JP2005525787A - プローブとの相互作用による遺伝子ハプロタイプの検出方法 - Google Patents
プローブとの相互作用による遺伝子ハプロタイプの検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005525787A JP2005525787A JP2003538184A JP2003538184A JP2005525787A JP 2005525787 A JP2005525787 A JP 2005525787A JP 2003538184 A JP2003538184 A JP 2003538184A JP 2003538184 A JP2003538184 A JP 2003538184A JP 2005525787 A JP2005525787 A JP 2005525787A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- probe
- gene fragment
- labeled
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
- C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/172—Haplotypes
Abstract
本発明は、目的のハプロタイプを含む標的核酸または遺伝子断片を同定すること、およびプライマー依存の転写物、プローブ、またはプライマー依存の転写/プライマー複合物のいずれかによってディスプレイされる少なくとも1つのパラメーターを検出することを含んでなる、遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。さらに、核酸または遺伝子断片を少なくとも1つのプローブで標識し、該核酸分子または遺伝子断片の速度を、プローブによってディスプレイされた少なくとも1つのパラメーターで逐次的に測定することによって検出することを含んでなる遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。
Description
本発明は、少なくとも1つのプローブとの相互作用によってマーキングされた核酸断片または分子を直接検出することによる、遺伝子ハプロタイプを同定するための装置および方法に関する。
研究者たちは、ヒトゲノムにおいて一塩基の変化、塩基の挿入または塩基の欠失が起こりうる数百万ものヌクレオチドの位置を同定してきた。個人の遺伝的構成物におけるこれら遺伝子の多様性(GVs)は、遺伝性疾患、疾患に対する素因、治療物質を代謝する能力、治療物質の代謝速度、治療物質の副作用などを決定づける。
代表的には、2以上のヘテロ接合体部位が存在する2つの染色体を有する組織または細胞(即ち、ヒトおよび動物におけるすべての正常な体細胞組織)から得られたDNAまたはcDNAの試料中では、通常、(i)DNA配列決定、(ii)オリゴヌクレオチドとゲノムDNAまたは全cDNAまたはそれらから得られた増幅産物との核酸ハイブリダイゼーション、(iii)ゲノムDNAまたは全cDNAまたはそれらから得られた増幅産物から得られたプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーション、または(iv)多様性検出のための大部分の増幅に基づく方法(most-amplification-based scheme)等の遺伝子型による解析法を用いた場合、どのヌクレオチドが共に1つの染色体に属しているのかを知ることは不可能である。
ハプロタイプは、純血種を用いて隣り合った変化のグループの転位を分類することによって推論することができるが、医学的研究のおいてしばしばそうであるように、無関係な人が研究の対象であるときには、純血種の解析はほとんどかまたは全く使用されない。無関係な人のハプロタイプを決定するいくつかの方法が存在する。スキャンした1または2つの変異のそれぞれに対するアレル特異的PCRプライマーの設定に基づいた方法(Michalatos-Beloin, et al., Nucl. Acids Res. 24: 4841-4843 (1996));しかし、これらの方法は一般にハプロタイプ分析される各部位のついてカスタマイズする必要があり、それゆえ時間がかかり高価である。さらに、これらの方法では、ハプロタイプを決定できるのは20キロベース未満の領域に限られる。
研究者たちは、さらに上記の表現型の多様性を引き起こすのは単にGVsの存在であるだけでなく、個人の染色体におけるGVsの分布または配置であることを明らかにした(Hess, P., et al., Impact of pharmacogenomics on the clinical laboratory, Mol. Diagn. 4: 289-98 (1999);Davidson, S. , Research suggests importance of haplotypes over SNPs, Nature Biotechnology 18: 1134-5 (2000))。例えば、2人の人は染色体の特定の領域における3つのGVsについてヘテロ接合体であり得るが、そのうちの1人はハプロタイプ(GV配置)が2人の間で異なるために遺伝性疾患を有する。影響を受けていない人においては、2つのGVが1つの染色体に存在し、他方のGVはもう一方の染色体に存在するが、疾患を有する個人には、3つのGVが同じ染色体に存在する。
ハプロタイプを決定する能力は、遺伝性疾患の研究および個人に特化した治療の発展の鍵を握る。ハプロタイプを決定する現在の方法は時間がかかり、扱いにくい。ほとんどの既存の方法は多くの工程を要し、多くの試料を試験するおよび/または関係するハプロタイプを決定するための特定のソフトウエアを使用する必要がある(例えば、本明細書の一部を構成する、米国特許第6,183, 958号(Stanton);米国特許第6,235, 502号(Weissman)を参照)。
アフィメトリクス(Affymetrix)は、ハプロタイプの決定に使用することができるチップの技術を用いた方法を記載した。2つのGS部位に対するオリゴヌクレオチドプローブは同じチップの部位と連結する。両プローブに対する核酸のハイブリダイゼーションは、両プローブに対する協同的ハイブリダイゼーションによって生じるハイブリッド収量の、別々のプローブのいずれか一方に対するハイブリダイゼーションと比較した増加によって決定付けられる(Gentalen, E., et al., A novel method for determining linkage between DNA sequences: hybridization to paired probe arrays, Nucleic Acids Res. 27 (6): 1485-91 (1999))。この方法は、各チップ部位について2つのプローブの解析に限られる。さらに、この方法は約2000塩基以上は離れていないGV部位の解析に限られる。さらに、チップ技術は、有効な使用のためには、有意の量の標的の物質を必要とする。標的の核酸はPCRまたは同様の増幅法を用いて、解析前に増幅することができるが、これらのさらなる工程は解析を煩雑なものにし、試料中の不純物の混入によって影響を受ける工程が増える。
本明細書の一部を構成する米国特許第5,104,791号(Abbottら)は、2つの核酸プローブを用いた標的核酸を検出する方法を記載している。1つのプローブは粒子に結合したキャプチャープローブであり、もう1つのプローブはレポーター核酸プローブである。標的の検出は、粒子(マイクロスフェア)および、発光、蛍光、放射能等であってよいレポータープローブを平行して検出することによって行う。しかしながら、本発明とは異なり、この方法は核酸プローブの使用に限られる。さらに、この方法はハプロタイプを決定する手段としては考えられなかった。さらに、この方法は、1回あたり2つのGVの解析に限定される。
本明細書の一部を構成するCaiらのPCT公開第WO01/90418は、1つの染色体に由来する、SNP等の隣接する遺伝子マーカーに特異的な2つの識別可能な発光標識の同時検出に基づく、1分子法を使用することを示している。しかし、この特許は、ハプロタイプを決定するために、色の区別または発光の寿命を含む発光を識別するための技術を必要とする。対照的に、本発明は、ハプロタイプを決定するために、ある特定のプロトコルを用いて、単一の標識またはプローブを使用することができる。単一の標識または区別することができない同じ色素で標識した2つのプローブを用いることが可能である。
しかし、Caiらは、所定のハプロイドに2つのマーカーが共に存在すると、単一の分子決定および同定を用いることにより、迅速な測定ができることを指摘している。伝統的に、会合試験は少数のマーカーが関係する単純な、一遺伝子性の疾患についてのみ成功しており、異なるハプロタイプの可能な組み合わせは限られる。従って、ハプロタイプは、多くの人のタイプ分け、ホモ接合型の可能性および親の情報によって、遺伝子型から推定することができる。しかし、大部分の疾患は複雑で複数の遺伝子が関係している。多遺伝子会合試験のためには、より多くのマーカーが必要であり、可能なハプロタイプの数は膨大である。これらの場合、遺伝子型からハプロタイプを推定するのは非常に困難である。ハプロタイプの推定のために多くの精巧なアルゴリズムが開発されており、それらは典型的には70〜90%の精度である。そのような精度は、大量のSNPをタイプ分けするときには有用ではなく、また臨床診断を目的とするには精度が低い。さらに、親のゲノムDNAを入手することが、不可能であったり現実的でないことが多い。これは深刻な問題であり、XおよびY染色体がバルク法で識別されるに十分相違している性染色体上にある場合を除いて、ハプロタイプを直接決定する簡単な方法は存在しない。
Calらにおいて示されているように、遺伝子型に基づく遺伝子プロファイルでは2つの染色体上のSNPの位置が分からないために不完全であることがある。例えば、同じ遺伝子に、AとBという2つの遺伝子マーカー(またはSNP)があるとする。aA/bB(AとBは野生型または天然に存在する優性の表現型を表し、aおよびbは2つの突然変異を表する)の遺伝子型については、ab/ABとAb/aBの2つの可能なハプロタイプの組み合わせが存在する。ab/ABを有する人の疾患の表現型は、Ab/aBを有する人と比べて比較的軽度である。これは、ab/ABを有する人がインタクト(無傷)な遺伝子のコピーを1つ有し、Ab/aBを有する人がインタクトなコピーをいずれの染色体上にも有しないからである。このような場合について、常套的な臨床条件において、2つの突然変異が同じ染色体上に存在しているか異なる染色体上に存在している(ハプロタイプ)かを見つけることができれば、将来の危険性の予測や疾患の診断に特に有用である。
ハプロタイプを判別するための別の慣用的手段は、アレル特異的ポリメラーゼ連鎖反応(アレル特異的PCR(Ruano, G.,et al., Haplotype of multiple polymorphisms resolved by enzymatic amplification of single DNA molecule, PNAS 87: 6296-6300 (1990)))であり、直接のハプロタイプ判別に最も慣用的に使用される方法である。これらの反応では、SNP−特異的PCRプライマーを設計して2つの染色体に由来する特定のハプロタイプを区別し増幅する。このような反応は、ストリンジェントな反応条件と、各試薬について個々に最適化する必要がある。従って、この方法は、大規模で高スループットハプロタイプ判別には適切ではない。さらに重要なことに、そのような解析は数キロベース以上離れたSNPのタイプ分けが不可能である。さらに、そのような増幅を基礎とするタイプ分けは、試料を扱っている間に試料DNA以外の少量のゲノムDNAの汚染によって煩雑になることが多い。
Calらのその他のハプロタイプの判別法は単一の精子または単一の染色体の測定が挙げられる(Ruano, supra; Zhang L., Whole genome amplification from a single cell : Implications for genetic analysis, PNAS 89: 5847-5851 (1992); Vogelstein, B., Digital PCR, PNAS 96 (16): 9236-9241 (1999); Wahlestedt C. , et al., Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids, PNAS 97: 5633-5638 (2000))。単一精子ソート分析では、個々のソートされた精子細胞に由来するPCR増幅されたDNAの遺伝子型を判別する。2つのハプロタイプを明らかにするに十分統計学的に信頼性を得るために、ある個人に由来する複数の精子細胞(少なくとも3〜5)をタイプ分けする。原則的には、この方法は煩雑であり、これまでのところ、成功している研究室は数少ない。この分子クローニング法は、個人のDNA(cDNA)の標的領域をベクターへクローニングし、単一のコロニーから得られたDNAの遺伝子型を判別することからなる。2つのハプロタイプを入手するためには、一人あたり複数のコロニーが必要である。この方法は多くの研究室で用いられているが、非常に手間と時間がかかり、実行するのが困難な場合がある。研究者たちは容易な代替手段が他にないために、この方法を使わざるを得ない。
最後に、Caiらは、AFM (Atomic Force Microscopy)画像処置によるハプロタイプ分析 (Wooley, A. T.ら、カーボンナノチューブを用いたキロベースサイズのDNAの直接のハプロタイプ分析、Nature Biotechnology 18: 760-763 (2OOO);Tato T.A.ら、力によるハプロタイプ分析、Nature Biotechnology 18: 713-713 (2000) は、個人のDNA分子上の多型部位を直接可視化するための新しい方法である。この方法は、高解像度の単層のカーボンナノチューブプローブを用いるAFMを利用して100〜10000塩基を含むDNA断片の複数の多型部位を直接読み取る。この方法では、DNA断片中の標的配列に対する標識されたオリゴヌクレオチドプローブの特異的なハイブリダイゼーションの後、AFMによりその標識の存在と空間的な配置を直接読み取る。しかしながら、そのようなシステムのスループットおよび感度はこれからも実証されるべきものであり、現在1日あたり200試料(各10画像)を処理することができる。
総じて、Caiらは、性染色体を用いること以外に、現在ハプロタイプを決定する簡単な方法は、一般には存在しないことを指摘している。ハプロタイプを決定するために2つの識別可能な色素を用いることが必要なCaiらの方法とは対象的に、単一の色素または2つの判別不可能な色素を用いることができるより簡便で効果的な方法が本発明において開発された。さらに、PCRによるDNA増幅またはクローニングや広範な最適化を必要とする大部分の先行技術とは違い、本発明は、ハプロタイプを決定するためのより直接的な方法を確立する。
ハプロタイプを決定するための単純で直接的な方法は、診断や生物医学的調査にとって相当の価値がある。このことは、特に、分析毎に複数のGV部位を解析し、GV部位が20キロベースも離れているような方法に該当する。ハプロタイプ分析のさらなる有用な特徴は、同じ分析方法で複数の遺伝子領域についてGVハプロタイプを決定する能力であろう。
本発明は、相違する配列または特定の多型変異を有する核酸のハプロタイプを直接同定するための方法を提供する。この多型変異は、挿入、欠失または一塩基の置換であり得る。解析された多型部位は20kb以上離れていても良い。本発明の方法は1回の分析で複数の遺伝子領域における複数のGVについてのハプロタイプを決定するために使用することができる。
一般に、本発明は、ある特定の技術を用いて識別不可能な少なくとも1つのプローブ、少なくとも2つの発光プローブと相互作用する核酸、またはそのプローブが遺伝子変異の部位を表する標的上の特異的な配列と相互作用する1つの発光および1つの非発光プローブを数える(即ち計数する)方法を提供する。プローブは標的と逐次にまたは同時に相互作用する。標的としては、核酸、核酸断片、プラスミドおよび遺伝子断片等のその他の分子が挙げられる。プローブは、核酸、オリゴヌクレオチド、核酸変異体、例えばPNAまたはLNA、ペプチド、タンパク質、色素、脂質、薬物、または小分子であってよい。与えられた実験では任意の種類のプローブの組み合わせを用いることができる。ハプロタイプの決定は、プローブによって影響を受けるまたは依存する1またはそれ以上のパラメーターの測定に基づく。
さらに、本発明はヌクレオチドマーカーの単一分子検出の利点とフリーの溶液またはふるいにかけられた単一分子キャピラリー電気泳動技術を併せ持つ。
したがって、本発明は、目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定することを含んでなる、遺伝子のハプロタイプを決定するための方法であって、(i)第1の遺伝子変異を認識するプライマーを、標的の核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせることであって、標的プライマーに依存する転写が標的の核酸または遺伝子断片から生じ;(1)そのプライマーの下流の第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの標識されたプローブを、プライマー依存転写物とハイブリダイズさせる、(2)またはそのプライマーの下流の第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの非標識プローブをプライマー依存転写物とハイブリダイズさせる;および(b)プライマー依存の転写物の1つのよって表される少なくとも1つのパラメーター、少なくとも1つのプローブまたはプライマー依存の転写物複合体を検出し、それにより、ディスプレイされたパラメーターをハプロタイプに関連付けること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
さらに、
(a)
(i)ハプロタイプに関連する第1の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、標識されたプライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
(1)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
(2)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの非標識プローブを前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
