子范围，例如，300 到 320 nm、320 到 340 nm、340 到 360 nm、360 到 380nm、380 到400 nm、400 到 420 nm、420 到 440 nm、440 到 460 nm、460 到 480 nm、480 到 500 nm的子范围。通常地，在约300nm到约500nm之间的波长进行的交联可被认为非经典的紫外或长波长交联。

使用的光的波长可主要通过灯的选择来确定。例如，为建立在300-500nm的光谱中的波长，可使用高压汞紫外灯。这样的灯通常发射不只 一个波长而是一系列波长（光谱），如本领域普通技术人员知道的。术语“300-500nm的光谱”涉及这种从高压汞紫外灯发射出的典型的光谱。可选地，光也可从LED中发射，其可以有不同的发射光谱，或从本领域普通技术人员已知的任何其他灯或光源中发射，只要发射波长的主线在300-500nm的范围内。

在特别优选的实施方案中，主发射线在365nm在所述300-500nm的发射光谱内。

进一步优选的是这样的交联方法，其中使用不发射完整光谱的波长而只发射特定的波长（特别优选365nm的波长）的光源。这样的限制可通过使用特定的灯或LED模式或通过使用允许确定的波长单独通过的滤光片元件而获得，如本领域普通技术人员应知的。

根据本发明的优选实施方案，可被固定化的核酸可以是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA 或ANA。DNA可以是例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式。RNA可以是例如p-RNA（即吡喃基-RNA）或结构上修饰的形式，如发夹RNA或茎环RNA。

术语“PNA”涉及肽核酸，即人工合成的与DNA或RNA类似的聚合物，其用于生物研究和医学治疗，但所知不会自然发生。PNA骨架通常由重复的N -(2-氨乙基)-甘氨酸单位通过肽键连接构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基羰基键连接到骨架上。PNA通常描述为类似肽，具有在第一位（左侧）的N 端和在右侧的C 端。

术语“CNA”涉及环乙烷氨基酸核酸。此外，此术语涉及环戊烷核酸，即核酸分子包含例如2' -脱氧卡巴鸟苷（2' –deoxycarbaguanosine）。

术语“HNA”涉及己糖醇核酸，即DNA类似物，其由标准核苷碱基和磷酸化的1,5 -失水己糖醇骨架构成。

术语“LNA”涉及锁核酸。通常地，锁核酸是修饰的并因此无法获得RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可被连接2'和4'碳的额外的桥修饰。这样的桥在3' 内（3' -endo）结构构象中锁定核糖。被锁定的核糖构象提高碱基的堆积和骨架的预组织。这可以显著提高热稳定性，即寡核苷酸的解链温度。

术语“ANA”涉及阿糖核酸或其衍生物。在本发明的上下文中，优选的ANA衍生物是2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿糖核苷（2'F-ANA）。

在进一步优选的实施方案中，核酸分子可以包含任何一种DNA、RNA、 PNA、 CNA、HNA、 LNA和ANA的组合。特别优选的是LNA核苷酸与DNA或RNA碱基的混合物。

在进一步优选的实施方案中，如上文定义的核酸分子可以是短寡核苷酸、长寡核苷酸或多聚核苷酸的形式。

在另一个优选的实施方案中，如上文定义的核酸分子可以是单链的或双链的。术语“单链核酸”涉及核酸分子，其包含单条的糖磷酸骨架和/或不被组装（organized）成螺旋形式。优选地这些核酸分子不展示二级结构或分子内结合。术语“双链核酸”涉及核酸分子，其包含两条糖磷酸骨架。在优选的实施方案中，双链核酸被组装成双螺旋形式。在进一步优选的实施方案中，根据本发明的双链核酸可以由不同类型的核酸分子组成，例如，DNA和RNA、DNA和PNA、DNA和CNA、DNA和HNA、DNA和LNA、DNA和ANA、或RNA和CNA、RNA和PNA、RNA和CNA、RNA和HNA、RNA和LNA、RNA和ANA、或PNA和CNA、PNA和HNA、PNA和LNA、PNA和ANA或CNA和HNA、CNA和LNA、CNA和ANA，或HNA和LNA、HNA和ANA、或LNA和ANA。可选地，它们也可以由以上提到的核苷酸变异体的任何段的组合组成。

在本发明的进一步优选的实施方案中，在波长为300 - 500nm，特别是365nm的核酸交联可用于固定化包含鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸的核酸分子，更优选包含由鸟嘌呤或尿嘧啶核苷酸构成的仅一种碱基类型的段的核酸。在更优选的实施方案中， 所述仅一种碱基类型的段由鸟嘌呤碱基构成，因为本发明人已发现在波长为365nm时，由鸟嘌呤构成的仅一种碱基类型的段可以比由尿嘧啶构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化在载体材料上，由尿嘧啶构成的构成的仅一种碱基类型的段反过来又可以在所述波长比由胸腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化到载体材料上，由胸腺嘧啶构成的仅一种碱基类型的段反过来又可以在所述波长比由胞嘧啶或腺嘌呤构成的仅一种碱基类型的段更有效地被固定化到载体材料上（也参见实施例1和图2）。

根据本发明进一步优选的实施方案，仅一种碱基类型的核酸可具有从约2到约200个核苷酸的长度，更优选从约2到约100个核苷酸，特别优选从约2到约50个核苷酸。也优选2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39 或40个核苷酸的长度。更优选的范围是10-20个核苷酸。最优选16个核苷酸的长度。

被固定化在载体材料上的核酸可根据进一步的优选实施方案以式I表示：

5’-Y_n-X_m-B_r-X_p-Z_q-3’