(b)前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも1つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物/プローブの複合体のうちの1つによってディスプレイされた少なくとも1つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。
(a)
(i)ハプロタイプに関連する第1の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、標識されたプライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
(1)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
(2)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの非標識プローブを前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
(b)前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも1つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物/プローブの複合体のうちの1つによってディスプレイされた少なくとも1つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法を提供する。
さらに、(a)核酸分子または遺伝子断片を、ハプロタイプを定義するおのおの異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および(b)プローブによって表される1つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、を含む方法を提供する。
さらに、(a)核酸分子または遺伝子断片を、おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および(b)そのプローブによってディスプレイされた少なくとも2つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出すること、を含んでなる方法を提供する。
さらに、(a)おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること;および(b)そのプローブによってディスプレイされたパラメーターを同時に測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し(ここで、パラメーターは協同的ハイブリダイゼーションではない)、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
さらに、(a)おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること;および(b)そのプローブによってディスプレイされた少なくとも2つのパラメーターを同時に測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、ここで、パラメーターは協同的ハイブリダイゼーションではなく、さらに、プローブは、マイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
さらに、(a)おのおのハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで核酸分子または遺伝子断片を標識すること;および(b)時間における差を検出することにより核酸分子または遺伝子断片の速度を検出し、プローブは第1の位置で第1の検出器により測定され、第2の位置で第2の検出器により検出され、プローブは、マイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
本発明の他の特徴、態様および利点は、以下の記載、実施例および添付した請求の範囲を参照することによってより理解されるであろう。
略語および定義
特に記載しない限り、以下で定義する用語は以下の意味を有する:
ハプロタイプ:本明細書で用いる「ハプロタイプ」は、遺伝型を含む各遺伝子の1つの対立遺伝子の組を意味する。さらに、1つの染色体または染色体の一部にある対立遺伝子の組、即ち関連する遺伝子の対立遺伝子の1つの組を意味する。本発明においては、ハプロタイプは好ましくは、与えられた個人に存在し、表現型に関連しうる二対立遺伝子マーカーの組合せを意味する。
対立遺伝子:「対立遺伝子」は、染色体上の同じ位置(座)を占める、いずれか1つの一連の2以上またはそれ以上の異なる遺伝子を意味する。常染色体は対になっているので、各常染色体の座は2個存在する。両染色体が同じ対立遺伝子を有する場合、同じ座を占有し、この状態を、この対立遺伝子についてホモ接合体という。2つの座の対立遺伝子が異なる場合、その人または細胞は両対立遺伝子についてヘテロ接合体という。
特に記載しない限り、以下で定義する用語は以下の意味を有する:
ハプロタイプ:本明細書で用いる「ハプロタイプ」は、遺伝型を含む各遺伝子の1つの対立遺伝子の組を意味する。さらに、1つの染色体または染色体の一部にある対立遺伝子の組、即ち関連する遺伝子の対立遺伝子の1つの組を意味する。本発明においては、ハプロタイプは好ましくは、与えられた個人に存在し、表現型に関連しうる二対立遺伝子マーカーの組合せを意味する。
対立遺伝子:「対立遺伝子」は、染色体上の同じ位置(座)を占める、いずれか1つの一連の2以上またはそれ以上の異なる遺伝子を意味する。常染色体は対になっているので、各常染色体の座は2個存在する。両染色体が同じ対立遺伝子を有する場合、同じ座を占有し、この状態を、この対立遺伝子についてホモ接合体という。2つの座の対立遺伝子が異なる場合、その人または細胞は両対立遺伝子についてヘテロ接合体という。
座:本明細書で用いられる、用語「座」は、特定の形質についての遺伝子が位置する連鎖地図におけるまたは染色体上の部位を意味する。遺伝子の対立遺伝子のいずれか1つがこの部位に存在しうる。
多型:本明細書において用いられる「多型」は、異なるゲノムまたは個人の間の2またはそれ以上の別のゲノム配列または対立遺伝子の存在を意味する。「多型」は、特定のゲノム配列の2またはそれ以上の変異体が集団において認められ得る状態をいう。「多型部位」は、変異が生じる座である。単一ヌクレオチド多型、即ちSNP、は、1個の塩基対の変化である。典型的には、単一ヌクレオチド多型は、多型部位での、あるヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置き換えである。1個のヌクレオチドの欠失または1個のヌクレオチドの挿入もまた1個のヌクレオチド多型を生じる。本発明においては、「単一ヌクレオチド多型」は好ましくは単一ヌクレオチド置換を意味する。典型的には、異なるゲノム間で、または異なる個人間で、多型部位は2つの異なるヌクレオチドによって占有されうる。
二対立遺伝子マーカー:本明細書において用いられる、「二対立遺伝子マーカー」は、集団において極めて高い頻度で2つの対立遺伝子、好ましくは単一ヌクレオチド多型を有する多型を意味する。
相互相関:
相互相関は、2つの生データの組gjおよびhkを解析にかけて、それぞれの検出器(好ましくは光検出器)からのデータの組を以下の式に当てはめる。
[式中、Nはデータポイントの総数である]。このデータ相互相関は、[好ましくは単一分子解析システムで]特定の分子が第1の検出器から第2の検出器へ通過する時間に対応するある時間のずれ(j)での、検出器からの第1のデータの組[好ましくはバックグラウンドレベルより上の光子カウント](g)が、第2の検出器からのデータの組[好ましくはバックグラウンドより上](h)と値が近くなる場合に大きくなる。試料に与えた電場を有する単一分子電気泳動装置において、キャピラリーの長さ方向に配置した光子検出器間の検出に関する時間のずれ(j)は、検出された分子の電気泳動速度に関連する。キャピラリーに電場を与えず、試料をキャピラリーから注入した同じ装置では、光子の放出検出に関する時間のずれ(j)はすべての分子について同じであり、注入スピードに関連する。
相互相関は、2つの生データの組gjおよびhkを解析にかけて、それぞれの検出器(好ましくは光検出器)からのデータの組を以下の式に当てはめる。
色素:本明細書において用いられる「色素」なる用語は、色材に用いられる物質または発光もしくは蛍光を生じることが可能な物質を意味する。色素は、特定の波長の吸収光または放射光であってよい。色素は、プローブおよび/または標的に、挿入され、非共有結合しまたは共有結合していてもよい。色素はそれ自身、副溝(minor groove)、十字型、ループまたはその他の立体構造を有する核酸のエレメントを検出するプローブのようにプローブを構成する。色素としてはBODIPYおよびALEXA色素、Cy[n]色素、STBR色素、臭化エチジウムや関連の色素、アクリジノレンジ、二量体シアニン色素、例えばTOTO、YOYO、BOBO,TOPROおよびPOPOおよびそれらの誘導体、ビス−ベンズイミド、OliGreen、PicoGreenおよび関連の色素、シアニン色素、フルオレセイン、LDS751、DAPI、AMCA、カスケードブルー、CL−NERF、ダンシルジアルキルアミノクマリン、4',5'−ジクロロ−2',7'−ジメトキシフルオレセイン、2',7'−ジクロロフルオレセイン、DM−NERF、エオシン、エリスロシン、フルオロセイン、ヒドロキシクマリン、イソスルファンブルー、リサミンローダミンB、マラカイトグリーン、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、NBD、オレゴングリーン、PyMPO、ピレン、ローダミン、ローダルグリーン、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、X−ローダミンおよびプローブまたは標的と相互作用するかコンジュゲートを形成するその他の色素が挙げられる。当業者は、本発明の範囲内で用いることができるその他の色素を認識するであろう。限定的なリストではなく、本発明の標識されたヌクレオチドを検出するために使用することができる、現在知られているまたは将来知られるすべての色素を包含する。
プローブ:本明細書において用いられる「プローブ」は、標的に存在する特定のヌクレオチド配列を同定するために用いることができる、定義された核酸断片、または生物化学的または生物学的分子または複合体を意味する。定義された核酸断片は、同定される特定のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。
蛍光寿命:本明細書において用いられる「蛍光寿命」なる用語は、N個の励起蛍光の集団が、蛍光およびその他の不活性化経路による励起エネルギーの消失によりN/eに指数関数的に減少するのに必要な時間を意味する。
蛍光偏光:本明細書において用いられる「蛍光偏光」なる用語は、液体中の蛍光性分子が平面偏光により励起されると、蛍光性分子中のフルオロフォアが励起状態で定常状態を維持しているとき、同一平面に偏光蛍光を発する(即ち、その光は偏光を保持する)、平蛍光分子の特性を意味する。
質量:本明細書において用いられる「質量」なる用語は、力と加速度に関連する物理的な「比例の定数」を意味する。
正味電荷:本明細書において用いられる「正味電荷」なる語は、ある分子についてひとまとめにしたすべての原子の電荷の極性を考慮に入れた合計を意味する。
形:本明細書において用いられる「形」なる語は、分子または分子複合体の3次元構造および分子または分子複合体が溶液中にあるときのそのような3次元構造の変化した形を意味する。
拡散:本明細書において用いられる「拡散」なる語は、分子の1つの場所から別の場所へのゆっくりとした移動を意味する。
電気泳動速度:本明細書において用いられる「電気泳動速度」なる語は、バックグラウンドの電解質に対する電場の影響下での荷電したまたは非荷電の分析対象の速度を意味する。キャピラリーシステムにおける電気泳動速度は、動電気学的速度および電気浸透力の複合的指標である。
蛍光:本明細書において用いられる「蛍光」なる語は、通常高い周波数の放射による照射中の金属からの、または電子の衝撃に由来する、放射物、通常は光、を意味する。
蛍光強度:本明細書に置いて用いられる「蛍光強度」は、蛍光試料からの放射を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される光子の数(好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の)を意味する。
発光:本明細書において用いられる「発光」なる語は、温度の上昇以外の何らか理由に関する物質からの光の放出を意味する。
発光強度:本明細書において用いられる「発光強度」は、発光試料からの発光を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される発光の数(好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の)を意味する。
化学発光:本明細書において用いられる「化学発光(Chmiluminescence)」なる語は、科学的エネルギーの光エネルギーへの直接の変換によって生じる発光を意味する。化学発光(Chmoluminescence)ともいう。
化学発光強度:本明細書において用いられる「化学発光強度」なる語は、化学発光試料からの発光を測定する検出システムの出力を意味する。さらに、単位時間あたりに検出される光子の数(好ましくはミリ秒および好ましくはバックグラウンドの閾値以上の)を意味する。
光吸収:本明細書において用いられる「光吸収」なる語は、対象または物質によって反射されない光エネルギー(波長)を意味する。
電気共鳴:本明細書において用いられる「電気共鳴」は、ある部分のインダクタンスまたは容量によるAC電流に与えられる抵抗を意味する。
PNA:本明細書において用いられる「PNA」は、ペプチド核酸(PNA)オリゴマー(新しいクラスの分子:リン酸骨格が変化しない「ペプチド様」(ポリアミド)骨格で置き換わっているDNAの類縁体(模擬体))を意味する。
LNA:本明細書中において用いられる「LNA」は、新規なクラスの核酸類縁体である、ロックされた核酸(Locked Nucleic Acids)を意味する。LNAモノマーは、2'-O位を4'C−位に連結するメチレンリンカーによって制限されたフラノース環立体配置を含むRNAヌクレオシドと構造的に類似する二環系化合物である。便宜上、1またはそれ以上のLNA修飾を含むすべての核酸はLNAと称する。LNAオリゴマーはワトソン−クリック塩基対の規則に従い、相補的なオリゴクレオチドとハイブリダイズする。LNAプローブの設計、合成およびハイブリダイゼーションは当分野において周知である。
DNX:本明細書において用いられる「DNX」は、1またはそれ以上の架橋ヌクレオチドアナログからなる核酸プローブを意味する。このアナログは、ハイブリダイゼーションによりプローブと標的核酸との間の共有結合を促進し、架橋を起こすために光活性化を必要とする。
表現型:本明細書において用いられる「表現型」なる語は、目視できる、検出可能なまたはさもなければ測定可能な生物の特性、例えば疾患の症状、または疾患のかかりやすさ等を意味する。
ハイブリダイゼーション:本明細書において用いられる「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基の対合による2本の一本鎖核酸による二本鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖の間で、またはミスマッチのマイナーな領域を含む核酸鎖の間で起こり得る。二対立遺伝子マーカーの一形態とハイブリダイズし、他のものとはハイブリダイズしないようにし、それゆえ2つの異なる対立遺伝子の形態を識別することができるように特異的なプローブを設計することができる。対立遺伝子特異的なプローブは、対で用いることができ、対の1つはもとの対立遺伝子を含む標的配列と完全な一致を示し、他方は、別の対立遺伝子を含む標的配列と完全な一致を示す。ハイブリダイゼーションの条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度の有意の違い、好ましくは、それによって対立遺伝子の一方に対してのみハイブリダイズする、本質的に二元的な応答が存在する十分にストリンジェントな条件である。プローブが正確に相補的な標的配列に対してのみハイブリダイズする、ストリンジェントな、配列特異的なハイブリダイゼーション条件は、当分野において周知である(Sambrook etal., Molecular Cloning--A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N. Y. , 2001)。ストリンジェントな条件は配列に依存し、種々の状況において異なる。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度とpHにおいて特定の配列について、熱融点(Tm)よりも約5℃低い温度になるように選択する。
多重プローブハプロタイプ決定法の応用
ディプロイド細胞は任意の遺伝子または少なくとも1つの識別可能な変異を有するいずれか一方の染色体断片において2つのハプロタイプをディスプレイする。ハプロタイプ変異は多くの良く研究されている単一ヌクレオド変異、例えば単一ヌクレオチド多型よりもより密接に相関している。従って、ハプロタイプの研究は、疾患の素因または感受性、治療的介入に対する応答および医薬において目的とするその他の表現型を含む様々な表現型の遺伝子的基礎を理解するのに価値がある。
ディプロイド細胞は任意の遺伝子または少なくとも1つの識別可能な変異を有するいずれか一方の染色体断片において2つのハプロタイプをディスプレイする。ハプロタイプ変異は多くの良く研究されている単一ヌクレオド変異、例えば単一ヌクレオチド多型よりもより密接に相関している。従って、ハプロタイプの研究は、疾患の素因または感受性、治療的介入に対する応答および医薬において目的とするその他の表現型を含む様々な表現型の遺伝子的基礎を理解するのに価値がある。