在式I中，Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中Y和Z可以是相同或不同的碱基类型；X为间隔；B是多于一种碱基类型的序列，以及n、m、r、p和q是核酸中核苷酸的数目，其中以下情况可以应用：n、m、p、q、r >1；n、m、r > 1 且 p、q = 0；p、q、r >1且 n、m = 0；n、q、r> 1 且m、p = 0； n、r > 1且m、p、q = 0；q、r > 1 且n、m、p = 0。术语“仅一种碱基类型的核苷酸段” 已在上文定义，涉及仅由一种碱基构成的核苷酸，所述碱基例如胸腺嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，或任何功能等同的其衍生物。

优选地，Y段和/或Z段可用于核酸的固定化，原因在于仅一种碱基类型的核苷酸的存在。更优选地， Y段和/或Z段可以由鸟嘌呤或尿嘧啶或胸腺嘧啶构成，更优选为鸟嘌呤。

Y和Z可以同时存在于同一核酸分子内。这种形式可以用于通过仅一种碱基类型的段在分子两端的同时交联。在进一步优选的实施方案中，Y和Z可以由不同碱基类型构成，即Y可以例如由尿嘧啶碱基类型构成，而Z可以由鸟嘌呤碱基类型构成，或反之亦然。这种核酸可以例如在不同波长被固定，优选在365nm和254 nm，并因此导致核酸可区别的方向性。这种核酸也可用于测试核酸的方向性和固定化方法对根据本发明与互补的寡核苷酸形成复合物的能力的影响。

在优选的实施方案中，Y和Z可以是相同的长度也可以是不同的长度。 Y和/或Z可以具有约2到约100个核苷酸的长度，更优选约4至约50个核苷酸，甚至更优选约8至约30个核苷酸。还优选4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。更优选10-20个核苷酸的范围。最优选的是16个核苷酸的长度。

在核酸分子的两端都包括元件Y和Z的形式中，在其中心包含如上文式I所述的特定核苷酸B。可选地，区域B可以只连接Y或Z中的一个，因此位于分子的末端。区域B可以被用于经典杂交或微阵列方法中的特定检测反应，即用于检测与特异性结合到位于元件B中它们互补区域的寡核苷酸的相互作用反应。Y和/或Z的长度和化学性质可以影响B区的灵活性，因此可用于优化这个区内的特定相互作用，例如，使用互补的寡核苷酸的特定杂交反应。在优选的实施方案中，B具有约4至约90个核苷酸长度，更优选约4至约50个核苷酸长度，甚至更优选约20到约30个核苷酸。优选长度还为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。最优选的是25个核苷酸的长度。因此，根据本发明具体实施方案，如上文定义的仅一种碱基类型的核苷酸段可以位于核酸分子两端中的任意一端，即在固定化核酸的3'或5'。更优选仅一种碱基类型的核苷酸段可以位于核酸分子的5’端。

本发明式I的元件X可以作为间隔元件另外存在，即作为包括未确定性质的序列的区域。更优选，元件X可以由脱碱基核苷酸组成。术语“脱碱基”涉及核酸分子上无碱基残基存在的位置。因此，核酸的脱碱基区域或段仅由糖磷酸骨架元件构成。这种脱碱基结构可以对整个分子特别是对于分子的元件B的灵活性有积极的影响。发明人能证明：脱碱基位点的存在对固定化分子与靶探针的特异性相互作用或杂交的能力产生积极的影响（参见实施例4和图5）。分子用于固定化的部分例如式I中的Y或Z的分离形成分子用于特异性杂交的部分例如式I中的B，其通过引入包含脱碱基位点的间隔元件来进行，这种分离可以显著地降低用于特异性杂交的分子部分例如式I中的B的非特异性杂交反应。

间隔元件Xm和Xp可以完全由脱碱基位点构成，或部分地由脱碱基位点构成。如果间隔元件部分地由脱碱基位点构成，间隔元件的基础（basic）部分可以由仅一种碱基类型的核苷酸构成，或可以由不同碱基类型的核苷酸构成。如上文定义的脱碱基位点可以聚集在一段中，或分散在间隔元件内，或者，可选地，也可以存在于如式I描述的整个分子中。优选地，脱碱基位点位于间隔元件X中并聚集在1或2段中。

优选地，如式I中描述的分子内的脱碱基位点的数量可以为约1到30之间，更优选约1到约20之间，甚至更优选地这样的分子可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个脱碱基位点。

间隔元件Xm和Xp可以在化学性质和长度上相同，或可以在化学性质和长度上不同。优选地，间隔元件Xm和Xp长度相等，为约1至约50个核苷酸，更优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的长度。在进一步的实施方案中，当q = 0，即没有式I所描述的序列元件Z的存在，末端间隔也是可以避免的，即p = 0。同样地，当n = 0，即没有式I所描述的序列元件Y的存在，末端间隔也是可以避免的，即m = 0。

根据本发明进一步的实施方案，可被固定化的核酸可以在任一或两个末端包含一个或多个标记物，优选在5'端。可选地，所述核酸分子也可以在分子的任何位置包含一个或多个标记物。优选地，所述核酸分子包含1至10个标记物，其可以是相同或不同的或其任何组合。更优选地，核酸分子或寡核苷酸包含1至5个标记物，甚至更优选2个标记物，最优选只有1个标记物。

所述标记物可以是放射性的、荧光的或化学发光的标记物。术语“放射性标记物”涉及发射放射性辐射的标记物，优选由放射性同位素构成。术语“放射性同位素”在标记物的上下文中涉及本领域普通技术人员已知的这样的要素。更优选，此术语涉及N-15、C-13、P-31或I-131。

术语“荧光标记物”涉及荧光团的化学反应性衍生物。通常，常见的反应性基团包括胺反应性异硫氰酸酯衍生物，如FITC和TRITC（荧光素和罗丹明衍生物），胺反应性琥珀酰亚氨酯，如NHS-荧光素，巯基反应性马来酰亚胺活化的荧光剂，如荧光素-5-马来酰亚胺。任何这些反应性染料与另一个分子的反应引起在荧光团和分子之间形成稳定的共价键。经过荧光标记反应，从标记的靶标分子中去除任何未反应的荧光团通常是必要的。这可以通过体积排阻色谱来完成，其利用荧光和标记的核酸或寡核苷酸大小不同的优势。荧光团可以与分离基质相互作用，降低分离效率。由于这个原因，可使用基于荧光染料疏水性的专门的染料去除柱。荧光标记物的特别的优势是从荧光标记物中发出的信号不会分散。缺乏荧光信号散开允许例如载体上更密集的探针间距。荧光探针的另一优点是可进行容易的多色杂交检测，允许直接定量测定与固定化在载体材料上的核酸分子形成复合物的寡核苷酸的相对丰度。在特别优选的实施方案中，可使用荧光标记物FITC、荧光素、荧光素-5-EX、5-SFX、罗丹明绿- X、BodipyFL-X、Cy2、Cy2-OSu、Fluor X、5(6)TAMRA- X、Bodipy TMR-X、罗丹明、罗丹明红-X、得克萨斯红、得克萨斯州红-X、Bodipy TR-X、Cy3-OSu、Cy3.5-OSu、Cy5、Cy5-Osu、Alexa荧光剂、Dylight荧光剂和/或Cy5.5-OSu。这些标记物可单独或以任何组合使用。

术语“化学发光标记物”涉及作为化学反应的结果，伴随着有限的发热，能够发出光线（发光）的标记物。优选地，此术语涉及鲁米诺、cyalume、草酰氯、TMAE(四(二甲氨基)乙烯)、焦酚、光泽精、acridinumester或二氧杂环丁烷（dioxetane）。

通常地，用于照射或交联方法的能量的量是重要的参数。通常地，本领域普通技术人员能够通过根据照射设备的生产厂家提供的指示确定适当且最适的照射剂量。例如，应用于基片上的总剂量可以用公式D = P ∙ T 来计算，其中D是应用于基片上的总剂量，单位是mJ/cm²，P是应用于载体材料上的光的强度，单位是mW/cm²，T是剂量使用的时间，单位是秒。应用于载体材料上的光的强度依赖于光源以及光源和被照射的载体材料之间的距离。根据发明的另一个优选的实施方案，用于在固体载体上固定化一个或多个核酸的在约300到约500nm波长的交联可以通过使用能量为从约0.5到约15 Joule/cm²范围的量来进行，更优选从约2.0到约12 Joule/cm²，甚至更优选从约4到约10 Joule/cm²，最优选在5 Joule/cm² 。在特别优选的实施方案中，交联通过使用5 Joule/ cm²的能量总量在365nm的波长进行。所用光源和载体材料之间的距离可以根据本领域普通技术人员已知的参数适当地调节。优选使用5cm到1m的距离，更优选10cm到500cm，甚至更优选10cm到200cm的距离。进一步优选25cm到150cm的距离。 最优选50cm的距离。

根据本发明另一优选实施方案，载体材料可以是固体材料或基片，其包含功能性化学基团，优选胺基或胺官能化的基团。术语“胺官能化的基团”涉及已用胺官能化的基团，即通过化学修饰已具有胺的功能。这些胺或胺基可为伯胺和仲胺。

优选地，在载体材料上或内部的功能性化学基团的存在和数目可以通过适当的化学激活过程来控制和调节。这种激活过程可以，例如提供在载体材料上或内部特异定位的官能团，使核酸和材料间的特异性相互作用在这些定位的官能团的情况中更易发生。

核酸分子的典型反应伴侣包含能够结合核酸的部分，优选结合胺官能化的核酸的部分。这样的载体材料的实例是醛、环氧或NHS基片。这种材料是本领域普通技术人员已知的。官能团是本领域普通技术人员已知的，所述官能团在核酸分子和载体材料间提供连接反应，其中核酸分子通过胺基的引入被化学活化。

可选择地，核酸分子的反应伴侣可以被化学激活，例如，通过官能团引入到载体材料中。术语“活化的载体材料”涉及材料，其中相互作用或反应的化学官能团通过如本领域普通技术人员已知的化学修饰过程被建立或使其可行。例如，包含羧基的基片必须在使用前被活化。

在载体材料上或内部的官能团的存在和数量也可以对固定化核酸的方向性和自由度有影响。例如，更高数量官能团的存在可以导致在核酸分子内不同的点的固定化。另外，在核酸分子内相应的反应元件的存在可被用于控制载体材料上的核酸分子的方向性，例如，在核酸分子的头部或尾部区或5’或3’区的固定化，或者单独在中心区或同时在中心和末端区的固定化。

载体材料中的功能性化学基团的特定位置可用于促进在这些定位的官能团内核酸和材料间特定的相互作用。这样的定位过程可以用于提供特定定位的核酸分子的规则的阵列，例如通过使用液体点样装置，优选喷墨装置。在载体材料上或内部的反应性化学元件也可以被封闭试剂所掩盖，在去封闭和去掩盖过程之后，可与核酸分子发生化学反应。可选地，这种化学元件可以通过使用本领域普通技术人员已知的相应且适合的活化剂被活化。

载体材料或基片可以另外包含光敏化合物，其可用于载体材料和核酸分子间的相互作用。如本领域普通技术人员已知的，适当的光敏化合物可用作连接分子。这种分子的实例是光敏生物素，或反应性部分，如在载体材料中的琥珀酰亚氨基-6- [4' -叠氮-2'- 硝基苯氨基] 己酸。