第一世代のマーカーは、RFLPであり、これは制限フラグメントの長さを変える変異である。しかし、RFLPを同定しタイピングするのに使用される方法は、比較的、材料と時間を多く消費する。第2世代の遺伝子マーカーはVNTRであり、これはミニサテライトまたはマイクロサテライトのいずれかに分類される。ミニサテライトはタンデムリピートDNA配列が5〜50リピートの単位で存在し、0.1〜20キロベースの長さにわたってヒト染色体の領域に分布している。これらは多くの可能性のある対立遺伝子を示すので、それらの情報量は非常に多い。ミニサテライトは、サザンブロッティングを行って試験を行う人の核酸試料に存在するタンデムリピートの数を同定することによりスコアリングを行う。しかしながら、サザンブロッティングによってタイピングできる可能性のあるVNTRは104個に過ぎない。さらに、RFLPおよびVNTRマーカーはいずれも、開発と大量の分析にコストと時間がかかる。
SNPまたは二対立遺伝子マーカー等のGVはRFLPやVNTRと同様に用いることができるがいくつかの利点を有する。SNPはヒトゲノムにおいて多く存在し最も頻度の高い種類の変異である。推定107を超える数の部位がヒトゲノムの3×109塩基対に散在している。従って、SNPは、RFLPまたはVNTRマーカーよりも頻度が高く一様に存在し、そのようなマーカーは目的の遺伝子座の近傍に見られるという可能性が大きいことを意味する。SNPはVNTRマーカーよりも変異が少ないが変異はより安定している。
さらに、特徴付けられたSNPの異なる形態は容易に識別されることが多いので、慣用的に容易にタイプ分けすることができる。二対立遺伝子マーカーは単一ヌクレオチドベースの対立遺伝子を有し、これらは2つの共通する対立遺伝子のみを有し、高度な平行検出と自動化されたスコアリングが可能である。従って、本発明の方法は、大量の個人の、迅速で高スループットのハプロタイプ分析の可能性をもたらす。
二対立遺伝子マーカーはゲノムに数多く存在し、情報量が十分で多数の解析が可能である。これら利点の複合的効果は家族における連鎖解析、アレル共有法、集団における連鎖不均衡試験、ケースコントロール集団の関連試験に用いることができる。二対立遺伝子マーカーは複雑な形質に関わる遺伝子を同定するために行うための関連試験が可能である。関連試験は、無関係のケースおよび対照集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度を調べ、一般に多遺伝子性または特発性の形質の決定に用いられる。関連試験は、通常の集団において行われ、罹患家族の関係する人に対して行う試験(連鎖試験)には限定されない。異なる遺伝子にける二対立遺伝子マーカーを、疾患または処置に対する応答との直接の関連について平行にスクリーニングすることができる。
この多重遺伝子法は、特定の表現型、薬物応答、特発性の形質または複合的な遺伝的病因を有する疾患の状態に対する複数の遺伝子因子の相乗効果を調べるための必要な統計的検出力を与えるので、様々なヒト遺伝子試験にとっての強力なツールである。
ハプロタイプ決定に関する本発明の一態様では、標的ゲノムDNAは1またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて断片に切断する。任意の核酸供給源を、精製されたまたは精製されていない形態で出発核酸として用いることができるが、目的とする特定の核酸配列を含んでいるまたは含んでいると考えられる。DNAまたはRNAは細胞、組織、体液などから以下に記載するようにして抽出することができる。本発明の遺伝子分析法において用いるための核酸は任意のほ乳類の供給源から得ることができるが、核酸試料を得る試験対象および個人は好ましくはヒトである。
解析に付するゲノムDNAの供給源に関しては、生体から得た任意の試料を特に制限されることなく用いることができる。これらの試料としては、本明細書に記載された本発明の方法によって試験することができる生物学的試料が挙げられ、ヒトおよび動物の体液が挙げられる。全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液および呼吸器系、消化器系および泌尿生殖器系の様々な外分泌物、涙、唾液、乳、白血球細胞、骨髄腫など;生物学的液、例えば培養細胞上清;腫瘍および非腫瘍組織およびリンパ節組織を含む固定組織標本;および骨髄穿刺液および固定細胞標本。本発明において用いられるゲノムDNAの好ましい供給源は、各ドナーの末梢静脈血から得る。生物学的試料からゲノムDNAを調製する技術は当業者に周知である。
例えば、DNA試料を以下のようにして末梢血静脈血から調製することができる:30mLの末梢静脈血をEDTAの存在下でドナーから採取する。細胞(ペレット化した)を2000rpmにて10分間の遠心により集める。赤血球を溶解液(最終体積50mL:10mMTris(pH7.6);5mM MgCl2)中で溶解してもよい。次いで、溶解溶液中でペレットを再懸濁した後、上清中に残っている赤血球を除去するのに必要な回数溶液を遠心する(10分間、2000rpm)。次いで白血球のペレットを、(a)3mLのTE10−2(Tris−HCl 10mL、EDTA2mM)/NaCl 0.4M;(b)200μL SDS 10%;および(c)500μLプロテイナーゼK(TE10−2/NaCl 0.4M中2mgのプロテイナーゼ)からなる溶解溶液3.7mLを用いて42℃にて一晩溶解した。
上記の静脈血血清、またはゲノムDNAの任意の供給源から得られた標的核酸の2本鎖をエンドヌクレアーゼにより断片に消化し、分離する。以下に記載するプロトコルに依存して、単一の又は異なるGV部位に特異的ないずれか一方または2つのプローブペプチド核酸(PNA)(本明細書の一部を構成する米国特許第5,539,082号(Nielsen))を核酸標的にハイブリダイゼーションさせることができる。標的核酸およびGVプローブのハイブリダイズした混合物を解析して個人の標的核酸断片に対する1または2つのGVプローブの同時の結合を検出する。
当分野で知られている任意のGVマーカーを、本明細書に記載されたハプロタイプ分析法、例えば以下の表1のウェブサイトのいずれかにおいて、本発明の標的ゲノムDNAおよびmRNAと共に用いることができる。
表1
The Genetic Annotation Initiative (http://Ipg.nci.nih.gov/lpg_small)
NIHは一般に癌および腫瘍形成に関連すると考えられるSNPの候補に関する情報を含むサイトを運営している。
dbSNP Polymorphism Repository (http://www.ncbi.nim.nih.gov/SNP/)
生物医学の研究において広範に利用可能なSNPに関する情報を含む、NIHが運営するより包括的なデータベース。
HUGO Mutation Database Initiative (http://ariel.its.unimelb.edu.au/-cotton/mdi.htm)
SNPを含むヒトの突然変異に関する情報に系統的にアクセスするように作られているデータベース。本サイトはHuman Genome Organization (HUGO)によって運営されている。
ヒトSNPデータベース (http:/lwww-genome.wi.mit.edu/snp/human/index.html)
Whitehead Institute for Biomedical Research Genome Instituteにより運営。
本サイトは、マッピングおよび配列決定についての数多くのWhiteheadリサーチプロジェクトによって生じたSNPについての情報を含む。
ヒトゲノムSNPデータベースにおける日本人のSNP(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)
本サイトは、染色体によって体系化されたSNPへのアクセスを提供している。
本サイトは東京大学によって運営されている。
HGBase (http://hgbase.interactiva.de/)
HGBASEはヒトゲノムにおけるすべての既知の配列変化をまとめ、遺伝子型が一般的な疾患、薬物応答、およびその他の表現型にどのように影響を及ぼすかを調査しする試みであり、スェーデンのKarolinska研究所により運営されている。
SNPコンソーシアムデータベース(http://snp.cshl. org/)
大手製薬および情報処理企業の協力によって得られたSNPおよび関連情報のコレクション。
GeneSNPs (http://www.genome.utah.edu/genesnps/)
ユタ大学によって運営されており、本サイトは、遺伝子の変化と環境刺激および生体異物との間の関係を理解に向け、アメリカ環境衛生研究所の主導によって得られたSNPに関する情報が含む。
GVプローブのハイブリダイゼーションは、単一分子電気泳動によって検出する(Castro, A.,et a/., Single-molecule electrophoresis, Anal. Chem. 67 (18): 3181-86 (1995))。図1および2に示した単一分子電気泳動装置は、蛍光タグを有する個々の分子を検出するための超高感度の手段である。
表1
The Genetic Annotation Initiative (http://Ipg.nci.nih.gov/lpg_small)
NIHは一般に癌および腫瘍形成に関連すると考えられるSNPの候補に関する情報を含むサイトを運営している。
dbSNP Polymorphism Repository (http://www.ncbi.nim.nih.gov/SNP/)
生物医学の研究において広範に利用可能なSNPに関する情報を含む、NIHが運営するより包括的なデータベース。
HUGO Mutation Database Initiative (http://ariel.its.unimelb.edu.au/-cotton/mdi.htm)
SNPを含むヒトの突然変異に関する情報に系統的にアクセスするように作られているデータベース。本サイトはHuman Genome Organization (HUGO)によって運営されている。
ヒトSNPデータベース (http:/lwww-genome.wi.mit.edu/snp/human/index.html)
Whitehead Institute for Biomedical Research Genome Instituteにより運営。
本サイトは、マッピングおよび配列決定についての数多くのWhiteheadリサーチプロジェクトによって生じたSNPについての情報を含む。
ヒトゲノムSNPデータベースにおける日本人のSNP(http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/)
本サイトは、染色体によって体系化されたSNPへのアクセスを提供している。
本サイトは東京大学によって運営されている。
HGBase (http://hgbase.interactiva.de/)
HGBASEはヒトゲノムにおけるすべての既知の配列変化をまとめ、遺伝子型が一般的な疾患、薬物応答、およびその他の表現型にどのように影響を及ぼすかを調査しする試みであり、スェーデンのKarolinska研究所により運営されている。
SNPコンソーシアムデータベース(http://snp.cshl. org/)
大手製薬および情報処理企業の協力によって得られたSNPおよび関連情報のコレクション。
GeneSNPs (http://www.genome.utah.edu/genesnps/)
ユタ大学によって運営されており、本サイトは、遺伝子の変化と環境刺激および生体異物との間の関係を理解に向け、アメリカ環境衛生研究所の主導によって得られたSNPに関する情報が含む。
GVプローブのハイブリダイゼーションは、単一分子電気泳動によって検出する(Castro, A.,et a/., Single-molecule electrophoresis, Anal. Chem. 67 (18): 3181-86 (1995))。図1および2に示した単一分子電気泳動装置は、蛍光タグを有する個々の分子を検出するための超高感度の手段である。
レーザーエピイルミネーションを共焦点蛍光検出と組み合わせて用い、極めて少量の溶媒を試験する。2つの励起レーザー10および12を顕微鏡の対物レンズ14を介して焦点を合わせ、少なくとも1つのプローブで標識したDNA試料を励起する。DNA希釈溶液を用いると、標識したDNAフラグメントは焦点を合わせたレーザービーム内には一定時間存在しないであろう。個々のDNAが励起領域に拡散するとき、DNAの標識は検出可能になる。蛍光は顕微鏡の対物レンズ14によって集められ、多色ビームスプリッタ13を通過し、二色ビームスプリッタ15内で2つの感光光子計測検出器16および18の間に分光される。
例示した装置は、前掲のCaiらによって示されている周知のレーザーエピイルミネーションおよび共焦点蛍光発光集光の設計に基づいている。試料24のプローブ体積の直線寸法は、1フェムトリットル(fl)(Ringlerら、1993)のオーダーのプローブ体積になる、ミクロンまたはそれ以下のオーダーである。レーザー10または12は、レーザー光線との接触によって励起されるプローブ検出の性質によって特定の波長で作動させることができる。例えば、レーザー10は、496nmでAr+レーザーによりフルオレセインのフルオロフォアを励起する。レーザー12は、633nmで作動するヘリウムネオンレーザーでフルオロファアN,N'−ビスカルボキシペンチル−5,5−ジスルフォナートピンドジカルボシアニン(Cy5)を励起することができる。
検出器16および18は1個の光子の計測が可能な光ダイオードである。検出器16の検出チャネルは、例えばフルオレセイン発光を検出のためにバンドパスフィルター(フィルターは示さず)がかけられている。検出器18からの検出チャネルは、例えばCy5発光を検出するためのバンドパスフィルター(フィルターは示さず)がかけられている。顕微鏡の対物レンズ14の画像のピンホール17は、オーバーラップする、焦点のあったレーザービームの直近への2つの検出器16および18の視野を制限する。
第1の態様では、液体の試料を含む細いガラス製キャピラリーチューブにレーザー光線を光学的に焦点を合わせる(図2)。電流をチューブ内の溶液に与え、融通のきかない(in lockstep)チューブ内に蛍光分子を移動させる。分子は各レーザービームを通過するので、各蛍光分子の発光が起こる。別のフラクション内で、励起分子の解放が起こり、検出可能な集中的発光が起きる。各分子がレーザービームを通過するのにかかる時間、各分子による励起発光サイクルが何回も繰り返される。1個の蛍光分子からの発光を入射ビームに対して直角に集め、光検出器上の顕微鏡の対物レンズによって焦点を合わせる。フィルターを用いてレーザーからの励起光を検出器に到達するように維持する。2つのレーザービーム間の蛍光分子の通過時間を測定する。2つのレーザー光線の間を蛍光分子が通過する時間を測定する。この特徴的な電気泳動的速度は各分子の大きさ、電荷および形に依存する。電気泳動的速度は、記載したハプロタイプ分析法の特定の態様においてプローブおよび標的分子を識別するために用いられるパラメーターの1つである。装置は、1秒間あたり数百個を検出する。
第2の態様では、この例示した装置において、標的DNAの希釈溶液中の1マイクロタイター滴(例えば、5マイクロリットル)の試料24を顕微鏡カバーガラスの下側で懸濁する。カバーガラスを読取台にマウントして蛍光検出プローブ体積を、レーザーで試料の滴の体積をスキャンする。パーソナルコンピュータ22には、2つの検出チャネル間の相互相関を実時間で計算するデジタル相関カード(ALV5000/E)が格納されている。
試料24中の個々のDNAフラグメントが、顕微鏡の対物レンズ14によって定義される励起領域を拡散するとき、DNAフラグメント上の蛍光標識されたプローブは蛍光を発する。蛍光は集められ、2つの高感度検出器16および18の間に分光される。1つのハイブリダイゼーションプローブのみを有するDNAフラグメントからのシグナルは、1つの検出器によってのみ記録される。各検出器によって記録された強度をコンピュータ22によって相互相関し、例えば1または2のプローブが同じDNAフラグメントに存在している場所を探す。
単一分子電気泳動
単一分子電気泳動法は、個々の分子の電気泳動速度−電場の影響下で溶液中を分子が移動する速度−の測定からなり、測定された速度を、特定の分子種に特徴的な速度と比較することによって分子を同定する。分子の電気泳動速度は、大きさ、形およびイオン電荷およびその分子が含まれる溶液の化学的環境によって決まる。従って、電気泳動速度は、各分子種に独特の同定指標を与える。
単一分子電気泳動法は、個々の分子の電気泳動速度−電場の影響下で溶液中を分子が移動する速度−の測定からなり、測定された速度を、特定の分子種に特徴的な速度と比較することによって分子を同定する。分子の電気泳動速度は、大きさ、形およびイオン電荷およびその分子が含まれる溶液の化学的環境によって決まる。従って、電気泳動速度は、各分子種に独特の同定指標を与える。
単一分子電気泳動は2つの光線に分光されるレーザー源、試料コンパートメント、集光光学系、2つの単光子検出器、およびコンピュータ制御の検出電子部品からなる。試料コンパートメントは、2つのリザーバを含み、一方は陽極で他方は陰極である。リザーバには分析中の溶媒を保持し、チューブによってキャピラリーセルにつながっている。キャピラリーセルに焦点を合わせた2つのレーザー光線は、250ミクロンの距離離れた5ミクロンのスポットを生じる。
電極に電圧をかけると、溶液中の分子はその分子の電荷に依存して陽極または陰極へ向かって移動する。溶液中の個々の分子は2つのレーザー発光のスポットを通過するときに蛍光を発する。次いで、各々の発光に由来する光子は顕微鏡の対物レンズによって集められて、単光子アバランシェ光ダイオードによって検出される。検出電子回路は、時間開閉ウィンドゥ(tima-gated window)セットを用いて遅延蛍光光子のみを検出することにより、ラマン効果およびレイリー散乱を排除する。装置は各分子が2つのレーザー光線の間を通過するのにかかった時間を測定し、この情報を用いて分子の電気泳動速度を計算する。次いで、コンピュータは、試料中ですべての化学種についてピークを示す電気泳動速度のヒストグラムを作成する。
単一分子電気泳動法は、分子の蛍光を測定することに依存するものであるが、その分子に蛍光タグ分子を付加することにより非蛍光分子も検出することができる。さらに、実験条件のいくつか、特に緩衝液の組成、pH、粘度、キャピラリーの内側表面のコーティング、励起および発光波長は、分析される具体的な試料化合物の最良の分離を達成するように最適化することができる。実際、キャピラリー電気泳動について特別に開発された分析プロトコルの多くは本方法に直接応用することが可能である。長年、研究者たちは、小さい有機分子や無機イオンから様々な種類の薬物や天然物に及ぶ多くの様々な化学種の分離のために様々なキャピラリー電気泳動法の最適化を行ってきた。
本明細書に記載された新しい方法は、自由溶液キャピラリー電気泳動(システム自動化、スピードおよび再現性)の利点と単一分子の検出の卓越した感度とを併せ持つことになる。本方法の感度および汎用性は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはその他の方法を用いる大規模なDNA増幅を行うことなく、蛍光イムノアッセイ、ハイブリダイゼーション、およびDNAフィンガープリンティング法の開発に道を開き得る。PCRは効果の高い増幅メカニズムであるが、多数のPCRサイクルの使用は汚染によっておよびまだ完全に理解されていないメカニズムによって生じる不明確性を誘発することがある。単一のフルオロフォア、核酸およびタンパク質の混合物の分析に関する能力が示される上に、本法は、試料成分の超高感度な分析を必要とする他の多くの分野に応用することができる。
上記のようにして調製された試料は四角のガラス製キャピラリーチューブ(一辺200μm)に注入される。直径5μmの円形のレーザー光線を、試料を入れたキャピラリーを垂直に通過させる。レーザーで誘発された蛍光を、入射レーザー光線に対して直角に配置させた適当な高感度検出器(単光子アバランシェ光ダイオード、即ち「SPAD」)を用いて検出する。このシステムのインターロゲーション体積(interrogation volume)は、レーザー光線の直径と検出器への光を検出する光学系によって選択されたレーザー光線の一部(セグメント)によって決定される。この例では、インターロゲーション体積を適当な試料濃度で、単一分子(単一の核酸標的フラグメント)が、観察を行っている間の各時間間隔の間のインターロゲーション体積中に存在するように設定する。
2つの検出器を用いる。各検出器についての光路は、レーザー光線の同じ領域に向けられており、それ故、各検出器は同一の用量を「問い合わせる」。2つの異なるペプチド核酸GVプローブを用い、各プローブはそれぞれ、同じDNA鎖にある異なるGVにハイブリダイズする。一方のプローブは、蛍光ローダミン6Gで末端が標識されており、もう一方のプローブは蛍光BODIPY−TRで末端が標識されている。532nmでプローブを励起し、各プローブは蛍光を異なった識別できる波長の蛍光を発する。各検出器への光路には、各SPADが実験に用いた2つの蛍光GVプローブのうちの1つのみを検出するように光フィルターが組み込まれている。2000ボルトの電圧を試料に通すと、試料成分がキャピラリーを移動する。データを、2ms間隔で連続的に各々の検出器で観察された多数の蛍光光子から集める。集めたデータを解析して蛍光がいつ両波長で同時に検出されたのかを求める。両GVプローブの同時検出は、両GVプローブが単一の核酸フラグメントにハイブリダイズしたことを示している。1pM以下のプローブ濃度で、蛍光プローブの同時検出は起こらない。結果として、ホモジニアスな分析方式を用い、結合しなかったプローブを試料を分析する前に除去する必要はない。これは、DNAを検出するための、Castroら (Single-molecule detection of specific nucleic acid sequences inunamplified genomic DNA, Anal. Chem. 69 (19): 3915-20 (1997))によって示されているフローサイトメトリー法と類似している。ゲノムDNAが標的である場合、2つのPNAプローブのハイブリダイゼーションは、個々のDNAフラグメントにおけるGVプローブに対するハプロタイプを示す。
蛍光の代替法を用い、同時または逐次のプローブと標的との相互作用を検出することができる。検出可能なパラメーターには、質量、電荷、形、蛍光寿命、蛍光極性、核酸などが挙げられる。プローブは核酸、オリゴヌクレオチド、PNA、LNA、ペプチド、タンパク質または特にGV部位と相互作用し得る任意の他の分子であってよい(本明細書の一部を構成するNielsenの米国特許第5,539,082号;http://www.exiquon.com(最後にアクセスした日2002年10月24日)を参照)。プローブは1つのパラメーターに影響を及ぼし、または複数のパラメーターを分析し、各パラメーターは1またはそれ以上のプローブによって影響される。
同時2プローブハプロタイプ分析
本発明のべつの態様では、1つの蛍光GVプローブと1つのマスGVプローブ(非蛍光)を用いる。マスプローブは、単一のペプチド核酸(PNA)15マーに共有結合した単一のナノスフェアからなる。使用したナノスフェアを合成し、精製して推定の分子量と電荷を有するナノスフェア集団を作製する(Bhalgat, M. K., et al., Green-and red-fluorescent nanospheres for the detection of cell surface receptors by flow cytometry, J. Immunol. Methods 219 (1-2): 57-68 (1998))。その結果、ナノスフェア−PNAプローブもまた推定の分子量と電荷を有する。キャピラリー中の試料溶液に電流を流すと、溶液中の分子が、各分子の電荷/質量比に依存する速度でキャピラリーを移動する。
第2のレーザー光線と関連する光検出器を第1の光線/検出器の下流のキャピラリー上に向ける。第2のレーザー光線は、第1のレーザー光線を通過する分子が第2のレーザー光線も同様に通過するよう設定する。両レーザー光線/検出器システムは第1のGVプローブからの蛍光を測定する。
本発明のべつの態様では、1つの蛍光GVプローブと1つのマスGVプローブ(非蛍光)を用いる。マスプローブは、単一のペプチド核酸(PNA)15マーに共有結合した単一のナノスフェアからなる。使用したナノスフェアを合成し、精製して推定の分子量と電荷を有するナノスフェア集団を作製する(Bhalgat, M. K., et al., Green-and red-fluorescent nanospheres for the detection of cell surface receptors by flow cytometry, J. Immunol. Methods 219 (1-2): 57-68 (1998))。その結果、ナノスフェア−PNAプローブもまた推定の分子量と電荷を有する。キャピラリー中の試料溶液に電流を流すと、溶液中の分子が、各分子の電荷/質量比に依存する速度でキャピラリーを移動する。
第2のレーザー光線と関連する光検出器を第1の光線/検出器の下流のキャピラリー上に向ける。第2のレーザー光線は、第1のレーザー光線を通過する分子が第2のレーザー光線も同様に通過するよう設定する。両レーザー光線/検出器システムは第1のGVプローブからの蛍光を測定する。
特注のソフトウェアを用いて、蛍光分子が第1の検出器と第2の検出器の間を通過するのにかかる時間を測定する。この移動時間(電気泳動速度)は、観察された分子または複合体の電荷/質量比に依存する。このシステムでは、3種類の蛍光分子/複合体が観察可能である:
(a)蛍光プローブ;
(b)蛍光プローブ+標的;および
(c)蛍光プローブ+マスプローブ+標的。
この3種類の分子は各々、溶液中での特定の移動時間を有しており、識別することができる(Long, D., et al., Electrophoretic mobility of composite objects in free solution: application to DNA separation, Electrophoresis 17 (6): 1161-6 (1996))。この例では、プローブ−標的の蛍光を測定することにより同時発光が検出され、マスプローブと結合することにより電気泳動速度の変化(変化した電荷/質量比)が生じた。
(a)蛍光プローブ;
(b)蛍光プローブ+標的;および
(c)蛍光プローブ+マスプローブ+標的。
この3種類の分子は各々、溶液中での特定の移動時間を有しており、識別することができる(Long, D., et al., Electrophoretic mobility of composite objects in free solution: application to DNA separation, Electrophoresis 17 (6): 1161-6 (1996))。この例では、プローブ−標的の蛍光を測定することにより同時発光が検出され、マスプローブと結合することにより電気泳動速度の変化(変化した電荷/質量比)が生じた。
逐次2プローブハプロタイプ分析
標的核酸との逐次的相互作用もまたハプロタイプの決定に用いることができる。プローブと標的核酸との逐次的相互作用は、ある時間間隔を置いて単一の検出器で、または別個の検出器で検出することができる。特定の標的分子を識別する手段が維持される限り、プローブの逐次的相互作用を検出することができる。逐次的プローブ結合の検出は、1またはそれ以上のプローブが標的核酸と強固に結合しない条件の下では特に有用である。
標的核酸との逐次的相互作用もまたハプロタイプの決定に用いることができる。プローブと標的核酸との逐次的相互作用は、ある時間間隔を置いて単一の検出器で、または別個の検出器で検出することができる。特定の標的分子を識別する手段が維持される限り、プローブの逐次的相互作用を検出することができる。逐次的プローブ結合の検出は、1またはそれ以上のプローブが標的核酸と強固に結合しない条件の下では特に有用である。
標的核酸との逐次的なプローブ相互作用をモニターする例を示す。この例では、プローブはマスプローブ(PNA+ナノスフェア)と蛍光オリゴヌクレオチドプローブからなる。この例では標的核酸フラグメントも蛍光を発する。標的プローブおよび第2のプローブは、異なった識別可能な波長の蛍光を発する。個々の蛍光標的核酸フラグメントは、それらフラグメントが電場に応答してガラス製キャピラリーを通過するように通る。キャピラリーの長さに沿ってレーザー誘導の蛍光を発するようにレーザー光線を作成し、蛍光を検出するためにCCD探知器を用いる。キャピラリーを移動する蛍光標識した核酸フラグメントはCCD検出器でピクセルからピクセルに移動することが観察される(Shortreed, M. R.,et al;., High-throughput single-molecule DNA screening based on electrophoresis, Anal. Chem. 72 (13): 2879-85 (2000))。核酸は一定の電荷/質量を有し、結果としてすべてのフラグメントはある特定の速度でシステムを移動する。マスプローブに結合した核酸フラグメントは、新たな、特定の速度(電荷/質量比の変化のために)を有する。核酸標的が第2のプローブに関連した波長で蛍光性になると第2のプローブの結合は検出される。
遺伝子領域におけるいくつかのGV部位の複数の分析を、各GV部位に関する異なった、識別可能な特徴を用いることによって、本発明を用いて1回の分析で行うことができる。例えば、4つのプローブ−識別可能な蛍光を有する2つのプローブと2つのマスプローブ(それぞれ異なる、識別可能な質量)を、蛍光プローブから識別可能な蛍光標的と共に使用することができる。このようなシステムを用いて4つの異なるGV部位にあるハプロタイプを決定することができる。
標的およびプローブの単一粒子電気泳動(Castro, et al., Anal. Chem. 67, 前掲)を本発明とともに用いて複数の遺伝子領域を1回の分析で分析することができる。各遺伝子領域は複数のGV部位について解析することができる。本発明のこの応用では、各標的の遺伝子領域(核酸フラグメント)が分析される領域から電気泳動的に識別可能なように、標的フラグメントのサイズを確定する。同様に、分析される遺伝子領域のそれぞれについてプローブおよび標的の種々の組合せが電気泳動的に識別可能なように、プローブ質量と電荷を確立する。結果として、電荷/質量比を用いて遺伝子領域を同定し、標的とのプローブ相互作用を変化した電荷/質量比または別のプローブパラメーター(蛍光等)によって検出する。
実施例
以下の実験例は説明を目的として記載するものであって限定ではない。
実施例1−ハプロタイプ単一プローブ検出
ハプロタイプを決定するための本発明の一態様では、第1のGV部位を特定のオリゴヌクレオチドプライマーによって検出する。熱DNAポリメラーゼを用いて転写をプライマーから開始し、伸張産物を作製する。熱サイクルを30サイクル反復して複数の伸張産物を各テンプレートから作製する。伸張産物上の下流のGVとハイブリダイズする単一の蛍光PNAプローブ(Alexa680色素)を、PNAの伸張産物とのハイブリダイゼーションが可能な条件下でこの伸張産物に付加する。室温で30分インキュベーションした後、ハイブリダイズしなかったPNAを、Microcon 30 YMフィルター/濃縮器を用いて試料の遠心することにより試料から除去する。フィルターに残った試料物質を30mMのgly−gly緩衝液(pH8.2)に懸濁する。伸張産物に第2のGV部位が存在すれば、Microconフィルターに残った試料に伸張産物−PNAハイブリッドが含まれているであろう。試料を希釈して、伸張産物の推定最終濃度10〜500fMにする。試料の励起は、出力が各レーザー光線あたり1.5mWで635nmの励起波長の固体レーザーを用いて行った。2つのレーザー光線とAlexa680色素からの蛍光を検出するのに適当な2つの検出器を上記に記載したように用い、試料中の分子の電気泳動速度を測定する。フリーのPNAの速度以外の速度を有する蛍光分子を計測する。このような分子は、伸張産物−PNAハイブリッドを示し、ハプロタイプを示すことに供する。
以下の実験例は説明を目的として記載するものであって限定ではない。
実施例1−ハプロタイプ単一プローブ検出
ハプロタイプを決定するための本発明の一態様では、第1のGV部位を特定のオリゴヌクレオチドプライマーによって検出する。熱DNAポリメラーゼを用いて転写をプライマーから開始し、伸張産物を作製する。熱サイクルを30サイクル反復して複数の伸張産物を各テンプレートから作製する。伸張産物上の下流のGVとハイブリダイズする単一の蛍光PNAプローブ(Alexa680色素)を、PNAの伸張産物とのハイブリダイゼーションが可能な条件下でこの伸張産物に付加する。室温で30分インキュベーションした後、ハイブリダイズしなかったPNAを、Microcon 30 YMフィルター/濃縮器を用いて試料の遠心することにより試料から除去する。フィルターに残った試料物質を30mMのgly−gly緩衝液(pH8.2)に懸濁する。伸張産物に第2のGV部位が存在すれば、Microconフィルターに残った試料に伸張産物−PNAハイブリッドが含まれているであろう。試料を希釈して、伸張産物の推定最終濃度10〜500fMにする。試料の励起は、出力が各レーザー光線あたり1.5mWで635nmの励起波長の固体レーザーを用いて行った。2つのレーザー光線とAlexa680色素からの蛍光を検出するのに適当な2つの検出器を上記に記載したように用い、試料中の分子の電気泳動速度を測定する。フリーのPNAの速度以外の速度を有する蛍光分子を計測する。このような分子は、伸張産物−PNAハイブリッドを示し、ハプロタイプを示すことに供する。
別法として、試料が検出キャピラリーを介して注入され電場が存在しないような条件下で、上記で調製した試料を単一分子電気泳動装置にて分析する。この装置の設定では、すべての分子が同じ速度で検出器を通過する。試料の処理と同様にして、結合しなかったPNAが除去されるように処理した対照の試料(PNAプローブ+標的DNA)を蛍光分子について分析(光子によって検出)し、蛍光を対照と試料の間で比較する。両方のGVが存在しプローブのハイブリダイゼーションが起こるならば、対照試料中では蛍光分子はほとんど検出されず、試料中に多数の蛍光分子が検出される。
ハプロタイプ分析の本発明の別の態様では、第1のGV部位を特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて検出する。第2のGVに特異的な結合しなかったPNAプローブを試料に添加し、熱ポリメラーゼを用いてプライマーから転写を開始する。アミノアリルdUTPを転写により伸張産物に取り込ませる。プライマーの下流に第2のGVが存在すれば、ハイブリダイズしたPNAプローブは、この時点で転写をブロックするであろう。30サイクルの熱サイクルを用いて複数の伸張産物をテンプレートから作製する。アミン反応性Alexa680色素をARES標識キットに記載されているように伸張産物中に導入したアミンとコンジュゲーションさせる。試料をMicrocon 30YMフィルター/濃縮器で遠心することにより取り込まれなかった色素を試料から除去する。フィルターに残った試料を30mMのgly−gly緩衝液(pH8.2)に懸濁する。試料を希釈して、伸張産物の推定最終濃度10〜500fMにする。次いで、試料を単一分子電気泳動装置を用いて分析する。試料の励起は、出力が各レーザー光線あたり1.5mWで635nmの励起波長の固体レーザーを用いて行う。2つのレーザー光線とAlexa680色素からの蛍光を検出するのに適当なフィルターを有する2つの検出器を上記に記載してようにして用い、試料中の分子の電気泳動速度を測定する。試料中に、第2の、下流のGV部位が存在すれば、PNAはこの部位で転写をブロックし、決まった長さの転写産物が生じる。単一分子電気泳動装置を用いて分析したとき、これらの産物からの蛍光は単一の速度で検出されない。
実施例2−同時ハイブリダイゼーション
原理:Alexa680は、標的およびプローブを標識して2つの核酸プローブと標的核酸との同時ハイブリダイゼーションを検出する。単一分子検出装置を用いて分析された分子の蛍光強度が、標的、プローブおよび単一のプローブ−標的ハイブリダイゼーション複合体の蛍光強度を超えているとき、同時ハイブリダイゼーションが分子レベルで起こったと考えられる。Alexa680で標識した一本鎖M13mp18(ssM13)のSME分析の解析によって2msec“bin”あたり20〜90光子の発光が得られ、まれに90光子を超える。Alexa680で標識したM13mp18RF(dsM13)のNci制限消化によって生じた3本鎖フラグメントは、20〜80光子の光子を発し、ごくまれに80光子を超える。2つの試料を、ssM13Alexa680(標的)およびdsM13Alexa680制限フラグメント(プローブ)と合わせる。変性および再生の後、各制限フラグメントから得た一方の鎖を重複しないようにssM13標的とハイブリダイズさせることができる。これらのハイブリッド分子によって生じた光子の数はssM13標的から放出された光子(最大約90)、およびハイブリダイズする各一本鎖プローブから放出された光子(各プローブにつき最大約40)の合計である。ハイブリッドの場合、一本鎖の標的単独または二本差のプローブ単独と比較して、高い平均の数の光子の放出が見られる。この実験計画はさらに、標識した標的と標識した2本鎖のプローブの両方が一緒になっているが変性していない。この対照試料には実験試料と同じ濃度の分子が含まれているが、一本鎖プローブは一本鎖の標的とハイブリッドを形成しないので、2msecあたり最大で約90光子よりも多くの発光は起こらない。