光敏生物素由生物素基团、连接基团和硝基苯叠氮基团构成，硝基苯叠氮基团是光可活化的。它通常用于在基片上定型分子。通常，紫外激光激发光敏生物素附着各种表面。这种附着过程通常发生在水性溶液中。光敏生物素是一种生物素种类，其为光可活化的，并可用于生物素化核酸和分子，特别是那些不具有存在用于耦合的胺或巯基的生物素化核酸和分子。当暴露在强光下，生物素的芳基叠氮基团转化为极具反应性的芳氮烯。这个过程可用于标记含有生物素的分子，例如核酸分子。

上述这些化合物可以在约300nm到约500nm波长的光活化后与核酸分子反应，并在基片上固定化分子。

在进一步优选的实施方案中，载体材料包含补骨脂素。补骨脂素是一种用于核酸的双功能光化学交联试剂。它插入核酸螺旋，并经长波长紫外光（例如365 nm波长）的照射，形成与嘧啶碱基的共价键。

优选的载体材料是多孔的载体材料或多孔基片。特别优选的是尼龙，例如NytranN^® 或者 Nytran SPC^® 或者Biodyne C^®。进一步优选的载体材料或基片类型是无孔基片。在无孔基片中，特别优选的是玻璃、聚- L -赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物（COCs）、环烯烃聚合物（COPs）、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。

硝酸纤维素膜是传统的膜，一般用于转移技术如DNA印迹。实现核酸结合硝酸纤维素的方法通常通过物理吸附方式进行，这是现有技术中众所周知的形式。硝酸纤维素的主要优点是它的现成的可用性和熟悉性。通过信号检测的放射性方法，硝酸纤维素膜的应用是被良好地建立。

作为硝酸纤维素膜的替代品，尼龙可用作核酸结合的基片，这归因于其更大的物理强度和结合能力，以及提供的可用表面化学性质的更广泛范围，从而优化核酸附着。尼龙膜上的固定化可以通过例如光交联，特别是紫外光交联，或化学活化来进行。尼龙上的固定化已被证明在重复的探针剥离过程中非常耐用。

大分子结合松散材料例如聚苯乙烯的方式还不是很清楚。松散材料结合能力的分配或者其增强可以通过提供官能团，优选胺基（其例如通过涂覆过程或表面处理或喷涂等是可利用的）来进行。优选使用的涂层材料是多聚-L -赖氨酸，其属于阳离子表面活性剂组。它包含带正电荷的亲水性基团（氨基）和疏水性基团（亚甲基），并已知与核酸分子相互作用。

作为松散材料，可以使用本领域普通技术人员已知的任何适当的材料。通常，使用玻璃或聚苯乙烯。聚苯乙烯是疏水性材料，适于结合带负电荷的大分子，因为它通常包含很少量的亲水基团。

为了将核酸固定化在载玻片上，另外已知的是通过提高玻璃表面的疏水性可以提高DNA固定化。这种增强可以允许相对更加密集填充形成。

除了用多聚- L -赖氨酸进行涂布或表面处理，松散材料特别是玻璃可以用硅烷化例如用环氧硅烷或氨基硅烷处理，或用甲矽烷化（silynation）或聚丙烯酰胺处理。

在本发明进一步的特别实施方案中，松散材料可以用如上文提到的膜材料来覆盖或涂覆。

本发明进一步的方面涉及根据如本文以上描述的方法被固定化的核酸的分析方法，其首先包括将固定化核酸与至少一种包含与所述固定化核酸的区域互补的片段的多聚核苷酸杂交探针，和至少一种包含带有与所述固定化核酸的区域相比单错配的片段的核酸杂交探针，和/或至少一种包含带有与所述固定化核酸的区域相比双错配的片段的核酸杂交探针，和/或至少一种包含带有更高数量的错配的片段的核酸杂交探针杂交；其次，确定固定化核酸和所述杂交探针之间形成的杂合体的解链点，其中解链点与存在于核酸杂交探针中的错配的类型和/或数量以及在仅一种碱基类型的核苷酸段中仅一种碱基类型的核苷酸的数量相关。通常地，进行解链曲线分析以允许核酸中的完全匹配和错配之间的差异而进行。相应的差异试验的选择性的质量和程度主要依赖于用于解链曲线分析的特征和成份。例如，核酸的质量（特别是固定化核酸中与已知的互补序列相比错配的缺失，或者结构的损伤和问题的缺失）可以通过这样的分析被确定。

可选地，在临床测试方案中，靶序列（例如来自潜在的病原体）可以具有非常高的程度的同源性或一致性。在这种情况下，解链曲线分析可帮助区分完全匹配和错配，即其可以促进区分这些非常相似的种类，并因此提供样品中种类的正确诊断。

被用作杂交探针的核酸分子的长度变化依赖于被分析的固定化核酸的长度。优选地，这些核酸分子具有约2到约50个核苷酸的长度，更优选约4到约30个核苷酸。甚至更优选核酸分子包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或者24个核苷酸。

术语“更高数量的错配”优选涉及3和20个错配之间的数量。实际的错配数量是变化的并依赖于被用作杂交探针的核酸分子的长度以及被分析的固定化核酸的长度。

如用于上述固定化核酸的分析方法的上下文中的术语“错配的类型”涉及错配的性质，即其碱基是配对的或被迫配对的。优选地，此术语涉及G/T、T/G、A/C或C/A错配。

使用的杂交条件是如本领域普通技术人员已知的标准杂交条件，例如源于分子生物学教材，如Sambrook等人编写的分子克隆实验指南，2001年，冷泉港实验室出版社。例如，使用缓冲液如SSC或SSPE。这些缓冲液是本领域普通技术人员已知的，并可根据源自例如Sambrook等人编写的分子克隆实验指南，2001年，冷泉港实验室出版社的信息来制备。SDS（优选在0.01-0.5%之间）也可以加入缓冲液。另外，缓冲液可以包含封闭剂，如鲱精DNA（hsDNA）或BSA。优选的缓冲液包含5 x SSC，0.1% SDS，0.1 mg/ml hsDNA。