原理:Alexa680は、標的およびプローブを標識して2つの核酸プローブと標的核酸との同時ハイブリダイゼーションを検出する。単一分子検出装置を用いて分析された分子の蛍光強度が、標的、プローブおよび単一のプローブ−標的ハイブリダイゼーション複合体の蛍光強度を超えているとき、同時ハイブリダイゼーションが分子レベルで起こったと考えられる。Alexa680で標識した一本鎖M13mp18(ssM13)のSME分析の解析によって2msec“bin”あたり20〜90光子の発光が得られ、まれに90光子を超える。Alexa680で標識したM13mp18RF(dsM13)のNci制限消化によって生じた3本鎖フラグメントは、20〜80光子の光子を発し、ごくまれに80光子を超える。2つの試料を、ssM13Alexa680(標的)およびdsM13Alexa680制限フラグメント(プローブ)と合わせる。変性および再生の後、各制限フラグメントから得た一方の鎖を重複しないようにssM13標的とハイブリダイズさせることができる。これらのハイブリッド分子によって生じた光子の数はssM13標的から放出された光子(最大約90)、およびハイブリダイズする各一本鎖プローブから放出された光子(各プローブにつき最大約40)の合計である。ハイブリッドの場合、一本鎖の標的単独または二本差のプローブ単独と比較して、高い平均の数の光子の放出が見られる。この実験計画はさらに、標識した標的と標識した2本鎖のプローブの両方が一緒になっているが変性していない。この対照試料には実験試料と同じ濃度の分子が含まれているが、一本鎖プローブは一本鎖の標的とハイブリッドを形成しないので、2msecあたり最大で約90光子よりも多くの発光は起こらない。
方法:プローブフラグメントを作製するための制限消化
m13MP18PF(NEB)をNci Iで消化し、約4kb、2kbおよび5kbの3つのフラグメントを得た。制限消化物をフェノール抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを40μLのTE緩衝液(pH8.0)に再懸濁した。
m13MP18PF(NEB)をNci Iで消化し、約4kb、2kbおよび5kbの3つのフラグメントを得た。制限消化物をフェノール抽出し、エタノール沈殿させた。ペレットを40μLのTE緩衝液(pH8.0)に再懸濁した。
1.DNA標的およびプローブの蛍光標識。機能的アミン基を、Label IT Amine Modifying Kit (Mirus, Madison,WI)を用いて、1Mgの未処理のssM13mp18(NEB)および1MgのNci I消化DNAに加えた。DNAを、アミン修飾試薬と37℃にて1時間インキュベーションした。次いで、各試料をエタノール沈殿し、5μLの水に再懸濁した。Alexa 680サクシニミジルエステル色素をARES Alexa 680キット(Molecular Probes, Eugene,OR)を用いて、アミン修飾DNAとカップリングした。1〜5μgのDNAを5μLのH2O中、3μLの25mg/mLの炭酸水素ナトリウム、2μLの色素とインキュベーションした。次いで、各紙薬をエタノール沈殿しMicrocon-30カラム(Millipore)にアプライした。各Microcon-30に1mLの水を通し、微量の未反応のアミン修飾試薬またはAlexa色素の試料を取り除いた。最終の試料体積を0.2mLとした。
2.ハイブリダイゼーション反応および単一分子解析
Alexa 680標識した一本鎖のM13標的(最終濃度20pM)とAlexa680で標識した二本鎖プローブ(最終濃度50pM)とを120mMのNaCl、10mMのTris(pH8.0)および5mMのEDTA中で混合することにより2種類の試料を調製した。ハイブリダイズする試料をpHを上げることにより変性させた後、Label IT アミン修飾キット (Mirus, Madison,WI)にて提供され記載されている緩衝液を用いて再生した。両試料を、室温で4時間インキュベーションした。最終濃度1pM標的および2.5pMのプローブの最終濃度について単一分子検出による分析のために、試料を分析用50mMGlyGly(pH8.2)中で20倍に希釈した。試料を、1μL/分の速度で装置のキャピラリーへ注入し、データを16分間集める。両データのセットを100光子またはそれ以上の相互相関について分析する。
Alexa 680標識した一本鎖のM13標的(最終濃度20pM)とAlexa680で標識した二本鎖プローブ(最終濃度50pM)とを120mMのNaCl、10mMのTris(pH8.0)および5mMのEDTA中で混合することにより2種類の試料を調製した。ハイブリダイズする試料をpHを上げることにより変性させた後、Label IT アミン修飾キット (Mirus, Madison,WI)にて提供され記載されている緩衝液を用いて再生した。両試料を、室温で4時間インキュベーションした。最終濃度1pM標的および2.5pMのプローブの最終濃度について単一分子検出による分析のために、試料を分析用50mMGlyGly(pH8.2)中で20倍に希釈した。試料を、1μL/分の速度で装置のキャピラリーへ注入し、データを16分間集める。両データのセットを100光子またはそれ以上の相互相関について分析する。
変性および再生した試料は、16分間でのデータにおいて2msecあたり>100光子の相互相関が564回あった。変性した対照試料は、2msecあたり>100光子のの相互相関が4回のみであった。標的に対する2つの蛍光プローブの同時ハイブリダイゼーションが、ハイブリッドを形成することができる標的およびプローブ分子と比較して、標的/プローブハイブリッド分子によって放出された光子の数の増加によって検出することができることを示す。個人の標的分子に対する2つの異なるGVプローブの同時ハイブリダイゼーションはハプロタイプを決定するのに十分である。
記載したこの実験において用いるプローブは大量であり、標的の短い部位(8〜30塩基対)に対して相補的なプローブを用いてハプロタイプ分析を改善する。そのような分析を以下に記載する。
目的は2つの異なる3kbのssLNAプローブを作製することである(1×平均シグナル強度)、それぞれssM13mp18の短い座(種々のGV座と等価)に対する親和性を有する。さらなる長さのプローブは、プローブの認識部分のための標識された「テール」として供する。蛍光色素を有するこれらのプローブ尾部を標識することによって、BioProfile Coporation's 単一分子電気泳動装置を用いて解析したときに平均2倍の蛍光強度を発するssM13mp18とssLNAプローブを含むハイブリッド分子を検出することができる。
材料:LNAオリゴ(Proligo)M13mp18h5594L6017(200nm,HPLC 80)5'-AGG GAA GAA AGC GAA AGG AGG CTG CCA GCG ACG AG (配列番号1);M13mp18h6702L6017 (200 nm, HPLC 80)5'-AAC CAA TAG GAA CGC CAT CAG CTG CCA GCG ACG AG (配列番号2); ラムダファージDNA (SigmaカスタムD-3654);NovaTaq PCRキット(Novagen カタログ番号 71005-3): デオキシヌクレオチド三リン酸(10, umol dNTPs) (Promega カタログ番号U1330);ARESTM Alex Fluor(登録商標)680 DNA標識キット(Molecular Probes カタログ番号A-21672);MinElute(商標)PCR 精製キット (Qiagen カタログ番号28004); GeneCapsule(商標) (Geno Technology, Inc.);MJ リサーチDNAエンジン(MJ Research, Inc. カタログ番号:PTC-0020, PTC-0225); 8-ストリップ0.2 mL 薄壁チューブ (MJ Research, Inc. カタログ番号:TBS- 0201); 0.2 mL薄壁チューブ用の8-ストリップキャップ(MJ Research, Inc. カタログ番号:TCS-0801)。
方法と結果
0.2mLの薄壁熱サイクルチューブ中以下の組成(最終濃度)を用いて、ラムダファージDNAの4521塩基のフラグメントを増幅するためにPCR反応混合物を準備する:Lambda5kLeftオリゴ (250nM); Lambda5kRightオリゴ(250 nM);10×PCR緩衝液+MgC(1×) ; dNTPミックス(0.2mM) ; NovaTaqTM (5 units);ラムダファージDNA(約500ng) ; 滅菌水を加えて最終の体積を50μLとする。試料を30サイクルの熱サイクルに付し、標準的なPCR温度サイクルレジメント(regiment)を用いて予測した大きさのPCR増幅物を作製した。
0.2mLの薄壁熱サイクルチューブ中以下の組成(最終濃度)を用いて、ラムダファージDNAの4521塩基のフラグメントを増幅するためにPCR反応混合物を準備する:Lambda5kLeftオリゴ (250nM); Lambda5kRightオリゴ(250 nM);10×PCR緩衝液+MgC(1×) ; dNTPミックス(0.2mM) ; NovaTaqTM (5 units);ラムダファージDNA(約500ng) ; 滅菌水を加えて最終の体積を50μLとする。試料を30サイクルの熱サイクルに付し、標準的なPCR温度サイクルレジメント(regiment)を用いて予測した大きさのPCR増幅物を作製した。
0.7%アガロースゲル中での電気泳動によりPCR増幅物を分析した後、増幅物が予測した大きさであることを確認するために臭化エチジウム染色を行う。GeneCapsule(商標)およびGeneCapsule(商標)に記載された方法を用いて4,521塩基のアプリコンを切断する。GeneCapsule(商標)はまた、取り込まれていないフリーのヌクレオチドおよびオリゴを除去する。切断されたフラグメントの濃度を、反応混合物の臭化エチジウム染色されたアリコートの蛍光を既知の濃度の染色された核酸との比較に基づいて見積もる。
精製したアプリコンを用いてssLNAプローブを作製する。0.2mLの薄壁熱サイクルチューブ内で以下の成分を十分混合することによりLNAオリゴのそれぞれについて別々のDNAポリメラーゼ伸張反応を準備する:M13mp18h5594L6017またはM13mp18h6702L6017 (250nM); 10× PCR 緩衝液+MgCl2 (1×) ;d [GAC] TPミックス(40 M dGTP, 40 M dATP, 40 M dCTP) ; アミノアリル-dUTP (60 M) ;dTTP(10, μM) ;NovaTaq(商標)(25 units); 4,521塩基ラムダPCRアプリコン (500 ng)。滅菌水を加えて最終体積を50μLとする。ストリップキャップをチューブにかぶせ、温度を標準的なPCR温度サイクルレジメを用いてサイクルさせ、約3kbの伸張産物を作製する。MinElute(商標)キットマニュアルの説明にしたがって、伸張反応産物をMinElute(商標)PCR精製キットを用いて精製する。エタノール沈殿の工程は、この精製の後、色素カップリング反応の前にTris緩衝液を除去することが必要である。溶出した伸張産物を5μLのヌクレアーゼ不含水に再懸濁する。
色素カップリング反応を行い、ssLNAプローブを蛍光標識する。ARES(商標)Alex Fluor(登録商標)680DNA標識キットのマニュアルのステップ4.1〜4.7に従い、色素をアミン修飾プローブにカップリングさせる。ARES(商標)マニュアルのステップ5.1〜5.2には、別のMinElute(商標)PCR精製カラムおよびエタノール沈殿を含む標識後の洗浄手順が記載されている。
標識したssLNAプローブを、各プローブについて最終濃度100pMに希釈した50mMのGlyGly緩衝液(pH8.2)に再懸濁する。各プローブの少量を、予めシリコン処理した1.5mLのチューブに分注し、さらに50mMのGlyGly緩衝液(pH8.2)中で10〜50fMの濃度に希釈する。これらの希釈物を単一分子電気泳動装置にて分析し以下を確認する:各プローブを個々に検出する能力、各ssLNAプローブの相対的な平均強度を検出する能力、および各プローブの実際の濃度を測定する能力。
ssLNAプローブおよびssM13mp18DNA両方を含むハイブリダイゼーション反応を開始する。以下の成分(最終濃度)を、予めシリコン処理した1.5mLのチューブ内で混合する:M13mp18h5594L6017 (10 pM);M13mp18h6702L6017 (10 pM);ssM13mp18 DNA (1 pM); 予め濾過したハイブリダイゼーション緩衝液(5×SSC,0.1%N-ラロイルサルコシン, 0.02%SDS), 滅菌水を加えて100μLとする)ハイブリダイゼーション反応物を65℃で16時間インキュベーションする。新しい予めシリコン処理した1.5mLチューブに少量ずつ分注し、50mMGlyGly緩衝液(pH8.2)中で約10fMのssM13mp18テンプレート濃度に対し1:100に希釈する。
1×および2×平均シグナル強度を有する分子の集団を検出する。1×平均シグナル強度分子は、伸張反応後依然としてラムダフラグメントに結合しているハイブリダイズしていないssLNAプローブおよびLNAプローブを示す。2×シグナル強度を有する分子はssM13mp18との両プローブのハイブリッドを示す。このようなGVの分析は、標的のハプロタイプを決定するのに十分である。
その他の態様
ここに記載された発明および請求の範囲は、ここに開示された特定の態様はいくつかの態様を説明することを意図するものであり、その態様の範囲に限定されない。任意均等な態様が本発明の範囲に属すると意図する。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な修飾が上記の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾もまた添付された請求の範囲に属すると意図される。
ここに記載された発明および請求の範囲は、ここに開示された特定の態様はいくつかの態様を説明することを意図するものであり、その態様の範囲に限定されない。任意均等な態様が本発明の範囲に属すると意図する。実際、本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な修飾が上記の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾もまた添付された請求の範囲に属すると意図される。
引用した文献
上記で引用した文献は、それぞれの文献、特許または特許出願があたかも参考のために本明細書においてその全体が組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、本明細書において同じ程度で参考のために組み込まれる。本明細書における文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であると自認するものであると解釈されてはならない。
上記で引用した文献は、それぞれの文献、特許または特許出願があたかも参考のために本明細書においてその全体が組み込まれるように具体的かつ個別に示されたかのように、本明細書において同じ程度で参考のために組み込まれる。本明細書における文献の引用は、そのような文献が本発明の先行技術であると自認するものであると解釈されてはならない。
Claims (82)
- (a)
(i)ハプロタイプに関連する第1の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、標識されたプライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
(1)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
(2)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの非標識プローブを前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
(b)前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも1つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物/プローブの複合体のうちの1つによってディスプレイされた少なくとも1つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、蛍光強度、発光、発光強度、化学発光、化学発光強度、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション(cooperative hybridization)からなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項1に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項1に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項4に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項4に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項4に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項4に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項1記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNA、DNA、RNAおよびDNXからなる群から選択される請求項1記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項1記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項1に記載の方法。 - (a)
(i)ハプロタイプに関連する第1の遺伝子変異を認識するプライマーを標的核酸分子または遺伝子断片とハイブリダイズさせ、プライマーに依存する転写物を該標的核酸または遺伝子断片から生じさせ、
(1)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの標識プローブを、前記プライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること、または
(2)該プライマーの下流にある第2の遺伝子変異を認識する少なくとも1つの非標識プローブを前記標識されたプライマーに依存する転写物とハイブリダイズさせること
により目的のハプロタイプを含む標的核酸分子または遺伝子断片を同定すること、および
(b)前記プライマーに依存する転写物、前記少なくとも1つのプローブ、またはプライマーに依存する転写物/プローブの複合体のうちの1つによってディスプレイされた少なくとも1つのパラメーターを検出し、それによりディスプレイされたパラメーターをハプロタイプと関連付けること
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、蛍光強度、発光、発光強度、化学発光、化学発光強度、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション(cooperative hybridization)からなる群から選択される請求項14記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項14に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項14に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項17に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項17に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項17に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項17に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項14記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項14に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNA、DNA、RNAおよびDNXからなる群から選択される請求項23記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項14記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項14に記載の方法。 - (a)核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および
(b)該プローブによってディスプレイされる1つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収、電気リアクタンスおよび共同ハイブリダイゼーション(cooperative hybridization)からなる群から選択される請求項27記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項27に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項27に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項27記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項27に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNAおよびDNAからなる群から選択される請求項36記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項27記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項27に記載の方法。 - (a)核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および
(b)該プローブによってディスプレイされる少なくとも2つのパラメーターにおける配列の変化を測定することによって核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収、電気リアクタンス、共同ハイブリダイゼーション(cooperative hybridization)およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項27記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項27に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項27に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項27記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項27に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNAおよびDNAからなる群から選択される請求項36記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項27記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項27に記載の方法。 - (a)核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および
(b)該プローブによってディスプレイされるパラメーターを同時に測定することによって該核酸分子または遺伝子断片を検出し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること(ここで該パラメーターは共同ハイブリダイゼーションではない)、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収および電気リアクタンスからなる群から選択される請求項53記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項27に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項27に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項27記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項27に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNAおよびDNAからなる群から選択される請求項36記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項27記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項27に記載の方法。 - (a)核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも2つのプローブで標識すること;および
(b)該プローブによってディスプレイされる少なくとも2つのパラメーターを同時に測定することによって該核酸分子または遺伝子断片を検出し、さらに分子がミクロスフェア、ナノスフェア、およびバーコード粒子からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを検出可能にすること(ここで該パラメーターは共同ハイブリダイゼーションではない)、
を含む遺伝子ハプロタイプを決定する方法。 - ディスプレイされるパラメーターが、蛍光寿命、蛍光極性、質量、正味の電荷、形、拡散、電気泳動速度、蛍光、発光、化学発光、光吸収および電気リアクタンスからなる群から選択される請求項53記載の方法。
- 工程(b)のパラメーターが電場においてディスプレイされる請求項27に記載の方法。
- 前記標識核酸または遺伝子フラグメントを、工程(b)の前に標識されていない核酸から分離する、請求項27に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸から分離する、請求項30に記載の方法。
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場における標識された核酸の電荷、質量または形の変化によって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法
- 標識された核酸または遺伝子フラグメントを、電場で標識された核酸をふるいにかけることによって、標識されていない核酸と区別する、請求項30に記載の方法。
- プローブが、マイクロスフェア、ナノスフェア、バーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合する請求項27記載の方法。
- プローブが、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、脂質、ステロール、生物学的分子、色素、薬物、質量タグ、同位元素、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される請求項27に記載の方法。
- 核酸が、PNA、LNAおよびDNAからなる群から選択される請求項36記載の方法。
- プローブが核酸または遺伝子フラグメントに共有結合する、請求項27記載の方法。
- プローブが、
(a)少なくとも1つの核酸または遺伝子フラグメント;および
(b)少なくとも1つの固体物質
と連携している、請求項27に記載の方法。 - (a)核酸分子または遺伝子断片を、各々、ハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識する少なくとも1つのプローブで標識すること;および
(b)ある時間での差を測定することにより核酸分子または遺伝子断片の速度を検出し、プローブは第1の位置で第1の検出器により、第2の位置で第2の検出器により測定されるパラメーターをディスプレイし、プローブがマイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法。 - 前記速度がCCD検出器により視覚的に検出される、請求項79に記載の方法。
- (a)核酸分子または遺伝子断片を、第1のプローブおよび第2のプローブで標識することであって、該第1のプローブと第2のプローブハプロタイプを定義する異なる遺伝子変異を認識し;および
(b)第1のプローブによってディスプレイされる第1のパラメーターと第2のプローブによってディスプレイされる第2のパラメーターを逐次的に測定することによって核酸分子または遺伝子断片の速度を検出することであって、該第1または第2のプローブがマイクロスフェア、ナノスフェアおよびバーコード粒子およびナノ結晶からなる群から選択される分子と結合し、それにより遺伝子ハプロタイプを決定可能にすること
を含む方法。 - 前記速度がCCD検出器により視覚的に検出される、請求項81に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33504001P | 2001-10-24 | 2001-10-24 | |
PCT/US2002/034217 WO2003035671A2 (en) | 2001-10-24 | 2002-10-24 | Methods for detecting genetic haplotypes by interaction with probes |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005525787A true JP2005525787A (ja) | 2005-09-02 |
Family
ID=23309991
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003538184A Pending JP2005525787A (ja) | 2001-10-24 | 2002-10-24 | プローブとの相互作用による遺伝子ハプロタイプの検出方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20030124592A1 (ja) |
EP (1) | EP1436426A4 (ja) |
JP (1) | JP2005525787A (ja) |
AU (1) | AU2002343573A1 (ja) |
CA (1) | CA2463420A1 (ja) |
MX (1) | MXPA04003926A (ja) |
WO (1) | WO2003035671A2 (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007533971A (ja) * | 2003-09-30 | 2007-11-22 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | 粒子検出の分析精度を改善する方法 |
JP2011513753A (ja) * | 2008-03-05 | 2011-04-28 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | 分子の高感度検出の方法および組成物 |
JP2015004691A (ja) * | 2006-04-04 | 2015-01-08 | シングレックス,インコーポレイテッド | 高感度のマーカー分析および分子検出のための方法および組成物 |
JP2018009903A (ja) * | 2016-07-14 | 2018-01-18 | シャープ株式会社 | 蛍光検査システム |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MXPA04003926A (es) * | 2001-10-24 | 2004-06-18 | Singulex Inc | Metodos para detectar haplotipos geneticos por interaccion con sondas. |
GB0125617D0 (en) * | 2001-10-25 | 2001-12-19 | Univ Manchester | Photostabilised organic material |
WO2004081191A2 (en) * | 2003-03-12 | 2004-09-23 | Cleveland State University | Molecular haplotyping of genomic dna |
WO2005019419A2 (en) * | 2003-07-31 | 2005-03-03 | Singulex, Inc. | Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules |
EP1698897B1 (en) * | 2003-12-19 | 2010-03-17 | Nippon Steel Kankyo Engineering Co., Ltd. | Novel mixtures for assaying nucleic acid, novel method of assaying nucleic acid with the use of the same and nucleic acid probe to be used therefor |
US9040305B2 (en) * | 2004-09-28 | 2015-05-26 | Singulex, Inc. | Method of analysis for determining a specific protein in blood samples using fluorescence spectrometry |
US7572640B2 (en) * | 2004-09-28 | 2009-08-11 | Singulex, Inc. | Method for highly sensitive detection of single protein molecules labeled with fluorescent moieties |
US8685711B2 (en) | 2004-09-28 | 2014-04-01 | Singulex, Inc. | Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules |
EP1805500A4 (en) * | 2004-09-28 | 2008-05-07 | Singulex Inc | SYSTEM AND METHOD FOR THE SPECTROSCOPIC ANALYSIS OF INDIVIDUAL PARTICLES |
US20060188899A1 (en) * | 2004-10-07 | 2006-08-24 | Dewalch N B | High speed DNA sequencer and method |
US7700287B2 (en) | 2005-01-28 | 2010-04-20 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for terminating a sequencing reaction at a specific location in a target DNA template |
US7838250B1 (en) | 2006-04-04 | 2010-11-23 | Singulex, Inc. | Highly sensitive system and methods for analysis of troponin |
CN103543094B (zh) | 2007-12-19 | 2017-06-09 | 神谷来克斯公司 | 单分子检测用扫描分析器和使用方法 |
US9127312B2 (en) | 2011-02-09 | 2015-09-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Analysis of nucleic acids |
AU2010259022B2 (en) | 2009-06-08 | 2016-05-12 | Singulex, Inc. | Highly sensitive biomarker panels |
CN102575984B (zh) * | 2009-08-17 | 2016-01-06 | 马尔文仪器有限公司 | 以经改良单光散射模式检测复杂流体的基于动态光散射的微流变性 |
JP2013525820A (ja) | 2010-05-06 | 2013-06-20 | シングレクス、インコーポレイテッド | 関節リウマチの発症に関するリスクを診断し、病期分類し、予測し、治療レスポンダーを同定するための方法 |