根据本发明的方法确定的解链点可以优选地与从参考品或已知核酸获得的解链点的值相比较。这样的参考可以例如已通过不同的固定化技术被固定化，和/或其杂交行为在如本领域普通技术人员已知的适当的标准化测试中已被检测。更优选地，此参考可以允许详细的解链点比较其关于错配的数量、错配的类型或性质或两种参数的组合。

通常地，至少一种杂交探针被标记，例如用如上文所述的标记物，优选荧光标记物标记。在更优选的实施方案中，进行根据FRET/Hybprobe 原理的检测。在这种情况下，杂交由两个相邻的杂交探针来进行，每一个用不同的荧光团标记，以便当两个探针都与靶核酸杂交时，FRET可以发生。术语“FRET”意味着荧光共振能量转移。简要地，供体发色团在其激发状态可以通过非辐射的长范围偶极-偶极耦合机制转移能量到紧密接近的受体发色团（通常<10nm）。这种技术是本领域普通技术人员已知的。

通常地，根据本文上述方法获得的解链点值被视为固定化核酸和杂交探针之间的杂交或相互作用的选择性的指示。增加的解链点或温度通常表示增加的结合选择性，因此是固定化核酸的质量和/或固定化核酸中结构损伤和问题的缺失的证据。

因此，根据本文上述方法固定化的核酸的解链点分析可以用于测试和质量控制固定化过程的结果。例如，在给定的核酸分子中错配的总量可以被确定。

另外，基于核酸可以通过使用长波长光在载体上有效地固定化以及对核酸分子的损伤可因此降低的观察，如上文所述的解链点分析可以有利地用于优化固定化过程，例如，通过确定在光波长、用于固定化的能量的总量和由错配碱基或位置的发生造成的核酸损伤的存在之间的优化的或良好的工作比率。

在进一步的实施方案中，优选在如上文所述的优化方法之后，根据本发明固定化的核酸分子可以用于解链点分析。例如，它们可用于确定固定化核酸-靶探针杂合体，所述杂合体完全匹配并不包含任何错配。更优选，它们可用于区分病原细菌，甚至更优选，其可被用于区分肠杆菌科的细菌，最优选，它们可用于区分大肠杆菌(E. coli)和肺炎克雷伯菌(K. pneumoniae)。

约1℃到5℃之间的完全匹配和单错配之间的解链温度差异可以用如上文定义的核酸分析方法检测。更优选地，约1到2℃之间的完全匹配和单错配之间的解链温度差异可被检测。

另一个方面，本发明涉及固定化核酸，其通过使用如上文所述的本发明的方法获得或可获得。这样的固定化核酸可以存在于阵列结构上（如微阵列）或自由沉淀到膜或其他载体上，优选如上文所述的载体材料。在特别优选的实施方案中，通过应用如上文所述的本发明的方法可获得的固定化核酸可以包含仅一种碱基类型的核苷酸段，更优选由鸟嘌呤或尿嘧啶组成的仅一种碱基类型的核苷酸段，甚至更优选由鸟嘌呤组成。进一步优选的是这样固定化的核酸分子，其包含相应的仅一种碱基类型的核苷酸段，其由鸟嘌呤或尿嘧啶组成或由鸟嘌呤在分子的末端组成，例如或在5’或在3’端。

在还另一个优选的实施方案中，本发明涉及根据如上文所述的本发明的方法固定化的核酸用于核酸阵列生产的应用。术语“核酸阵列”涉及核酸的空间排列，优选基因芯片、基因组芯片、DNA芯片、基因阵列或微阵列。如本发明提供的核酸阵列可以根据不同的设置，其关于例如所述阵列的表面和/或载体。阵列设置可以基于载玻片（例如，根据由Affymetrix、Agilent、Nimblegen 或CodeLink提供的技术），基于微珠（例如，根据由Illumina提供的技术），或者基于多孔膜（例如，根据由Clondiag、Xceed、Pamgene或Philips提供的技术）。

在本发明的上下文中，核酸阵列可以以装置的形式提供，其包含适于含有液体样品的室，其中液体样品包含靶核酸。在这样的阵列中，根据本发明固定化的探针核苷酸可以被定位在室表面不同的位置上。

在微阵列装置中固定化核酸序列的数量可以在5到15000之间，优选在5到6000之间，更优选在10到2000之间，甚至更优选在20到500之间，最优选在30到200之间。术语“核酸序列”涉及序列，其可通过至少一个直至几千个包含确定的核苷酸构成和顺序的核酸分子来表示。另外，此术语可以包含相同的或不同的核酸序列。术语“不同的”意味着序列之间至少在一个核苷酸位置存在区别。优选地，此术语涉及不同的序列。

术语阵列的“室”定义封闭的空间，其中排列探针以致固定化核酸存在与定义的空间中，以致其能够和其它存在于所述空间中的分子接触。当然，所述空间或室可以是对于实验进程中一个或多个随后的程序上的步骤是开放的，如，例如液体样品装填到所述空间中或者清洗或者漂洗步骤。但是，为分析探针和其它存在于所述空间内的分子之间的相互关系，室可以是封闭的，为具有确定的反应参数的封闭反应体系提供条件，这些参数例如所述室中某种分子的浓度。

在进一步的优选实施方案中，本发明也涉及如上文定义的固定化方法用于核酸阵列生产的应用，更优选用于如上文定义的核酸阵列生产的应用。

在还进一步优选的实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，其包含根据本发明的方法固定化的核酸阵列和含有确定量的与至少一条所述的固定化核酸互补的已知的标记核酸的对照探针。在进一步特别优选的实施方案中，核酸阵列是如上文定义的阵列。