CN104641233B (zh) | 2012-06-22 | 2018-01-09 | 麦考瑞大学 | 采用寿命编码的复合悬液分析/阵列 |
CN107735497B (zh) * | 2015-02-18 | 2021-08-20 | 卓异生物公司 | 用于单分子检测的测定及其应用 |
Family Cites Families (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4071298A (en) * | 1974-06-27 | 1978-01-31 | Stanford Research Institute | Laser Raman/fluorescent device for analyzing airborne particles |
DE2732272C2 (de) * | 1977-07-16 | 1979-07-05 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts, 6900 Heidelberg | Verfahren und Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von gefärbten Partikeln, insbesondere biologischen Zellen |
US4251733A (en) * | 1978-06-29 | 1981-02-17 | Hirleman Jr Edwin D | Technique for simultaneous particle size and velocity measurement |
US4172227A (en) * | 1978-07-21 | 1979-10-23 | Becton, Dickinson And Company | Flow microfluorometer |
US5034506A (en) * | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4768879A (en) * | 1986-06-17 | 1988-09-06 | The Dow Chemical Company | Method for measuring the size of objects in a fluid medium |
US5041733A (en) * | 1987-03-20 | 1991-08-20 | Agency Of Industrial Science & Technology | Method and apparatus for identifying chromosomes or cells |
US5104791A (en) * | 1988-02-09 | 1992-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Particle counting nucleic acid hybridization assays |
US4927265A (en) * | 1988-04-29 | 1990-05-22 | 501 Microphoretic Systems, Inc. | Detector for fluorescence and absorption spectroscopy |
US5002389A (en) * | 1988-12-22 | 1991-03-26 | Honeywell Inc. | Pulsed fluorescence velocimeter |
US5108179A (en) * | 1989-08-09 | 1992-04-28 | Myers Stephen A | System and method for determining changes in fluorescence of stained nucleic acid in electrophoretically separated bands |
US5770029A (en) * | 1996-07-30 | 1998-06-23 | Soane Biosciences | Integrated electrophoretic microdevices |
CA2079005A1 (en) * | 1990-04-11 | 1991-10-12 | Geoffrey Stephen Begg | Methods and apparatus allowing sequential chemical reactions |
US5432272A (en) * | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
US5539082A (en) * | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5853989A (en) * | 1991-08-27 | 1998-12-29 | Zeneca Limited | Method of characterisation of genomic DNA |
US5994069A (en) * | 1996-01-24 | 1999-11-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages |
US6383747B1 (en) * | 1991-11-01 | 2002-05-07 | The Immunogenetics Research Foundation Incorporated | Method for determining ancestral haplotypes using haplospecific geometric elements within the major histocompatibility complex multigene cluster |
US5605662A (en) * | 1993-11-01 | 1997-02-25 | Nanogen, Inc. | Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics |
US5846708A (en) * | 1991-11-19 | 1998-12-08 | Massachusetts Institiute Of Technology | Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection |
US5545524A (en) * | 1991-12-04 | 1996-08-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for chromosome region-specific probes |
US5589333A (en) * | 1992-02-03 | 1996-12-31 | Thomas Jefferson University | In situ polymerase chain reaction |
US5209834A (en) * | 1992-03-09 | 1993-05-11 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Ordered transport and identification of particles |
WO1993020236A1 (en) * | 1992-04-03 | 1993-10-14 | Applied Biosystems, Inc. | Probe composition and method |
US5541311A (en) * | 1992-12-07 | 1996-07-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase |
DK0679251T3 (da) * | 1993-01-18 | 1999-01-25 | Evotec Biosystems Aktiengesell | Fremgangsmåde og apparat til vurdering af biopolymerers fitness |
GB9301122D0 (en) * | 1993-01-21 | 1993-03-10 | Scient Generics Ltd | Method of analysis/separation |
JPH06265447A (ja) * | 1993-03-16 | 1994-09-22 | Hitachi Ltd | 微量反応装置およびこれを使用する微量成分測定装置 |
US5543838A (en) * | 1993-08-31 | 1996-08-06 | Xerox Corporation | Signal multiplexing system for an image sensor array |
JP3290786B2 (ja) * | 1993-11-26 | 2002-06-10 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
CA2188660C (en) * | 1994-04-25 | 2005-01-18 | Richard G. H. Cotton | Detection of mutation by resolvase cleavage |
US5919623A (en) * | 1994-04-27 | 1999-07-06 | St. James's And Seacroft University Hospitals Nhs Trust | Nucleic acid mutation assays |
US5540494A (en) * | 1994-06-03 | 1996-07-30 | Purvis, Jr.; Norman B. | Method and apparatus for determining absolute particle size, surface area and volume normalized fluorescence using forward angle light scatter intensity in flow cytometry |
US6001229A (en) * | 1994-08-01 | 1999-12-14 | Lockheed Martin Energy Systems, Inc. | Apparatus and method for performing microfluidic manipulations for chemical analysis |
US5571410A (en) * | 1994-10-19 | 1996-11-05 | Hewlett Packard Company | Fully integrated miniaturized planar liquid sample handling and analysis device |
US5645702A (en) * | 1995-06-07 | 1997-07-08 | Hewlett-Packard Company | Low voltage miniaturized column analytical apparatus and method |
US5658413A (en) * | 1994-10-19 | 1997-08-19 | Hewlett-Packard Company | Miniaturized planar columns in novel support media for liquid phase analysis |
US5585069A (en) * | 1994-11-10 | 1996-12-17 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Partitioned microelectronic and fluidic device array for clinical diagnostics and chemical synthesis |
US5603351A (en) * | 1995-06-07 | 1997-02-18 | David Sarnoff Research Center, Inc. | Method and system for inhibiting cross-contamination in fluids of combinatorial chemistry device |
FI98765C (fi) * | 1995-01-16 | 1997-08-11 | Erkki Soini | Virtaussytometrinen menetelmä ja laite |
DE19508366C2 (de) * | 1995-03-10 | 1998-01-29 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum direkten Nachweisen weniger Nucleinsäurestränge |
US5793485A (en) * | 1995-03-20 | 1998-08-11 | Sandia Corporation | Resonant-cavity apparatus for cytometry or particle analysis |
US5682038A (en) * | 1995-04-06 | 1997-10-28 | Becton Dickinson And Company | Fluorescent-particle analyzer with timing alignment for analog pulse subtraction of fluorescent pulses arising from different excitation locations |
US5798222A (en) * | 1995-07-17 | 1998-08-25 | Guava Technologies, Inc. | Apparatus for monitoring substances in organisms |
US5716825A (en) * | 1995-11-01 | 1998-02-10 | Hewlett Packard Company | Integrated nucleic acid analysis system for MALDI-TOF MS |
US6613508B1 (en) * | 1996-01-23 | 2003-09-02 | Qiagen Genomics, Inc. | Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques |
US6090606A (en) * | 1996-01-24 | 2000-07-18 | Third Wave Technologies, Inc. | Cleavage agents |
US5746901A (en) * | 1996-04-05 | 1998-05-05 | Regents Of The University Of California | Hybrid slab-microchannel gel electrophoresis system |
US6399023B1 (en) * | 1996-04-16 | 2002-06-04 | Caliper Technologies Corp. | Analytical system and method |
US5945580A (en) * | 1996-04-19 | 1999-08-31 | Dna Plant Technology Corporation | Capsicum hemicellulase polynucleotides and polypeptides |
US5863801A (en) * | 1996-06-14 | 1999-01-26 | Sarnoff Corporation | Automated nucleic acid isolation |
DE19630956A1 (de) * | 1996-07-31 | 1998-02-05 | Basf Ag | Verfahren und Vorrichtung zur Raman-Korrelationsspektroskopie |
DE19634873A1 (de) * | 1996-08-29 | 1998-03-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | System zur Unterscheidung fluoreszierender Molekülgruppen durch zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung |
WO1998010097A2 (en) * | 1996-09-03 | 1998-03-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method and apparatus for single molecule two color fluorescent detection and molecular weight and concentration determination |
JP3935509B2 (ja) * | 1997-02-12 | 2007-06-27 | ワイ. チャン,ユージーン | ポリマー分析のための方法および製品 |
SE522077C2 (sv) * | 1997-09-05 | 2004-01-13 | Lightup Technologies Ab | Förfarande att välja sekvens hos sond för nukleinsyrahybridisering |
US6710871B1 (en) * | 1997-06-09 | 2004-03-23 | Guava Technologies, Inc. | Method and apparatus for detecting microparticles in fluid samples |
GB2326229A (en) * | 1997-06-13 | 1998-12-16 | Robert Jeffrey Geddes Carr | Detecting and analysing submicron particles |
US5989402A (en) * | 1997-08-29 | 1999-11-23 | Caliper Technologies Corp. | Controller/detector interfaces for microfluidic systems |
US6049380A (en) * | 1997-11-12 | 2000-04-11 | Regents Of The University Of California | Single molecule identification using selected fluorescence characteristics |