术语“含有确定量的与……互补的已知的标记核酸的对照探针”涉及良好确定的核酸或寡核苷酸，其被提供带有标记物，优选荧光标记物，其用于校准和/或测试或质量检查至少一条以阵列形式存在的固定化核酸。

在特别优选的实施方案中，根据本发明的诊断试剂盒可用于检测和/或诊断动物或植物的疾病或病症，优选人类或伴侣动物，用于检测个体或群体中的遗传变化，用于检测个体或群体中的疾病或病症的倾向，或用于检测个体或群体中抗性基因或抗性盒的存在，特别是抗生素抗性基因或抗性盒。

术语“检测”涉及根据本发明固定化的核酸阵列应用于与核酸或寡核苷酸相互作用或杂交，所述核酸或寡核苷酸源自不同来源、组织、样品、器官等，其与下文描述的医学的或生物学的鉴定目的相关联。

优选地，这样源自不同来源的核酸或寡核苷酸在其被带入与如上文定义的核酸阵列接触或接近前被例如用如上文定义的标记物标记，以允许识别固定化在阵列中的核酸与源自任何上述来源的靶核酸之间的特异性相互作用或杂交。这样的靶核酸的制备和/或加工是本领域普通技术人员已知的，并可以源自教科书，例如Sambrook等人编写的分子克隆实验指南，2001年，冷泉港实验室出版社。

优选地，本发明的诊断试剂盒可用于免疫系统的缺陷和病症的检测和/或诊断，例如免疫细胞的增殖、分化或转移（趋化性）。免疫细胞通过称为血细胞生成的过程发育，从多能干细胞产生骨髓（血小板、红细胞、中性粒细胞和巨噬细胞）和淋巴（B和T淋巴细胞）。这些免疫缺陷和病症的病因可以是遗传的，体细胞的（somatic）、如癌症或一些自身免疫病症，获得性的（例如由化疗或毒素）或者感染的。在另一个优选实施方案中，如上文定义的试剂盒可用于检测造血细胞的缺陷和病症。免疫缺陷综合征的实例包括但不限于：血液蛋白症（例如，无丙种球蛋白血症，异常γ球蛋白血症）、共济失调毛细血管扩张症、普通可变的免疫缺陷、迪格奥尔格综合症、HIV感染、HTLV-BLV感染、白细胞粘附缺陷综合征、淋巴细胞减少症、吞噬细胞杀菌功能障碍、重症联合免疫缺陷（SCIDs）、Wiskott-Aldric症、贫血、血小板减少或血红蛋白尿。

另外，本发明诊断试剂盒也可用于监控止血剂或溶解血栓剂的活性。例如，本诊断试剂盒可用于检测凝血失调（例如无纤维蛋白原血症、因子缺乏）或血小板失调（例如血小板减少症）。另外，本试剂盒可用于确定指示心脏病（梗塞）的高危险或者中风或者检测梗塞前的参数；这些参数是本领域普通技术人员已知的。

本发明的诊断试剂盒也可用于自身免疫病症的检测和/或诊断。可被检测和/或诊断的自身免疫病症的实例包括但不限于：阿狄森氏病、溶血性贫血、抗磷脂综合征、类风湿性关节炎、皮炎、过敏性脑脊髓炎、肾小球肾炎、Goodpasture's-综合征、格雷夫斯病、多发性硬化症、重症肌无力、神经炎、眼炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺疾病、紫癜、雷特氏症、僵硬人综合征、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性肺部炎症、格林巴利综合征、胰岛素依赖型糖尿病和自身免疫性炎症眼科疾病。

类似地，过敏反应和状况的易感性，例如哮喘（特别是过敏性哮喘）或者其他呼吸道问题，也可用如上文定义的诊断试剂盒检测和诊断。

另外，本发明的诊断试剂盒可用于过度增生病症的检测和/或诊断，包括肿瘤。可被检测的过度增生病症的实例包括但不限于肿瘤，其位于：腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺体（肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺）、眼、头颈、神经（中枢和外周）、淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾、胸椎以及泌尿生殖系统。用本发明的试剂盒可检测的过度增生病症的进一步的实例包括高γ球蛋白血症、淋巴增生症、病变蛋白血症、紫癜、结节病、塞扎里综合症、瓦尔登斯特巨球蛋白血症、高歇氏病、组织细胞增多症以及任何其他除了肿瘤的过度增生疾病，其位于以上列出的器官系统。

本发明的诊断试剂盒也可以用于检测感染性病原体或检测和/ 或诊断感染。病毒是感染性病原体的一个实例，感染性病原体可引起可被本发明的诊断试剂盒检测的疾病或症状。病毒的实例包括但不限于以下的DNA和RNA病毒科： 虫媒病毒、腺病毒科、沙粒病毒科、动脉炎病毒、双股双节RNA病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、圆环病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、嗜肝病毒科（肝炎）、疱疹病毒科（例如巨细胞病毒、单纯疱疹、带状疱疹）、单股负链病毒（例如副粘病毒科、麻疹病毒属、弹状病毒科）、正粘病毒科（例如流感）、乳多空病毒科、小DNA病毒科、小RNA病毒科、痘病毒科（例如天花或牛痘）、呼肠孤病毒科（例如轮状病毒属）、逆转录病毒科（人类嗜T淋巴细胞病毒I型、人类嗜T淋巴细胞病毒II型、慢病毒属）和披膜病毒科（例如风疹病毒）。属于这些科的病毒可引起多种的疾病和症状、包括但不限于：关节炎、毛细支气管炎、脑炎、眼部感染（例如结膜炎、角膜炎）、慢性疲劳综合症、肝炎（A、B、C、E、慢性活动性、丁型）、脑膜炎、机会性感染（例如AIDS）、肺炎、伯基特氏淋巴瘤、水痘、出血热、麻疹、流行性腮腺炎、副流行性感冒、狂犬病、普通感冒、脊髓灰质炎、白血病、风疹、性传播疾病、皮肤疾病（例如卡波济肉瘤、疣）及病毒血症。

类似地，本发明的诊断试剂盒可用于检测可引起疾病和症状的细菌或真菌病原体，包括但不限于以下的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌科和真菌：放线菌目（例如棒状杆菌、分支杆菌、诺卡氏菌）、曲霉菌、芽孢杆菌科（例如炭疽、梭菌）、拟杆菌科、芽生菌、博代氏杆菌、包柔氏螺旋体、普鲁氏菌、念珠菌、弯曲杆菌、球孢子菌、隐球菌、Dermatocycoses、肠杆菌科（克雷伯氏杆菌、沙门氏菌、沙雷氏菌、耶尔森氏杆菌）、丹毒丝菌、螺杆菌、军团菌、钩端螺旋体、李斯特菌、支原体、奈瑟氏球菌（例如不动杆菌、淋病奈瑟菌、Menigococcal）、巴斯德菌感染（例如放线菌、嗜血杆菌、巴斯德菌）、假单胞菌、立克次氏体、衣原体、梅毒螺旋体和葡萄球菌。这些细菌和真菌家族可以引起以下疾病或症状，包括但不限于：菌血症、心内膜炎、眼部感染（结膜炎、结核、葡萄膜炎）、牙龈炎、机会性感染（例如、AIDS相关感染）、甲沟炎、假体相关感染、赖特病、呼吸道感染、例如百日咳或脓胸、败血症、莱姆病、猫抓病、痢疾、副伤寒、食物中毒、伤寒、肺炎、淋病、脑膜炎、衣原体、梅毒、白喉、麻风病、副结核病、结核病、狼疮、肉毒中毒、坏疽、破伤风、脓疱疮、风湿热、猩红热、性传播疾病、皮肤疾病（例如蜂窝组织炎、皮肤真菌病）、毒血症、尿路感染、伤口感染。

在特别优选的实施方案中，本发明的诊断试剂盒可用于检测以下病原体或它们在人或动物身体样品中或人或动物的排泄物中的存在：埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、克雷伯氏肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis）、产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、孔氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、肠道球菌属的种（Enterococcus sp.）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）、缓症链球菌（Streptococcus mitis）、耳葡萄球菌（Staphylococcus auricularis）、缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus）、β血红素G组链球菌（Streptococcus beta haem Group G）、β血红素F组链球菌（Streptococcus beta haem Group F）、格氏链球菌（Streptococcus gordonii）、D组链球菌（Streptococcus Group D）、口腔链球菌（Streptococcus oralis）、副血链球菌（Streptococcus parasanguis）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius）、弗氏拧檬酸杆菌（Citrobacter freudii）、单核细胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、滕黄微球菌（Micrococcus luteus）、琼氏不动杆菌（Acinetobacter junii）、蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）、粪拟杆菌（Bacteroides caccae）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）、普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）、假白喉棒杆菌（Corynebacterium pseudodiphtheriticum）、棒杆菌属的种（Corynebacterium sp.）、解脲棒杆菌（Corynebacterium urealyticum）、核粒梭菌（Fusiobacterium nucleatum）、微球菌属的种（Micrococcus sp.）、多杀巴斯德菌（Pasteurella multocida）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）、皮氏罗尔斯顿菌（Ralstonia pickettii）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella ser. Paratyphi B ）和肠耶尔森菌（Yersinia enterocditi）。

另外，本发明的诊断试剂盒可用于检测引起疾病或症状的寄生虫病原体，包括但不限于以下科：变形虫、巴贝西虫、球虫、隐孢子虫、双核阿米巴虫、马类锥虫、外寄生虫、梨形鞭毛虫、蠕虫、利士曼原虫、泰勒尔梨浆虫、弓形虫、锥虫、毛滴虫。这些寄生虫可以引起多种的疾病或症状，包括但不限于：疥疮、恙螨病、眼部感染、肠病（例如痢疾、梨形鞭毛虫病）、肝病、肺病、机会性感染（例如AIDS相关的）、疟疾、怀孕并发症和弓形虫病，这些也可通过使用本发明的诊断试剂盒被检测到。

下面的实施例和图片仅供说明性目的。因此应理解的是，实施例和图片不能被解释为限制性。本领域普通技术人员显然能够设想本文列出的原则的进一步修改。

实施例

实施例1——在不同波长的固定化效率的测试

不同固定化方法的固定化效率在Nytran SPC尼龙膜上测试。具体地，在254nm波长的光、非紫外光和在365nm波长的光被用于在5秒或20秒暴露的暴露时间段中核酸分子的暴露。作为核酸分子，使用不同的寡核苷酸，其包含仅一种碱基的16个核苷酸（即16A、16C、16G、16T、16U），每个16-mer用Atto655染料标记。

被测试的参数是核酸的固定化效率或恢复，即固定化的寡核苷酸和沉淀的寡核苷酸之间的比值，修正紫外应用中荧光团密度的损失。在紫外应用后，为了移除未结合的材料洗涤样品。作为洗涤缓冲液，使用5x SSC，其含有0.1%SDS和0.1mg/ml鲱精DNA。洗涤/封闭在50℃进行1小时。