WO1999034195A1 (de) * | 1997-12-23 | 1999-07-08 | Evotec Biosystems Ag | Verfahren zum nachweis von reaktionen mittels koinzidenzanalyse |
US6041515A (en) * | 1998-01-12 | 2000-03-28 | Life Technologies, Inc. | Apparatus for drying solutions containing macromolecules |
SE9800360D0 (sv) * | 1998-02-06 | 1998-02-06 | Goeteborg University Science I | Method, apparatus and flow cell for high sensitivity detection of fluorescent molecules |
US6183958B1 (en) * | 1998-05-06 | 2001-02-06 | Variagenics, Inc. | Probes for variance detection |
DE19841187C1 (de) * | 1998-09-09 | 2000-02-10 | Hirschmann Richard Gmbh Co | Mobilfunkantenne |
US6235502B1 (en) * | 1998-09-18 | 2001-05-22 | Molecular Staging Inc. | Methods for selectively isolating DNA using rolling circle amplification |
US6689323B2 (en) * | 1998-10-30 | 2004-02-10 | Agilent Technologies | Method and apparatus for liquid transfer |
DE69930310T3 (de) * | 1998-12-14 | 2009-12-17 | Pacific Biosciences of California, Inc. (n. d. Ges. d. Staates Delaware), Menlo Park | Kit und methode zur nukleinsäuresequenzierung einzelner moleküle durch polymerase synthese |
AU2733200A (en) * | 1999-01-20 | 2000-08-07 | Northwestern University | Dna mobility modifier |
US6249341B1 (en) * | 1999-01-25 | 2001-06-19 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells |
US6671044B2 (en) * | 1999-01-25 | 2003-12-30 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells in broad flat flow |
US6473176B2 (en) * | 1999-01-25 | 2002-10-29 | Amnis Corporation | Imaging and analyzing parameters of small moving objects such as cells |
EP1169722A1 (en) * | 1999-03-18 | 2002-01-09 | Cambridge Research & Instrumentation, Inc. | High-efficiency multiple probe imaging system |
WO2000070080A1 (en) * | 1999-05-17 | 2000-11-23 | Caliper Technologies Corp. | Focusing of microparticles in microfluidic systems |
US6309886B1 (en) * | 1999-06-04 | 2001-10-30 | The Regents Of The University Of California | High throughput analysis of samples in flowing liquid |
US6811668B1 (en) * | 1999-06-22 | 2004-11-02 | Caliper Life Sciences, Inc. | Apparatus for the operation of a microfluidic device |
US6532067B1 (en) * | 1999-08-09 | 2003-03-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Aerosol fluorescence spectrum analyzer for rapid measurement of single airborne particles |
US6316230B1 (en) * | 1999-08-13 | 2001-11-13 | Applera Corporation | Polymerase extension at 3′ terminus of PNA-DNA chimera |
AU7875600A (en) * | 1999-10-08 | 2001-04-23 | University Of Utah Research Foundation | Particle analysis assay for biomolecular quantification |
US6252664B1 (en) * | 1999-10-15 | 2001-06-26 | Biocrystal Ltd. | Fluorescence filter cube for fluorescence detection and imaging |
US20020167665A1 (en) * | 2000-05-19 | 2002-11-14 | Yeung Edward S. | High-throughput methods of distinguishing at least one molecule individually in a sample comprising multiple molecules and systems for use therein |
US20060008799A1 (en) * | 2000-05-22 | 2006-01-12 | Hong Cai | Rapid haplotyping by single molecule detection |
EP1176212A1 (en) * | 2000-07-24 | 2002-01-30 | Centre National de Genotype | Method for haplotyping by mass spectrometry |
IL144515A0 (en) * | 2000-07-31 | 2002-05-23 | Pfizer Prod Inc | A pcr-based multiplex assay for determining haplotype |
US6608680B2 (en) * | 2000-08-25 | 2003-08-19 | Amnis Corporation | TDI imaging system for kinetic studies |
AU2001289177A1 (en) * | 2000-08-30 | 2002-03-13 | Haplogen, Llc | Method for determining alleles |
US6537437B1 (en) * | 2000-11-13 | 2003-03-25 | Sandia Corporation | Surface-micromachined microfluidic devices |
US6783992B2 (en) * | 2001-01-03 | 2004-08-31 | Agilent Technologies, Inc. | Methods and using chemico-mechanical microvalve devices for the selective separation of components from multi-component fluid samples |
US6850317B2 (en) * | 2001-01-23 | 2005-02-01 | Schlumberger Technology Corporation | Apparatus and methods for determining velocity of oil in a flow stream |
US6386219B1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-05-14 | Agilent Technologies, Inc. | Fluid handling system and method of manufacture |
US6802342B2 (en) * | 2001-04-06 | 2004-10-12 | Fluidigm Corporation | Microfabricated fluidic circuit elements and applications |
US6766817B2 (en) * | 2001-07-25 | 2004-07-27 | Tubarc Technologies, Llc | Fluid conduction utilizing a reversible unsaturated siphon with tubarc porosity action |
WO2003043402A2 (en) * | 2001-10-19 | 2003-05-30 | Proligo Llc | Nucleic acid probes and methods to detect and/or quantify nucleic acid analytes |
MXPA04003926A (es) * | 2001-10-24 | 2004-06-18 | Singulex Inc | Metodos para detectar haplotipos geneticos por interaccion con sondas. |
US6599436B1 (en) * | 2001-12-06 | 2003-07-29 | Sandia Corporation | Formation of interconnections to microfluidic devices |
US20040166514A1 (en) * | 2002-11-19 | 2004-08-26 | Singulex, Inc. | Detection of target molecules through interaction with probes |
EP1805500A4 (en) * | 2004-09-28 | 2008-05-07 | Singulex Inc | SYSTEM AND METHOD FOR THE SPECTROSCOPIC ANALYSIS OF INDIVIDUAL PARTICLES |
-
2002
- 2002-10-24 MX MXPA04003926A patent/MXPA04003926A/es unknown
- 2002-10-24 US US10/280,580 patent/US20030124592A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-24 JP JP2003538184A patent/JP2005525787A/ja active Pending
- 2002-10-24 EP EP02780526A patent/EP1436426A4/en not_active Withdrawn
- 2002-10-24 CA CA002463420A patent/CA2463420A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-24 AU AU2002343573A patent/AU2002343573A1/en not_active Abandoned
- 2002-10-24 WO PCT/US2002/034217 patent/WO2003035671A2/en active Application Filing
-
2006
- 2006-02-09 US US11/352,448 patent/US20060281102A1/en not_active Abandoned
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007533971A (ja) * | 2003-09-30 | 2007-11-22 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | 粒子検出の分析精度を改善する方法 |
JP2015004691A (ja) * | 2006-04-04 | 2015-01-08 | シングレックス,インコーポレイテッド | 高感度のマーカー分析および分子検出のための方法および組成物 |
JP2011513753A (ja) * | 2008-03-05 | 2011-04-28 | シンギュレックス・インコーポレイテッド | 分子の高感度検出の方法および組成物 |
JP2018009903A (ja) * | 2016-07-14 | 2018-01-18 | シャープ株式会社 | 蛍光検査システム |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002343573A1 (en) | 2003-05-06 |
WO2003035671A2 (en) | 2003-05-01 |
WO2003035671A3 (en) | 2003-11-13 |
US20060281102A1 (en) | 2006-12-14 |
EP1436426A4 (en) | 2005-11-02 |
US20030124592A1 (en) | 2003-07-03 |
EP1436426A2 (en) | 2004-07-14 |
MXPA04003926A (es) | 2004-06-18 |
CA2463420A1 (en) | 2003-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20060281102A1 (en) | Methods for detecting genetic haplotypes by interaction with probes | |
CA2295333C (en) | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect | |
US7371520B2 (en) | Methods and apparati using single polymer analysis | |
US7282330B2 (en) | Methods and apparati using single polymer analysis | |
Twyman et al. | Techniques patents for SNP genotyping | |
US20030235854A1 (en) | Methods for analyzing a nucleic acid | |
Gilboa et al. | Single-molecule analysis of nucleic acid biomarkers–A review | |
JP2005537030A5 (ja) | ||
CN106164297A (zh) | 单分子电子多重snp试验以及pcr分析 | |
JP4110223B2 (ja) | Pnaプローブを用いる、溶液中でのヌクレオチドアッセイ法 | |
JP3752466B2 (ja) | 遺伝子検査方法 | |
US6573047B1 (en) | Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation | |
Fors et al. | Large-scale SNP scoring from unamplified genomic DNA | |
US7485425B2 (en) | Methods for amplification of nucleic acids using spanning primers | |
US7829278B2 (en) | Polynucleotide barcoding | |
US20030077584A1 (en) | Methods and compositons for bi-directional polymorphism detection | |
Hung et al. | Use of multiplex PCR and CE for gene dosage quantification and its biomedical applications for SMN, PMP22, and α‐globin genes | |
US20030087272A1 (en) | Gene testing method | |
EP1606389B1 (en) | Methods for polynucleotide sequence detection | |
US20040185467A1 (en) | Genotyping | |
US20040203005A1 (en) | Dual hybridization of complex nucleic acid samples for sequencing and single-nucleotide polymorphism identification | |
Göransson | Readout Strategies for Biomolecular Analyses | |
Dutton | Validation of Four Multiplex SNP Panels for Forensic DNA Testing: An Assessment of the Sensitivity and Reproducibility of the SNaPshot Primer Extension Assay |