实验结果显示于图2中。具体地，柱状表示包含仅一种碱基类型的16个核苷酸的不同寡核苷酸的恢复，其可被用于计算固定化效率。

从图2中显而易见的是，对于254nm紫外暴露，其传统地用于在尼龙膜上的紫外交联，当使用U尾时，固定化效率最高。包含仅胸腺嘧啶的寡核苷酸也进行很好。

但是，当膜和寡核苷酸暴露于300-500nm的紫外，特别是365nm时，鸟嘌呤寡核苷酸表现出色。认为不同的结合机制是这个交联步骤的基础。但是，机制本身在分子水平上还不完全清楚。

实施例2——包含T尾的核酸的恢复测试和敏感性测试

在实时杂交测定中测试敏感性，即每单位时间捕获的分析物的数量。Nytran N或Nytran SPC尼龙薄膜用于实验。

该测定使用捕获寡核苷酸（即被固定化的沉淀的核酸分子）进行，所述寡核苷酸不包含T尾或包含 T16尾，即16个胸腺嘧啶段。这些实验在流动室中进行，其是膜在其中被夹住并且杂交液通过膜被抽吸的装置。图3A中，在X轴描述了循环数，其等于时间（1个周期需要1分钟）。杂交用互补的DNA来完成。杂交缓冲液是5 × SSC，0.1％SDS，0.1mg/ml鲱精DNA。温度设定在50℃。

如从图 3A可以得到的，包含T16尾的寡核苷酸显示增加的杂交信号，这是由于较高的恢复。恢复是固定化的寡核苷酸和沉淀的寡核苷酸之间的比值。

实验表明恢复和由此的灵敏度随捕获分子内仅一种碱基类型的核苷酸数量的增加而增加。

可以从图 3B中得到，结果的归一化显示了包含T或A核苷酸的沉淀的寡核苷酸平均恢复率，其作为碱基类型（T或A）和碱基数量（2、4、8、16或32）的函数；结果的归一化清楚地说明：当捕获寡核苷酸中仅一种碱基类型的核苷酸的数目（即T的数目）从2增至32时，恢复可以3-4倍提高。固定化通过使用254nm波长的紫外光进行。

实施例3——固定化核酸的特异性测试

在结合测定中测试固定化核酸的特异性，即区分匹配和不匹配的靶标的能力。

该测定是用包含0、4或16 个T的固定化核酸（捕获探针）进行的。使用了不同的捕获探针，包含完全匹配、单错配（（AG）突变）和双错配（（AAGG）突变）。利用PCR产物进行杂交。杂交在流动室中进行，其是膜在其中被夹住并且杂交液通过膜被抽吸的装置。温度设定在50℃。杂交进行1小时。杂交后，缓冲液改为2 × SSC，温度以1℃/ min增加，以制作解链曲线和评估特异性。

图 4描绘了对于不同的捕获探针，互补、单错配和双错配杂合体的去结合曲线；如可从图 4得到的，由于与错配探针相比互补探针增加的解链温度，获得了增强的选择性。

实施例4——脱碱基位点对杂交强度的影响

在结合测定中测试脱碱基位点对含有完全匹配、单错配（（AG）突变）和双错配（（AAGG）突变）的DNA的核酸分子的杂交强度的影响。捕获探针包含0、2、4或8个脱碱基位点。结合测定使用互补的靶标寡核苷酸在NytranN尼龙膜上进行。

如可从图5中得到的，在所有测试的情况下，即与互补的靶标寡核苷酸、错配靶标寡核苷酸或双错配靶标寡核苷酸杂交的情况下，杂交强度随脱碱基位点数量的增加而增加。该影响是因为用于特异性固定和特异性杂交的序列更有效的分离，从而降低非特异性杂交。

Claims (14)

1.一种在载体上固定化核酸的方法，其包括以下步骤：

（a）提供带有仅一种碱基类型的核苷酸段的核酸；及

（b）通过光交联在固体载体上固定化所述核酸，其中所述光交联在300-500nm的波长下进行，以及其中所述交联使用能量为从0.5 Joule/cm²到10 Joule/cm²范围的量进行。

2.权利要求1的方法，其中所述光交联在365nm的波长进行。

3.权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA、RNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA，其寡核苷酸；或其任何的组合。

4.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述核酸是双链的或单链的。

5.权利要求1的方法，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段是鸟嘌呤或尿嘧啶段。

6.权利要求5的方法，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段具有7到100个核苷酸的长度。

7.权利要求6的方法，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段具有16个核苷酸的长度。

8.权利要求1的方法，其中所述仅一种碱基类型的核苷酸段定位在所述核酸的3'或5'端。

9.权利要求1-3中任意一项的方法，其中所述核酸由下式表示：

5’-Y_n-X_m-B_r-X_p-Z_q-3’

Y和Z是仅一种碱基类型的核苷酸段，其中Y和Z是相同或不同的碱基类型； X是间隔；B是多于一种碱基类型的序列，以及n、m、r、p 和q是核酸中核苷酸的数量，其中以下情况应用：n、m、p、q、r >1； n、m、r > 1 且 p、q = 0； p、q、r >1 且 n、m = 0； n、q、r > 1 且 m、p= 0； n、r > 1 且 m、p、q = 0； q、r > 1 且 n、m、p = 0。

10.权利要求9的方法，其中所述 X是由脱碱基核苷酸组成的间隔。

11.权利要求1的方法，其中所述固体载体包含胺官能化的基团。

12.权利要求1或11的方法，其中所述固体载体包含伯胺或仲胺和/或补骨脂素。

13.权利要求11的方法，其中所述固体载体是多孔基片，或无孔基片。

14.权利要求13的方法，其中所述固体载体是由尼龙组成的多孔基片，或由玻璃、聚- L-赖氨酸涂层材料、硝酸纤维素、聚苯乙烯、环烯烃共聚物（COC）、环烯烃聚合物COP、聚丙烯、聚乙烯或聚碳酸酯组成的无孔基片。